JPH0253495A - 組換え型鳥類プロラクチン又は組換え型鳥類プレプロラクチン，組換え型ニワトリプロラクチン，組換え型ニワトリプロラクチン構造遺伝子，組換え型ニワトリプレプロラクチン，組換え型ニワトリプレプロラクチン構造遺伝子，組換えプラスミド，組換えプラスミドを含む微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、鳥類プロラクチンに関するものであり、特に
、組換え型ニワトリプロラクチン、組換え型ニワトリプ
ロラクチン構造遺伝子、組換え型ニワトリプレプロラク
チン、組換え型ニワトリプレプロラクチン構造遺伝子、
組換えプラスミド、組換え型ニワトリプロラクチン及び
組換え型ニワトリプレプロラクチンの製造法に関するも
のである。

［従来の技術］ プロラクチンは、下垂体好酸性細胞で産生されるホルモ
ンであり、成長ホルモンと胎盤性ラクトゲンの近縁のペ
プチドで、共通の先祖ペプチドより派生したと考えられ
ている。

ホ乳類のプロラクチンは脳下垂体前葉において生産され
るが、それらの活性ならびに構造は既に知られている。

例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ等は既に報告されて
おり、最近では魚類であるサケプロラクチンの単離及び
構造がカワウチ（］１にａｗａｕｃｈｉ）らによってジ
ェネラル・アンド・コンパラティブ・エンドクリノロシ
イ（Ｇｅｎ、Ｃｏｍｐ、Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌ、４９，４
４６−４５８．１９１３３）やアーク・バイオケミスト
リー・アンド・バイオフィジックス（＾ｒｃｈ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ、２４４　（２）　、５
２８−５４１．１９８６）に報告されており、同じくカ
ワウチ（Ｈ，Ｋａｗａｕｃｈｉ）らによって、コイプロ
ラクチンの構造（Ｇｅｎ、Ｃｏｍｐ、Ｅｎｄ。

ｃｒｉｎｏｌ、、６６．２８０−２９０．１９８７）が
報告されている。

また、鳥類におけるプロラクチンの作用は多様であるこ
とが知られている。クロップ・ミルクの形成、巣造り、
抱卵等のいわゆる母性行動の維持、あるいは渡り鳥では
、夜の浮動、いらだち、皮下脂肪の増加（渡りの準備）
等への作用、掌なわち生殖あるいはそれに関する行動に
及ぶ広い生理作用か知られている。

現在１，１類のプロラクチンは鳥類における母性行動の
話起等の作用が考えられるので、特にニワトリフロラク
ヂンでは、養鶏分野ての応用が期待されている。

［発明が解決しようとする課題］ しかし、鳥類プロラクチンについでは、ホルモンタンパ
ク質が単離されたという報告はあるものの（Ｓｃａｎｓ
、Ｃ，Ｇ　らＧｅｎ、Ｃｏｍｐ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ
、　２７３７１３７９．１９７５）その後の報告はなく
、ホルモンタンパク質及び遺伝子の構造は解析されてい
ない現状であった。

さらに、天然のニワトリプロラクチンはニヮトり脳下垂
体に極微量に含まれているに過ぎず、その構造解析もさ
れいないのが現状である。それ故、その供給は大量の脳
下垂体が必要となり限界がある。

そこで上記の諸問題を鑑み、本発明者らは、遺伝子組換
え技術を利用したニワトリプロラクチンの構造解析し、
将来の大量供給を目的として木発明に至った。

さらに付言すると、本発明によって、ニワトリプロラク
チン構造遺伝子をクローニングして、塩基配列を決定す
るだけでなく、ニワトリプロラクチンのアミノ酸配列が
解明され、ニワトリプロラクチンを大腸菌等の微生物に
よって生産し、単ＨＥ可能になり、多様な生理作用を持
つニワトリプロラクチンのさらに詳しい生理作用の研究
に役立つとともに、その応用範囲の広がることも予想さ
れる。

即ち、鳥類プロラクチン遺伝子に関して、本発明者らが
ニワトリプレプロラクチン遺伝子を単離し構造を決定し
、ニワトリプロラクチンの構造についてもこれを解明し
たものである。

［課題を解決するための手段］ 本発明の第１の発明に係る組換え型鳥類プロラクチン又
は組換え型鳥類プレプロラクチンは、鳥類下垂体より分
（必されるｍＲＮＡ由来のものである。

第２の発明に係る組換え型ニワトリプロラクチンは下記
のアミノ酸配列の全部又は一部を有するものである。

Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｇ
ｌｙ−５ｅｒ−Ｖａｌ−八５ｎ−（：ｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖ
ａｌ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈ
ｅ−へｓｐ−へｒｇ−ＡｌａＶａ　１−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ
−５ｅｒ−Ｈｉ　５−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｈｉ　ｓ−’ｌ
’ｙｒ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−ｆｌｅ−Ｐ
ｈｅ−＾５ｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−八５ｐ−Ｇ　ｌｕ−へ
ｒｇ−Ｔｙｒへ１ａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−八ｒｇ−Ｇｌｙ
−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−八１ａ−ＶａｔＡ
ｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−５ｅ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ
−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−へ１ａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−
１１ｅ−旧５−１１ｉｓ−Ｇｌｕ−八５ｐ−Ｌｅｕ−１
，ｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇ　ｌｙ−
Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａ
ｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｈ１ｓ−Ｌｅｕ−八１
ａＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−＾ｒｇ−４１ｅ−
Ｌｙｓ−Ｇ　ｌｕ−八１ａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−
１１ｅ−Ｌｃｕ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−八１ａ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｕ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｓｎ−Ｌ
ｙｓ　−Ａ　ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　Ｉ
ｙ−Ｍｅｔ−Ｇ　１ｕ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｖａ　Ｉ−Ｇ
　ｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａ　ｌ−ｔｌ　１ｓ−５ｅｒ−Ｇ　
１ｙ−ｔｌ　１ｓ−Ａ　１ａ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｓｎ−Ｇ
　ｌｕ−１１ｅ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｈ１ｓ−５ｅｒ−Ａ
　５ｐ−Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ−Ｐ　ｒｏ−５ｅｒ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ＡＩａ−＾５ｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−
５ｅｒ−八ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−八ＩａへＰｈｅ−Ｔ
ｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−１１
ｉｓ−Ａｒｇ−へｒｇ−へ５ｐ−５ａｒ−１（ｉｓ−Ｌ
ｙｓ−１１ｅ−へｓｐ−へ５ｎ−Ｔｙｒ−１，ｅｕ−Ｌ
ｙｓＶａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−＾ｒｇ−Ｌｅｕ
−１１ｅ−Ｈｉｓ−八５ｐ−５ｅｒ−八ｓｎ−ｙｓ 第５ｐ発明に係る組換え型ニワトリプロラクチン構造遺
伝子は、第２の発明のアミノ酸配列をコードするもので
ある。

第４の発明に係る組換え型ニワトリプレプロラクチンは
、下記のアミノ酸配列の全部又は一部を有するものであ
る。

Ｍｅｔ−５ｅｒ−八５ｎ Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ （：ｙｓ−Ｐｒｏ−１１ｅ Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ Ｓｅｒ−１１＋５−Ｔｙｒ Ｐｈｅ−八ｓｎ−Ｇｌｕ Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ １１ｉｓ−Ｔｈｒ−５ｅｒ Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ａｌａ Ｌｅｕ−八５ｎ−Ｌｅｕ へｓｎ−へ５ｐ−Ｐｒ。

Ｇｉｎ−Ａｒｇ−１ｉｅ 八ｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌａｕ Ｉｌｅ Ｐｈｅ １ｅ Ｓｅｒ Ｇｉｎ Ｖａ Ｌａｕ Ｌｙｓ Ｇｒｙ−八１ａ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−５ｅｒ−八５ｎ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ
−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−５ｅｒ−Ｖａｌ−八ｓｎ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｎ−Ｖａｌ−５ｅｒＰｈｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−八Ｉ
ａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−１（ｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅ
ｕ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−１１ａ−八５ｐ−Ｇ　ｌ
ｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−八Ｉａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ
−Ｌｙｓ−へ１ａ−Ｖａｌ−八５ｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−八５ｐ−Ｌ
ｙｓＧｌｎ−１１ｅ−１１ｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓ
ｐ−ＬｅｕＶａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−
５ｅｒ−Ｔｒｐ１１ｅ−Ｈｉｓ−Ｌｃｕ−八１ａ−５ｅ
ｒ−Ｇｌｕ−ＶａｌＧｌｕ−八１ａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−
１’ｈｒ−１１ｅ−Ｌｅｕ−八ｒｇ−Ｖａｔ−ｔｌｉｓ
−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−へ１ａ−Ｇｌｙ−八５ｎ−
Ｇ　１ｕ−１１ｅＴｙｒ−５ｅｒ−１１ｉｓ−５ｅｒ−
八５ｐ−Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｌａｕ−
Ｇ　Ｉｎ−Ｌｅｕ−へ１ａ−八５ｐ−Ｇｌｕ−八ｓｐ−
５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｌ＋ｅ−八Ｉａ−ＰｈａＴ
ｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌａｕ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉ
ｓ−Ａｒｇ−八ｒｇ−Ａｓｐ−５ｅｒＨ１ｓ−Ｌｙｓ−
１１ｅ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌａｕ−Ｌｙｓ−Ｖ
ａ　ｌ　−Ｌｅｕ−ＬｙｓＣｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１
１ｅ−旧５−Ａ５ｐ−５ｅｒ−Ａｓｎ−（：ｙｓ第５の
発明に係る組換え型ニワトリプレプロラクチン構造遺伝
子は、第４の発明のアミノ酸配列をコードするものであ
る。

第６の発明に係る組換えプラスミドは、第２の発明のア
ミノ酸配列の全部又は一部をコードする組換え型ニワト
リプロラクチン構造遺伝子を含有するものである。

第７の発明に係る組換えプラスミドは、第４の発明のア
ミノ酸配列の全部又は一部をコードする組換え型ニワト
リプレプロラクチン構造遺伝子を含有するものである。

第８の発明に係る微生物は第６又は第７の発明に記載の
組換えプラスミドを含むものである。

第９の発明に係る組換え型鳥類プロラクチン及び組換え
型鳥類プレプロラクチンの製造法は、第１の発明に記載
の組換え型鳥類プロラクチン又は組換え型鳥類プレプロ
ラクチンをコードする遺伝子を組み込んだ組換えプラス
ミドを含有する微生物を培養基中にて培養し、該培養基
中に蓄積された請求項１の組換え型鳥類プロラクチン又
は組換え型鳥類プレプロラクチンを分離精製するもので
ある。

木発明をさらに詳しく説明すると、ニワトリから摘出し
た脳下垂体組織をグアニジウムヂオシアネート溶液中で
破砕し、遠心分離によりＲＮＡ分画を集め、得られたＲ
ＮＡ分画をオリゴｄ　（Ｔ）カラムに通して・ポリ（Ａ
）末端を有するポリ（八）”ＲＮＡ（メツセンジャーＲ
ＮＡ）を濃縮した。

濃縮したポリ（八）′″ＲＮＡをプラスミドｐｓＩ４０
０１のアンピシリン耐性遺伝子と７７個のｄ　（Ｔ）連
鎖を持つ全長２５００塩基対のクローニング用ブライマ
ーと連結させ、逆転写酵素でポリ（Ａ）”ＲＮＡの相補
ＩＱ　Ｄ　Ｎ　Ａを合成してその３°末端にデオキシヌ
クレオヂト末端転移酵素によって２２個のｄ　（Ｃ）連
鎖をつけた。

相補’ｄＲＤ　Ｎ　Ａを含まないクローニングベクター
側の末端を制限酵素Ｉｆ　ｉ　ｎ　ｄ　Ｉｌｌの処理に
よって除き、方で用意した両端にＨｉｎｄｌｌｌＨ接着
末端と２２個のｄ　（Ｇ）連鎖を持ち内部にｌａｃプロ
モーター１個とＳＤ（シャイン・ダルガルノ）配列と翻
訳開始コドンＡＴＧのセットを３フレーム分持つ全長３
９０塩基対のｐｓＩ４００１由来のリンカ−ＤＮＡをこ
の旧ｎｄＩ１１断片に結合させた。それと同時に両端に
位置した２２個づつのｄ　（Ｃ）連鎖とｄ　（Ｇ）連鎖
によってこのポリ（八）”ＲＮ　Ａを含むベクターブラ
イマーとリンカ−からなるＤ　Ｎ　Ａ　Ｉｌｌを環状化
させ、つづいてＲＮａｓｅＨとＤＮＡポリミラーゼ処理
によってリン酸ジエステル結合を形成させてここにニワ
トリプロラクチン構造遺伝子（相補３５１　Ｄ　Ｎ　Ａ
　）を含むＤＮＡ鎮を完全な環状ＤＮＡ構造のプラスミ
ドとして完成した。

本発明者らは、得られたプラスミドを大腸菌Ｄ）１１株
に導入して、３７℃で培養し、アンピシリンを含む寒天
培地上に育成したコロニーに対して、ブタプロラクチン
のｃＤＮＡの制限酵素５ｔｙｔ及びＮ５ｉｌ処理によっ
て得られる２５０及び５３０塩基対のＤＮＡ断片をプロ
ーブとしてコロニーハイブリダイゼイションを行うこと
により複数個の陽性コロニーを得た。

第１図に示されているのは本発明によって初めて明らか
にされたニワトリプロラクチン構造遺伝子の全塩基配列
であり、請求項４で示したアミノ酸配列をコードする領
域を含んでいる。その構造から、Ｎ末端側にシグナルペ
プチド部分と思われるアミノ酸３０残基が存在し、本発
明において初めて鳥類のプロラクチンの構造が解明され
た。

なお、形質転換体として本プラスミドｐｃＰＲＬｌを導
入した大腸菌（ＤＨＩ株）は寄託番号　微工研菌寄第１
０１６３号として、工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託済みである。

さらに付言すると、本発明のニワトリプロラクチン構造
遺伝子及びニワトリプレプロラクチン構造遺伝子は、こ
れを利用することにより、適当な宿主（例えば大腸菌、
枯草菌、酵母等）において、ニワトリプロラクチンある
いはニワトリブロラクヂン様ポリペプチドが生産可能で
あることを意味するものである。すなわち、本発明で得
られた遺伝子を適当な宿主内で調節可能な遺伝子配列（
例えばｔａｃ　、　ｔｒｐ　、λＰＬと呼ばれるプロモ
ーター）を含んだ組換えプラスミドを導入子形質転換す
れば、そのポリペプチドの生産はプロモーターの支配下
におかれ、人為的にその生産を調節することが可能とな
るということである。

［作用］ 本発明におけるプロラクチンポリペプチド及びその話導
体は、鳥類における母性行動の誘起等の作用により、鳥
類の育種、増殖等の分野で広い用途か期待される。鳥類
における母性行動の誘起等の作用が考えられるので、特
にニワトリプロラクチンでは、養鶏分野での応用が期待
されている。

［実施例］ 以下に本発明の具体的な実施例を示す。

実施例１．鶏脳下垂体からの全ポリ（Ａ）”ＲＮＡの単
量ト ニワトリ脳下垂体からポリ（八）”ＲＮ　Ａの単υ■は
、グアニジウムチオシアネート法（重定勝哉、細胞工学
、２，６１６（１９８３）　）に従い下記のごとく調整
した。

ニワトリの凍結脳下垂体６４０ｍｇ　（約１０個体分）
を６Ｍグアニジウムチオシアネート（和光純薬工業社製
（以下「和光」と略記））、５ｍＭクエン酸ナトリウム
、０．５９６ザルコシルナトリウム及び０．ＩＭβ−メ
ルカプトエタノール溶液５ｍｌ中で、ポリトロンホモゲ
ナイザーにて破砕、可溶化した。このホモケネートを１
８Ｇ注射針で数回通し、染色体由来のＤＮＡを分断した
。このものを５．７Ｍセシウムクロライド（和光）　、
　０．１　Ｍ　Ｅ　ＤＴＡ　（ｐｌ＋　８．０）の溶液
上にこの溶液の約２倍量となるように静かに重層し、ベ
ックマン社製　５Ｗ４０Ｔｉ　　ローターで２万９千回
転で１９時間遠心することによりＲＮＡの沈殿を得た。

このＲＮＡを注意深く洗浄し、１０ｍ１Ｊ　　Ｔｒｉｓ
−）ＩＣＩ、　　１　ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａに懸濁し
、エタノール沈殿を３回行った。得られた沈殿を１０ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、　　１ｍＭ　
　ＥＤＴＡ。

０１零　ＳＤＳ熔７夜に懸τ蜀し、最終濃度　０．５Ｍ
になるようにしＩＣ１を加え、９０℃、２分間インキュ
ベートし、オリゴ（ｄＴ）セルロース（コラボレーティ
ブ・リサーチ社製）カラム・クロマトグラフィをかけた
。

吸着したポリ（Ａ）”ＲＮＡを１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−
ＩＩｃＩ　（ｐｌ（７，５）　、　　１　ｍＭ　　Ｅ　
ＤＴＡ及びＯ，Ｉ零　５ＤＳｉ液で溶出した。紫外線（
２６０ｎｍ）の吸収が認められる画分を回収し、ポリ（
＾）”ＲＮ　Ａ　　６９μｇを得た。

実施例２．ｃＤＮＡ合成とベクタープラスミドへの組み
込み： ｃＤＮＡの合成とベクターへの組み込みは、オカヤマバ
ーグ法（モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジ
イ（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、２，１６１（１
９８２）；重定勝哉、細胞工学、２，６１６　（１９８
３）　）に従い下記のごとく行った。

プラスミドｐｓＩ４００１　　（に、Ｉｚｕｉら、ヌク
レイツク・アシド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　八ｃｉ
ｄｓ　Ｒｅｓ、）、１４．１６１５（１９８６））　　
４００μｇを制限酵素Ｋｐ口■　にツボンジーン社製、
以下制限酵素は全てニラポンジーン社製のものを使用し
た。）で、３７℃で５時間反応させ、完全に消化した。

フェノールクロロホルム処理後、エタノール沈殿を行い
ＤＮＡを回収した。にｐｎｌで消化したこのＤＮＡを次
にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラー
ゼ（ＴｄＴ、ファルマシア社製）の反応を利用して、に
ｐｎｌ切断部位の３°末端にポリｄ（Ｔ）ｇＵを約６０
個付加した。フェノールクロロホルム処理、エタノール
沈殿後ＤＮＡを回収し、次に制限酵素Ｂａｍ１ｌｌで消
化を行い得られた　２．８　ＫｂｐのＤＮＡ断片を低融
点アガロースゲルで分離後回収した。

回収したＤＮＡは、次にオリゴｄ（Ａ）セルロースカラ
ムクロマトグラフィ（コラボレーティブ・リサーチ社製
）を行い、ポリｄＤＨ；Ｕが充分付加されたＤＮＡ断片
（以下ベクターブライマーと呼ぶ）を得た。

リンカ−ＤＮＡの調整は以下のごとく行った。

ｐｓＩ４００１　、１００μｇを制限酵素Ｐｓｔｌで完
全に消化し、ゲノールクロロホルムＩＡ理、エタノール
沈殿を行い、該ＤＮＡのＰｓｔｌ切断部位の３°末端に
ポリｄ　（Ｇ）をＴｄＴを用いて約１５個付加した。フ
ェノールクロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、回
収したＤＮＡを制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩで完全に
消化し、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い２
８０塩基のポリｄ（Ｇｌ付ＤＮＡ断片を分離、回収した
。以下このＤＮＡ断片はリンカ−ＤＮＡと呼ぶ。

実施例１で調整したポリ（八）’ＲＮＡ約５μｇとベク
タープライマー　１．５μｇとを混合し、１０単位の逆
転写酵素（和光）を加えて、３７℃、４０分反応させた
。反応物をフェノールクロロポルム処理、エタノール沈
殿操作を２回繰返した後、ＴｄＴを３７℃、２０分反応
させて、ｄ（Ｃ）鎖を約１５個付加した。該反応物を再
びフェノール処理、エタノール沈殿を行いＤＮＡを回収
して、制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩて完全消化を行い
、再ひフェノール処理、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡ
を回収した。該ＤＮＡの１０分の１景を取り、上記のご
とく調整したリンカ−Ｄ　Ｎ　Ａ　１２ｎｇを加えて１
晩犬Ｉ１Ｍ菌由来のＤＮＡリガーゼ（ファルマシア社製
）を加えて環状化した。

該反応物に大腸菌ＤＮＡリガーゼを追加し、さらにリボ
ヌクレアーゼＨ（ファルマシア社製）、ＤＮＡポリメラ
ーゼ■　にッポンジーン社裂）を加えて、１２℃、２５
℃で各々１時間インキュベ−１・し、ここに二重鎖Ｄ　
Ｎ　Ａの完全な組合せプラスミドを作成した。

実施例３．ニワトリブロラクヂンｃＤＮＡ組換えプラス
ミドの選択とｃＤＮＡ部分の塩基配列上記のごとく得ら
れた組換えプラスミドを大腸菌ＤＨＩ株に、ハナハン（
Ｈａｎａｈａｎ　）の方法（ＤＮ　Ａ　ｃｌｏｎｉｎｇ
、ｖｏｌ、ｌ、ｐ１０９．　ＩＰＬ　ＰＲＥＳＳ、１９
８５　）に従い形質転換し、アンピシリン耐性を示す約
１万個のコロニーをワットマン５４１ペーパー（ワット
マン社製）に固定した。そして、ブタプロラクチンｃＤ
ＮＡを制限酵素ｓｔｙ　！及びＮ５ｉｌ処理によって得
られる　２５０及び５３０塩基よりなるＤＮＡ断片をニ
ック・トランスレーションによって３２ｐで標識し、こ
れをプローブとして、５０９６ホルムアミド、４２℃の
条件でコロニーパイプリダイゼイションを行った所、８
個の陽性コロニーが得られた。

これらのコロニーより組換えプラスミドを抽出し制限酵
素による分析を行った所、その全てに付いて、同じよう
な結果が得られた。その結果を第２図に示す。そしてほ
ぼ完全長のｃＤＮＡ部分の長さと推定されたクローンで
あったｐｃＰＲＬｌにつき、ジオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ
ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミイ
・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、）、ＵＳＡ、７４．５４５３（１９７７）　）
に従いニワトリプロラクチンの塩基配列の決定を行った
。第１図にｃＤＮＡ部分の塩基配列とアミノ酸配列を示
す。また、表ＩＡ〜Ｇには組換えプラスミドｐｃＰｎＬ
＋の全塩基配列を示す。尚、表中の塩基番号３９０から
１３５５が第１図で示した部分である。

［発明の効果コ 本発明は以上説明したとおり、本発明によって初めて解
明されたニワトリプロラクチンのアミノ酸配列をもとに
して、その全部または一部のアミノ酸配列をコードする
デオキシリボヌクレオヂド連鎖を含む種々の発現ベクタ
ーを構築し、それぞれを適切な形質転換体として大腸菌
、枯草菌、光合成細菌、酵母または動物細胞等に導入し
てのち培養することにより各種の形質転換体より組換え
型ニワトリプロラクチンを容易にしかも大量に得ること
が出来るという効果がある。

表ＩＡ

【図面の簡単な説明】

第、１図はニワトリプロラクチンを含む相補６１　ＤＮ
Ａ部分の全塩基配列とその配列から明らかとなったアミ
ノ酸配列図、第２図はニワトリプロラクチン相補９５　
Ｄ　Ｎ　Ａを含む部分の制限酵素切断地図である。 代理人　弁理士　佐　藤　正　年 ＣＴＡＧＴＣＡＧＴ丁　ＧＡＣＧＧＴＴＣＡＡ　　ＡＧ
ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴ　　ＡＧＣＣＣ
ＧＴＣＡＡ表 一ハー１リハしｌ目　Ｇも１八八らＩＡも１　八りにＭ
；八ＡらＡ八　にＡＡＣＧＡＡＡＣＧ　　ＧＴＧＡＡＡ
ＡＧＴＧ表 ８しＡし匂ＩＬ＋ｌ−五１（ＪもらもＧらＩＡ八（ｌし
ももらＵ１’ＧＧＣＧＡＣＧＣＧＧＡＡＴ　　ＡＧＧＣ
ＣＡＴＴＧＡ表 １、＋ＬＪｆＭ；ＡＭ；Ｕ　　Ｇ（ＸＩＡＵＡ（ｉにに
　　Ｕ（、’もし６丁（ＧもＴ　　ＡＣＴＧＧＧＴＣＡ
Ｇ　　ＴＧＣＡＴＣＧＣＴＡ表 １゜ １−１１（１１ａｌ−１，、シｌＬ−Ｌ−Ｌ、ＬｊＡＡ
ＩＬＪＬｊｌ’Ａ　　ｌｊハ１−（−１ａｕ（ｘら１し
　八しｌｊＡに（ｉＴＴＡＣＴＡＴＧＧＣＧＣｒＣ表 ＧＡＧＴＴＣＣｒＡＧ　　ＡＡＴＧＧＣＧＡＣＡ　　Ａ
ＣＴに’１“Ａらも１’に　　ＡＡもしＩＡＬ＾１１　
１ａ（＃ＩＬｓＡＬｉＬ、＾し拍　４Ｖ　　Ｅ５　　韮
　目Δ　軒占 定曝　足Ｃ？α　？メ　８責　６己 表 ＡＧＴＧＣＴＣＣＧＧ　ＧＡＡＡＧＣＡＧＡＡ　　ＧＴ
Ｔ（、Ｔ＾Δ〒５ 図 ｖｕＩＩ ＥｃｏＲ１ −Ｓｓｐ　１ Ｘｂａ ＰｖｕＩＩ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）鳥類下垂体より分泌されるｍＲＮＡ由来の組換え
   型鳥類プロラクチン又は組換え型鳥類プレプロラクチン
   。 （２）下記のアミノ酸配列の全部又は一部を有するポリ
   ペプチドである組換え型ニワトリプロラクチン。 【遺伝子配列があります】 （３）請求項２のアミノ酸配列をコードする組換え型ニ
   ワトリプロラクチン構造遺伝子。（４）下記のアミノ酸
   配列の全部又は一部を有するポリペプチドである組換え
   型ニワトリプレプロラクチン。 【遺伝子配列があります】 （５）請求項４のアミノ酸配列をコードする組換え型ニ
   ワトリプレプロラクチン構造遺伝子。 （６）請求項２のアミノ酸配列の全部又は一部をコード
   する組換え型ニワトリプロラクチン構造遺伝子を含有す
   る組換えプラスミド。 （７）請求項４のアミノ酸配列の全部又は一部をコード
   する組換え型ニワトリプレプロラクチン構造遺伝子を含
   有する組換えプラスミド。 （８）請求項６又は７に記載の組換えプラスミドを含む
   微生物。 （９）前記微生物が大腸菌（Ｅｓｃｈａｒｉｃｉａ　ｃ
   ｏｌｉ）に属することを特徴とする請求項８に記載の組
   換えプラスミドを含む微生物。 （１０）請求項１に記載の組換え型鳥類プロラクチン又
   は組換え型鳥類プレプロラクチンをコードする遺伝子を
   組み込んだ組換えプラスミドを含有する微生物を培養基
   中にて培養し、該培養基中に蓄積された請求項１の組換
   え型鳥類プロラクチン又は組換え型鳥類プレプロラクチ
   ンを分離精製することを特徴とする組換え型鳥類プロラ
   クチン及び組換え型鳥類プレプロラクチンの製造法。