JPH0253032B2

JPH0253032B2 -

Info

Publication number: JPH0253032B2
Application number: JP14904181A
Authority: JP
Inventors: Sadaji Uragami; Sumyasu Takano; Noboru Sato
Original assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 1981-09-21
Filing date: 1981-09-21
Publication date: 1990-11-15
Also published as: JPS5851937A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はシリカゲルの再生法に関し、さらに詳
細には補酵素Ｑの精製に使用されたシリカゲルの
再生法に係わる。補酵素Ｑは、生体内では電子伝
達系に関与し、心不全などの疾病の治療薬として
使用されている。この補酵素Ｑは合成、醗酵およ
び天然物からの抽出などの方法により製造される
が、医薬であるために高純度であることが必要と
されている。そのための精製方法としては、吸着
剤としてシリカゲルを使用するカラムクロマトグ
ラフイが行われているが、カラムクロマトグラフ
イにおける補酵素Ｑと不純物との分離性の点か
ら、シリカゲルの再生が不充分であるので、再使
用することは困難であつた。このようなことから
シリカゲルを使用するカラムクロマトグラフイは
作業性の点およびシリカゲルの使用量の点で工業
的な精製方法として問題があつた。

本発明者らはシリカゲルカラムクロマトグラフ
イにおいて、シリカゲル再生方法を種々検討した
結果、吸着、溶出および洗浄を行つた後のシリカ
ゲルを、40℃乃至沸点以下の温度の無極性溶剤に
接触させることによりシリカゲルが吸着されてい
た水分および洗浄で用いた溶剤を取り除くことが
可能であり、この方法によつて得られた再生シリ
カゲルを使用したカラムクロマトグラフイは補酵
素Ｑと不純物との分離がよく、シリカゲルの反復
使用が可能となり、シリカゲルの使用量をへらす
ことができた。また、この再生方法はカラム容器
に充填されたままのシリカゲルに適用されるので
シリカゲルの充填、取り出しなどの作業を省略す
ることができることが判明し、本発明を完成し
た。

すなわち、本発明はシリカゲルを吸着剤とした
カラムクロマトグラフイで補酵素Ｑをシリカゲル
に吸着、溶出用有機溶剤により溶出させることに
より補酵素Ｑを精製し、次いで溶出用有機溶剤よ
りも極性の高い洗浄用有機溶剤でシリカゲルを洗
浄したのち、シリカゲルに無極性溶剤を接触させ
るカラム中のシリカゲルの再生法において、40℃
乃至沸点以下の温度の無極性溶剤を用いることを
特徴とするシリカゲルの再生法である。

本発明において精製される出発物質は、合成、
醗酵および天然物からの抽出などの方法により補
酵素Ｑを製造する際に混入されたたとえば各種の
脂質などの不純物を含んでいる粗補酵素Ｑであ
る。本発明における補酵素Ｑは補酵素Q₁〜Q₁₂の
いずれでもよく、その２種以上の混合物でもよ
い。

本発明に使用されるシリカゲルには特に制限は
ないが、実用上、たとえばシリカゲル（商品名ワ
コーゲルＣ−200、和光純薬製）、シリカゲル
（商品名ワコーゲルＣ−300、和光純薬製）、シ
リカゲル（商品名アート（Art）7734、メルク社
製）、およびシリカゲル（商品名アート 9385、
メルク社製）、シリカゲル（商品名KT−3063、
フジゲル製）およびシリカゲル（商品名4B、フ
ジゲル製）などの市販品が好適に使用される。

シリカゲルによる吸着、溶出および洗浄は常法
によつて行なわれる。

溶出処理で使用する溶出用有機溶剤は、実用
上、通常はたとえばベンゼンおよびトルエンなど
の単一溶剤またはｎ−ヘキサン、ｎ−ペンタン、
イソオクタン、シクロヘキサン、ベンゼンおよび
石油エーテルなどの無極性溶剤と、クロロホル
ム、エチルエーテル、イソプロピルエーテル、酢
酸エチル、アセトン、メタノールおよびエタノー
ルなどの極性溶剤とを混合して極性を調節した混
合溶剤が用いられる。

溶出を行つた後のシリカゲルに吸着されている
不純物を除去するためのシリカゲルの洗浄は、ク
ロロホルム、エチルエーテル、イソプロピルエー
テル、酢酸エチル、アセトン、メタノール、エタ
ノールなどをそれぞれ単独もしくはこれらの混合
物、またはこれらとｎ−ヘキサン、ｎ−ペンタ
ン、イソオクタン、シクロヘキサン、ベンゼン、
石無エーテルなどの無極性溶剤との混合物を使用
して行われる。なお洗浄に用いられる洗浄用溶剤
は、溶出に使用された溶出用有機溶剤よりも極性
が大きくなければならない。洗浄に用いる溶剤量
は特に制限はなく、シリカゲルに吸着されている
不純物を脱離するに必要な溶剤量であればよい
が、一般にシリカゲル１Kgあたり約２〜15が好
ましい。

本発明での再生においてシリカゲルに接触させ
る無極性有機溶剤としてはｎ−ヘキサン、ｎ−ヘ
プタン、ｎ−ペンタン、イソオクタン、シクロヘ
キサン、石油エーテル、ベンゼンおよびトルエン
などがある。

これらの無極性溶剤にシリカゲルを接触させて
シリカゲルを再生するが、この再生は40℃乃至沸
点以下の温度に加熱された無極性溶剤を用いて行
われる。この温度を、使用される溶剤の沸点より
も高くすると、常圧では溶剤の一部がガス化しそ
のためにカラム中の溶剤の流れが円滑でなくな
り、シリカゲルの再生は行われないかまたは不充
分となる。また、この温度を40℃より低くする
と、シリカゲルの再生は不充分または不可能とな
る。加熱の方法としては、加熱した溶剤をカラム
に注入してもよく、またカラム全体を加熱しても
よいが、実用上、後者が好ましい。

本発明の再生において、溶剤の流下速度を大き
くするためにはカラム塔頂から加圧することが好
ましい。

再生においてシリカゲルと接触させる無極性溶
剤の量には特に制限はないが、通常はシリカゲル
１Kgあたり約５〜30であり、15〜25好まし
い。

このようにして本発明での再生によりシリカゲ
ルの吸着されていた少なくとも水分、さらには洗
浄で使用された洗浄用溶剤などは、再生に使用さ
れた再生用溶剤とともにカラム外に排出されるこ
とにより除去されシリカゲルは再生される。補酵
素Ｑの精製に使用されたシリカゲルは従来は再生
が不充分で再使用が不可能とされていたが、本発
明によつてシリカゲルの吸着分離能を回復させ再
使用を可能とし、シリカゲルの交換を不要とし、
またシリカゲルの使用量を節減でき、従つてコス
ト的にも、操作上からも改善され、本発明は工業
的に大きな意義がある。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。

実施例１ (1) 粗補酵素Q₁₀の調製法メタノールを含有する合成培地で、メタノー
ル資化性細菌のプロタミノバクタールバー
NCIB 2879を、28℃で空気を通気し、かつ機
械撹拌しながら培養した。培養終了後、遠心分
離機で集菌し、スプレードライヤーで乾燥し
て、18Kgの乾燥菌体を得た。

乾燥菌体18Kgに60のアセトンに加え、30℃
で１時間撹拌、抽出を行なつたのち（第１回抽
出）、濾別し、抽出液と抽出残菌体を得た。こ
の第１回抽出後の濾別によつて得られた抽出残
菌体に60のアセトンを新たに加え30℃で１時
間撹拌、抽出を行なつたのち（第２回抽出）、
濾別し、抽出液と抽出残菌体を得た。さらにこ
の第２回抽出後の濾別によつて得られた抽出残
菌体に60のアセトンを新たに加え30℃で１時
間撹拌、抽出を行なつたのち（第３回抽出）、
濾別し、抽出液と抽出残菌体を得た。以上３回
分の抽出液を合わせて減圧濃縮、乾固し、これ
に1000mlのｎ−ヘキサンを加えて溶解し、不溶
な不純物を除去した。これに28wt％のアンモ
ニア水を５％含むメタノール溶液200mlを加え、
20分間撹拌したのち静止し、ｎ−ヘキサン層と
アンモニア・メタノール層を分離させ、アンモ
ニア・メタノール層を除去した。その後、ヘキ
サン層に5vol％の水を含むメタノール溶液200
mlを加え20分間撹拌したのち静置し、ｎ−ヘキ
サン層と水・メタノール層を分離させ、水・メ
タノール層を除去した。ｎ−ヘキサン層を減圧
濃縮および乾固し、これを150mlのアセトンに
溶解し、不溶物を除去した。この液にメタノー
ル150mlを加え、−10℃のデイープフリーザーに
入れ一昼夜静置し、結晶を析出させ、濾別し、
補酵素Q₁₀を含む粗結晶（純度81.0％）20ｇを
得た。

(2) 補酵素Q₁₀の精製径26mm、長さ300mmのカラム容器にｎ−ヘキ
サンに懸濁されたシリカゲル（商品名ワコーゲ
ルＣ−300、和光純薬製）を50ｇ充填し、ｎ
−ヘキサンに溶解した前記の粗結晶５ｇをカラ
ム上部にチヤージし吸着させた後、アセトン含
有率1vol％のアセトンとｎ−ヘキサンとの混合
物を流速200ml／hrで流下したところ、流下開
始から約２時間10分後に補酵素Q₁₀を含む流出
液がカラムから流出しはじめた。純補酵素Q₁₀
含有区分として500mlを分取し、これから溶剤
を除去して3.63ｇの純補酵素Q₁₀を得た。これ
は粗結晶中の補酵素Q₁₀の約90％に相当する。

(3) 再生シリカゲルによる補酵素Q₁₀の精製次に本発明によるシリカゲルの再生および再
生シリカゲルを用いての補酵素Q₁₀の精製につ
いての実験例を示す。

前記(2)の操作を行つたのち、このシリカゲル
カラムにアセトン：ｎ−ヘキサンの１：１混合
溶剤（vol）を300ml 流してシリカゲルを洗浄
し、不純物を取り除いた後にカラムを外部から
加熱して55℃に保ちながらｎ−ヘキサンを1000
ml流し、カラムの再生を行つた。

再生したシリカゲルが充填されているカラム
に、ｎ−ヘキサンに溶解した前記(1)の粗結晶５
ｇをカラム上部にチヤージし吸着させた後、ア
セトン含有率1vol％のアセトンとｎ−ヘキサン
との混合物を流速200ml／hrで流下させた。純
補酵素Q₁₀含有区分として500mlを分取し、こ
れから溶剤を除去して3.50ｇの純補酵素Q₁₀を
得た。これは粗結晶中の補酵素Q₁₀の約86％に
相当する。

比較例１シリカゲルとｎ−ヘキサンを室温で接触させて
シリカゲルを再生したほかは実施例１と同様にし
て行つたところ、純補酵素Q₁₀含有区分として
250mlが得られ、これから溶剤を除去して1.6ｇの
純補酵素Q₁₀を得た。これは粗結晶中の補酵素
Q₁₀の約40％に相当する。

実施例２ (1) 粗補酵素Q₁₀の調製法イソデカレノールと２，３−ジメトキシ−５
−メチルハイドロキノンとを反応させて得られ
た補酵素Q₁₀を含む反応液50ｇに抽出剤として
アセトニトリル2500mlを添加し、30℃で10分間
抽出を行つて抽出液を得、この抽出液を濾別し
た。この操作を５回行い、得られた抽出液を合
わせて減圧濃縮し、乾固して固形物を得た。こ
の固形物にメチルエチルケトン200mlを加え20
℃にて撹拌溶解して濾過し、この濾液を−10℃
のデイープフリーザーに入れ２時間放置し、液
が−10℃になつたことを確認した後、純度99.4
％の粉末補酵素Q₁₀0.5mgを添加し、さらに５日
間放置して結晶を析出させた。析出した結晶を
濾別し、これを真空乾燥したところ、補酵素
Q₁₀を含む粗結晶（純度73.7％）20ｇを得た。

(2) 補酵素Q₁₀の精製径26mm、長さ300mmのカラム容器にｎ−ヘプ
タンに懸濁させたシリカゲル（商品名アート
（Art） 7734、メルク社製）を50ｇ充填し、
ｎ−ヘプタンに溶解した前記の粗結晶５ｇをカ
ラム上部にチヤージ吸着させた後酢酸エチル含
有率5vol％の酢酸エチルとｎ−ヘプタンとの混
合液を流速180ml／hrで流下したところ、流下
開始から約２時間後に補酵素Q₁₀を含む流出液
がカラムから流出しはじめた。純補酵素Q₁₀含
有区分として400mlを分取し、これから溶剤を
除去して3.25ｇの純補酵素Q₁₀を得た。これは
粗結晶中の補酵素Q₁₀の約89％に相当する。

前記(2)の操作を行つたのち、このシリカゲル
カラムに酢酸エチルを300ml流して洗浄し不純
物を取り除いた後、カラムを外部から加熱して
75℃に保ちながらｎ−ヘプタンを600ml流し、
カラムの再生を行つた。

再生されたシリカゲルが充填されているカラ
ムにｎ−ヘプタンに溶解した前記(1)の粗結晶５
ｇをカラム上部にチヤージし吸着させた後、酢
酸エチル含有率5vol％の酢酸エチルとｎ−ヘプ
タンとの混合液を流速180ml／hrで流下させた。

純補酵素Q₁₀含有区分として400mlを分取し、
これから溶剤を除去して3.10ｇの純補酵素Q₁₀
を得た。これは粗結晶中の補酵素Q₁₀の約85％
に相当する。

比較例２シリカゲルとｎ−ヘプタンを室温で接触させて
シリカゲルを再生したほかは実施例２と同様にし
ておこなつたところ、純補酵素Q₁₀含有区分とし
て300mlを分取し、これから溶剤を除去して、2.5
ｇの純補酵素Q₁₀を得た。これは粗結晶中の補酵
素Q₁₀の約68％に相当する。

Claims

【特許請求の範囲】

１シリカゲルを吸着剤としたカラムクロマトグ
ラフイで補酵素Ｑをシリカゲルに吸着、溶出用有
機溶剤により溶出させることにより補酵素Ｑを精
製し、次いで溶出用有機溶剤よりも極性の高い洗
浄用有機溶剤でシリカゲルを洗浄したのち、シリ
カゲルに無極性溶剤を接触させるカラム中のシリ
カゲルの再生法において、40℃乃至沸点以下の温
度の無極性溶剤を用いることを特徴とするシリカ
ゲルの再生方法。