JPH025395B2 - - Google Patents
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- JPH025395B2 JPH025395B2 JP61166710A JP16671086A JPH025395B2 JP H025395 B2 JPH025395 B2 JP H025395B2 JP 61166710 A JP61166710 A JP 61166710A JP 16671086 A JP16671086 A JP 16671086A JP H025395 B2 JPH025395 B2 JP H025395B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は新規な主としてヒト顆粒球系細胞のコ
ロニー形成をさせるために必要な、特異的な刺激
因子、すなわちコロニー刺激因子（以下「CSF」
と略記する）活性を有する糖蛋白質、及びその製
造方法に関する。 〔従来の技術〕 ２層軟寒天培養法で、上層に標的細胞として骨
髄細胞を、下層に腎細胞や胎児細胞を入れて培養
すると、上層の細胞の一部が増殖分化し、好中球
系顆粒球（以下「顆粒球（granulocyte）」と称
す）や単球マクロフアージからなるコロニーが形
成されることから、生体内にコロニー形成を促進
する因子が存在することが知られていた
（PluznikとSach；J.Cell.Comp.Physiol、66巻
319頁（1965）、BradleyとMetcalf；Aust.J.Exp.
Biol.Med.Sci.44巻287頁（1966））。 CSFと総称されるこの因子は、正常に広く生体
内分布する細胞、たとえば、Ｔ細胞、単球マクロ
フアージ、繊維芽細胞、内皮細胞などより産生さ
れることが知られている。CSFには顆粒球・単球
マクロフアージの幹細胞に作用して、その増殖を
刺激し分化を誘導して、軟寒天中で顆粒球や単球
マクロフアージから成るコロニーを形成させる作
用をもつ顆粒球−単球マクロフアージCSF（GM
−CSFと略記する）、主として単球マクロフアー
ジのコロニーを形成させる作用をもつ単球マクロ
フアージCSF（Ｍ−CSFと略記する）より未分化
な多能性幹細胞に作用する多能性CSF（multi−
CSFと略記する）、あるいは本発明の如き、主と
して顆粒球形コロニーを形成させる作用をもつ顆
粒球CSF（Ｇ−CSFと略記する）などのサブクラ
スが存在し、それぞれのサブクラスによつて標的
細胞の分化段階も異なることが考えられる様にな
つてきた［Asano；代謝−Metabolism and
Disease、22巻 249頁（1985）、Yunis等；
“Growth and Maturation Factors”edited by
Guroff、John Wiley ＆ Sons、NY、１巻、
209頁（1983）］。 従つて個々のサブクラスを精製し、その化学的
性状や生物学的性状をより詳細に調べることは構
血機構や種々の血液学的疾患の病態の解析にきわ
めて重要なことである。 中でもＧ−CSFの生物学的作用として、骨髄性
白血病細胞の分化誘導と成熟顆粒球の機能亢進が
注目されており、特に白血病の治療と予防へのＧ
−CSFの臨床的有用性が大いに期待されてきた。 〔発明が解決しようとする問題点〕 Ｇ−CSFの単離精製のために従来行われてきた
試みは、細胞倍養法を用いてその培養上清からＧ
−CSFを単離する方法であるが、Ｇ−CSFが低濃
度しか産生されないこと、大量の倍養液から微量
のＧ−CSFを得るには複雑な精製過程を必要とす
るなどの難点をかかえ未だ大量の均一なＧ−CSF
を得るには至つていなかつた。従つて、組換え
DNA技術を用いてＧ−CSFを大量に製造するこ
とが渇望されていた。 〔問題点を解決するための手段〕 かかる状況において、本発明者らはヒトＧ−
CSF活性を有するポリペプチドをコードする遺伝
子を単離し、当該遺伝子を宿主細胞内で発現する
ことに成功した。 本発明は図３Ｂ，又は図４Ｂ，に示された
アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する
cDNA断片を含む組換えベクターで形質転換され
た哺乳動物細胞を培養し、次いで産生されたヒト
顆粒球コロニー刺激因子活性を有する糖蛋白質を
分解することを特徴とするヒト顆粒球コロニー刺
激因子活性を有する糖蛋白質の製造方法を提供す
るものである。 以下、本発明を詳細に説明する。 本発明で用いられるヒトＧ−CSF活性を有する
ポリペプチドをコードする遺伝子としては、シヨ
糖密度勾配遠心法により15〜17S画分として得ら
れる、ヒトＧ−CSF活性を有するポリペプチドを
コードするメツセンジヤーRNA（mRNA）に相
補的なDNA（cDNA）がある。 本出願人は２系列のこのようなcDNAを得た。
そのうちの１つの系列のcDNAは図３Ｂのポリペ
プチド又はをコードする遺伝子あるいはその
一部を有するものであり、さらに詳細には図３Ａ
の塩基配列の5′−末端から32〜34ヌクレオチド位
のATGから650〜652ヌクレオチド位のCCCまで
の配列、122〜124位のACCから650〜652位の
CCCまでの配列または図３Ａに記載された配列
あるいはその一部を有するものである。 この系列のcDNAをcDNA（＋VSE）と称す
る。 他の系列のcDNAは図４Ｂのポリペプチド又
はをコードする遺伝子あるいはその一部を有す
るものであり、さらに詳細には図４Ａの塩基配列
の5′−末端から31〜33ヌクレオチド位のATGか
ら640〜642ヌクレオチド位のCCCまでの配列、
121〜123位のACCから640〜642位のCCCまでの
配列または図４Ａに記載された配列あるいはその
一部を有するものである。 この系列のcDNAをcDNA（−VSE）と称す
る。 上記の遺伝子は、例えばＧ−CSF活性を有する
ポリペプチドを産生する能力を有する哺乳動物細
胞等からＧ−CSFをコードするmRNAを調製し
た後、既知の方法により２本鎖cDNAに変換し、
このDNAを含む組換体の集合（以下cDNAライ
ブラリーと称する）から既知の方法によりスクリ
ーニングすることによつて得られる。 一方、前記mRNAの供給源となる哺乳動物細
胞は本発明においては、ヒト口腔底癌由来の細胞
株CHU−２（collection Nationale De Cultur
es De Microorganismes（C.N.C.M）寄託番号Ｉ
−483）であるが、腫瘍細胞株にかぎらず、哺乳
動物から分離できる細胞、あるいは樹立した他の
細胞株でもよい。 又、mRNAの調製はすでに他のいくつかの生
理活性タンパクの遺伝子をクローン化する際、用
いられた方法、例えば、バナジウム複合体等を用
いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面
活性剤処理、フエノール処理を行う（Bergerと
Birk enmeier；Biochemistry18巻5143頁
（1979）を参照）か、グアニジンチオシアナート
処理後、CsCl密度勾配遠心を行う（Chirgwin
等；Biochemistry18巻5294頁（1979）を参照）
ことによつて、全RNAを得た後、オリゴ（dT）
−セルロースやセフアロース2Bを担体とするポ
リＵ−セフアロース等を用いたアフイニテイーカ
ラム法あるいはバツチ法によりポリ（A+）RNA
（mRNA）を得ることができる。またシヨ糖密度
勾配遠心法等によりポリ（A+）RNAを更に分画
することもできる。 上記の如くして得られたmRNAが、Ｇ−CSF
活性をもつポリペプチドをコードするものである
ことを確認するためには、mRNAをタンパク質
に翻訳させ、生理活性を調べるか、抗Ｇ−CSF抗
体を用いてそのタンパクを同定する等の方法を行
えばよい。例えば、アフリカツメガエル（Xeno
pus laevis）の卵母細胞にmRNAを注入して翻
訳させたり（Gurdon等；Nature、233巻177頁
（1972）を参照）、あるいはウサギ網状赤血球
（Reti culocyte）系や小麦胚芽（Wheat germ）
系を利用した翻訳反応が行われている（Schleif
とWensin ｋ；“Practical Methods in
Molecular Biology”、Springer−Verlag、NY、
（1981））。 Ｇ−CSF活性の検定は骨髄細胞を用いた軟寒天
培養法を適用して実施できる。それらの手法につ
いては総説がある（Metcalf；“Hemopoietic
Colonies”、Springer−Verlag、Berlin、
Heideiberg、NY（1977））。 前述の如き方法で得たmRNAを鋳型にして１
本鎖cDNAを合成した後、この１本鎖cDNAから
２本鎖cDNAを合成し、適当なベクターDNAと
の組換えプラスミドを作成する。これで大腸菌
（Escherichia coli）などを形質転換して、形質
転換株のDNA群（cDNAライブラリー）を得る。 mRNAから２本鎖cDNAを得るには、例えば
mRNAの3′−末端にあるポリＡ−鎖に相補的な
オリゴ（dT）をプライマーとして逆転写酵素で
処理するか、またはＧ−CSFタンパクのアミノ酸
配列の一部に相応するオリゴヌクレオチドを合成
し、これをプライマーとして逆転写酵素で処理し
てmRNAに相補的なcDNAを合成する。２本鎖
cDNAは、アルカリ処理でmRNAを分解・除去
した後、得られた１本鎖cDNAを逆転写酵素又は
DNAポリメラーゼ（例えばKlenow断片等）
処理後SIヌクレアーゼ等で処理して得るか、ある
いは、直接RNase ＨおよびDNAポリメラーゼ
（例えば、大腸菌のDNAポリメラーゼ等）等で
処理することによつても得ることができる（例え
ば、Naniatis等；Molecular cloning、Cold、
Spring Harborlaboratory（1982）およびGubler
とHoffman；Gene25巻263頁（1983）を参照）。 このようにして得られた２本鎖cDNAを適当な
ベクター、例えば、pSC101、pDF41、ColE1、
pMB9、pBR322、pBR327、pACYC1などに代
表されるEK型プラスミドベクターや、λgt.λc、
λgt10、λgtWESなどに代表されるフアージベク
ターなどに組み込んだ後、大腸菌（X1776；
HB101；DH1、C600株など）等を形質転換して
cDNAライブラリーを得ることができる（例え
ば、前出“Molecular cloning”を参照）。 ２本鎖cDNAをベクターと連結させるには、
DNA末端に連結可能な末端をつけるべく、適当
な化学合成DNA断片を付加し、予め制限酵素を
用いて開裂させたベクターDNAとATP存在下に
T4フアージDNAリガーゼで処理することにより
行うことができる。あるいは、予め制限酵素を用
いて開裂させたベクターDNAと２本鎖cDNAの
それぞれにdG、dC−鎖（あるいはdA、dT−鎖）
を付加した後、例えば両DNAを含む溶液を徐冷
することによつても行うことができる（前記
Molecular cloningを参照）。 こうして得られた組換えDNA体による宿主細
胞の形質転換は、例えば宿主細胞が大腸菌の場合
Hanahanが詳細に記述している如き方法（J.
Mol.Biol.；166巻557頁（1983））、すなわち、
CaCl2やMgCl2又はRbClを共存させて調製したコ
ンピテント細胞に該組換えDNA体を加えること
により実施することができる。 目的とする遺伝子を保有する細胞を検索するに
は、インターフエロンcDNAのクローン化で用い
られたプラス−マイナス法（Taniguchi等；
Proc.Jpn.Acad.55巻Ser.B、464頁（1979））や、
ハイブリダイゼーシヨン−トランスレーシヨンア
ツセイ法（Nagata等；Nature284巻316頁
（1980））など、又は該タンパク質のアミノ酸配列
をもとにして化学合成したオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いたコロニーあるいはプラークハイブ
リダイゼーシヨン法（Wallace等；Nucleic
Acids Res.９巻879頁（1981）およびBentonと
Davise：Science196巻180頁（1977）などを用い
ればよい。 このようにしてクローン化されたヒトＧ−CSF
活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を
含む断片は適当なベクターDNAに再び組み込む
ことにより、他の原核生物または真核生物の宿主
細胞を形質転換させることができる。更にこれら
のベクターに適当なプロモーター及び形質発現に
係る配列を導入することにより、それぞれの宿主
細胞に於いて遺伝子を発現させることが可能であ
る。 哺乳動物由来の宿主細胞としては、COS細胞、
チヤイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、Ｃ
−127細胞、HeLa細胞などがあげられ、これ等
の細胞を形質転換させるベクターとしては、
pSV2−gpt（MulliganとBerg；Proc.Natl.Acad.
Sci.USA；78巻2072頁（（1981）を参照）等があ
る。これ等のベクターは複製起源、選択マーカ
ー、発現させようとする遺伝子の前に位置するプ
ロモーター、RNAスプライス部位、ポリアデニ
ル化シグナルなどを含んでいる。 哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモータ
ーとしてはレトロウイルス、ポリオーマウイル
ス、アデノウイルス、シミアンウイルス40
（SV40）などのプロモーターを用いればよい。例
えばSV40のプロモーターを使用する場合は、
Mulliganなどの方法（Nature277巻108頁
（1979））に従えば容易に実施することができる。 複製起源としては、SV40、ポリオーマウイル
ス、アデノウイルス、牛パピローマウイルス
（BPV）等の由来のものを用いることができ、選
択マーカーとしては、ホスホトランスフエラーゼ
APH（3′）あるいは（neo）遺伝子、チミジ
ンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチン−
グアニンホスホリボシルトランスフエラーゼ
（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素
（DHFR）遺伝子等を用いることができる。 以上の如き宿主−ベクター系を用いてヒトＧ−
CSF活性を有するポリペプチドを得るには、上記
ベクターの適当な部位に該遺伝子を組み込んだ組
換えDNA体により宿主細胞を形質転換させた後、
得られた形質転換体を培養すればよい。さらに細
胞内または培養液から該ポリペプチドを分離・精
製するには、公知の手段を用いて行うことができ
る。 一般に真核生物の遺伝子はヒトインターフエロ
ン遺伝子等で知られているように、多形現象
（polymorphysm）を示すと考えられ（例えば
Nishi等；J.Biochem.97巻153頁（1985）を参
照）、この多形現象によつて１個またはそれ以上
のアミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配列
の変化はあつてもアミノ酸は全く変わらない場合
もある。 また例えば図３Ｂあるいは図４Ｂのアミノ酸配
列の中の１個またはそれ以上のアミノ酸を欠くか
又は付加されたポリペプチド、あるいは１個また
はそれ以上のアミノ酸が１個またはそれ以上のア
ミノ酸で置換されたポリペプチドでもＧ−CSF活
性を有することがある。例えば、ヒトインターロ
イキン２（IL−２）遺伝子のシステインに相当す
る塩基配列をセリンに相当する塩基配列に変換し
て得られたポリペプチドがインターロイキン２活
性を保持することもすでに公知となつている
（Wang等；Science、224巻1431頁（1984））。そ
れゆえ、それ等天然に存在するかあるいは人工合
成されたポリペプチドがヒトＧ−CSF活性を有す
る限りそれ等のポリペプチドをコードする遺伝子
を含む組換ベクターによつて形質された動物細胞
（形質転換体）を培養して得られた糖蛋白質は全
て本発明に含まれる。 本発明のヒトＧ−CSF活性を有する糖蛋白質を
得るために必要な遺伝子、該遺伝子を有する組換
えベクター及びこれを含有する形質転換体、並び
にこの形質転換体を培養し、取得した目的の糖蛋
白質、夫々についてその製法の概要を説明すると
以下の通りである。 (1) プローブの調製 腫瘍細胞株CHU−２の培養上清から精製し
て得られた均一ヒトCSFタンパクについてＮ末
端よりアミノ酸配列を決定し、さらにブロムシ
アン分解、トリプシン処理などにより断片化し
た後その断片についてもアミノ酸配列を決定し
た［実施例３(i)、(ii)、(iii)］。 そのアミノ酸配列中から図１に示される配列
に対応する３種類のヌクレオチドプローブ(A)、
プローブ（LC）およびプローブ（IWQ）を合
成した（実施例４）。 プローブ(A)は連続した14個のヌクレオチドか
らなる混合型プローブである。プローブ
（IWQ）は、ヒトコレシストキニン遺伝子のク
ローン化で用いられた如き（Takahashi等；
Proc. Natl.Acad.Sci.、USA、82巻1931頁
（1985））デオキシイノシンを使用した30個の連
続したヌクレオチドである。 プローブ（LC）は実施例３(i)に示したアミ
ノ酸配列のＮ末端から32〜39番に相当する部分
を、図３に示した塩基配列を基にして合成した
24個のヌクレオチドからなるプローブである。 ヌクレオチドの化学合成は改良型ホスホトリ
エステル法を固相法に適用して行うことがで
き、Narangのの総説に記述されている
（Tetrahedron39巻３−22頁（1983））。 使用するプローブは、本発明で用いたプロー
ブ以外の位置のアミノ酸配列に基づくものであ
つてもよい。 (2) cDNAライブラリーの構築 CHU−２細胞にグアニジンチオシアナート
溶液を加えてホモジナイズし、CsCl密度勾配
遠心法により全RNAを得る。 この全RNAからオリゴdTセルロースカラム
によりポリ（A+）RNAを選別した後、逆転写
酵素により１本鎖cDNAを合成し、RNase Ｈ
およびE.coliDNAポリメラーゼを用いて、
２本鎖cDNAを得た。得られた２本鎖のcDNA
にdC鎖を付加し、Pst切断部位にdG鎖を付
加したpBR322ベクターとつなぎ合せて、大脹
菌X1776株を形質転換させ、pBR322系cDNA
ライブラリーを構築した（実施例５、６）。 同様にEcoRIリンカーを用いて、２本鎖
cDNAをλgt10ベクターと連結し、λフアージ
系cDNAライブラリーを構築した（実施例７）。 (3) スクリーニング pBR322系cDNAライブラリー由来の組換え
体をワツトマン541濾紙に固定し、 32Pで放射
標識したプローブIWQを用いて、コロニーハ
イブリダイゼーシヨンを行つた結果、１個のク
ローンが選別できた。このクローンを、サザン
ブロツテイング法（Southern；J.Mol.Biol.98
巻503頁（1975））を用いて更に詳細に検討した
ところ、プローブＡともにハイブリダイズし
た。 このクローンの塩基配列をジデオキシ法
（Sanger；Science214巻1205頁（1981））によ
つて決定した。 得られたcDNAインサートの塩基配列を図２
に示す。図２に示される如く、このcDNAイン
サートはプローブIWQおよびプローブＡを含
む308塩基対からなり、実施例３(iii)に示したア
ミノ酸配列を含む83個のアミノ酸をコードする
オープンリーデイングフレームを有しているこ
とがわかつた。 この308塩基対を含むpBR322由来のプラス
ミドを以下pHCS−１と略記する（実施例８）。 pHCS−１から得られる308塩基対を含む
DNA断片をニツクトランスレーシヨン法（前
出、Molecular Cloningを参照）にて放射標識
し、これをプローブとしてλgt10由来のcDNA
ライブラリーをプラークハイブリダイゼーシヨ
ン（BentonとDavis；Science196巻180頁
（1977）によりスクリーニングして５個のクロ
ーンを得、cDNAを含むと思われるクローンに
ついてその塩基配列を前述と同様の方法で決定
した（図３Ａ）。 図３Ａに示される如く、このcDNAインサー
トは１つの大きなオープンリーデイングフレー
ムを有する。 このcDNAによつてコードされるアミノ酸配
列は図３Ａに示された如く演えきできる。 実施例３(i)に示されているＧ−CSFタンパク
のＮ末端アミノ酸配列との比較により、本
cDNAは5′−末端から32〜34ヌクレオチド位の
ATG配列から始まり、119〜121位のGCC配列
で終わる90塩基対によつてコードされるシグナ
ルペプチドおよび122〜124位のACC配列から
始まり650〜652位のCCC配列で終わる531塩基
対によつてコードされる成熟Ｇ−CSFポリペプ
チドに相当する塩基配列を含んでいることがわ
かつた。従つて図３Ｂに示されたアミノ酸配列
のポリペプチドは207個のアミノ酸からなり、
その分子量は22292.67ダルトンと計算された。
同様にアミノ酸配列のポリペプチドは177個
のアミノ酸からなり、その分子量は18986.74ダ
ルトンであつた（実施例９）。 但しタンパク質の開始部位に関しては、32〜
34位あるいは68〜70位のATGも同様に考え得
る。EcoR1切断部位にこのcDNA（＋VSE）を
挿入したPBR322を保持するエシエリヒア・コ
リ（E.coli）X1776株は、工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている（FERM BP
−954）。 図５には、得られた遺伝子の制限酸素切断部
位を示した。 また、このcDNAをpBR327［Soberon等；
Gene９巻287頁（1980）］とEcoR部位で結合
したプラスミドをpBRG4と称する。 このようにして得られたpBRG4を、制限酵
素EcoRで処理して得られる約1500塩基対の
cDNAを含むDNA断片をニツクトランスレー
シヨン法（前出のMolecular cloningを参照）
にて放射標識し、これをプローブとして、再び
λgt10由来のcDNAライブラリーをプラークハ
イブリダイゼーシヨン（前出BentonとDavisの
文献参照）によりスクリーニングした。この
際、同時にλフアージDNAを固定したニトロ
セルロース濾紙を２枚作成しておき、先り述べ
たプローブLCにて同様のプラークハイブリダ
イゼーシヨンを行い、両プローブでポジテイブ
となるフアージを選別した。完全長と思われる
クローンを選別し、ジデオキシ法を用いて
cDNAインサートの塩基配列を決定したところ
図４Ａに示される如くであつた。 このcDNAは一つの大きなオープンリーデイ
ングフレームを有し、コードされるアミノ酸配
列は図４Ａに示された如く演えきできる。 実施例３(i)に示されているＧ−CSFタンパク
のＮ末端アミノ酸配列との比較により、本
cDNAは5′−末端から31〜33ヌクレオチド位の
ATG配列から始まり、118〜120位のGCC配列
で終わる90塩基対によつてコードされるシグナ
ルペプチドおよび121〜123位のACC配列から
始まり640〜642位のCCC配列で終る522塩基対
によつてコードされる成熟Ｇ−CSFポリペプチ
ドに相当する塩基配列を含んでいることがわか
つた。従つて図４Ｂに示されたアミノ酸配列
のポリペプチドは204個のアミノ酸からなり、
その分子量は21977.35ダルトンと計算された。
同様にアミノ酸配列のポリペプチドは、174
個のアミノ酸からなり、その分子量は18671.42
ダルトンであつた（実施例10）。 但しタンパク質の開始部位に関しては、31〜
33位以外に58〜60位あるいは67〜69位のATG
も同様に考え得る。 EcoR切断部位に本cDNA（−VSE）を挿
入したpBR327を保持するエシエリヒア・コリ
（E.coli）X1776株は工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている（FERM BP−955）。 図５には、得られた遺伝子の制限酵素切断部
位を示した。 また、このcDNAをpBR327とEcoR部位
で結合したプラスミドをPBRV2と称する。 (4) 動物細胞用組換えベクターの構築 宿主細胞としてC127細胞、NIH3T3細胞を
使用する場合の組換えベクター（BPV由来）
およびCHO細胞を使用する場合の組換えベク
ター（DHFRを含む）の構築を＋VSE系、−
VSE系cDNAについて各々行つた。ここでは
代表的な例について述べるが詳しくは実施例を
参照されたい。 (A) ＋VSE系組換えベクターの構築 前記(3)で得られたcDNA（＋VSE）断片を
ベクターpdKCRに組み込みpHGA410プラス
ミドとした後（実施例11）（図６）これを
EcoRで部分消化し、末端をブラントエン
ド（blunt end）にする。このDNAにHind
リンカーを付加し、次いでHind処理を
しT4DNAリガーゼ処理した後これで塩化ル
ビジウム法（前出 Molecular Cloning参
照）を用い、E.coli DH株を形質転換し
た。得られたプラスミドをpHGA410(H)と命
名する（図７）。 pHGA410(H)をSalで処理し、次いで末
端をブラントエンド化した後再びHind処
理しHind−Sal断片を回収する。 一方、ウシ乳頭腫ウイルスの形質転換断片
を有するpdBPV−１プラスミドをHind、
Pvuで処理し大きいほうのDNA断片を分
離し、これと先のHind−Sal断片を結合
する。これを用いてE.coli DH株を形質転
換しpHGG4由来のCFS−cDNAを有するプ
ラスミド、pTN−G4を得る（図７）（実施
例12）。 一方、pHGA410プラスミドかpHGA410
(H)プラスミドとpAdD26SVpAプラスミドを
用いてCHO細胞用組換えベクター（＋VSE）
であるpHGG4−dhfrを構築した（図８ａ及
びｂ）（実施例14）。 更にpAdD26SVpAからDHFR遺伝子を含
む約2KbのDNA断片をEcoRおよびBamH
処理により回収し、pHGA410(H)のHind
部位に挿入してpG4DR1とpG4DR2を構築し
た（図８ｃ）（実施例14）。 (B) −VSE系組換えベクターの構築 前記(3)で得られたcDNA（−VSE）断片を
ベクターpdKCRに組み込みpHGV2プラスミ
ドとした後（実施例17）これをEcoRで部
分消化し、末端をブラントエンド（blunt
end）にする。このDNAにHindリンカー
を付加し、次いでHind処理をしT4DNA
リガーゼ処理した後、これで塩化ルビジウム
法（前出Molecular Cloning参照）を用い、
E.coli DH株を形質転換した。得られたプ
ラスミドをpHGV2(H)と命名する（図１０）。 pHGV2(H)をSalで処理し、次いで末端
をブラントエンド化した後再びHind処理
しHind−Sal断片を回収する一方、ウシ
乳頭腫ウイルスの形質転換断片を有する
pdBPV−１プラスミドをHind、Pvuで
処理し大きい方のDNA断片を分離し、これ
と先のHind−Sal断片を結合する。これ
を用いてE.ColiDHI株を形質転換しpHGV2
由来のCSF−cDNAを有するプラスミド、
pTN−V2を得る（図１０）（実施例18）。 ＋VSEと同様にpHGV2プラスミドかPH
GV2(H)プラスミドとpAdD26SVpAプラスミ
ドを用いてCHO細胞用組換えベクター（−
VSE）であるpHGV2−dhfrを構築した（図
１１ａ及びｂ）（実施例20）。 更にpAdD26SVpAからDHFR遺伝子を含
む約2KbのDNA断片をEcoRおよびBamH
処理により回収し、pHGV2(H)のHind部
位に挿入してpV2DR1とpV2DR2を構築した
（図１１ｃ）（実施例20）。 (5) 動物細胞による形質発現 ここでは代表的な例について述べるが、その
他の場合については各実施例を見られたい。 マウスC127細胞による形質発現 pTN−G4プラスミドまたはpTN−V2プラス
ミドをBamHで処理しておき、これを用いて
培養増殖させておいたC127細胞をリン酸−カル
シウム法で形質転換する。得られた形質転換細胞
を培養しCSF生産能の高いクローンを選別する。 形質発現したＧ−CSFはこれらの形質転換細胞
の培養液から回収精製され、ヒト−Ｇ−CSF活性
を示すことが確認された。又試料のアミノ酸分析
及び糖含有量分析により目的糖蛋白質の確認もな
された。 尚、糖含有分析に関しては、アミノ酸分析に用
いたCSF試料をエルソン−モルガン法によるアミ
ノ糖定量、オルシノール硫酸法による中性糖の定
量またチオバルビツール法によるシアル酸の定量
にてそれぞれ実施した。 定量方法は生化学実験講座第４巻「糖質の化学
（下巻）」（東京化学同人）の13章に記載されてい
る。各定量値から重量％を換算した結果、発現ベ
クター及び培養条件等の違いにより、得られたＧ
−CSFの糖含量は１〜20（重量％）の範囲に分布
していた。 実施例 以下実施例をあげて本発明を詳細に説明する
が、その前にCSF活性の測定法について参考例で
説明しておく。 参考例 CSF活性の測定方法 本発明において用いられたCSF活性（以下
CSAと略す）の測定方法は次のとおりである。 「CSAの測定方法」 (a) ヒト骨髄細胞を用いる場合： Bradley T.R.、Metcalf D.等の方法 （Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci.44巻287〜300
頁、1966年）に準じて単層軟寒天培養法により
行つた。すなわちウシ胎児血清0.2ml、被検検
体0.1ml、ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液0.1ml
（１〜２×105有核細胞）、改変McCoy′s5A培養
液0.2ml、寒天を0.75％含む改変McCoy′s5A培
養液0.4mlを混合して直径35mmの組織培養プラ
ステイツクデイツシユに入れて固まらせたの
ち、37℃、５％炭酸ガス／95％空気、100％湿
度の条件で培養を行い、10日後に形成されたコ
ロニー数（50個以上の細胞からなる集落を１コ
ロニーとする）を数え、１個のコロニーを形成
する活性を１単位（Unit）としてCSAを求め
た。 (b) マウス骨髄細胞を用いる場合： ウマ血清0.4ml、被検検体0.1ml、C3H／He
（メス）マウスの骨随細胞浮遊液0.1ml（0.5〜
１×105有核細胞）、寒天を0.75％含む改変
McCoy′s5A培養液0.4mlを混合し直径35mmの組
織培養用プラステイツクデイツシユに入れて固
まらせたのち、37℃、５％炭酸ガス／95％空
気、100％湿度の条件下にて５日間培養し、形
成されたコロニー数（50個以上の細胞からなる
集落を１コロニーとする）を数え、１個のコロ
ニーを形成する活性を１単位（Unit）として
CSAを求めた。 尚、上記(a)、(b)の方法において用いた「改変
McCoy′s5A培養液および(a)で用いたヒト骨髄
非付着性細胞浮遊液は次の如くして作成した。 「改変McCoy′s5A培養液（２倍濃度）」
McCoy′s5A培養液（GIBCO社製）12ｇ、
MEMアミノ酸ビタミン培地（日水製薬社製）
2.55ｇ、重炭酸ナトリウム2.18ｇ、ペニシリン
Ｇカリウム50000単位を２回蒸溜水500mlに溶解
後、0.22μｍのミリポアフイルターにて濾過滅
言を行つた。 「ヒト骨随非付着性細胞浮遊液」 健常人胸骨せん刺により得た骨髄液を
PRMI1640培養液にて５倍に希釈し、Ficol−
Paque液（フアルマシア社製）に重層し、400
×ｇ、30分、25℃にて遠心を行い、界面の細胞
層（比重＜1.077）を回収する。この細胞を洗
浄後、20％ウシ胎児血清を含むRPM1640培
養液にて５×106Cell／mlの濃度に調整し、25
cm2の組織培養用プラスチツクフラスコに入れ、
炭酸ガス培養器にて30分間インキユベートした
のち、上清の非付着性細胞を回収し、再度25cm2
プラスチツクフラスコに入れ、２時間30分イン
キユベートしたのち、上清の非付着性細胞を集
めて用いた。 実施例 １ 「CHU−２」の樹立 著明な好中球の増多が認められた口腔底癌患者
の腫瘍をnu／nuマウスに移植した。この腫瘍は
移植約10日後に著明な腫瘍の増大と好中球の増多
が認められた。この腫瘍を移植12日後に無菌的に
摘出し、１〜２mm3角に細切し、これを以下の如
く培養した。 上記細切した腫瘍塊10〜15片を50mlのプラスチ
ツク遠心管に入れ、５mlのトリプシン溶液（トリ
プシン0.25％、EDTA0.02％含む）を加え、37℃
の温浴中で10分間振とうしたのち上清を捨て、再
度、同トリプシン溶液５mlを加え、37℃で15分間
攪拌しながらトリプシン消化を行つた。 上清の細胞浮遊液を回収し、ウシ胎児血清を１
ml加えてトリプシンの作用を止めたのち氷中に保
存した。 以上の操作を再度行い細胞浮遊液を回収し、前
回の分と合わせて1500r.p.m10分間の遠心により
細胞ペレツトを得た。 この細胞ペレツトをウシ胎児血清を10％含むＦ
−10にて２回洗浄したのち、25cm2のプラスチツク
培養フラスコに細胞濃度５×106個／フラスコに
なるようにして植え込んだ、ウシ胎児血清を10％
含有するＦ−10培養液を用い、炭酸ガスインキユ
ベーター（炭酸ガス濃度５％）、湿度100％）中に
て一晩インキユベートしたのち、上清を非付着細
胞と共に除去し、新しい培養液を加えて培養を継
続した。培養開始後６日目に細胞がいつぱいに増
殖したので、この時点で培養液を新しいものに替
えた。翌日、この培養液を捨て、RPM1640で
５倍希釈した抗マウス赤血球抗体（Cappel社製）
２mlと同じくRPM1640で2.5倍希釈したモルモ
ツト補体（極東製薬社製）２mlを加え37℃、20分
間インキユベートした。インキユベーシヨン終了
後ウシ胎児血清を10％含むＦ−10にて２回洗浄し
nu／nuマウス由来のフイブロブラストを条去し
引き続きウシ胎児血清を10％含むＦ−10倍養液を
加えて、さらに２日間培養を行つた後細胞の一部
を取り出し限界希釈法によりクローニングを行つ
た。得られた11個のクローンについてCSF活性を
調べたところ、他のものよりも約10倍高い活性を
示すクローン（CHU−２）が得られた。 実施例 ２ CSFの単離 上述の如くして樹立された細胞が完全に密に増
殖した150cm2の培養フラスコ２本より細胞を回収
し、これをウシ胎児血清を10％含有するＦ−10培
養液500mlに浮遊させたのち、1580cm2のガラス製
ローラーボトル（Belco社製）に移し、0.5r.p.m.
の速度で回転培養を行つた。細胞がローラーボト
ルの内壁に完全に密に増殖した時点で培養液を血
清を含まないRPM1640に交換し、４日間培養
したのち培養上清を回収し、ウシ胎児血清を10％
含有するＦ−10を加えて培養を続行する。３日間
培養したのち再び血清を含まないRPMI1640に液
替を行い、４日後に培養上清を回収した。以下同
様の操作をくり返すことにより、毎週１ボトルよ
り500mlずつの血清を含まない培養上清が得られ、
しかもこの方法によりかなり長期間にわたつて細
胞を維持し、培養上清を回収することが可能であ
つた。得られた培養上清５を１バツチとし、こ
れに0.01％ツイーン20を添加後Hollow Fiber
DC−４およびAmicon PM−10（アミコン社製）
を用いた限外濾過法により約1000倍に濃縮したの
ち、これを以下の順序で精製した。 (i) 直径4.6cm、長さ90cmのUltrogel AcA54カラ
ム（LKB社製）を用い、0.15M NaCl及び0.01
％ツイーン20（半井化学社製）を含む0.01Mト
リス塩酸緩衝液（PH7.4）を用いて前記濃縮し
た培養上清５mlを流速約50ml／時間でゲル濾過
した。尚カラムはあらかじめウシ血清アルブミ
ン（分子量67000）、オボアルブミン（分子量
45000）、チトクロームＣ（分子量12400）にてキ
ヤリブレーシヨンを行つた。ゲル濾過終了後各
フラクシヨンより0.1mlずつを採取し、10倍に
希釈した後、前述した「CSAの測定方法(b)」
により活性を示す画分を調べた。この結果、先
ずVe＝400〜700mlの画分がマクロフアージ優
位のCSAを示し、Ve＝800〜1200mlの画分が顆
粒球優位のCSAを示すことがわかつたので、
後者の画分を集めPM−10（アミコン社製）を
用いる限外濾過器によつて約５mlに濃縮した。 (ii) 上記濃縮画分にｎ−プロパノール（東京化成
社製、アミノ酸配列決定用）を30％含む0.1％
トリフルオロ酢酸水溶液を添加し、氷中に15分
間程度放置したのち、15000r.p.m.10分の遠心
により沈澱を除去した。次いで先のｎ−プロパ
ノールおよびトリフルオロ酢酸を含む水溶液で
平衡化したμBondapakC18カラム（Waters社
製、セミ分取用、８mm×30cm）に吸着後、30〜
60％の直線濃度勾配のｎ−プロパノールを含む
0.1％トリフルオロ酢酸水溶液で順次溶出した。
高速液体クロマト装置は日立685−50型を、検
出は日立638−41型検出器（いずれも日立製作
所製）を用い、220nｍと280nｍの吸収を同時
に測定した。溶出後、各画分より10μlを分取
100倍希釈したのち、前述の「CSAの測定法
(b)」により活性を示す画分を調べた。この結
果、ｎ−プロパノール40％にて溶出されるペー
クに活性が認められたので、このピークを集め
再度同じ条件で再クロマトを行い上記と同様に
してCSAを調べたところ、やはりｎ−プロパ
ノール40％の位置のピークに活性が認められた
ので、このピークを集め（４フラクシヨン＝４
ml）を凍結乾燥した。 (iii) 上記凍結乾燥粉末をｎ−プロパノールを40％
含む0.1％トリフルオロ酢酸水溶液200μに溶
解し、TSK−G3000SWカラム（東洋曹達社
製、7.5mm×60cm）を用いた高速液体クロマト
グラフイ（HPLC）にかけた。溶出は同水溶液
により0.4ml／分の流速で行い、フラクシヨン
コレクターFRAC−100（フアルマシア社製）に
より0.4mlずつ分取した。分取した各画分につ
いてCSAを前記と同様にして調べた結果、保
持時間が37〜38分の画分（分子量約２万に相
当）に活性が認められたので、この画分を回収
し、更に分析用μBondapakC18カラム（4.6mm
×30cm）による精製を施したのち、メインピー
クを回収し凍結乾燥した。得られた製品につい
て前述の「CSAの測定方法(a)」によつて検定
したところヒトＧ−CSF活性を有することを認
めた。 実施例 ３ アミノ酸配列の決定 (i) Ｎ末端アミノ酸配列の決定 試料を気相式シークエンサー（アプライドバ
イオシステム社製）を用いてエドマン
（Edman）分解し、得られたPTHアミノ酸を
高速液体クロマトグラフイー装置（ベツクマ
ン・インストルメンツ社製）および
Ultrasphere−ODSカラム（ベツクマン・イン
ストルメンツ社製）を用いて常法により分析し
た。カラム（5μｍ、直径4.6mm、長さ250mm）を
開始緩衝液（15ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液PH
4.5、40％アセトニトリルを含む水溶液）にて
平衡化したのち、検体（20μlの開始緩衝液にて
溶解）を注入して開始緩衝液によるイソクラテ
イツク溶出により分離を行つた。流速は1.4
ml／分、カラム温度は40℃に保持した。PTH
アミノ酸の検出は269nｍと320nｍの紫外部吸
収を利用した。あらかじめ標準PTHアミノ酸
（シグマ社製）各2nmolを同一の系で分離して
保持時間を決定し、被検検体の保持時間から同
定を行つた。 この結果、Ｎ末端から40残基目までのアミノ
酸配列は次の如く決定された。 H2N−Thr−Pro−Leu−Gly− Pro−Ala−Ser−Ser−Leu− Pro−Gln−Ser−Phe−Leu− Leu−Lys−Cys−Leu−Glu− Gln−Val−Arg−Lys−Ile− Gln−Gly−Asp−Gly−Ala− Ala−Leu−Gln−Glu−Lys− Leu−Cys−Ala−Thr−Tyr− Lys− (ii) ブロムシアン分解 試料を70％ギ酸に溶かし、昇華精製したブロ
ムシアン200当量を加えて、37℃で一夜反応さ
せた。次に反応物を凍結乾燥後、TSK
G3000SWカラム（東洋曹達社製）を用いた
HPLCで分画し４つのピークを得た。ピークを
分子量の大きい順にCN−１、CN−２、CN−
３、CN−４と命名し、収率のよいCN−１、
CN−２についてアミノ酸配列を自動気相式シ
ークエンサー（アプライドバイオシステム社
製）を用いて(i)と同様の条件で分析した。 その結果、CN−１はＧ−CSFタンパクのＮ
末端からのペプチドであることがわかつた。さ
らにCN−２は以下のアミノ酸配列を有してい
た。 Pro−Ala−Phe−Ala−Ser− Ala−Phe−Gln−Arg−Arg− Ala−Gly−Gly−Val−Leu− Val−Ala−Ser−His−Leu− Gln− (iii) トリプシン分解 試料を8M尿素を含む0.1Mトリス塩酸緩衝液
（PH7.4）に溶かし、0.1％２−メルカプトエタ
ノールを含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH7.4）
を加えて最終的に2Mの尿素となるように調整
した。次いで試料を酵素が50：１となるように
TPCK処理トリプシン（シグマ社製商品名）を
加え、25℃で４時間反応させた後、さらに同量
のTPCK処理トリプシンを加えて、再度25℃で
16時間反応させた。反応後、反応物をC8カラ
ム（山村化学社製）を用いた高速逆相カラムク
ロマトグラフイーに付した。溶出は0.1％TFA
を含むｎ−プロパノールを用い、ｎ−プロパノ
ール濃度を５％〜60％に直線的に上げて行つ
た。280nｍの紫外部吸収を測定して得られた
ピークのうち、メインピークについて(i)と同条
件下に自動気相式シークエンサー（アプライド
バイオシステム社製）を用いてアミノ酸配列を
分析した。その結果、メインピークは(ii)のCN
−２断片の一部を含む以下の配列を有するペプ
チドであることがわかつた。 Gln−Leu−Asp−Val−Ala− Asp−Phe−Ala−Thr−Thr− Ile−Trp−Gln−Gln−Met− Glu−Glu−Leu−Gly−Met− Ala−Pro−Ala−Leu−Gln− Pro−Thr−Gln−Gly−Ala− Met−Pro−Ala−Phe−Ala− Ser− 実施例 ４ DNAプローブの作成 (i) プローブIWQの合成 実施例３(iii)で得られたアミノ酸配列の中から
Ile−Trp−Gln−Gln−Met−Glu−Glu−Leu
−Gly−Metで示される10個のアミノ酸の配列
に基づいて、30個の連続するヌクレオチドを得
た（図１）。図１の配列に於いて、例えば5′−
末端から９位のヌクレオチドはdAおよびdGを
等量含む混合物であることを示す。原料のヌク
レオチドは主にダイマーを使用し、必要に応じ
て随時モノヌクレオチドも使用した。グラスフ
イルター付きカラムに出発原料のヌクレオチド
樹脂Ap−ｄ(G)（ヤマサ醤油社製）20mgを入れ
塩化メチレンにて洗浄を繰り返した後、３％ト
リクロロ酢酸を含む塩化メチレン溶液にて、
４，4′−ジメトキシトリチル基を脱離せしめ、
次いで１mlの塩化メチレンでカラムを数回洗浄
した。無水ピリジンで洗浄して溶媒を置換した
のちヌクレオチドダイマー（DMTr）ApTp
（NHR3）（日本ゼオン社製；NHR3はトリエチ
ルアンモニウム、DMTrはジメトキシトリチ
ルを示す）20mgと0.2mlのピリジンを加えて真
空ポンプにてカラム内を真空乾燥した。次い
で、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホニ
ル−３−ニトロトリアゾリド（MSNT、和光
純薬社製）20mgと無水ピリジン0.2mlを加えた
後、カラム内を窒素ガスで置換して、室温下に
45分間時々振とうさせることによつてヌクレオ
チド樹脂とダイマーを縮合させた。反応終了
後、ピリジンにてカラムを洗浄し、次いで未反
応のOH基を過剰の無水酢酸と４−ジメチルア
ミノピリジンを含むピリジン溶液にてアセチル
化した後、再びカラムをピリジンで洗浄した。
以下同様に、（DMTr）Ip（NHR3）、（DMTr）
GpGp（NHR3）、（DMTr）Ip（NHR3）、
（DMTr）CpTp（NHR3）と（MMTr）TpTp
（NHR3）の等量混合物、（DMTr）ApAp
（NHR3）と（DMTr）ApGp（NHR3）の等量
混合物、（DMTr）ApGp（NHR3）と
（DMTr）GpGp（NHR3）の等量混合物、
（DMTr）GpAp（NHR3）、（DMTr）TpGp
（NHR3）、（DMTr）ApAp（NHR3）と
（DMTr）GpAp（NHR3）の等量混合物、
（DMTr）CpAp（NHR3）、（DMTr）ApAp
（NHR3）と（DMTr）ApGp（NHR3）との等
量混合物、（DMTr）GpGp（NHR3）、
（DMTr）TpGp（NHR3）、（DMTr）Ip
（NHR3）、（DMTr）ApTp（NHR3） ［（DMTr）Ip（NHR3）はヤマサ醤油社製、
その他は全て日本ゼオン社製］の順で、前述の
操作を繰り返すことによつて縮合させた。最終
段階の反応終了後、アセチル化することなし
に、ピリジン、塩化メチレンン、エーテルの順
で樹脂を洗浄した後、乾燥させた。乾燥させた
樹脂を1Mテトラメチルグアニジンおよび1Mα
−ピコリンアルドキシムを含むジオキサン１
ml、ピリジン0.5ml、水0.2mlの混合液1.7mlに懸
濁した後、一夜室温にて放置した後、100〜
200μまで減圧濃縮した。この濃縮液に少量
（２〜３滴）のピリジンを加えた後、濃アンモ
ニア水２〜３mlを加え55℃で６時間加温した。
次いで酢酸エチルを加えて抽出分離し、得られ
た水層を減圧濃縮した後、50ｍＭトリエチルア
ンモニウム酢酸溶液（PH7.0）に溶解せしめて
Ｃ−18カラム（1.0×15cm、Waters社製）を用
いたカラムクロマトグラフイーに付した。溶出
は、50ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸溶液
（PH7.0）中10％〜30％の直線濃度勾配のアセト
ニトリルで行い、アセトニトリル濃度が25％付
近の位置で溶出されるピーク画分を減圧濃縮し
た。 この濃縮液に80％酢酸を加えて室温下に30分
間放置した後、酢酸エチルを加えて抽出・分離
し得られた水層を減圧下に濃縮した。得られた
濃縮液は、C18カラム（センシユー科学社製、
SSC−ODS−272、6φ×200mm）を用いた高速
液体クロマトグラフイーに付して、さらに精製
した。溶出は50ｍＭトリエチルアンモニウム酢
酸溶液（PH7.0）中10％〜20％の直線濃度勾配
のアセトニトリルを用いて行い、10A260units
以上の収量で合成DNAが得られた。 (ii) プローブＡの合成 実施例３(iii)で得られたアミノ酸配列の中から
Met−Pro−Ala−Phe−Alaで示される５個の
アミノ酸の配列に基づいて14個の連続するヌク
レオチドを得た（図１）。 合成は、プローブIWQと同様な方法で行い
ヌクレオチド樹脂AP−ｄ（Ｔ）（ヤマサ醤油社
製）に（DMTr）CpAp（NHR3）；（DMTr）
GpGp（NHR3）；（DMTr）CpAp（NHR3）、
（DMTr）CpTp（NHR3）、（DMTr）CpGp
（NHR3）および（DMTr）CpCp（NHR3）の
等量混合物；（DMTr）ApGp（NHR3）、
（DMTr）TpGp（NHR3）、（DMTr）GpGp
（NHR3）および（DMTr）CpGp（NHR3）の
等量混合物；（DMTr）ApAp（NHR3）；
（DMTr）CpAp（NHR3）と（DMTr）CpGp
（NHR3）の等量混合物；（DMTr）Gp
（NHR3）（いずれも日本ゼオン社製）の順に混
合させて約10A260unitsの合成DNAを得た。 得られたオリゴヌクレオチドの塩基配列を
Maxam−Gilbert法により調べたところ図１に
示された塩基配列を有していることが確認され
た。 (iii) プローブLCの合成 アプライドバイオシステム社のDNA合成機
380Aにより、自動合成を行つた。この方法は
Caruthers等の記載した原理（J.Am.Chem.
Soc、103巻3185頁（1981））に基づいており、
ホスホアミダイト法と称されている。 5′のジメトキシトリチル基（DMTr）を脱保
護したdG−Ｓ（Ｓは支持体）にテトラゾールで
予め活性化した（DMTr）−dTのホスホアミダ
イト体を縮合させた後、未反応の水酸基をアセ
チル化し、次いで水存在下でヨウ素酸化を行つ
てリン酸体に導いた。DMTr基を脱保護し、
以後同様に縮合を繰り返して図１に示される如
き配列の24個のヌクレオチドを合成した。得ら
れたヌクレオチドを支持体から開裂せしめ脱保
護した後、C18カラム（センシユー科学社製
SSC−ODS−272）を用いた逆相系高速液体ク
ロマトグラフイーにて精製した。 実施例 ５ CHU−２細胞の培養とmRNAの精製 (1) CHU−２細胞の培養と細胞の回収 樹立されたCHU−２細胞を150cm2の培養フラ
スコ２本に完全に密に増殖させた後、これをウ
シ胎児血清を10％含有するRPMI1640培養液
500mlに浮遊させたのち、1580cm2のガラス製ロ
ーラーボトル（Belco社製）に移し、0.5r.p.m.
の速度で４日間回転培養を行つた。細胞がロー
ラーボトルの内壁に完全に密に増殖した時点
で、ローラーボトルから培養液を除き、あらか
じめ37℃に加温したEDTAを0.02％含む生理食
塩水100mlを加え、37℃で２分間加温後、ピペ
ツト操作にて細胞をはく離せしめた。得られた
細胞懸濁液を1500r.p.m.10分間の遠心にて細胞
ペレツトを得る。細胞をEDTAを含まない生
理食塩水５mlに再び懸濁し、1500r.p.m.10分間
遠心にて細胞ペレツトを得た（湿重量約0.8
ｇ）、このようにして得られた細胞はRNA抽出
操作を行うまで−80℃にて凍結保存する。 (2) mRNAの精製 上記の如くして得られたCHU−２細胞から
のmRNAの単離は本質的に“Molecular
Coloning”［Maniatis等、Cold、Spring
Harbor、196頁（1982）］に記載されているよ
うにして実施した。凍結保存されていたCHU
−２細胞（湿重量3.8ｇ）に20mlの6Mグアニジ
ン溶液（6Mグアニジンチオシアナート、５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム（PH7.0）、0.1M β−メ
ルカプトエタノール、0.5％ザルコシル硫酸ナ
トリウム）に懸濁し、Vortexミキサーにて２
〜３分よく混合した後、18Gの注射針を装てん
した20ml容の注射器を用いて10回吸入排出を繰
り返した。ベツクマン社製SW40Tiローターに
合うポリアロマー製の遠心チユーブに６mlの
5.7M CsCl−0.1M EDTA、（PH7.5）を先に加
えておき、チユーブが満たされるように上述の
細胞が壊れて粘稠になつたグアニジン溶液約６
mlを重層した。このようにして調製された遠心
チユーブ４本を30000r.p.m.、20℃で15時間遠
心した後、得られたペレツトを少量の70％エタ
ノールを用いて３回洗浄した。 各々のチユーブから得られたペレツトを合し
て550μの水に溶解せしめNaCl濃度が0.2Mと
なるように調整したのち、フエノール−クロロ
ホルム（１：１）処理、クロロホルム処理後、
2.5倍容量のエタノールを加えてエタノール沈
澱を行い全RNAを得た（湿細胞3.8ｇより全
RNA約10.1mgを得た）。 全RNAからポリ（A+）−RNAの精製は以下
の如く行つた。この方法はmRNAが3′末端に
ポリＡ鎖を付加していることを利用したアフイ
ニテイークロマトグラフイーである。オリゴ
（dT）−セルロース（Ｐ−Ｌ Biochemicals社
製Type7）を用い、吸着は全RNAを吸着緩衝
液（10ｍＭトリス−塩酸（PH7.5）、0.5M
NaCl、１ｍＭ EDTA、0.1％SDS溶液を含
む）に溶解し、65℃で５分間加熱した後、同溶
液にて充てんされたオリゴ（dT）−セルロース
カラムに通過させて行い、溶出はTE溶液（10
ｍＭトリス−塩酸（PH7.5）、１ｍＭ EDTAを
含む）で行つた。未吸着通過液は再び同カラム
に通して同様に溶出操作を行い、１回目の溶出
液と混合した。このような操作を用いて、ポリ
（A+）−RNA400μｇを得た。 このようにして調製したmRNAをSchleifと
Wensinkの実験技術書（Practical Metods in
Molecular Biology、Springer−Verlag、
New York、Heiderberg、Berlin、（1981））
中に記載されている方法と同様の操作で、シヨ
糖密度勾配遠心法によりサイズ分画した。 すなわち、SW40Tiローター（Beckman社
製）用チユーブに５％〜25％のシヨ糖密度勾配
を作る。シヨ糖溶液は0.1M NaCl、10ｍＭト
リス−塩酸（PH7.5）、１ｍＭ EDTA、0.5％
SDSの溶液にそれぞれ５％、25％の割合いで
RNaseフリーのシヨ糖（Schwarz／Mann社
製）を含んでいる。 上記で述べた如き方法で調製したmRNA（ポリ
（A+）−RNA）800μｇを200μl〜500μlのTE溶液
に溶解せしめ、65℃で５分間加熱後急冷した後、
シヨ糖密度勾配液の上にのせる。30000r.p.m.に
て20時間遠心後0.5mlずつ分画を集め260nｍの吸
光度を測り、同様に行つた標準RNA（28S、18S、
5SのリボソームRNA）の位置に基づいて、分画
されたRNAのサイズを決めると同時に各分画の
Ｇ−CSF活性をアフリカツメガエル（Xenopus
laevis）の卵母細胞系を用いて調べた。すなわち
各分画のmRNAを1μｇ／μの濃度の水溶液に
調製し、ツメガエル（生後約１年）から取り出し
た卵母細胞１個に50nｇのmRNAの割合いで注入
した後、96穴のマイクロタイタープレートの１穴
に卵母細胞を10個ずつ入れ、それぞれ100μの
バース培地（88ｍＭ NaCl、１ｍＭ KCl、2.4
ｍＭ NaHCO3、0.82ｍＭ MgSO4、0.33ｍＭ
Ca（NO3）2、0.41ｍＭ CaCl2、7.5ｍＭトリス−
塩酸（PH7.6）、ペニシリン10mg／、ストレプト
マイシン硫酸10mg／）中で48時間室温で培養し
た後上清を回収し、濃縮・精製してＧ−CSF活性
を測定する。 この結果、15〜17S画分にＧ−CSF活性が認め
られた。 実施例 ６ cDNAの合成（pBR系cDNAライブラリーの構
築） 前述の方法で得られたポリ（A+）−RNAから
Land等の方法［Nucleic Acids Res.、９巻2251
頁（1981）］に基づき、GuberとHoffmanの方法
［Gene、25巻263頁（1983）］を加味してcDNAを
合成した。 (1) １本鎖cDNAの合成 エツペンドルフ社製1.5ml容チユーブに以下
の如くの順序で試薬を入れる。80μの反応緩
衝液（500ｍＭ KCl、50ｍＭ MgCl2、250ｍ
Ｍトリス−塩酸、PH8.3）、20μの200ｍＭジチ
オスレイトール、32μの12.5ｍＭ dNTP
（dATP、dGTP、dCTP、dTTPを各々12.5ｍ
Ｍ含む）、10μのα− 32P−dCTP（アマシヤ
ム社製、PB10205）、32μのオリゴ（dT）12-18
（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製、500μｇ／μ）、
20μのポリ（A+）−RNA（2.1μｇ／μ）、蒸
溜水206μの計400μの反応液を65℃で５分
間加熱後、42℃で５分間加温する。この反応液
に逆転写酵素（宝酒造製）120単位を加え、さ
らに42℃、２時間反応させた後、RNaseイン
ヒビター（Bethesda Research Laboratories
社製）2μ、20μのTE溶液、16μの100ｍ
Ｍピロリン酸ナトリウム、48単位（4μ）の
逆転写酵素を追加して、今度は46℃２時間反応
せしめた。0.5M EDTA 8μ、10％SDS 8μ
を加えて反応を停止させた後、フエノール−ク
ロロホルム処理、エタノール沈澱（２回）を行
い一本鎖cDNAを得た。 (2) １本鎖cDNAへのdC−鎖付加 上記で得られた一本鎖cDNAを60μの蒸溜
水に溶解後、60μのdC−鎖付加緩衝液（400
ｍＭカコジル酸カリウム；50ｍＭトリス−塩酸
（PH6.9）；４ｍＭジチオスレイトール；１ｍ
MCoCl2；１ｍＭ dCTP）に加え、37℃で５
分間加温した。この反応液にターミナルトラン
スフエラーゼ（27unit／μ、Ｐ−Ｌ
Biochemicals社製）3μを加えて37℃で2.5分
間反応した後、フエノール−クロロホルム処理
（１回）、およびエタノール沈澱（２回）を行
い、100ｍＭ NaClを含むTE溶液40μに溶解
せしめた。 (3) ２本鎖cDNAの合成 上記40μのDNA溶液に4μのオリゴ
（dG）12-18（200μｇ／ml、Ｐ−Ｌ
Biochemicals社製）を加え65℃５分間、続い
て42℃で30分間加温した後、反応液を０℃に保
つた。この反応液に緩衝液80μ（100ｍＭト
リス−塩酸、PH7.5、20ｍMMgCl2、50ｍＭ
（NH4）2SO4、500ｍＭ KCl）、4μの４ｍＭ、
dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTPを各々
４ｍＭ含む）、60μの１ｍＭ β−NAD及び
210μの蒸溜水、20μのE.coli DNAポリメ
ラーゼ（宝酒造社製）、15μのＥ、coli
DNAリガーゼ（宝酒造社製）、15μのＥ、
coli、RNase Ｈ（宝酒造社製）を加え12℃にて
１時間反応させた後、さらに4μの４ｍ
MdNTPを追加し、25℃で１時間反応して、フ
エノール−クロロホルム処理、エタノール沈澱
（１回）を行つて、約8μｇの２本鎖cDNAを得
た。この２本鎖cDNAをTE溶液に溶解せしめ、
1.2％アガロースゲル電気泳動を行い、約560塩
基対（bp）〜２キロ塩基対（Kbp）の大きさ
に相当する部分をワツトマンDE81（ワツトマン
社製）に吸着させ溶出回収したところ、約0.2μ
ｇが回収された。 (4) ２本鎖cDNAへのdC−鎖付加 上記の如く得られた２本鎖cDNAを40μの
TE溶液に溶解し、(2)の項で述べたdC−鎖付加
緩衝液8μを加え37℃で２分間加温した後、
1μのターミナルトランスフエラーゼ
（27unit／μ）を加えて37℃で３分間反応せ
しめた。反応液を直ちに０℃に冷却し、0.5M
EDTA1μを加えて反応を停止した後、フエ
ノール−クロロホルム処理、エタノール沈澱を
行い、得られた沈澱をTE溶液10μに懸濁し
た。 (5) pBR系cDNAライブラリーの構築 市販のオリゴ（dG）鎖付加pBR322ベクター
（ベセスダリサーチラボラトリーズ社製、
10ng／μ）4μと上記dC−鎖付加２本鎖
cDNA2μを75μの0.1M NaClを含むTE溶
液の中でアニールさせた。アニールは65℃、５
分加温した後40℃にて２時間加温、その後、室
温になるまで放置して行つた。 一方、Naniatisらの実験書［Molecular
cloning、Cold Spring Harbor、249頁
（1982）］に記載されている方法等を用いて大腸
菌X1776株からコンピテント細胞を調製し、上
記アニールされたプラスミドにより形質転換を
行い、トランスフオーマント（形質転換体）が
得られた。 実施例 ７ cDNA合成（λフアージ系ライブラリーの構
築） (1) １本鎖cDNAの合成 実施例５で述べた方法に従つて3.8ｇの凍結
保存CHU−２細胞から２回オリゴ（dT）セル
ロースカラムによる精製を経て400μｇのポリ
（A+）−RNAを得た。 このポリ（A+）−RNA12μｇを溶解したTE
溶液10μを10μgのアクチノマイシンＤ（シグ
マ社製）を含む反応チユーブに入れた後、以下
の順序で試薬類を加えた；20μの逆転写緩衝
液（250ｍＭトリス−塩酸（PH8.3）、40ｍＭ
MgCl2、250ｍＭ KCl）、20μの５ｍＭ
dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTPを各々
５ｍＭ含む）、20μlのオリゴ（dT）12-18（0.2μ
ｇ／ml Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）、1μの
1Mジチオスレイトール、2μの30unit／μ
のRNasin（プロメガバイオテク社）、10μの
逆転写酵素（10unit／μ生化学工業社製）、
1μのα−［ 32p］dATP（10μCiアマシヤム社
製）、16μの水で計100μの液量の反応液に
なる。反応液を42℃で２時間保つた後、5μ
の0.5M EDTA及び1μの20％SDSを加えて反
応を停止した。フエノール−クロロホルム
（100μ）処理、エタノール沈澱（２回）を行
つて約4μｇの１本鎖cDNAを得た。 (2) ２本鎖cDNAの合成 上記の如く得られたcDNAを29μのTE溶
液に溶解し以下の順序で試薬類を加えて反応液
とした；25μのポリメラーゼ緩衝液（400ｍ
MHepes（PH7.6）；16ｍＭ MgCl2；63ｍＭの
β−メルカプトエタノール；270ｍＭ KCl）；
10μの５ｍＭ dNTP；1.0μの15ｍＭ β
−NAD；1.0μのα−［ 32p］dATP（10μCi／
μ）；0.2μE.coliDNAリガーゼ（60unit／
μ宝酒造社製）；5.0μのE.coli DNAポリメ
ラーゼ（New England Biolabs社、
10unit／μ）；0.1μのRNase Ｈ（60unit／
μ宝酒造社製）；28.7μの蒸溜水。 反応液を14℃で１時間インキユベートした
後、室温にもどして、さらに１時間インキユベ
ートした。次いで5μの0.5M EDTAと1μの
20％SDSを加えて反応を停止させ、フエノール
−クロロホルム処理、エタノール沈澱を行つ
た。得られたDNAを0.5ｍＭ EDTA20μに
溶解せしめ、3μのKlenow緩衝液（500ｍＭ
トリス−塩酸（PH8.0）、50ｍＭ MgCl2）、3μ
の５ｍＭ dNTP、及び水4μを加えて反応
液を調製した後、1μのDNAポリメラーゼ
（Klenow断片）（宝酒造社製）を加えて30℃15
分インキユベートした。 この反応液に70μのTE溶液を加えて希釈
し、さらに5μの0.5M EDTA、1μの20％
SDSを加えて反応を停止した。反応液をフエノ
ール−クロロホルム処理し、エタノール沈澱を
行つて約8μｇの２本鎖cDNAを得た。 (3) ２本鎖cDNAのメチル化 (2)の項で合成した２本鎖cDNAの水溶液30μ
、メチル化緩衝液（500ｍＭトリス−塩酸
（PH8.0）、50ｍＭ EDTA）40μ、SAM溶液
（800μM Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチルメチオ
ニン（SAM）、50ｍＭ β−メルカプトエタノ
ール）20μ、水100μを加えた混合液に
EcoRIメチラーゼ（New England Biolabs
社、20unit／μ）15μを加えて全反応液を
200μとし、37℃２時間インキユベートした。
フエノール処理、エーテル処理を行つた後、エ
タノール沈澱を行つてDNAを回収した。 (4) EcoRIリンカーの付加 上記メチル化された２本鎖DNA約1.2μｇに
リガーゼ緩衝液（250ｍＭトリス−塩機（PH
7.5）、100ｍＭ MgCl2）1.5μ、あらかじめ
リン酸化されたEcoRIリンカー0.5μ（10mer
宝酒造社製）、1.5μの10ｍMATP、100ｍＭ
ジチオスレイトール1.5μ、2μのH2Oを加
え、反応液を15μとしてT4DNAリガーゼ
（3.4u／μ、宝酒造社製）0.7μを加えて４
℃で１晩反応させた後、65℃にて10分間加熱し
リガーゼを失活させた。この反応液をさらに
100ｍＭトリス−塩酸（PH7.5）、５ｍＭ
MgCl2、50ｍＭ NaCl、100μｇ／mlのゼラチ
ンの濃度で全液量が50μになるように調製し
た後、EcoRI（10unit／μ）3.5μ加え、37
℃、２時間反応させた。次いで0.5Mの
EDTA2.5μ、20％SDS0.5μを加えた後フエ
ノール−クロロホルム処理を行いエタノール沈
澱によりDNAを回収した。この後Ultrogel
AcA34（LKB社製）のゲル濾過法あるいはアガ
ロースゲル電気泳動法にて未反応のEcoRIリン
カーを除去し、リンカー付加２本鎖cDNA約
0.5〜0.7μｇを回収した。 (5) ２本鎖cDNAとλgt10ベクターの結合上記の
リンカー付加２本鎖cDNAを、2.4μgの予じめ
EcoRI処理したλgt10ベクター（ベクタークロ
ーニングシステム社）、リガーゼ緩衝液（250ｍ
Ｍトリス塩酸、100ｍＭ MgCl2）1.4μ、蒸
溜水6.5μを加えて、42℃、15分間処理した
後、10ｍＭ ATP1μ、0.1Mジチオスレイト
ール1μ、T4DNAリガーゼ0.5μを加え全量
を15μとした後、12℃で一晩反応させた。 (6) インビトロパツケージング 上記(5)で得られた組換え体DNAの約1/3をイ
ンビトロパツケージングキツト（プロメガ バ
イオテク社）を用いてパツケージングし、フア
ージプラークを得た。 実施例 ８ プローブIWQによりpBR系ライブラリーのス
クリーニング コロニーの成育した寒天培地上にワツトマン
541濾紙をのせ37℃で２時間放置した。以下、
TaubとThompsonの方法［Anal.Biochem.126巻
222頁（1982）］に準じて濾紙を処理した。 すなわち、541濾紙にコロニーを移した後、ク
ロラムフエニコール（250μｇ／μ）を含んだ
寒天培地に移し、さらに37℃で一晩放置した。 541濾紙を取り出した後、室温下で0.5N
NaOH溶液を浸した濾紙上に３分間放置し、こ
れを２回くり返した。以下同様な操作を0.5Mト
リス−塩酸（PH８）溶液を用いて３分間、２回行
ない、更に４℃下に0.05Mトリス−塩酸（PH８）
溶液で３分、1.5mg／mlのリゾチーム液（0.05M
トリス−塩酸（PH８）、25％シヨ糖を含む）で10
分間、次いで37℃下に１×SSC（0.15MNaCl及び
0.015Mクエン酸ナトリウム）溶液で２分間、
200μｇ／mlプロテアーゼＫを含む１×SSC溶液で
30分、再び室温下に１×SSC溶液で２分間、95％
エタノール溶液で２分間、２回行つた後、541濾
紙を乾燥させた。得られた乾燥541濾紙を室温下
にフエノール：クロロホルム：イソアミルアルコ
ール（25：24：１、100ｍＭトリス−塩酸（PH
8.5）、100ｍＭ NaCl、10ｍＭ EDTAで平衡化
したもの）溶液に30分間侵した。以下同様の操作
を５×SSC溶液で３分間、３回、次いで95％エタ
ノール溶液で３分間、２回行つた後、濾紙を乾燥
させた。 プローブIWQを常法（Molecular cloningを参
照）に従つて 32Pを用いて放射標識した後、
Wallace等の方法（Nucleic Acids Res.９巻879
頁（1981））に従つてコロニーハイブリダイゼー
シヨンを行つた。６×NET［0.9M NaCl、
0.09Mトリス−塩酸（PH7.5）、６ｍＭ EDTA］
５×Denhardt溶液、0.1％SDS 0.1mg／ml変性
DNA（仔牛胸線DNA）を含むハイブリダイゼー
シヨン緩衝液中で65℃、４時間、プレハイブリダ
イゼーシヨンを行つた後、放射標識化したプロー
ブIWQ1×106cpm／mlを含む前記ハイブリダイゼ
ーシヨン緩衝液を用いて56℃で一夜ハイブリダイ
ゼーシヨンを行つた。反応終了後541濾紙を室温
下に0.1％SDSを含む６×SSC溶液で30分、２回
および56℃、1.5分間洗滌した後、オートラジオ
グラフイーを行つた。 シグナルの出たクローンよりプラスミドを分離
した後、プローブIWQを用いてサザンプロツテ
イングを行つた。ハイブリダイゼーシヨンおよび
オートラジオグラフイーは前述と同一の条件で行
なつた。 同様にプローブＡを用いてサザンブロツテイン
グを行つた。ハイブリダイゼーシヨンは前述のハ
イブリダイゼーシヨン緩衝液を用い、49℃で１時
間行い、39℃まで徐冷後さらに39℃で１時間行な
つた。反応終了後、ニトロセルロースフイルター
を0.1％SDSを含む６×SSCで室温下に30分で２
回洗滌し、次いで390℃で３分間洗滌した後、オ
ートラジオグラフイーを行なつた。 この結果、１個のクローンがポジテイブなもの
として得られ、ジデオキシ法により塩基配列を決
定したところ図２に示した如く、プローブIWQ
及びプローブＡ部分を含む308塩基対よりなる
DNAであることが判明し、このインサートを含
むpBR322由来プラスミドをpHCS−１と命名し
た。 実施例 ９ pHCS−１由来DNAプローブによるλフアー
ジ系ライブラリーのスクリーニング BentonとDavisの方法［Science196巻、180頁、
（1977）］に準じてプラークハイブリダイゼーシヨ
ンを行つた。実施例８で得られたpHCS−１を
Sau3AおよびEcoRIで処理して約600塩基対の
DNA断片を得、このDNA断片を常法に従いニツ
クトランスレーシヨンにより放射標識した。フア
ージプラークの生じた寒天培地上にニトロセルロ
ース濾紙（Ｓ＆Ｓ社）をのせてフアージを移し、
0.5M NaOHにてDNAを変性させ、以下の順序
で濾紙を処理した。0.1M NaOH、1.5M NaCl
で20秒続いて0.5Mトリス−塩酸（PH7.5）、1.5M
NaClで20秒２回、最後に120mM NaCl、15mM
クエン酸ソーダ、13mM KH2PO4、1mM
EDTA、PH7.2で20秒処理した。 次いで濾紙を乾燥し、80℃で２時間加熱して
DNAを固定した、５×SSC、５×Denhardt溶
液、50mMリン酸緩衝液、50％ホルムアミド、
0.25mg／mlの変性DNA（鮭精巣DNA）、及び0.1％
SDSを含むハイブリダイゼーシヨン緩衝液中で42
℃にて一晩プレハイブリダイゼーシヨンを行い、
ニツクトランスレーシヨンにより放射標識化した
pHCS−１プローブ４×105cpm／mlを含むハイ
ブリダイゼーシヨン緩衝液（５×SSC、５×
Denhardt溶液、20mMリン酸緩衝液（PH6.0）、50
％ホルムアミド、0.1％SDS、10％デキストラン
硫酸、0.1mg／mlの変性DNA（鮭精巣DNA）の混
合液）で42℃にて20時間ハイブリダイゼーシヨン
を行つた。 ニトロセルロース濾紙を室温下に0.1％SDSを
含む２×SSCで20分間洗滌し、次いで44℃で、
0.1％SDSを含む0.1×SSCで30分間、さらに室温
下で0.1×SSCで10分間洗滌した後、オートラジ
オグラフイーで検出した。 その結果、５個のポジテイブなクローンＧ１〜
５が得られた。そこで、得られたクローンのうち
完全長cDNAを含むと思われるクローンのDNA
塩基配列をジデオキシ法にて調べたところ図３Ａ
に示される如き塩基配列が得られた。そこでこの
cDNAをλgt10ベクターより切りだし、pBR327
［Soberon等；Gene９巻287頁（1980）］とEcoRI
部位で結合させ、プラスミドとして大量調製し
た。このプラスミドをpBRG4と称する。 実施例 10 pBRG4由来DNAプローブおよびプローブLC
によるλフアージ系ライブラリーのスクリーニ
ング 実施例９で用いたBentonとDavisの方法（前出
の文献を参照）に準じてプラークハイブリダイゼ
ーシヨンを行つた。フアージプラークの生じた寒
天培地上にニトロセルロース濾紙（Ｓ＆Ｓ社製）
をのせてフアージを移し、0.5M NaOHにて
DNAを変性させ、以下の順序で濾紙を処理した。 0.1M NaOH、1.5M NaClで20秒、続いて
0.5Mトリス−塩酸（PH7.5）、1.5M NaClで20秒
２回、最後に120ｍＭ NaCl、15ｍＭクエン酸ソ
ーダ、13ｍＭ KH2PO4、１ｍＭ EDTA、（PH
7.2）で20秒処理した。次いで濾紙を乾燥し、80
℃で２時間乾燥してDNAを固定した。このよう
にして同一の濾紙を２枚作製し、pBRG4由来
DNAプローブとプローブLGによるスクリーニン
グにそれぞれ供した。pBRG4由来DNAプローブ
による場合は、pBRG4をEcoRIで処理して約
1500塩基対のDNA断片を得、このDNA断片を常
法に従つてニツクトランスレーシヨンにより放射
標識した。上記濾紙を５×SSC、５×Denhardt
溶液、50ｍＭリン酸緩衝液、50％ホルムアミド、
0.25mg／mlの変性DNA（鮭精巣DNA）、及び0.1％
SDSを含むハイブリダイゼーシヨン緩衝液中で42
℃にて一晩、プレハイブリダイゼーシヨンを行
い、上記の放射標識した約1500塩基対のDNAプ
ローブ（約１×106cpm／ml）を含むプレハイブ
リダイゼーシヨン緩衝液［５×SSC、５×
Denhardt溶液、20ｍＭリン酸緩衝液（PH6.0）、
50％ホルムアミド、0.1％SDS、10％デキストラ
ン硫酸、0.1mg／mlの変性DNA（鮭精巣DNA）の
混合液］で42℃にて20時間ハイブリダイゼーシヨ
ンを行つた。ニトロセルロース濾紙を室温下に、
0.1％SDSを含む２×SSCで20分間洗滌し、次い
で44℃で、0.1％SDSを含む0.1×SSCで30分間、
さらに室温下で0.1％SSCで10分間洗滌した後、
オートラジオグラフイーで検出した。 プローブLCの場合は、濾紙を0.1％SDSを含む
３×SSCで、65℃にて２時間前処理した後、６×
NET、１×Denhardt溶液、100μｇ／mlの変性
DNA（鮭精巣DNA）を含む溶液中、65℃で２時
間、プレハイブリダイゼーシヨンを行つた。 放射標識したプローブLC（２×106cpm／ml）
を含むハイブリダイゼーシヨン緩衝液［６×
NET、１×Denhardt溶液、100μｇ／ml変性
DNA（鮭精巣DNA）］で63℃にて一晩ハイブリダ
イゼーシヨンを行つた後、ニトロセルロース濾紙
を室温下に、0.1％SDSを含む６×SSCで20分間
洗滌し、この洗滌を３回行つた後、0.1％SDSを
含む６×SSCにて、63℃で２分間洗滌した。 濾紙を乾燥した後オートラジオグラフイーで検
出した。 このようにして行つたスクリーニングに於い
て、２つのプローブの両方にポジテイブなクロー
ンを選別し、そのうち完全長のcDNAを含むと思
われるクローンの塩基配列をジデオキシ法にて調
べたところ図４Ａに示される如き塩基配列が得ら
れれた。そこでこのcDNAをλgt10ベクターより
切りだし、pBR327とEcoR部位で結合させ、
プラスミドPBRV２を得た。 実施例 11 PHGA410ベクターの調製（動物細胞用、＋
VSE系） 実施例９で得られた図３Ａで示されるcDNAの
EcoR断片を制限酵素Draにて37℃で２時間
で処理した後、DNAポリメラーゼのKlenow
断片（宝酒造社製）で処理し、末端を平滑末端と
した。1μｇのBglリンカー（8mer；宝酒造社
製）をATPを用いてリン酸化した後、上記で得
られた約1μｇのDNA断片混合物と結合させた。
次いで制限酵素Bglで処理してアガロースゲル
電気泳動を行い、最も大きいDNA断片だけを回
収した。 このDNA断片は図５に示すようにヒトＧ−
CSFポリペプチドをコードする部分を含む約710
塩基対に相当していた。ベクターpdKCR
（FuKunaga等；Proc.Natl.Acad.Sci.USA；81巻
5086頁（1984））を制限酵素BamHIで処理した
後、アルカリフオスフアターゼ（宝酒造社製）で
脱リン酸して得られたベクターDNAをT4DNA
リガーゼ（宝酒造社製）を加えてcDNA断片と結
合させpHGA410を得た（図６）。図６に示され
るごとくこのプラスミドは、SV40初期遺伝子の
プロモーター、SV40の複製開始領域、ウサギβ
−グロビン遺伝子の一部、pBR322の複製開始領
域およびpBR322由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子
（Ampr）をふくみ、SV40初期遺伝子のプロモー
ター下流にヒトＧ−CSF遺伝子が接続されてい
る。 実施例 12 C127細胞用組替えベクターの構築（＋VSE） (1) pHGA410(H)の構築 実施例11で得られたpHGA410プラスミド
（図６）20μｇを50ｍＭ Tri−HCl（pH7.5）、
７ｍＭ MgCl2、100ｍＭ NaCl、７ｍM2−
メルカプトエタノール、0.01％ウシ血清アルブ
ミン（BSA）の反応液に溶解し、制限酵素
EcoR（宝酒造社製、10〜15単位）を加えて
約30分37℃にて反応させ、EcoRによる部分
消化を行つた。次いでフエノール−クロロホル
ム（１：１）処理を２回行いエーテル処理、エ
タノール沈澱を行つてDNA断片を処理した。 このDNA断片を50ｍＭ Tris−HCl、５ｍ
Ｍ MgCl2、10ｍＭ DTT、１ｍＭのdATP、
dCTP、dGTP、dTTPからなる50μの液に溶
解しE.coliDNAポリメラーゼ−Klenow断片
（宝酒造社製）5μを加えて14℃２時間インキ
ユベートしブラントエンド（blunt end）にし
た。 これから0.8％アガロースゲル電気泳動によ
り約5.8Kbの断片6μｇを回収した。 回収したDNA断片5μｇを再び50ｍＭ Tris
−HCl（PH7.6）、10ｍＭ MgCl2、10ｍＭ
DTT、１ｍＭ ATPからなる反応液50μ中
に溶解し、Hindリンカー（宝酒造社製）2μ
ｇ、及びT4DNAリガーゼ（宝酒造社製）100
単位を加えて、４℃にて一晩反応した。 次いで、フエーノル処理、エーテル処理、エ
タノール沈澱後、10ｍMTris−HCl（PH7.5）、
７ｍＭ MgCl2、60ｍＭ NaClの溶液30μに
溶解し、制限酵素Hind10単位存在下３時間
37℃でインキユベートした。再びT4DNAリガ
ーゼにより処理した後、そのDNAを塩化ルビ
ジウム法（前記の「Molecular Cloning」参
照）によりE.coli DH株に形質転換し、アン
ピシリン耐性（Ampr）のコロニーを得て
pHGA410プラスミドのEcoR部位がHind
に置きかわつたプラスミドを保持する菌を選択
した。このようにして得られたプラスミドを
pHGA410(H)と命名する（図７）。 (2) 発現用組換えベクターpTN−G4の構築上記
(1)で得られたpHGA410(H)（20μｇ）を10ｍＭ
Tris−HCl（PH7.5）、７ｍＭ MgCl2、175ｍ
Ｍ NaCl、0.2ｍＭ DTA、７ｍM2−メルカ
プトエタノール、0.01％ウシ血清アルブミンか
らなる反応液50μに溶解し、制限酵素Sal
（宝酒造社製）20単位を加え、37℃にて５時間
インキユベートした。次いでフエーノル処理、
エタノール沈澱後、DNAポリメラーゼ
Klenow断片（宝洒造社製）にて前出の反応と
同様に14℃約２時間インキユベートし、ブラン
トエンドにした。これを、アガロース電気泳動
で回収することなくエタノール沈澱したDNA
断片を制限酵素Hindにて処理して、約2.7kb
のHind−Sal断片を１％アガロースゲル電
気泳動にて5μｇ回収した。 一方、ウシ乳頭腫ウイルス［bovine
papilloma virus（BPV）］を有するプラスミド
pdBPV−１（Sarver、N.、Sbyrne、J.C＆
Howley、P.M.（1982）Proc.Natl.Acad.Sci.
USA79巻7147−7151；Dr.Howleyより入手、
ATCC37134…1985年版ATCCカタログに掲載）
をNagataらの方法の如く（Fukunaga、
Sokawa、＆ Nagata、（1984）Proc.Natl.
Acad.Sci.USA81巻5086−5090）Hind及び
Pvuで処理して8.4kbのDNA断片を得てお
く。 この8.4kbのDNA断片と上記の約2.7kbの
Hind−SalDNA断片を常法に従つて
T4DNAリガーゼにより処理し、前出の
「Molecular Cloning」に記載された塩化ルビ
ジウム法によりE.Coli DH株に形質転換し、
pHGA410由来Ｇ−CSFのcDNAを有するプラ
スミドを保持するE.coliコロニーを選別した。
このプラスミドをPTN−G4と命名する（図
７）。 一方、アデノウイルスType〔蛋白質核酸
酵素27巻12月号（1982年）、共立出版発行〕よ
りVA及びVAを含む約1700bpのSal−
Hind断片を含むプラスミド△PVAよりVA
およびVAを含む断片を回収した。この断
片を先に述べたPTNG4のHind部位に挿入し
てpTNG4VAαおよびpTNG4VAβを得た（図
７）。このプラスミドはアデノのVA遺伝子に
よりSV40の初期プロモーターからの転写産物
の発現効率を高めるようにしたものである。 実施例 13 C127細胞の形質転換及びその発現（＋VSE） 実施例12で得たpTN−G4をマウスC127細胞に
形質転換する前に制限酵素BamHで処理する。
即ちpTN−G4プラスミド20μｇを10ｍＭ Tris
−HCl（PH8.0）、７ｍＭ MgCl2、100ｍＭ、
NaCl、２ｍM2−メルカプトエタノール、0.01％
BSAの混合液100μに溶解せしめBamH（宝
酒造社製）20単位で処理し、フエノール処理、エ
ーテル処理、エタノール沈澱を行つた。 マウスC127細胞は10％牛胎児血清（GIBCO
社製）を含むDulbecco′s minimal essential培地
中で増殖させる。径５cmのプレートに増殖した
C127細胞に、プレート当たり上記調製DNAを
10μｇの割り合いでリン酸−カルシウム法
（Haynes、Ｊ＆Weissmann、Ｃ（1983）Nucleic
Acid Res.11巻687−706参照）にて形質転換を行
い、グリセロール処理の後、12時間37℃でインキ
ユベートした。 次に、この細胞を３枚の新しい径５cmプレート
に移し、１週間２回の割り合いで培地交換をし
た。16日目にFoci（集塊）を形成した部分をそれ
ぞれ新しいプレートに移し、上述の培地で継代培
養し、Ｇ−CSF生産能の高いクローンを選別し
た。その結果〜１mg／のレベルのＧ−CSF生産
がみられた。更にクローニングを続けた結果、10
mg／以上のレベルのＧ−CSF産生を確認した。 尚、宿主細胞には上記のC127細胞のほか
NIH3T3細胞も用いることができる。 実施例 14 CHO細胞によるＧ−CSFの発現（＋VSE） (1) PHGG4−dnfrの構築 実施例11で得たpHGA410プラスミド20μｇ
を10ｍMTris−HCl（PH7.5）、７ｍＭ MgCl2、
175ｍＭ NaCl、0.2ｍＭ EDTA、0.7ｍＭ
２−メルカプトエタノール、0.01％BSAを含む
溶液100μに溶解し、制限酵素Sal（宝酒造
社製）20単位を加え37℃一晩反応した後、フエ
ノール処理、エーテル洗浄、エタノール沈澱を
行つた。 次ぎに、得られたDNA沈澱を50ｍMTris−
HCl、５ｍＭ MgCl2、10ｍＭ DTT、１ｍ
ＭのdATP、dCTP、dGTP、TTPからなる反
応液100μに溶解し、E.Coli DNAポリメラー
ゼ−Klenow断片（宝酒造社製10μ）を加え
て14℃２時間反応させ、フエノール処理、エー
テル洗浄、エタノール沈澱を行つた。 このDNAにEcoRリンカーを付加する。即
ち上記DNAを50μの50ｍMTris−HCl（PH
7.4）、10ｍMDTT、0.5ｍＭスペルミジン、２
ｍMATP、2.5ｍＭヘキサミン塩化コバルト、
20μｇ／mlBSAからなる反応液に溶解し、
EcoRリンカー（宝酒造社製）を加え、200単
位のT4DNAリガーゼ（宝酒造社製）を加え４
℃、12〜16時間反応した。フエーノル処理、エ
ーテル洗浄、エタノール沈澱を常法に従つて行
つた後、該DNAをEcoRで部分消化し、１％
アガロースゲル電気泳動で約2.7kbのフラグメ
ントを3μｇ回収した。 一方、pAdD26SVpAプラスミド
（Kaufman、R.G.＆ Sharp、P.A（1982）J.
Mol.Biol.159巻601〜621及びKaufman、R.G.
＆ Sharp、P.A（1982）Mol.Cell Biol、２巻
1304〜1319）をEcoRにて処理し、バクテリ
アアルカリフオスフアクターゼ（BAP）処理
して脱リン酸を行う。すなわち、
pAdD26SVpA20μｇとEcoR20単位を反応液
50ｍMris−HCl（PH7.5）、７ｍＭ MgCl2、100
ｍＭ NACl、７ｍM2−メルカプトエタノー
ル、0.01％BSAの混合液100μに加え、37℃
10時間反応させ、続いて上記反応液にBAP5単
位を加え、68℃にて30分間反応した。その後フ
エノール処理をし、電気泳動にて
pAdD26SVpAのEcoR断片を回収した（〜
5μｇ）。 上記した約2.7kbの断片とpAdD26SVpAの断
片のそれぞれ0.5μｇずつをアニールした。この
プラスミドをE.coli DH株に塩化ルビジウム
法により形質転換してpHGG4−dhfrのプラス
ミドを保持するコロニーを選択する。得られた
プラスミドをpHGG4−dhfrと命名した（図８
ａ）。 なお、上記の別法として、pHGG4プラスミ
ドをSal処理し、EcoRリンカーを付加する
ことなしにEcoRで部分消化し約2.7kbの断片
を回収し、E.coli DNAポリメラーゼ−klenow
断片で該DNA断片を処理し末端をブラントエ
ンド化する。 一方前述と同じ方法でpAdD26SVpAのブラ
ントエンド化したEcoR断片を調製し、両者
をT4DNAリガーゼ処理してpHGG4−dhfrを
調製することもできる。 また実施例12の(1)で得られたPHGA410(H)を
実施例12の(2)記載した如く、制限酵素Hind
およびSalにて処理し、Hind−Sal断片
を上記pAdD26SVpAのブラントエンド化した
EcoRに連結してもPHGG4−dhfrを得ること
ができる（図８図）。 (2) pG4DR1およびpG4DR2の構築 (1)の項で述べたpAdD26SVpA10μｇを50ｍ
Ｍ Tris−HC（PH7.5）、７ｍＭ MgCl2、100
ｍＭ NaCl、７ｍM2−メルカプトエタノー
ル、0.01％BSAを含む反応液50mlに溶解し、制
限酵素EcoRおよびBamHがそれぞれ10単
位を加え、37℃10時間反応させた。常法に従い
フエーノル処理、エーテル洗浄を行つた。１％
低融点アガロース電気泳動にて、約2Kbの
DNA断片を回収した後、DNAポリメラーゼ−
Klenow断片にて、常法に従いブラントエンド
化して、フエノール処理、エーテル洗浄、エタ
ノール沈澱を行つた。 一方、実施例12の(1)で得られたpHGA410(H)
10μｇを10ｍＭ Tris−HCl（PH7.5）、７ｍＭ
MgCl2、60ｍＭ NaClを含む反応液50μに溶
解し、Hind10単位を加えて37℃、６時間反
応させた。常法に従い１％低融点アガロース電
気泳動にてDNA断片を回収し、更にBAP処理
をした後、Klenow断片にてブラントエンド化
した、フエノール処理、エーテル洗浄を行つた
後、先に述べた約2KbのDNA断片とT4DNA
リガーゼを用いてブラントエンド結合させた。
即ちそれぞれDNA断片1μｇを66ｍＭ Tris−
HCl（PH7.5）、6.6ｍＭ MgCl2、５ｍＭ
DTT、１ｍMATPを含む反応液30μｇに溶解
せしめ、T4DNAリガーゼ50単位を加え、６
℃、12時間反応せしめた後、E.ColiDH株に
形質転換した。このようにして、図８ｃに示す
pG4DR1およびpG4DR2を得た。 (3) 形質転換と発現 CHO細胞（dhfr-株、コロンビア大学Dr.L.
Chasinより入手）を９cm径のプレート（Nunc
社製）中10％仔牛血清を含むα最小必須培地
（α−MEM、アデノシン、デオキシアデノシ
ン、チミジン添加）で培養増殖し、これをリン
酸−カルシウム法（Wigler等、Cell14巻725頁
（1978））によつて形質転換した。 即ち(1)で調製したpHGG4−dhfrプラスミド
1μｇにキヤリアーDNA（子牛胸線DNA）を適
量加えて、TE溶液375μに溶解し1M
CaCl2125μを加える。３〜５分氷上で冷やし
500μの２×HBS（50ｍＭ Hepes、280ｍＭ
NaCl、1.5ｍＭリン酸緩衝液）を加え再び氷
冷後、上記のCHO細胞培養液１mlと混合し、
プレートに滴下した後、CO2インキユベーター
中で９時間培養した。プレートから培地を除去
し、TBS（Tris−Buffered Saline）にて洗浄
後、20％グリセロール含有TBS添加、再び洗
浄した後、非選択培地（前出α−MEM培地、
ヌクレオチド添加）を添加して２日間インキユ
ベートし選択培地（ヌクレオチド無添加）で
１：10に細胞を分割した。次いで２日毎に選択
培地にて培地交換を行いながら培養を続行し生
じたコロニーを選別して新しいプレートに移し
た。 新しいプレートでは0.02μMメトトレキセー
ト（MTX）存在下で増殖し、0.05μM、更に
0.1μM MTX存在下で増殖させてクローニング
を行つた。なおCHO細胞の形質転換はCHO細
胞に対しpHGG4とpAdD26SVpAを同時形質転
換（Co transformation）することによつても
行うことができる（Scahill等．Proc.Natl.
Acad.Sci.USA80巻4654−4658（1983）参照）。 また、以下に述べる方法にによつてもCHO
細胞の形質転換を行つた。即ち、上記(2)の項で
調製したpG4DR1あるいはpG4DR2をあらかじ
めそれぞれSalおよびKpnで処理してDNA
断片を得て、そのうちの10μｇを上記と同様に
CHO細胞に形質転換させた。このようにして
形質転換された細胞を選択培地にて上記の如く
倍養を続けると約７日目で明らかなコロニーが
１プレートにつき100個以上出現した。コロニ
ーを一つ一つ選別することなしに、再び新しい
プレートに移しかえた後、0.01μM MTX存在
下に選択培地で培養を続けると、十数個のコロ
ニーが出現した。更にこのような手法により
MTXの濃度を0.02μM、0.05μM、0.1μMと上
昇させ、生き残つてきたコロニーを選別した。
また、得られた十数個のコロニーをそれぞれ選
別した後、MTX濃度を上昇させても同様のコ
ロニーの選別を行うことができた。 又いわゆるポリシストロニツク遺伝子を有す
る組換えベクターを構築し、これを用いて
CHO細胞を形質転換することができた。即ち、
pAdD26SVpAをPst処理し、２つの断片を
回収しこれらとpBRG4由来のCSFcDNA断片
を結合することにより、アデノウイルスプロモ
ーター、CSFcDNA、DHFR、SV40のポリＡ
部位の順序に配列した組換えベクターを構築し
CHO細胞にいれて実施した。 実施例 15 発現物質のＧ−CSF活性検定（＋VSE） 実施例13及び実施例14で得られたC127細胞及
びCHO細胞の培養上清を夫々1N酢酸によりPH４
に調整し、等容量のｎ−プロパノールを加えた
後、生じた沈澱を遠心除去し、C8逆相系担体
（山村化学社製）を充填したオープンカラム（1φ
×２cm）に通し、50％ｎ−プロパノールで溶出さ
せた。溶出液を水で２倍に希釈した後、YMC−
C8カラム（山村化学社製）を用いた逆相高速液
体クロマトグラフイーにて0.1％TFAを含む30〜
60％の直線濃度勾配のｎ−プロパノールにて溶出
を行つた。ｎ−プロパノール濃度が40％付近の位
置で溶出される画分を分取した後、凍結乾燥し、
0.1Mグリシン緩衝液（PH９）に溶解せしめた。
このような過程を経ることによつて、ヒトＧ−
CSFはC127及びCHO細胞上清から約20倍に濃縮
された。 コントロールとして、前述の方法に従つてヒト
Ｇ−CSFcDNAを含まないプラスミドで細胞を形
質転換した後その培養上清を濃縮した。得られた
標品について参考例に記載された「ヒトＧ−
CSAの測定方法(a)」に基づいた方法にてヒトＧ
−CSF活性を検定した。尚、発現効率が十分に高
い場合には培養上清を直接検定に供してもよい。
ここでは濃縮した例について結果を示した。その
結果は表−１の通りであつた。
ロニー形成をさせるために必要な、特異的な刺激
因子、すなわちコロニー刺激因子（以下「CSF」
と略記する）活性を有する糖蛋白質、及びその製
造方法に関する。 〔従来の技術〕 ２層軟寒天培養法で、上層に標的細胞として骨
髄細胞を、下層に腎細胞や胎児細胞を入れて培養
すると、上層の細胞の一部が増殖分化し、好中球
系顆粒球（以下「顆粒球（granulocyte）」と称
す）や単球マクロフアージからなるコロニーが形
成されることから、生体内にコロニー形成を促進
する因子が存在することが知られていた
（PluznikとSach；J.Cell.Comp.Physiol、66巻
319頁（1965）、BradleyとMetcalf；Aust.J.Exp.
Biol.Med.Sci.44巻287頁（1966））。 CSFと総称されるこの因子は、正常に広く生体
内分布する細胞、たとえば、Ｔ細胞、単球マクロ
フアージ、繊維芽細胞、内皮細胞などより産生さ
れることが知られている。CSFには顆粒球・単球
マクロフアージの幹細胞に作用して、その増殖を
刺激し分化を誘導して、軟寒天中で顆粒球や単球
マクロフアージから成るコロニーを形成させる作
用をもつ顆粒球−単球マクロフアージCSF（GM
−CSFと略記する）、主として単球マクロフアー
ジのコロニーを形成させる作用をもつ単球マクロ
フアージCSF（Ｍ−CSFと略記する）より未分化
な多能性幹細胞に作用する多能性CSF（multi−
CSFと略記する）、あるいは本発明の如き、主と
して顆粒球形コロニーを形成させる作用をもつ顆
粒球CSF（Ｇ−CSFと略記する）などのサブクラ
スが存在し、それぞれのサブクラスによつて標的
細胞の分化段階も異なることが考えられる様にな
つてきた［Asano；代謝−Metabolism and
Disease、22巻 249頁（1985）、Yunis等；
“Growth and Maturation Factors”edited by
Guroff、John Wiley ＆ Sons、NY、１巻、
209頁（1983）］。 従つて個々のサブクラスを精製し、その化学的
性状や生物学的性状をより詳細に調べることは構
血機構や種々の血液学的疾患の病態の解析にきわ
めて重要なことである。 中でもＧ−CSFの生物学的作用として、骨髄性
白血病細胞の分化誘導と成熟顆粒球の機能亢進が
注目されており、特に白血病の治療と予防へのＧ
−CSFの臨床的有用性が大いに期待されてきた。 〔発明が解決しようとする問題点〕 Ｇ−CSFの単離精製のために従来行われてきた
試みは、細胞倍養法を用いてその培養上清からＧ
−CSFを単離する方法であるが、Ｇ−CSFが低濃
度しか産生されないこと、大量の倍養液から微量
のＧ−CSFを得るには複雑な精製過程を必要とす
るなどの難点をかかえ未だ大量の均一なＧ−CSF
を得るには至つていなかつた。従つて、組換え
DNA技術を用いてＧ−CSFを大量に製造するこ
とが渇望されていた。 〔問題点を解決するための手段〕 かかる状況において、本発明者らはヒトＧ−
CSF活性を有するポリペプチドをコードする遺伝
子を単離し、当該遺伝子を宿主細胞内で発現する
ことに成功した。 本発明は図３Ｂ，又は図４Ｂ，に示された
アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する
cDNA断片を含む組換えベクターで形質転換され
た哺乳動物細胞を培養し、次いで産生されたヒト
顆粒球コロニー刺激因子活性を有する糖蛋白質を
分解することを特徴とするヒト顆粒球コロニー刺
激因子活性を有する糖蛋白質の製造方法を提供す
るものである。 以下、本発明を詳細に説明する。 本発明で用いられるヒトＧ−CSF活性を有する
ポリペプチドをコードする遺伝子としては、シヨ
糖密度勾配遠心法により15〜17S画分として得ら
れる、ヒトＧ−CSF活性を有するポリペプチドを
コードするメツセンジヤーRNA（mRNA）に相
補的なDNA（cDNA）がある。 本出願人は２系列のこのようなcDNAを得た。
そのうちの１つの系列のcDNAは図３Ｂのポリペ
プチド又はをコードする遺伝子あるいはその
一部を有するものであり、さらに詳細には図３Ａ
の塩基配列の5′−末端から32〜34ヌクレオチド位
のATGから650〜652ヌクレオチド位のCCCまで
の配列、122〜124位のACCから650〜652位の
CCCまでの配列または図３Ａに記載された配列
あるいはその一部を有するものである。 この系列のcDNAをcDNA（＋VSE）と称す
る。 他の系列のcDNAは図４Ｂのポリペプチド又
はをコードする遺伝子あるいはその一部を有す
るものであり、さらに詳細には図４Ａの塩基配列
の5′−末端から31〜33ヌクレオチド位のATGか
ら640〜642ヌクレオチド位のCCCまでの配列、
121〜123位のACCから640〜642位のCCCまでの
配列または図４Ａに記載された配列あるいはその
一部を有するものである。 この系列のcDNAをcDNA（−VSE）と称す
る。 上記の遺伝子は、例えばＧ−CSF活性を有する
ポリペプチドを産生する能力を有する哺乳動物細
胞等からＧ−CSFをコードするmRNAを調製し
た後、既知の方法により２本鎖cDNAに変換し、
このDNAを含む組換体の集合（以下cDNAライ
ブラリーと称する）から既知の方法によりスクリ
ーニングすることによつて得られる。 一方、前記mRNAの供給源となる哺乳動物細
胞は本発明においては、ヒト口腔底癌由来の細胞
株CHU−２（collection Nationale De Cultur
es De Microorganismes（C.N.C.M）寄託番号Ｉ
−483）であるが、腫瘍細胞株にかぎらず、哺乳
動物から分離できる細胞、あるいは樹立した他の
細胞株でもよい。 又、mRNAの調製はすでに他のいくつかの生
理活性タンパクの遺伝子をクローン化する際、用
いられた方法、例えば、バナジウム複合体等を用
いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面
活性剤処理、フエノール処理を行う（Bergerと
Birk enmeier；Biochemistry18巻5143頁
（1979）を参照）か、グアニジンチオシアナート
処理後、CsCl密度勾配遠心を行う（Chirgwin
等；Biochemistry18巻5294頁（1979）を参照）
ことによつて、全RNAを得た後、オリゴ（dT）
−セルロースやセフアロース2Bを担体とするポ
リＵ−セフアロース等を用いたアフイニテイーカ
ラム法あるいはバツチ法によりポリ（A+）RNA
（mRNA）を得ることができる。またシヨ糖密度
勾配遠心法等によりポリ（A+）RNAを更に分画
することもできる。 上記の如くして得られたmRNAが、Ｇ−CSF
活性をもつポリペプチドをコードするものである
ことを確認するためには、mRNAをタンパク質
に翻訳させ、生理活性を調べるか、抗Ｇ−CSF抗
体を用いてそのタンパクを同定する等の方法を行
えばよい。例えば、アフリカツメガエル（Xeno
pus laevis）の卵母細胞にmRNAを注入して翻
訳させたり（Gurdon等；Nature、233巻177頁
（1972）を参照）、あるいはウサギ網状赤血球
（Reti culocyte）系や小麦胚芽（Wheat germ）
系を利用した翻訳反応が行われている（Schleif
とWensin ｋ；“Practical Methods in
Molecular Biology”、Springer−Verlag、NY、
（1981））。 Ｇ−CSF活性の検定は骨髄細胞を用いた軟寒天
培養法を適用して実施できる。それらの手法につ
いては総説がある（Metcalf；“Hemopoietic
Colonies”、Springer−Verlag、Berlin、
Heideiberg、NY（1977））。 前述の如き方法で得たmRNAを鋳型にして１
本鎖cDNAを合成した後、この１本鎖cDNAから
２本鎖cDNAを合成し、適当なベクターDNAと
の組換えプラスミドを作成する。これで大腸菌
（Escherichia coli）などを形質転換して、形質
転換株のDNA群（cDNAライブラリー）を得る。 mRNAから２本鎖cDNAを得るには、例えば
mRNAの3′−末端にあるポリＡ−鎖に相補的な
オリゴ（dT）をプライマーとして逆転写酵素で
処理するか、またはＧ−CSFタンパクのアミノ酸
配列の一部に相応するオリゴヌクレオチドを合成
し、これをプライマーとして逆転写酵素で処理し
てmRNAに相補的なcDNAを合成する。２本鎖
cDNAは、アルカリ処理でmRNAを分解・除去
した後、得られた１本鎖cDNAを逆転写酵素又は
DNAポリメラーゼ（例えばKlenow断片等）
処理後SIヌクレアーゼ等で処理して得るか、ある
いは、直接RNase ＨおよびDNAポリメラーゼ
（例えば、大腸菌のDNAポリメラーゼ等）等で
処理することによつても得ることができる（例え
ば、Naniatis等；Molecular cloning、Cold、
Spring Harborlaboratory（1982）およびGubler
とHoffman；Gene25巻263頁（1983）を参照）。 このようにして得られた２本鎖cDNAを適当な
ベクター、例えば、pSC101、pDF41、ColE1、
pMB9、pBR322、pBR327、pACYC1などに代
表されるEK型プラスミドベクターや、λgt.λc、
λgt10、λgtWESなどに代表されるフアージベク
ターなどに組み込んだ後、大腸菌（X1776；
HB101；DH1、C600株など）等を形質転換して
cDNAライブラリーを得ることができる（例え
ば、前出“Molecular cloning”を参照）。 ２本鎖cDNAをベクターと連結させるには、
DNA末端に連結可能な末端をつけるべく、適当
な化学合成DNA断片を付加し、予め制限酵素を
用いて開裂させたベクターDNAとATP存在下に
T4フアージDNAリガーゼで処理することにより
行うことができる。あるいは、予め制限酵素を用
いて開裂させたベクターDNAと２本鎖cDNAの
それぞれにdG、dC−鎖（あるいはdA、dT−鎖）
を付加した後、例えば両DNAを含む溶液を徐冷
することによつても行うことができる（前記
Molecular cloningを参照）。 こうして得られた組換えDNA体による宿主細
胞の形質転換は、例えば宿主細胞が大腸菌の場合
Hanahanが詳細に記述している如き方法（J.
Mol.Biol.；166巻557頁（1983））、すなわち、
CaCl2やMgCl2又はRbClを共存させて調製したコ
ンピテント細胞に該組換えDNA体を加えること
により実施することができる。 目的とする遺伝子を保有する細胞を検索するに
は、インターフエロンcDNAのクローン化で用い
られたプラス−マイナス法（Taniguchi等；
Proc.Jpn.Acad.55巻Ser.B、464頁（1979））や、
ハイブリダイゼーシヨン−トランスレーシヨンア
ツセイ法（Nagata等；Nature284巻316頁
（1980））など、又は該タンパク質のアミノ酸配列
をもとにして化学合成したオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いたコロニーあるいはプラークハイブ
リダイゼーシヨン法（Wallace等；Nucleic
Acids Res.９巻879頁（1981）およびBentonと
Davise：Science196巻180頁（1977）などを用い
ればよい。 このようにしてクローン化されたヒトＧ−CSF
活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を
含む断片は適当なベクターDNAに再び組み込む
ことにより、他の原核生物または真核生物の宿主
細胞を形質転換させることができる。更にこれら
のベクターに適当なプロモーター及び形質発現に
係る配列を導入することにより、それぞれの宿主
細胞に於いて遺伝子を発現させることが可能であ
る。 哺乳動物由来の宿主細胞としては、COS細胞、
チヤイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、Ｃ
−127細胞、HeLa細胞などがあげられ、これ等
の細胞を形質転換させるベクターとしては、
pSV2−gpt（MulliganとBerg；Proc.Natl.Acad.
Sci.USA；78巻2072頁（（1981）を参照）等があ
る。これ等のベクターは複製起源、選択マーカ
ー、発現させようとする遺伝子の前に位置するプ
ロモーター、RNAスプライス部位、ポリアデニ
ル化シグナルなどを含んでいる。 哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモータ
ーとしてはレトロウイルス、ポリオーマウイル
ス、アデノウイルス、シミアンウイルス40
（SV40）などのプロモーターを用いればよい。例
えばSV40のプロモーターを使用する場合は、
Mulliganなどの方法（Nature277巻108頁
（1979））に従えば容易に実施することができる。 複製起源としては、SV40、ポリオーマウイル
ス、アデノウイルス、牛パピローマウイルス
（BPV）等の由来のものを用いることができ、選
択マーカーとしては、ホスホトランスフエラーゼ
APH（3′）あるいは（neo）遺伝子、チミジ
ンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチン−
グアニンホスホリボシルトランスフエラーゼ
（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素
（DHFR）遺伝子等を用いることができる。 以上の如き宿主−ベクター系を用いてヒトＧ−
CSF活性を有するポリペプチドを得るには、上記
ベクターの適当な部位に該遺伝子を組み込んだ組
換えDNA体により宿主細胞を形質転換させた後、
得られた形質転換体を培養すればよい。さらに細
胞内または培養液から該ポリペプチドを分離・精
製するには、公知の手段を用いて行うことができ
る。 一般に真核生物の遺伝子はヒトインターフエロ
ン遺伝子等で知られているように、多形現象
（polymorphysm）を示すと考えられ（例えば
Nishi等；J.Biochem.97巻153頁（1985）を参
照）、この多形現象によつて１個またはそれ以上
のアミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配列
の変化はあつてもアミノ酸は全く変わらない場合
もある。 また例えば図３Ｂあるいは図４Ｂのアミノ酸配
列の中の１個またはそれ以上のアミノ酸を欠くか
又は付加されたポリペプチド、あるいは１個また
はそれ以上のアミノ酸が１個またはそれ以上のア
ミノ酸で置換されたポリペプチドでもＧ−CSF活
性を有することがある。例えば、ヒトインターロ
イキン２（IL−２）遺伝子のシステインに相当す
る塩基配列をセリンに相当する塩基配列に変換し
て得られたポリペプチドがインターロイキン２活
性を保持することもすでに公知となつている
（Wang等；Science、224巻1431頁（1984））。そ
れゆえ、それ等天然に存在するかあるいは人工合
成されたポリペプチドがヒトＧ−CSF活性を有す
る限りそれ等のポリペプチドをコードする遺伝子
を含む組換ベクターによつて形質された動物細胞
（形質転換体）を培養して得られた糖蛋白質は全
て本発明に含まれる。 本発明のヒトＧ−CSF活性を有する糖蛋白質を
得るために必要な遺伝子、該遺伝子を有する組換
えベクター及びこれを含有する形質転換体、並び
にこの形質転換体を培養し、取得した目的の糖蛋
白質、夫々についてその製法の概要を説明すると
以下の通りである。 (1) プローブの調製 腫瘍細胞株CHU−２の培養上清から精製し
て得られた均一ヒトCSFタンパクについてＮ末
端よりアミノ酸配列を決定し、さらにブロムシ
アン分解、トリプシン処理などにより断片化し
た後その断片についてもアミノ酸配列を決定し
た［実施例３(i)、(ii)、(iii)］。 そのアミノ酸配列中から図１に示される配列
に対応する３種類のヌクレオチドプローブ(A)、
プローブ（LC）およびプローブ（IWQ）を合
成した（実施例４）。 プローブ(A)は連続した14個のヌクレオチドか
らなる混合型プローブである。プローブ
（IWQ）は、ヒトコレシストキニン遺伝子のク
ローン化で用いられた如き（Takahashi等；
Proc. Natl.Acad.Sci.、USA、82巻1931頁
（1985））デオキシイノシンを使用した30個の連
続したヌクレオチドである。 プローブ（LC）は実施例３(i)に示したアミ
ノ酸配列のＮ末端から32〜39番に相当する部分
を、図３に示した塩基配列を基にして合成した
24個のヌクレオチドからなるプローブである。 ヌクレオチドの化学合成は改良型ホスホトリ
エステル法を固相法に適用して行うことがで
き、Narangのの総説に記述されている
（Tetrahedron39巻３−22頁（1983））。 使用するプローブは、本発明で用いたプロー
ブ以外の位置のアミノ酸配列に基づくものであ
つてもよい。 (2) cDNAライブラリーの構築 CHU−２細胞にグアニジンチオシアナート
溶液を加えてホモジナイズし、CsCl密度勾配
遠心法により全RNAを得る。 この全RNAからオリゴdTセルロースカラム
によりポリ（A+）RNAを選別した後、逆転写
酵素により１本鎖cDNAを合成し、RNase Ｈ
およびE.coliDNAポリメラーゼを用いて、
２本鎖cDNAを得た。得られた２本鎖のcDNA
にdC鎖を付加し、Pst切断部位にdG鎖を付
加したpBR322ベクターとつなぎ合せて、大脹
菌X1776株を形質転換させ、pBR322系cDNA
ライブラリーを構築した（実施例５、６）。 同様にEcoRIリンカーを用いて、２本鎖
cDNAをλgt10ベクターと連結し、λフアージ
系cDNAライブラリーを構築した（実施例７）。 (3) スクリーニング pBR322系cDNAライブラリー由来の組換え
体をワツトマン541濾紙に固定し、 32Pで放射
標識したプローブIWQを用いて、コロニーハ
イブリダイゼーシヨンを行つた結果、１個のク
ローンが選別できた。このクローンを、サザン
ブロツテイング法（Southern；J.Mol.Biol.98
巻503頁（1975））を用いて更に詳細に検討した
ところ、プローブＡともにハイブリダイズし
た。 このクローンの塩基配列をジデオキシ法
（Sanger；Science214巻1205頁（1981））によ
つて決定した。 得られたcDNAインサートの塩基配列を図２
に示す。図２に示される如く、このcDNAイン
サートはプローブIWQおよびプローブＡを含
む308塩基対からなり、実施例３(iii)に示したア
ミノ酸配列を含む83個のアミノ酸をコードする
オープンリーデイングフレームを有しているこ
とがわかつた。 この308塩基対を含むpBR322由来のプラス
ミドを以下pHCS−１と略記する（実施例８）。 pHCS−１から得られる308塩基対を含む
DNA断片をニツクトランスレーシヨン法（前
出、Molecular Cloningを参照）にて放射標識
し、これをプローブとしてλgt10由来のcDNA
ライブラリーをプラークハイブリダイゼーシヨ
ン（BentonとDavis；Science196巻180頁
（1977）によりスクリーニングして５個のクロ
ーンを得、cDNAを含むと思われるクローンに
ついてその塩基配列を前述と同様の方法で決定
した（図３Ａ）。 図３Ａに示される如く、このcDNAインサー
トは１つの大きなオープンリーデイングフレー
ムを有する。 このcDNAによつてコードされるアミノ酸配
列は図３Ａに示された如く演えきできる。 実施例３(i)に示されているＧ−CSFタンパク
のＮ末端アミノ酸配列との比較により、本
cDNAは5′−末端から32〜34ヌクレオチド位の
ATG配列から始まり、119〜121位のGCC配列
で終わる90塩基対によつてコードされるシグナ
ルペプチドおよび122〜124位のACC配列から
始まり650〜652位のCCC配列で終わる531塩基
対によつてコードされる成熟Ｇ−CSFポリペプ
チドに相当する塩基配列を含んでいることがわ
かつた。従つて図３Ｂに示されたアミノ酸配列
のポリペプチドは207個のアミノ酸からなり、
その分子量は22292.67ダルトンと計算された。
同様にアミノ酸配列のポリペプチドは177個
のアミノ酸からなり、その分子量は18986.74ダ
ルトンであつた（実施例９）。 但しタンパク質の開始部位に関しては、32〜
34位あるいは68〜70位のATGも同様に考え得
る。EcoR1切断部位にこのcDNA（＋VSE）を
挿入したPBR322を保持するエシエリヒア・コ
リ（E.coli）X1776株は、工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている（FERM BP
−954）。 図５には、得られた遺伝子の制限酸素切断部
位を示した。 また、このcDNAをpBR327［Soberon等；
Gene９巻287頁（1980）］とEcoR部位で結合
したプラスミドをpBRG4と称する。 このようにして得られたpBRG4を、制限酵
素EcoRで処理して得られる約1500塩基対の
cDNAを含むDNA断片をニツクトランスレー
シヨン法（前出のMolecular cloningを参照）
にて放射標識し、これをプローブとして、再び
λgt10由来のcDNAライブラリーをプラークハ
イブリダイゼーシヨン（前出BentonとDavisの
文献参照）によりスクリーニングした。この
際、同時にλフアージDNAを固定したニトロ
セルロース濾紙を２枚作成しておき、先り述べ
たプローブLCにて同様のプラークハイブリダ
イゼーシヨンを行い、両プローブでポジテイブ
となるフアージを選別した。完全長と思われる
クローンを選別し、ジデオキシ法を用いて
cDNAインサートの塩基配列を決定したところ
図４Ａに示される如くであつた。 このcDNAは一つの大きなオープンリーデイ
ングフレームを有し、コードされるアミノ酸配
列は図４Ａに示された如く演えきできる。 実施例３(i)に示されているＧ−CSFタンパク
のＮ末端アミノ酸配列との比較により、本
cDNAは5′−末端から31〜33ヌクレオチド位の
ATG配列から始まり、118〜120位のGCC配列
で終わる90塩基対によつてコードされるシグナ
ルペプチドおよび121〜123位のACC配列から
始まり640〜642位のCCC配列で終る522塩基対
によつてコードされる成熟Ｇ−CSFポリペプチ
ドに相当する塩基配列を含んでいることがわか
つた。従つて図４Ｂに示されたアミノ酸配列
のポリペプチドは204個のアミノ酸からなり、
その分子量は21977.35ダルトンと計算された。
同様にアミノ酸配列のポリペプチドは、174
個のアミノ酸からなり、その分子量は18671.42
ダルトンであつた（実施例10）。 但しタンパク質の開始部位に関しては、31〜
33位以外に58〜60位あるいは67〜69位のATG
も同様に考え得る。 EcoR切断部位に本cDNA（−VSE）を挿
入したpBR327を保持するエシエリヒア・コリ
（E.coli）X1776株は工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている（FERM BP−955）。 図５には、得られた遺伝子の制限酵素切断部
位を示した。 また、このcDNAをpBR327とEcoR部位
で結合したプラスミドをPBRV2と称する。 (4) 動物細胞用組換えベクターの構築 宿主細胞としてC127細胞、NIH3T3細胞を
使用する場合の組換えベクター（BPV由来）
およびCHO細胞を使用する場合の組換えベク
ター（DHFRを含む）の構築を＋VSE系、−
VSE系cDNAについて各々行つた。ここでは
代表的な例について述べるが詳しくは実施例を
参照されたい。 (A) ＋VSE系組換えベクターの構築 前記(3)で得られたcDNA（＋VSE）断片を
ベクターpdKCRに組み込みpHGA410プラス
ミドとした後（実施例11）（図６）これを
EcoRで部分消化し、末端をブラントエン
ド（blunt end）にする。このDNAにHind
リンカーを付加し、次いでHind処理を
しT4DNAリガーゼ処理した後これで塩化ル
ビジウム法（前出 Molecular Cloning参
照）を用い、E.coli DH株を形質転換し
た。得られたプラスミドをpHGA410(H)と命
名する（図７）。 pHGA410(H)をSalで処理し、次いで末
端をブラントエンド化した後再びHind処
理しHind−Sal断片を回収する。 一方、ウシ乳頭腫ウイルスの形質転換断片
を有するpdBPV−１プラスミドをHind、
Pvuで処理し大きいほうのDNA断片を分
離し、これと先のHind−Sal断片を結合
する。これを用いてE.coli DH株を形質転
換しpHGG4由来のCFS−cDNAを有するプ
ラスミド、pTN−G4を得る（図７）（実施
例12）。 一方、pHGA410プラスミドかpHGA410
(H)プラスミドとpAdD26SVpAプラスミドを
用いてCHO細胞用組換えベクター（＋VSE）
であるpHGG4−dhfrを構築した（図８ａ及
びｂ）（実施例14）。 更にpAdD26SVpAからDHFR遺伝子を含
む約2KbのDNA断片をEcoRおよびBamH
処理により回収し、pHGA410(H)のHind
部位に挿入してpG4DR1とpG4DR2を構築し
た（図８ｃ）（実施例14）。 (B) −VSE系組換えベクターの構築 前記(3)で得られたcDNA（−VSE）断片を
ベクターpdKCRに組み込みpHGV2プラスミ
ドとした後（実施例17）これをEcoRで部
分消化し、末端をブラントエンド（blunt
end）にする。このDNAにHindリンカー
を付加し、次いでHind処理をしT4DNA
リガーゼ処理した後、これで塩化ルビジウム
法（前出Molecular Cloning参照）を用い、
E.coli DH株を形質転換した。得られたプ
ラスミドをpHGV2(H)と命名する（図１０）。 pHGV2(H)をSalで処理し、次いで末端
をブラントエンド化した後再びHind処理
しHind−Sal断片を回収する一方、ウシ
乳頭腫ウイルスの形質転換断片を有する
pdBPV−１プラスミドをHind、Pvuで
処理し大きい方のDNA断片を分離し、これ
と先のHind−Sal断片を結合する。これ
を用いてE.ColiDHI株を形質転換しpHGV2
由来のCSF−cDNAを有するプラスミド、
pTN−V2を得る（図１０）（実施例18）。 ＋VSEと同様にpHGV2プラスミドかPH
GV2(H)プラスミドとpAdD26SVpAプラスミ
ドを用いてCHO細胞用組換えベクター（−
VSE）であるpHGV2−dhfrを構築した（図
１１ａ及びｂ）（実施例20）。 更にpAdD26SVpAからDHFR遺伝子を含
む約2KbのDNA断片をEcoRおよびBamH
処理により回収し、pHGV2(H)のHind部
位に挿入してpV2DR1とpV2DR2を構築した
（図１１ｃ）（実施例20）。 (5) 動物細胞による形質発現 ここでは代表的な例について述べるが、その
他の場合については各実施例を見られたい。 マウスC127細胞による形質発現 pTN−G4プラスミドまたはpTN−V2プラス
ミドをBamHで処理しておき、これを用いて
培養増殖させておいたC127細胞をリン酸−カル
シウム法で形質転換する。得られた形質転換細胞
を培養しCSF生産能の高いクローンを選別する。 形質発現したＧ−CSFはこれらの形質転換細胞
の培養液から回収精製され、ヒト−Ｇ−CSF活性
を示すことが確認された。又試料のアミノ酸分析
及び糖含有量分析により目的糖蛋白質の確認もな
された。 尚、糖含有分析に関しては、アミノ酸分析に用
いたCSF試料をエルソン−モルガン法によるアミ
ノ糖定量、オルシノール硫酸法による中性糖の定
量またチオバルビツール法によるシアル酸の定量
にてそれぞれ実施した。 定量方法は生化学実験講座第４巻「糖質の化学
（下巻）」（東京化学同人）の13章に記載されてい
る。各定量値から重量％を換算した結果、発現ベ
クター及び培養条件等の違いにより、得られたＧ
−CSFの糖含量は１〜20（重量％）の範囲に分布
していた。 実施例 以下実施例をあげて本発明を詳細に説明する
が、その前にCSF活性の測定法について参考例で
説明しておく。 参考例 CSF活性の測定方法 本発明において用いられたCSF活性（以下
CSAと略す）の測定方法は次のとおりである。 「CSAの測定方法」 (a) ヒト骨髄細胞を用いる場合： Bradley T.R.、Metcalf D.等の方法 （Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci.44巻287〜300
頁、1966年）に準じて単層軟寒天培養法により
行つた。すなわちウシ胎児血清0.2ml、被検検
体0.1ml、ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液0.1ml
（１〜２×105有核細胞）、改変McCoy′s5A培養
液0.2ml、寒天を0.75％含む改変McCoy′s5A培
養液0.4mlを混合して直径35mmの組織培養プラ
ステイツクデイツシユに入れて固まらせたの
ち、37℃、５％炭酸ガス／95％空気、100％湿
度の条件で培養を行い、10日後に形成されたコ
ロニー数（50個以上の細胞からなる集落を１コ
ロニーとする）を数え、１個のコロニーを形成
する活性を１単位（Unit）としてCSAを求め
た。 (b) マウス骨髄細胞を用いる場合： ウマ血清0.4ml、被検検体0.1ml、C3H／He
（メス）マウスの骨随細胞浮遊液0.1ml（0.5〜
１×105有核細胞）、寒天を0.75％含む改変
McCoy′s5A培養液0.4mlを混合し直径35mmの組
織培養用プラステイツクデイツシユに入れて固
まらせたのち、37℃、５％炭酸ガス／95％空
気、100％湿度の条件下にて５日間培養し、形
成されたコロニー数（50個以上の細胞からなる
集落を１コロニーとする）を数え、１個のコロ
ニーを形成する活性を１単位（Unit）として
CSAを求めた。 尚、上記(a)、(b)の方法において用いた「改変
McCoy′s5A培養液および(a)で用いたヒト骨髄
非付着性細胞浮遊液は次の如くして作成した。 「改変McCoy′s5A培養液（２倍濃度）」
McCoy′s5A培養液（GIBCO社製）12ｇ、
MEMアミノ酸ビタミン培地（日水製薬社製）
2.55ｇ、重炭酸ナトリウム2.18ｇ、ペニシリン
Ｇカリウム50000単位を２回蒸溜水500mlに溶解
後、0.22μｍのミリポアフイルターにて濾過滅
言を行つた。 「ヒト骨随非付着性細胞浮遊液」 健常人胸骨せん刺により得た骨髄液を
PRMI1640培養液にて５倍に希釈し、Ficol−
Paque液（フアルマシア社製）に重層し、400
×ｇ、30分、25℃にて遠心を行い、界面の細胞
層（比重＜1.077）を回収する。この細胞を洗
浄後、20％ウシ胎児血清を含むRPM1640培
養液にて５×106Cell／mlの濃度に調整し、25
cm2の組織培養用プラスチツクフラスコに入れ、
炭酸ガス培養器にて30分間インキユベートした
のち、上清の非付着性細胞を回収し、再度25cm2
プラスチツクフラスコに入れ、２時間30分イン
キユベートしたのち、上清の非付着性細胞を集
めて用いた。 実施例 １ 「CHU−２」の樹立 著明な好中球の増多が認められた口腔底癌患者
の腫瘍をnu／nuマウスに移植した。この腫瘍は
移植約10日後に著明な腫瘍の増大と好中球の増多
が認められた。この腫瘍を移植12日後に無菌的に
摘出し、１〜２mm3角に細切し、これを以下の如
く培養した。 上記細切した腫瘍塊10〜15片を50mlのプラスチ
ツク遠心管に入れ、５mlのトリプシン溶液（トリ
プシン0.25％、EDTA0.02％含む）を加え、37℃
の温浴中で10分間振とうしたのち上清を捨て、再
度、同トリプシン溶液５mlを加え、37℃で15分間
攪拌しながらトリプシン消化を行つた。 上清の細胞浮遊液を回収し、ウシ胎児血清を１
ml加えてトリプシンの作用を止めたのち氷中に保
存した。 以上の操作を再度行い細胞浮遊液を回収し、前
回の分と合わせて1500r.p.m10分間の遠心により
細胞ペレツトを得た。 この細胞ペレツトをウシ胎児血清を10％含むＦ
−10にて２回洗浄したのち、25cm2のプラスチツク
培養フラスコに細胞濃度５×106個／フラスコに
なるようにして植え込んだ、ウシ胎児血清を10％
含有するＦ−10培養液を用い、炭酸ガスインキユ
ベーター（炭酸ガス濃度５％）、湿度100％）中に
て一晩インキユベートしたのち、上清を非付着細
胞と共に除去し、新しい培養液を加えて培養を継
続した。培養開始後６日目に細胞がいつぱいに増
殖したので、この時点で培養液を新しいものに替
えた。翌日、この培養液を捨て、RPM1640で
５倍希釈した抗マウス赤血球抗体（Cappel社製）
２mlと同じくRPM1640で2.5倍希釈したモルモ
ツト補体（極東製薬社製）２mlを加え37℃、20分
間インキユベートした。インキユベーシヨン終了
後ウシ胎児血清を10％含むＦ−10にて２回洗浄し
nu／nuマウス由来のフイブロブラストを条去し
引き続きウシ胎児血清を10％含むＦ−10倍養液を
加えて、さらに２日間培養を行つた後細胞の一部
を取り出し限界希釈法によりクローニングを行つ
た。得られた11個のクローンについてCSF活性を
調べたところ、他のものよりも約10倍高い活性を
示すクローン（CHU−２）が得られた。 実施例 ２ CSFの単離 上述の如くして樹立された細胞が完全に密に増
殖した150cm2の培養フラスコ２本より細胞を回収
し、これをウシ胎児血清を10％含有するＦ−10培
養液500mlに浮遊させたのち、1580cm2のガラス製
ローラーボトル（Belco社製）に移し、0.5r.p.m.
の速度で回転培養を行つた。細胞がローラーボト
ルの内壁に完全に密に増殖した時点で培養液を血
清を含まないRPM1640に交換し、４日間培養
したのち培養上清を回収し、ウシ胎児血清を10％
含有するＦ−10を加えて培養を続行する。３日間
培養したのち再び血清を含まないRPMI1640に液
替を行い、４日後に培養上清を回収した。以下同
様の操作をくり返すことにより、毎週１ボトルよ
り500mlずつの血清を含まない培養上清が得られ、
しかもこの方法によりかなり長期間にわたつて細
胞を維持し、培養上清を回収することが可能であ
つた。得られた培養上清５を１バツチとし、こ
れに0.01％ツイーン20を添加後Hollow Fiber
DC−４およびAmicon PM−10（アミコン社製）
を用いた限外濾過法により約1000倍に濃縮したの
ち、これを以下の順序で精製した。 (i) 直径4.6cm、長さ90cmのUltrogel AcA54カラ
ム（LKB社製）を用い、0.15M NaCl及び0.01
％ツイーン20（半井化学社製）を含む0.01Mト
リス塩酸緩衝液（PH7.4）を用いて前記濃縮し
た培養上清５mlを流速約50ml／時間でゲル濾過
した。尚カラムはあらかじめウシ血清アルブミ
ン（分子量67000）、オボアルブミン（分子量
45000）、チトクロームＣ（分子量12400）にてキ
ヤリブレーシヨンを行つた。ゲル濾過終了後各
フラクシヨンより0.1mlずつを採取し、10倍に
希釈した後、前述した「CSAの測定方法(b)」
により活性を示す画分を調べた。この結果、先
ずVe＝400〜700mlの画分がマクロフアージ優
位のCSAを示し、Ve＝800〜1200mlの画分が顆
粒球優位のCSAを示すことがわかつたので、
後者の画分を集めPM−10（アミコン社製）を
用いる限外濾過器によつて約５mlに濃縮した。 (ii) 上記濃縮画分にｎ−プロパノール（東京化成
社製、アミノ酸配列決定用）を30％含む0.1％
トリフルオロ酢酸水溶液を添加し、氷中に15分
間程度放置したのち、15000r.p.m.10分の遠心
により沈澱を除去した。次いで先のｎ−プロパ
ノールおよびトリフルオロ酢酸を含む水溶液で
平衡化したμBondapakC18カラム（Waters社
製、セミ分取用、８mm×30cm）に吸着後、30〜
60％の直線濃度勾配のｎ−プロパノールを含む
0.1％トリフルオロ酢酸水溶液で順次溶出した。
高速液体クロマト装置は日立685−50型を、検
出は日立638−41型検出器（いずれも日立製作
所製）を用い、220nｍと280nｍの吸収を同時
に測定した。溶出後、各画分より10μlを分取
100倍希釈したのち、前述の「CSAの測定法
(b)」により活性を示す画分を調べた。この結
果、ｎ−プロパノール40％にて溶出されるペー
クに活性が認められたので、このピークを集め
再度同じ条件で再クロマトを行い上記と同様に
してCSAを調べたところ、やはりｎ−プロパ
ノール40％の位置のピークに活性が認められた
ので、このピークを集め（４フラクシヨン＝４
ml）を凍結乾燥した。 (iii) 上記凍結乾燥粉末をｎ−プロパノールを40％
含む0.1％トリフルオロ酢酸水溶液200μに溶
解し、TSK−G3000SWカラム（東洋曹達社
製、7.5mm×60cm）を用いた高速液体クロマト
グラフイ（HPLC）にかけた。溶出は同水溶液
により0.4ml／分の流速で行い、フラクシヨン
コレクターFRAC−100（フアルマシア社製）に
より0.4mlずつ分取した。分取した各画分につ
いてCSAを前記と同様にして調べた結果、保
持時間が37〜38分の画分（分子量約２万に相
当）に活性が認められたので、この画分を回収
し、更に分析用μBondapakC18カラム（4.6mm
×30cm）による精製を施したのち、メインピー
クを回収し凍結乾燥した。得られた製品につい
て前述の「CSAの測定方法(a)」によつて検定
したところヒトＧ−CSF活性を有することを認
めた。 実施例 ３ アミノ酸配列の決定 (i) Ｎ末端アミノ酸配列の決定 試料を気相式シークエンサー（アプライドバ
イオシステム社製）を用いてエドマン
（Edman）分解し、得られたPTHアミノ酸を
高速液体クロマトグラフイー装置（ベツクマ
ン・インストルメンツ社製）および
Ultrasphere−ODSカラム（ベツクマン・イン
ストルメンツ社製）を用いて常法により分析し
た。カラム（5μｍ、直径4.6mm、長さ250mm）を
開始緩衝液（15ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液PH
4.5、40％アセトニトリルを含む水溶液）にて
平衡化したのち、検体（20μlの開始緩衝液にて
溶解）を注入して開始緩衝液によるイソクラテ
イツク溶出により分離を行つた。流速は1.4
ml／分、カラム温度は40℃に保持した。PTH
アミノ酸の検出は269nｍと320nｍの紫外部吸
収を利用した。あらかじめ標準PTHアミノ酸
（シグマ社製）各2nmolを同一の系で分離して
保持時間を決定し、被検検体の保持時間から同
定を行つた。 この結果、Ｎ末端から40残基目までのアミノ
酸配列は次の如く決定された。 H2N−Thr−Pro−Leu−Gly− Pro−Ala−Ser−Ser−Leu− Pro−Gln−Ser−Phe−Leu− Leu−Lys−Cys−Leu−Glu− Gln−Val−Arg−Lys−Ile− Gln−Gly−Asp−Gly−Ala− Ala−Leu−Gln−Glu−Lys− Leu−Cys−Ala−Thr−Tyr− Lys− (ii) ブロムシアン分解 試料を70％ギ酸に溶かし、昇華精製したブロ
ムシアン200当量を加えて、37℃で一夜反応さ
せた。次に反応物を凍結乾燥後、TSK
G3000SWカラム（東洋曹達社製）を用いた
HPLCで分画し４つのピークを得た。ピークを
分子量の大きい順にCN−１、CN−２、CN−
３、CN−４と命名し、収率のよいCN−１、
CN−２についてアミノ酸配列を自動気相式シ
ークエンサー（アプライドバイオシステム社
製）を用いて(i)と同様の条件で分析した。 その結果、CN−１はＧ−CSFタンパクのＮ
末端からのペプチドであることがわかつた。さ
らにCN−２は以下のアミノ酸配列を有してい
た。 Pro−Ala−Phe−Ala−Ser− Ala−Phe−Gln−Arg−Arg− Ala−Gly−Gly−Val−Leu− Val−Ala−Ser−His−Leu− Gln− (iii) トリプシン分解 試料を8M尿素を含む0.1Mトリス塩酸緩衝液
（PH7.4）に溶かし、0.1％２−メルカプトエタ
ノールを含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH7.4）
を加えて最終的に2Mの尿素となるように調整
した。次いで試料を酵素が50：１となるように
TPCK処理トリプシン（シグマ社製商品名）を
加え、25℃で４時間反応させた後、さらに同量
のTPCK処理トリプシンを加えて、再度25℃で
16時間反応させた。反応後、反応物をC8カラ
ム（山村化学社製）を用いた高速逆相カラムク
ロマトグラフイーに付した。溶出は0.1％TFA
を含むｎ−プロパノールを用い、ｎ−プロパノ
ール濃度を５％〜60％に直線的に上げて行つ
た。280nｍの紫外部吸収を測定して得られた
ピークのうち、メインピークについて(i)と同条
件下に自動気相式シークエンサー（アプライド
バイオシステム社製）を用いてアミノ酸配列を
分析した。その結果、メインピークは(ii)のCN
−２断片の一部を含む以下の配列を有するペプ
チドであることがわかつた。 Gln−Leu−Asp−Val−Ala− Asp−Phe−Ala−Thr−Thr− Ile−Trp−Gln−Gln−Met− Glu−Glu−Leu−Gly−Met− Ala−Pro−Ala−Leu−Gln− Pro−Thr−Gln−Gly−Ala− Met−Pro−Ala−Phe−Ala− Ser− 実施例 ４ DNAプローブの作成 (i) プローブIWQの合成 実施例３(iii)で得られたアミノ酸配列の中から
Ile−Trp−Gln−Gln−Met−Glu−Glu−Leu
−Gly−Metで示される10個のアミノ酸の配列
に基づいて、30個の連続するヌクレオチドを得
た（図１）。図１の配列に於いて、例えば5′−
末端から９位のヌクレオチドはdAおよびdGを
等量含む混合物であることを示す。原料のヌク
レオチドは主にダイマーを使用し、必要に応じ
て随時モノヌクレオチドも使用した。グラスフ
イルター付きカラムに出発原料のヌクレオチド
樹脂Ap−ｄ(G)（ヤマサ醤油社製）20mgを入れ
塩化メチレンにて洗浄を繰り返した後、３％ト
リクロロ酢酸を含む塩化メチレン溶液にて、
４，4′−ジメトキシトリチル基を脱離せしめ、
次いで１mlの塩化メチレンでカラムを数回洗浄
した。無水ピリジンで洗浄して溶媒を置換した
のちヌクレオチドダイマー（DMTr）ApTp
（NHR3）（日本ゼオン社製；NHR3はトリエチ
ルアンモニウム、DMTrはジメトキシトリチ
ルを示す）20mgと0.2mlのピリジンを加えて真
空ポンプにてカラム内を真空乾燥した。次い
で、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホニ
ル−３−ニトロトリアゾリド（MSNT、和光
純薬社製）20mgと無水ピリジン0.2mlを加えた
後、カラム内を窒素ガスで置換して、室温下に
45分間時々振とうさせることによつてヌクレオ
チド樹脂とダイマーを縮合させた。反応終了
後、ピリジンにてカラムを洗浄し、次いで未反
応のOH基を過剰の無水酢酸と４−ジメチルア
ミノピリジンを含むピリジン溶液にてアセチル
化した後、再びカラムをピリジンで洗浄した。
以下同様に、（DMTr）Ip（NHR3）、（DMTr）
GpGp（NHR3）、（DMTr）Ip（NHR3）、
（DMTr）CpTp（NHR3）と（MMTr）TpTp
（NHR3）の等量混合物、（DMTr）ApAp
（NHR3）と（DMTr）ApGp（NHR3）の等量
混合物、（DMTr）ApGp（NHR3）と
（DMTr）GpGp（NHR3）の等量混合物、
（DMTr）GpAp（NHR3）、（DMTr）TpGp
（NHR3）、（DMTr）ApAp（NHR3）と
（DMTr）GpAp（NHR3）の等量混合物、
（DMTr）CpAp（NHR3）、（DMTr）ApAp
（NHR3）と（DMTr）ApGp（NHR3）との等
量混合物、（DMTr）GpGp（NHR3）、
（DMTr）TpGp（NHR3）、（DMTr）Ip
（NHR3）、（DMTr）ApTp（NHR3） ［（DMTr）Ip（NHR3）はヤマサ醤油社製、
その他は全て日本ゼオン社製］の順で、前述の
操作を繰り返すことによつて縮合させた。最終
段階の反応終了後、アセチル化することなし
に、ピリジン、塩化メチレンン、エーテルの順
で樹脂を洗浄した後、乾燥させた。乾燥させた
樹脂を1Mテトラメチルグアニジンおよび1Mα
−ピコリンアルドキシムを含むジオキサン１
ml、ピリジン0.5ml、水0.2mlの混合液1.7mlに懸
濁した後、一夜室温にて放置した後、100〜
200μまで減圧濃縮した。この濃縮液に少量
（２〜３滴）のピリジンを加えた後、濃アンモ
ニア水２〜３mlを加え55℃で６時間加温した。
次いで酢酸エチルを加えて抽出分離し、得られ
た水層を減圧濃縮した後、50ｍＭトリエチルア
ンモニウム酢酸溶液（PH7.0）に溶解せしめて
Ｃ−18カラム（1.0×15cm、Waters社製）を用
いたカラムクロマトグラフイーに付した。溶出
は、50ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸溶液
（PH7.0）中10％〜30％の直線濃度勾配のアセト
ニトリルで行い、アセトニトリル濃度が25％付
近の位置で溶出されるピーク画分を減圧濃縮し
た。 この濃縮液に80％酢酸を加えて室温下に30分
間放置した後、酢酸エチルを加えて抽出・分離
し得られた水層を減圧下に濃縮した。得られた
濃縮液は、C18カラム（センシユー科学社製、
SSC−ODS−272、6φ×200mm）を用いた高速
液体クロマトグラフイーに付して、さらに精製
した。溶出は50ｍＭトリエチルアンモニウム酢
酸溶液（PH7.0）中10％〜20％の直線濃度勾配
のアセトニトリルを用いて行い、10A260units
以上の収量で合成DNAが得られた。 (ii) プローブＡの合成 実施例３(iii)で得られたアミノ酸配列の中から
Met−Pro−Ala−Phe−Alaで示される５個の
アミノ酸の配列に基づいて14個の連続するヌク
レオチドを得た（図１）。 合成は、プローブIWQと同様な方法で行い
ヌクレオチド樹脂AP−ｄ（Ｔ）（ヤマサ醤油社
製）に（DMTr）CpAp（NHR3）；（DMTr）
GpGp（NHR3）；（DMTr）CpAp（NHR3）、
（DMTr）CpTp（NHR3）、（DMTr）CpGp
（NHR3）および（DMTr）CpCp（NHR3）の
等量混合物；（DMTr）ApGp（NHR3）、
（DMTr）TpGp（NHR3）、（DMTr）GpGp
（NHR3）および（DMTr）CpGp（NHR3）の
等量混合物；（DMTr）ApAp（NHR3）；
（DMTr）CpAp（NHR3）と（DMTr）CpGp
（NHR3）の等量混合物；（DMTr）Gp
（NHR3）（いずれも日本ゼオン社製）の順に混
合させて約10A260unitsの合成DNAを得た。 得られたオリゴヌクレオチドの塩基配列を
Maxam−Gilbert法により調べたところ図１に
示された塩基配列を有していることが確認され
た。 (iii) プローブLCの合成 アプライドバイオシステム社のDNA合成機
380Aにより、自動合成を行つた。この方法は
Caruthers等の記載した原理（J.Am.Chem.
Soc、103巻3185頁（1981））に基づいており、
ホスホアミダイト法と称されている。 5′のジメトキシトリチル基（DMTr）を脱保
護したdG−Ｓ（Ｓは支持体）にテトラゾールで
予め活性化した（DMTr）−dTのホスホアミダ
イト体を縮合させた後、未反応の水酸基をアセ
チル化し、次いで水存在下でヨウ素酸化を行つ
てリン酸体に導いた。DMTr基を脱保護し、
以後同様に縮合を繰り返して図１に示される如
き配列の24個のヌクレオチドを合成した。得ら
れたヌクレオチドを支持体から開裂せしめ脱保
護した後、C18カラム（センシユー科学社製
SSC−ODS−272）を用いた逆相系高速液体ク
ロマトグラフイーにて精製した。 実施例 ５ CHU−２細胞の培養とmRNAの精製 (1) CHU−２細胞の培養と細胞の回収 樹立されたCHU−２細胞を150cm2の培養フラ
スコ２本に完全に密に増殖させた後、これをウ
シ胎児血清を10％含有するRPMI1640培養液
500mlに浮遊させたのち、1580cm2のガラス製ロ
ーラーボトル（Belco社製）に移し、0.5r.p.m.
の速度で４日間回転培養を行つた。細胞がロー
ラーボトルの内壁に完全に密に増殖した時点
で、ローラーボトルから培養液を除き、あらか
じめ37℃に加温したEDTAを0.02％含む生理食
塩水100mlを加え、37℃で２分間加温後、ピペ
ツト操作にて細胞をはく離せしめた。得られた
細胞懸濁液を1500r.p.m.10分間の遠心にて細胞
ペレツトを得る。細胞をEDTAを含まない生
理食塩水５mlに再び懸濁し、1500r.p.m.10分間
遠心にて細胞ペレツトを得た（湿重量約0.8
ｇ）、このようにして得られた細胞はRNA抽出
操作を行うまで−80℃にて凍結保存する。 (2) mRNAの精製 上記の如くして得られたCHU−２細胞から
のmRNAの単離は本質的に“Molecular
Coloning”［Maniatis等、Cold、Spring
Harbor、196頁（1982）］に記載されているよ
うにして実施した。凍結保存されていたCHU
−２細胞（湿重量3.8ｇ）に20mlの6Mグアニジ
ン溶液（6Mグアニジンチオシアナート、５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム（PH7.0）、0.1M β−メ
ルカプトエタノール、0.5％ザルコシル硫酸ナ
トリウム）に懸濁し、Vortexミキサーにて２
〜３分よく混合した後、18Gの注射針を装てん
した20ml容の注射器を用いて10回吸入排出を繰
り返した。ベツクマン社製SW40Tiローターに
合うポリアロマー製の遠心チユーブに６mlの
5.7M CsCl−0.1M EDTA、（PH7.5）を先に加
えておき、チユーブが満たされるように上述の
細胞が壊れて粘稠になつたグアニジン溶液約６
mlを重層した。このようにして調製された遠心
チユーブ４本を30000r.p.m.、20℃で15時間遠
心した後、得られたペレツトを少量の70％エタ
ノールを用いて３回洗浄した。 各々のチユーブから得られたペレツトを合し
て550μの水に溶解せしめNaCl濃度が0.2Mと
なるように調整したのち、フエノール−クロロ
ホルム（１：１）処理、クロロホルム処理後、
2.5倍容量のエタノールを加えてエタノール沈
澱を行い全RNAを得た（湿細胞3.8ｇより全
RNA約10.1mgを得た）。 全RNAからポリ（A+）−RNAの精製は以下
の如く行つた。この方法はmRNAが3′末端に
ポリＡ鎖を付加していることを利用したアフイ
ニテイークロマトグラフイーである。オリゴ
（dT）−セルロース（Ｐ−Ｌ Biochemicals社
製Type7）を用い、吸着は全RNAを吸着緩衝
液（10ｍＭトリス−塩酸（PH7.5）、0.5M
NaCl、１ｍＭ EDTA、0.1％SDS溶液を含
む）に溶解し、65℃で５分間加熱した後、同溶
液にて充てんされたオリゴ（dT）−セルロース
カラムに通過させて行い、溶出はTE溶液（10
ｍＭトリス−塩酸（PH7.5）、１ｍＭ EDTAを
含む）で行つた。未吸着通過液は再び同カラム
に通して同様に溶出操作を行い、１回目の溶出
液と混合した。このような操作を用いて、ポリ
（A+）−RNA400μｇを得た。 このようにして調製したmRNAをSchleifと
Wensinkの実験技術書（Practical Metods in
Molecular Biology、Springer−Verlag、
New York、Heiderberg、Berlin、（1981））
中に記載されている方法と同様の操作で、シヨ
糖密度勾配遠心法によりサイズ分画した。 すなわち、SW40Tiローター（Beckman社
製）用チユーブに５％〜25％のシヨ糖密度勾配
を作る。シヨ糖溶液は0.1M NaCl、10ｍＭト
リス−塩酸（PH7.5）、１ｍＭ EDTA、0.5％
SDSの溶液にそれぞれ５％、25％の割合いで
RNaseフリーのシヨ糖（Schwarz／Mann社
製）を含んでいる。 上記で述べた如き方法で調製したmRNA（ポリ
（A+）−RNA）800μｇを200μl〜500μlのTE溶液
に溶解せしめ、65℃で５分間加熱後急冷した後、
シヨ糖密度勾配液の上にのせる。30000r.p.m.に
て20時間遠心後0.5mlずつ分画を集め260nｍの吸
光度を測り、同様に行つた標準RNA（28S、18S、
5SのリボソームRNA）の位置に基づいて、分画
されたRNAのサイズを決めると同時に各分画の
Ｇ−CSF活性をアフリカツメガエル（Xenopus
laevis）の卵母細胞系を用いて調べた。すなわち
各分画のmRNAを1μｇ／μの濃度の水溶液に
調製し、ツメガエル（生後約１年）から取り出し
た卵母細胞１個に50nｇのmRNAの割合いで注入
した後、96穴のマイクロタイタープレートの１穴
に卵母細胞を10個ずつ入れ、それぞれ100μの
バース培地（88ｍＭ NaCl、１ｍＭ KCl、2.4
ｍＭ NaHCO3、0.82ｍＭ MgSO4、0.33ｍＭ
Ca（NO3）2、0.41ｍＭ CaCl2、7.5ｍＭトリス−
塩酸（PH7.6）、ペニシリン10mg／、ストレプト
マイシン硫酸10mg／）中で48時間室温で培養し
た後上清を回収し、濃縮・精製してＧ−CSF活性
を測定する。 この結果、15〜17S画分にＧ−CSF活性が認め
られた。 実施例 ６ cDNAの合成（pBR系cDNAライブラリーの構
築） 前述の方法で得られたポリ（A+）−RNAから
Land等の方法［Nucleic Acids Res.、９巻2251
頁（1981）］に基づき、GuberとHoffmanの方法
［Gene、25巻263頁（1983）］を加味してcDNAを
合成した。 (1) １本鎖cDNAの合成 エツペンドルフ社製1.5ml容チユーブに以下
の如くの順序で試薬を入れる。80μの反応緩
衝液（500ｍＭ KCl、50ｍＭ MgCl2、250ｍ
Ｍトリス−塩酸、PH8.3）、20μの200ｍＭジチ
オスレイトール、32μの12.5ｍＭ dNTP
（dATP、dGTP、dCTP、dTTPを各々12.5ｍ
Ｍ含む）、10μのα− 32P−dCTP（アマシヤ
ム社製、PB10205）、32μのオリゴ（dT）12-18
（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製、500μｇ／μ）、
20μのポリ（A+）−RNA（2.1μｇ／μ）、蒸
溜水206μの計400μの反応液を65℃で５分
間加熱後、42℃で５分間加温する。この反応液
に逆転写酵素（宝酒造製）120単位を加え、さ
らに42℃、２時間反応させた後、RNaseイン
ヒビター（Bethesda Research Laboratories
社製）2μ、20μのTE溶液、16μの100ｍ
Ｍピロリン酸ナトリウム、48単位（4μ）の
逆転写酵素を追加して、今度は46℃２時間反応
せしめた。0.5M EDTA 8μ、10％SDS 8μ
を加えて反応を停止させた後、フエノール−ク
ロロホルム処理、エタノール沈澱（２回）を行
い一本鎖cDNAを得た。 (2) １本鎖cDNAへのdC−鎖付加 上記で得られた一本鎖cDNAを60μの蒸溜
水に溶解後、60μのdC−鎖付加緩衝液（400
ｍＭカコジル酸カリウム；50ｍＭトリス−塩酸
（PH6.9）；４ｍＭジチオスレイトール；１ｍ
MCoCl2；１ｍＭ dCTP）に加え、37℃で５
分間加温した。この反応液にターミナルトラン
スフエラーゼ（27unit／μ、Ｐ−Ｌ
Biochemicals社製）3μを加えて37℃で2.5分
間反応した後、フエノール−クロロホルム処理
（１回）、およびエタノール沈澱（２回）を行
い、100ｍＭ NaClを含むTE溶液40μに溶解
せしめた。 (3) ２本鎖cDNAの合成 上記40μのDNA溶液に4μのオリゴ
（dG）12-18（200μｇ／ml、Ｐ−Ｌ
Biochemicals社製）を加え65℃５分間、続い
て42℃で30分間加温した後、反応液を０℃に保
つた。この反応液に緩衝液80μ（100ｍＭト
リス−塩酸、PH7.5、20ｍMMgCl2、50ｍＭ
（NH4）2SO4、500ｍＭ KCl）、4μの４ｍＭ、
dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTPを各々
４ｍＭ含む）、60μの１ｍＭ β−NAD及び
210μの蒸溜水、20μのE.coli DNAポリメ
ラーゼ（宝酒造社製）、15μのＥ、coli
DNAリガーゼ（宝酒造社製）、15μのＥ、
coli、RNase Ｈ（宝酒造社製）を加え12℃にて
１時間反応させた後、さらに4μの４ｍ
MdNTPを追加し、25℃で１時間反応して、フ
エノール−クロロホルム処理、エタノール沈澱
（１回）を行つて、約8μｇの２本鎖cDNAを得
た。この２本鎖cDNAをTE溶液に溶解せしめ、
1.2％アガロースゲル電気泳動を行い、約560塩
基対（bp）〜２キロ塩基対（Kbp）の大きさ
に相当する部分をワツトマンDE81（ワツトマン
社製）に吸着させ溶出回収したところ、約0.2μ
ｇが回収された。 (4) ２本鎖cDNAへのdC−鎖付加 上記の如く得られた２本鎖cDNAを40μの
TE溶液に溶解し、(2)の項で述べたdC−鎖付加
緩衝液8μを加え37℃で２分間加温した後、
1μのターミナルトランスフエラーゼ
（27unit／μ）を加えて37℃で３分間反応せ
しめた。反応液を直ちに０℃に冷却し、0.5M
EDTA1μを加えて反応を停止した後、フエ
ノール−クロロホルム処理、エタノール沈澱を
行い、得られた沈澱をTE溶液10μに懸濁し
た。 (5) pBR系cDNAライブラリーの構築 市販のオリゴ（dG）鎖付加pBR322ベクター
（ベセスダリサーチラボラトリーズ社製、
10ng／μ）4μと上記dC−鎖付加２本鎖
cDNA2μを75μの0.1M NaClを含むTE溶
液の中でアニールさせた。アニールは65℃、５
分加温した後40℃にて２時間加温、その後、室
温になるまで放置して行つた。 一方、Naniatisらの実験書［Molecular
cloning、Cold Spring Harbor、249頁
（1982）］に記載されている方法等を用いて大腸
菌X1776株からコンピテント細胞を調製し、上
記アニールされたプラスミドにより形質転換を
行い、トランスフオーマント（形質転換体）が
得られた。 実施例 ７ cDNA合成（λフアージ系ライブラリーの構
築） (1) １本鎖cDNAの合成 実施例５で述べた方法に従つて3.8ｇの凍結
保存CHU−２細胞から２回オリゴ（dT）セル
ロースカラムによる精製を経て400μｇのポリ
（A+）−RNAを得た。 このポリ（A+）−RNA12μｇを溶解したTE
溶液10μを10μgのアクチノマイシンＤ（シグ
マ社製）を含む反応チユーブに入れた後、以下
の順序で試薬類を加えた；20μの逆転写緩衝
液（250ｍＭトリス−塩酸（PH8.3）、40ｍＭ
MgCl2、250ｍＭ KCl）、20μの５ｍＭ
dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTPを各々
５ｍＭ含む）、20μlのオリゴ（dT）12-18（0.2μ
ｇ／ml Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）、1μの
1Mジチオスレイトール、2μの30unit／μ
のRNasin（プロメガバイオテク社）、10μの
逆転写酵素（10unit／μ生化学工業社製）、
1μのα−［ 32p］dATP（10μCiアマシヤム社
製）、16μの水で計100μの液量の反応液に
なる。反応液を42℃で２時間保つた後、5μ
の0.5M EDTA及び1μの20％SDSを加えて反
応を停止した。フエノール−クロロホルム
（100μ）処理、エタノール沈澱（２回）を行
つて約4μｇの１本鎖cDNAを得た。 (2) ２本鎖cDNAの合成 上記の如く得られたcDNAを29μのTE溶
液に溶解し以下の順序で試薬類を加えて反応液
とした；25μのポリメラーゼ緩衝液（400ｍ
MHepes（PH7.6）；16ｍＭ MgCl2；63ｍＭの
β−メルカプトエタノール；270ｍＭ KCl）；
10μの５ｍＭ dNTP；1.0μの15ｍＭ β
−NAD；1.0μのα−［ 32p］dATP（10μCi／
μ）；0.2μE.coliDNAリガーゼ（60unit／
μ宝酒造社製）；5.0μのE.coli DNAポリメ
ラーゼ（New England Biolabs社、
10unit／μ）；0.1μのRNase Ｈ（60unit／
μ宝酒造社製）；28.7μの蒸溜水。 反応液を14℃で１時間インキユベートした
後、室温にもどして、さらに１時間インキユベ
ートした。次いで5μの0.5M EDTAと1μの
20％SDSを加えて反応を停止させ、フエノール
−クロロホルム処理、エタノール沈澱を行つ
た。得られたDNAを0.5ｍＭ EDTA20μに
溶解せしめ、3μのKlenow緩衝液（500ｍＭ
トリス−塩酸（PH8.0）、50ｍＭ MgCl2）、3μ
の５ｍＭ dNTP、及び水4μを加えて反応
液を調製した後、1μのDNAポリメラーゼ
（Klenow断片）（宝酒造社製）を加えて30℃15
分インキユベートした。 この反応液に70μのTE溶液を加えて希釈
し、さらに5μの0.5M EDTA、1μの20％
SDSを加えて反応を停止した。反応液をフエノ
ール−クロロホルム処理し、エタノール沈澱を
行つて約8μｇの２本鎖cDNAを得た。 (3) ２本鎖cDNAのメチル化 (2)の項で合成した２本鎖cDNAの水溶液30μ
、メチル化緩衝液（500ｍＭトリス−塩酸
（PH8.0）、50ｍＭ EDTA）40μ、SAM溶液
（800μM Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチルメチオ
ニン（SAM）、50ｍＭ β−メルカプトエタノ
ール）20μ、水100μを加えた混合液に
EcoRIメチラーゼ（New England Biolabs
社、20unit／μ）15μを加えて全反応液を
200μとし、37℃２時間インキユベートした。
フエノール処理、エーテル処理を行つた後、エ
タノール沈澱を行つてDNAを回収した。 (4) EcoRIリンカーの付加 上記メチル化された２本鎖DNA約1.2μｇに
リガーゼ緩衝液（250ｍＭトリス−塩機（PH
7.5）、100ｍＭ MgCl2）1.5μ、あらかじめ
リン酸化されたEcoRIリンカー0.5μ（10mer
宝酒造社製）、1.5μの10ｍMATP、100ｍＭ
ジチオスレイトール1.5μ、2μのH2Oを加
え、反応液を15μとしてT4DNAリガーゼ
（3.4u／μ、宝酒造社製）0.7μを加えて４
℃で１晩反応させた後、65℃にて10分間加熱し
リガーゼを失活させた。この反応液をさらに
100ｍＭトリス−塩酸（PH7.5）、５ｍＭ
MgCl2、50ｍＭ NaCl、100μｇ／mlのゼラチ
ンの濃度で全液量が50μになるように調製し
た後、EcoRI（10unit／μ）3.5μ加え、37
℃、２時間反応させた。次いで0.5Mの
EDTA2.5μ、20％SDS0.5μを加えた後フエ
ノール−クロロホルム処理を行いエタノール沈
澱によりDNAを回収した。この後Ultrogel
AcA34（LKB社製）のゲル濾過法あるいはアガ
ロースゲル電気泳動法にて未反応のEcoRIリン
カーを除去し、リンカー付加２本鎖cDNA約
0.5〜0.7μｇを回収した。 (5) ２本鎖cDNAとλgt10ベクターの結合上記の
リンカー付加２本鎖cDNAを、2.4μgの予じめ
EcoRI処理したλgt10ベクター（ベクタークロ
ーニングシステム社）、リガーゼ緩衝液（250ｍ
Ｍトリス塩酸、100ｍＭ MgCl2）1.4μ、蒸
溜水6.5μを加えて、42℃、15分間処理した
後、10ｍＭ ATP1μ、0.1Mジチオスレイト
ール1μ、T4DNAリガーゼ0.5μを加え全量
を15μとした後、12℃で一晩反応させた。 (6) インビトロパツケージング 上記(5)で得られた組換え体DNAの約1/3をイ
ンビトロパツケージングキツト（プロメガ バ
イオテク社）を用いてパツケージングし、フア
ージプラークを得た。 実施例 ８ プローブIWQによりpBR系ライブラリーのス
クリーニング コロニーの成育した寒天培地上にワツトマン
541濾紙をのせ37℃で２時間放置した。以下、
TaubとThompsonの方法［Anal.Biochem.126巻
222頁（1982）］に準じて濾紙を処理した。 すなわち、541濾紙にコロニーを移した後、ク
ロラムフエニコール（250μｇ／μ）を含んだ
寒天培地に移し、さらに37℃で一晩放置した。 541濾紙を取り出した後、室温下で0.5N
NaOH溶液を浸した濾紙上に３分間放置し、こ
れを２回くり返した。以下同様な操作を0.5Mト
リス−塩酸（PH８）溶液を用いて３分間、２回行
ない、更に４℃下に0.05Mトリス−塩酸（PH８）
溶液で３分、1.5mg／mlのリゾチーム液（0.05M
トリス−塩酸（PH８）、25％シヨ糖を含む）で10
分間、次いで37℃下に１×SSC（0.15MNaCl及び
0.015Mクエン酸ナトリウム）溶液で２分間、
200μｇ／mlプロテアーゼＫを含む１×SSC溶液で
30分、再び室温下に１×SSC溶液で２分間、95％
エタノール溶液で２分間、２回行つた後、541濾
紙を乾燥させた。得られた乾燥541濾紙を室温下
にフエノール：クロロホルム：イソアミルアルコ
ール（25：24：１、100ｍＭトリス−塩酸（PH
8.5）、100ｍＭ NaCl、10ｍＭ EDTAで平衡化
したもの）溶液に30分間侵した。以下同様の操作
を５×SSC溶液で３分間、３回、次いで95％エタ
ノール溶液で３分間、２回行つた後、濾紙を乾燥
させた。 プローブIWQを常法（Molecular cloningを参
照）に従つて 32Pを用いて放射標識した後、
Wallace等の方法（Nucleic Acids Res.９巻879
頁（1981））に従つてコロニーハイブリダイゼー
シヨンを行つた。６×NET［0.9M NaCl、
0.09Mトリス−塩酸（PH7.5）、６ｍＭ EDTA］
５×Denhardt溶液、0.1％SDS 0.1mg／ml変性
DNA（仔牛胸線DNA）を含むハイブリダイゼー
シヨン緩衝液中で65℃、４時間、プレハイブリダ
イゼーシヨンを行つた後、放射標識化したプロー
ブIWQ1×106cpm／mlを含む前記ハイブリダイゼ
ーシヨン緩衝液を用いて56℃で一夜ハイブリダイ
ゼーシヨンを行つた。反応終了後541濾紙を室温
下に0.1％SDSを含む６×SSC溶液で30分、２回
および56℃、1.5分間洗滌した後、オートラジオ
グラフイーを行つた。 シグナルの出たクローンよりプラスミドを分離
した後、プローブIWQを用いてサザンプロツテ
イングを行つた。ハイブリダイゼーシヨンおよび
オートラジオグラフイーは前述と同一の条件で行
なつた。 同様にプローブＡを用いてサザンブロツテイン
グを行つた。ハイブリダイゼーシヨンは前述のハ
イブリダイゼーシヨン緩衝液を用い、49℃で１時
間行い、39℃まで徐冷後さらに39℃で１時間行な
つた。反応終了後、ニトロセルロースフイルター
を0.1％SDSを含む６×SSCで室温下に30分で２
回洗滌し、次いで390℃で３分間洗滌した後、オ
ートラジオグラフイーを行なつた。 この結果、１個のクローンがポジテイブなもの
として得られ、ジデオキシ法により塩基配列を決
定したところ図２に示した如く、プローブIWQ
及びプローブＡ部分を含む308塩基対よりなる
DNAであることが判明し、このインサートを含
むpBR322由来プラスミドをpHCS−１と命名し
た。 実施例 ９ pHCS−１由来DNAプローブによるλフアー
ジ系ライブラリーのスクリーニング BentonとDavisの方法［Science196巻、180頁、
（1977）］に準じてプラークハイブリダイゼーシヨ
ンを行つた。実施例８で得られたpHCS−１を
Sau3AおよびEcoRIで処理して約600塩基対の
DNA断片を得、このDNA断片を常法に従いニツ
クトランスレーシヨンにより放射標識した。フア
ージプラークの生じた寒天培地上にニトロセルロ
ース濾紙（Ｓ＆Ｓ社）をのせてフアージを移し、
0.5M NaOHにてDNAを変性させ、以下の順序
で濾紙を処理した。0.1M NaOH、1.5M NaCl
で20秒続いて0.5Mトリス−塩酸（PH7.5）、1.5M
NaClで20秒２回、最後に120mM NaCl、15mM
クエン酸ソーダ、13mM KH2PO4、1mM
EDTA、PH7.2で20秒処理した。 次いで濾紙を乾燥し、80℃で２時間加熱して
DNAを固定した、５×SSC、５×Denhardt溶
液、50mMリン酸緩衝液、50％ホルムアミド、
0.25mg／mlの変性DNA（鮭精巣DNA）、及び0.1％
SDSを含むハイブリダイゼーシヨン緩衝液中で42
℃にて一晩プレハイブリダイゼーシヨンを行い、
ニツクトランスレーシヨンにより放射標識化した
pHCS−１プローブ４×105cpm／mlを含むハイ
ブリダイゼーシヨン緩衝液（５×SSC、５×
Denhardt溶液、20mMリン酸緩衝液（PH6.0）、50
％ホルムアミド、0.1％SDS、10％デキストラン
硫酸、0.1mg／mlの変性DNA（鮭精巣DNA）の混
合液）で42℃にて20時間ハイブリダイゼーシヨン
を行つた。 ニトロセルロース濾紙を室温下に0.1％SDSを
含む２×SSCで20分間洗滌し、次いで44℃で、
0.1％SDSを含む0.1×SSCで30分間、さらに室温
下で0.1×SSCで10分間洗滌した後、オートラジ
オグラフイーで検出した。 その結果、５個のポジテイブなクローンＧ１〜
５が得られた。そこで、得られたクローンのうち
完全長cDNAを含むと思われるクローンのDNA
塩基配列をジデオキシ法にて調べたところ図３Ａ
に示される如き塩基配列が得られた。そこでこの
cDNAをλgt10ベクターより切りだし、pBR327
［Soberon等；Gene９巻287頁（1980）］とEcoRI
部位で結合させ、プラスミドとして大量調製し
た。このプラスミドをpBRG4と称する。 実施例 10 pBRG4由来DNAプローブおよびプローブLC
によるλフアージ系ライブラリーのスクリーニ
ング 実施例９で用いたBentonとDavisの方法（前出
の文献を参照）に準じてプラークハイブリダイゼ
ーシヨンを行つた。フアージプラークの生じた寒
天培地上にニトロセルロース濾紙（Ｓ＆Ｓ社製）
をのせてフアージを移し、0.5M NaOHにて
DNAを変性させ、以下の順序で濾紙を処理した。 0.1M NaOH、1.5M NaClで20秒、続いて
0.5Mトリス−塩酸（PH7.5）、1.5M NaClで20秒
２回、最後に120ｍＭ NaCl、15ｍＭクエン酸ソ
ーダ、13ｍＭ KH2PO4、１ｍＭ EDTA、（PH
7.2）で20秒処理した。次いで濾紙を乾燥し、80
℃で２時間乾燥してDNAを固定した。このよう
にして同一の濾紙を２枚作製し、pBRG4由来
DNAプローブとプローブLGによるスクリーニン
グにそれぞれ供した。pBRG4由来DNAプローブ
による場合は、pBRG4をEcoRIで処理して約
1500塩基対のDNA断片を得、このDNA断片を常
法に従つてニツクトランスレーシヨンにより放射
標識した。上記濾紙を５×SSC、５×Denhardt
溶液、50ｍＭリン酸緩衝液、50％ホルムアミド、
0.25mg／mlの変性DNA（鮭精巣DNA）、及び0.1％
SDSを含むハイブリダイゼーシヨン緩衝液中で42
℃にて一晩、プレハイブリダイゼーシヨンを行
い、上記の放射標識した約1500塩基対のDNAプ
ローブ（約１×106cpm／ml）を含むプレハイブ
リダイゼーシヨン緩衝液［５×SSC、５×
Denhardt溶液、20ｍＭリン酸緩衝液（PH6.0）、
50％ホルムアミド、0.1％SDS、10％デキストラ
ン硫酸、0.1mg／mlの変性DNA（鮭精巣DNA）の
混合液］で42℃にて20時間ハイブリダイゼーシヨ
ンを行つた。ニトロセルロース濾紙を室温下に、
0.1％SDSを含む２×SSCで20分間洗滌し、次い
で44℃で、0.1％SDSを含む0.1×SSCで30分間、
さらに室温下で0.1％SSCで10分間洗滌した後、
オートラジオグラフイーで検出した。 プローブLCの場合は、濾紙を0.1％SDSを含む
３×SSCで、65℃にて２時間前処理した後、６×
NET、１×Denhardt溶液、100μｇ／mlの変性
DNA（鮭精巣DNA）を含む溶液中、65℃で２時
間、プレハイブリダイゼーシヨンを行つた。 放射標識したプローブLC（２×106cpm／ml）
を含むハイブリダイゼーシヨン緩衝液［６×
NET、１×Denhardt溶液、100μｇ／ml変性
DNA（鮭精巣DNA）］で63℃にて一晩ハイブリダ
イゼーシヨンを行つた後、ニトロセルロース濾紙
を室温下に、0.1％SDSを含む６×SSCで20分間
洗滌し、この洗滌を３回行つた後、0.1％SDSを
含む６×SSCにて、63℃で２分間洗滌した。 濾紙を乾燥した後オートラジオグラフイーで検
出した。 このようにして行つたスクリーニングに於い
て、２つのプローブの両方にポジテイブなクロー
ンを選別し、そのうち完全長のcDNAを含むと思
われるクローンの塩基配列をジデオキシ法にて調
べたところ図４Ａに示される如き塩基配列が得ら
れれた。そこでこのcDNAをλgt10ベクターより
切りだし、pBR327とEcoR部位で結合させ、
プラスミドPBRV２を得た。 実施例 11 PHGA410ベクターの調製（動物細胞用、＋
VSE系） 実施例９で得られた図３Ａで示されるcDNAの
EcoR断片を制限酵素Draにて37℃で２時間
で処理した後、DNAポリメラーゼのKlenow
断片（宝酒造社製）で処理し、末端を平滑末端と
した。1μｇのBglリンカー（8mer；宝酒造社
製）をATPを用いてリン酸化した後、上記で得
られた約1μｇのDNA断片混合物と結合させた。
次いで制限酵素Bglで処理してアガロースゲル
電気泳動を行い、最も大きいDNA断片だけを回
収した。 このDNA断片は図５に示すようにヒトＧ−
CSFポリペプチドをコードする部分を含む約710
塩基対に相当していた。ベクターpdKCR
（FuKunaga等；Proc.Natl.Acad.Sci.USA；81巻
5086頁（1984））を制限酵素BamHIで処理した
後、アルカリフオスフアターゼ（宝酒造社製）で
脱リン酸して得られたベクターDNAをT4DNA
リガーゼ（宝酒造社製）を加えてcDNA断片と結
合させpHGA410を得た（図６）。図６に示され
るごとくこのプラスミドは、SV40初期遺伝子の
プロモーター、SV40の複製開始領域、ウサギβ
−グロビン遺伝子の一部、pBR322の複製開始領
域およびpBR322由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子
（Ampr）をふくみ、SV40初期遺伝子のプロモー
ター下流にヒトＧ−CSF遺伝子が接続されてい
る。 実施例 12 C127細胞用組替えベクターの構築（＋VSE） (1) pHGA410(H)の構築 実施例11で得られたpHGA410プラスミド
（図６）20μｇを50ｍＭ Tri−HCl（pH7.5）、
７ｍＭ MgCl2、100ｍＭ NaCl、７ｍM2−
メルカプトエタノール、0.01％ウシ血清アルブ
ミン（BSA）の反応液に溶解し、制限酵素
EcoR（宝酒造社製、10〜15単位）を加えて
約30分37℃にて反応させ、EcoRによる部分
消化を行つた。次いでフエノール−クロロホル
ム（１：１）処理を２回行いエーテル処理、エ
タノール沈澱を行つてDNA断片を処理した。 このDNA断片を50ｍＭ Tris−HCl、５ｍ
Ｍ MgCl2、10ｍＭ DTT、１ｍＭのdATP、
dCTP、dGTP、dTTPからなる50μの液に溶
解しE.coliDNAポリメラーゼ−Klenow断片
（宝酒造社製）5μを加えて14℃２時間インキ
ユベートしブラントエンド（blunt end）にし
た。 これから0.8％アガロースゲル電気泳動によ
り約5.8Kbの断片6μｇを回収した。 回収したDNA断片5μｇを再び50ｍＭ Tris
−HCl（PH7.6）、10ｍＭ MgCl2、10ｍＭ
DTT、１ｍＭ ATPからなる反応液50μ中
に溶解し、Hindリンカー（宝酒造社製）2μ
ｇ、及びT4DNAリガーゼ（宝酒造社製）100
単位を加えて、４℃にて一晩反応した。 次いで、フエーノル処理、エーテル処理、エ
タノール沈澱後、10ｍMTris−HCl（PH7.5）、
７ｍＭ MgCl2、60ｍＭ NaClの溶液30μに
溶解し、制限酵素Hind10単位存在下３時間
37℃でインキユベートした。再びT4DNAリガ
ーゼにより処理した後、そのDNAを塩化ルビ
ジウム法（前記の「Molecular Cloning」参
照）によりE.coli DH株に形質転換し、アン
ピシリン耐性（Ampr）のコロニーを得て
pHGA410プラスミドのEcoR部位がHind
に置きかわつたプラスミドを保持する菌を選択
した。このようにして得られたプラスミドを
pHGA410(H)と命名する（図７）。 (2) 発現用組換えベクターpTN−G4の構築上記
(1)で得られたpHGA410(H)（20μｇ）を10ｍＭ
Tris−HCl（PH7.5）、７ｍＭ MgCl2、175ｍ
Ｍ NaCl、0.2ｍＭ DTA、７ｍM2−メルカ
プトエタノール、0.01％ウシ血清アルブミンか
らなる反応液50μに溶解し、制限酵素Sal
（宝酒造社製）20単位を加え、37℃にて５時間
インキユベートした。次いでフエーノル処理、
エタノール沈澱後、DNAポリメラーゼ
Klenow断片（宝洒造社製）にて前出の反応と
同様に14℃約２時間インキユベートし、ブラン
トエンドにした。これを、アガロース電気泳動
で回収することなくエタノール沈澱したDNA
断片を制限酵素Hindにて処理して、約2.7kb
のHind−Sal断片を１％アガロースゲル電
気泳動にて5μｇ回収した。 一方、ウシ乳頭腫ウイルス［bovine
papilloma virus（BPV）］を有するプラスミド
pdBPV−１（Sarver、N.、Sbyrne、J.C＆
Howley、P.M.（1982）Proc.Natl.Acad.Sci.
USA79巻7147−7151；Dr.Howleyより入手、
ATCC37134…1985年版ATCCカタログに掲載）
をNagataらの方法の如く（Fukunaga、
Sokawa、＆ Nagata、（1984）Proc.Natl.
Acad.Sci.USA81巻5086−5090）Hind及び
Pvuで処理して8.4kbのDNA断片を得てお
く。 この8.4kbのDNA断片と上記の約2.7kbの
Hind−SalDNA断片を常法に従つて
T4DNAリガーゼにより処理し、前出の
「Molecular Cloning」に記載された塩化ルビ
ジウム法によりE.Coli DH株に形質転換し、
pHGA410由来Ｇ−CSFのcDNAを有するプラ
スミドを保持するE.coliコロニーを選別した。
このプラスミドをPTN−G4と命名する（図
７）。 一方、アデノウイルスType〔蛋白質核酸
酵素27巻12月号（1982年）、共立出版発行〕よ
りVA及びVAを含む約1700bpのSal−
Hind断片を含むプラスミド△PVAよりVA
およびVAを含む断片を回収した。この断
片を先に述べたPTNG4のHind部位に挿入し
てpTNG4VAαおよびpTNG4VAβを得た（図
７）。このプラスミドはアデノのVA遺伝子に
よりSV40の初期プロモーターからの転写産物
の発現効率を高めるようにしたものである。 実施例 13 C127細胞の形質転換及びその発現（＋VSE） 実施例12で得たpTN−G4をマウスC127細胞に
形質転換する前に制限酵素BamHで処理する。
即ちpTN−G4プラスミド20μｇを10ｍＭ Tris
−HCl（PH8.0）、７ｍＭ MgCl2、100ｍＭ、
NaCl、２ｍM2−メルカプトエタノール、0.01％
BSAの混合液100μに溶解せしめBamH（宝
酒造社製）20単位で処理し、フエノール処理、エ
ーテル処理、エタノール沈澱を行つた。 マウスC127細胞は10％牛胎児血清（GIBCO
社製）を含むDulbecco′s minimal essential培地
中で増殖させる。径５cmのプレートに増殖した
C127細胞に、プレート当たり上記調製DNAを
10μｇの割り合いでリン酸−カルシウム法
（Haynes、Ｊ＆Weissmann、Ｃ（1983）Nucleic
Acid Res.11巻687−706参照）にて形質転換を行
い、グリセロール処理の後、12時間37℃でインキ
ユベートした。 次に、この細胞を３枚の新しい径５cmプレート
に移し、１週間２回の割り合いで培地交換をし
た。16日目にFoci（集塊）を形成した部分をそれ
ぞれ新しいプレートに移し、上述の培地で継代培
養し、Ｇ−CSF生産能の高いクローンを選別し
た。その結果〜１mg／のレベルのＧ−CSF生産
がみられた。更にクローニングを続けた結果、10
mg／以上のレベルのＧ−CSF産生を確認した。 尚、宿主細胞には上記のC127細胞のほか
NIH3T3細胞も用いることができる。 実施例 14 CHO細胞によるＧ−CSFの発現（＋VSE） (1) PHGG4−dnfrの構築 実施例11で得たpHGA410プラスミド20μｇ
を10ｍMTris−HCl（PH7.5）、７ｍＭ MgCl2、
175ｍＭ NaCl、0.2ｍＭ EDTA、0.7ｍＭ
２−メルカプトエタノール、0.01％BSAを含む
溶液100μに溶解し、制限酵素Sal（宝酒造
社製）20単位を加え37℃一晩反応した後、フエ
ノール処理、エーテル洗浄、エタノール沈澱を
行つた。 次ぎに、得られたDNA沈澱を50ｍMTris−
HCl、５ｍＭ MgCl2、10ｍＭ DTT、１ｍ
ＭのdATP、dCTP、dGTP、TTPからなる反
応液100μに溶解し、E.Coli DNAポリメラー
ゼ−Klenow断片（宝酒造社製10μ）を加え
て14℃２時間反応させ、フエノール処理、エー
テル洗浄、エタノール沈澱を行つた。 このDNAにEcoRリンカーを付加する。即
ち上記DNAを50μの50ｍMTris−HCl（PH
7.4）、10ｍMDTT、0.5ｍＭスペルミジン、２
ｍMATP、2.5ｍＭヘキサミン塩化コバルト、
20μｇ／mlBSAからなる反応液に溶解し、
EcoRリンカー（宝酒造社製）を加え、200単
位のT4DNAリガーゼ（宝酒造社製）を加え４
℃、12〜16時間反応した。フエーノル処理、エ
ーテル洗浄、エタノール沈澱を常法に従つて行
つた後、該DNAをEcoRで部分消化し、１％
アガロースゲル電気泳動で約2.7kbのフラグメ
ントを3μｇ回収した。 一方、pAdD26SVpAプラスミド
（Kaufman、R.G.＆ Sharp、P.A（1982）J.
Mol.Biol.159巻601〜621及びKaufman、R.G.
＆ Sharp、P.A（1982）Mol.Cell Biol、２巻
1304〜1319）をEcoRにて処理し、バクテリ
アアルカリフオスフアクターゼ（BAP）処理
して脱リン酸を行う。すなわち、
pAdD26SVpA20μｇとEcoR20単位を反応液
50ｍMris−HCl（PH7.5）、７ｍＭ MgCl2、100
ｍＭ NACl、７ｍM2−メルカプトエタノー
ル、0.01％BSAの混合液100μに加え、37℃
10時間反応させ、続いて上記反応液にBAP5単
位を加え、68℃にて30分間反応した。その後フ
エノール処理をし、電気泳動にて
pAdD26SVpAのEcoR断片を回収した（〜
5μｇ）。 上記した約2.7kbの断片とpAdD26SVpAの断
片のそれぞれ0.5μｇずつをアニールした。この
プラスミドをE.coli DH株に塩化ルビジウム
法により形質転換してpHGG4−dhfrのプラス
ミドを保持するコロニーを選択する。得られた
プラスミドをpHGG4−dhfrと命名した（図８
ａ）。 なお、上記の別法として、pHGG4プラスミ
ドをSal処理し、EcoRリンカーを付加する
ことなしにEcoRで部分消化し約2.7kbの断片
を回収し、E.coli DNAポリメラーゼ−klenow
断片で該DNA断片を処理し末端をブラントエ
ンド化する。 一方前述と同じ方法でpAdD26SVpAのブラ
ントエンド化したEcoR断片を調製し、両者
をT4DNAリガーゼ処理してpHGG4−dhfrを
調製することもできる。 また実施例12の(1)で得られたPHGA410(H)を
実施例12の(2)記載した如く、制限酵素Hind
およびSalにて処理し、Hind−Sal断片
を上記pAdD26SVpAのブラントエンド化した
EcoRに連結してもPHGG4−dhfrを得ること
ができる（図８図）。 (2) pG4DR1およびpG4DR2の構築 (1)の項で述べたpAdD26SVpA10μｇを50ｍ
Ｍ Tris−HC（PH7.5）、７ｍＭ MgCl2、100
ｍＭ NaCl、７ｍM2−メルカプトエタノー
ル、0.01％BSAを含む反応液50mlに溶解し、制
限酵素EcoRおよびBamHがそれぞれ10単
位を加え、37℃10時間反応させた。常法に従い
フエーノル処理、エーテル洗浄を行つた。１％
低融点アガロース電気泳動にて、約2Kbの
DNA断片を回収した後、DNAポリメラーゼ−
Klenow断片にて、常法に従いブラントエンド
化して、フエノール処理、エーテル洗浄、エタ
ノール沈澱を行つた。 一方、実施例12の(1)で得られたpHGA410(H)
10μｇを10ｍＭ Tris−HCl（PH7.5）、７ｍＭ
MgCl2、60ｍＭ NaClを含む反応液50μに溶
解し、Hind10単位を加えて37℃、６時間反
応させた。常法に従い１％低融点アガロース電
気泳動にてDNA断片を回収し、更にBAP処理
をした後、Klenow断片にてブラントエンド化
した、フエノール処理、エーテル洗浄を行つた
後、先に述べた約2KbのDNA断片とT4DNA
リガーゼを用いてブラントエンド結合させた。
即ちそれぞれDNA断片1μｇを66ｍＭ Tris−
HCl（PH7.5）、6.6ｍＭ MgCl2、５ｍＭ
DTT、１ｍMATPを含む反応液30μｇに溶解
せしめ、T4DNAリガーゼ50単位を加え、６
℃、12時間反応せしめた後、E.ColiDH株に
形質転換した。このようにして、図８ｃに示す
pG4DR1およびpG4DR2を得た。 (3) 形質転換と発現 CHO細胞（dhfr-株、コロンビア大学Dr.L.
Chasinより入手）を９cm径のプレート（Nunc
社製）中10％仔牛血清を含むα最小必須培地
（α−MEM、アデノシン、デオキシアデノシ
ン、チミジン添加）で培養増殖し、これをリン
酸−カルシウム法（Wigler等、Cell14巻725頁
（1978））によつて形質転換した。 即ち(1)で調製したpHGG4−dhfrプラスミド
1μｇにキヤリアーDNA（子牛胸線DNA）を適
量加えて、TE溶液375μに溶解し1M
CaCl2125μを加える。３〜５分氷上で冷やし
500μの２×HBS（50ｍＭ Hepes、280ｍＭ
NaCl、1.5ｍＭリン酸緩衝液）を加え再び氷
冷後、上記のCHO細胞培養液１mlと混合し、
プレートに滴下した後、CO2インキユベーター
中で９時間培養した。プレートから培地を除去
し、TBS（Tris−Buffered Saline）にて洗浄
後、20％グリセロール含有TBS添加、再び洗
浄した後、非選択培地（前出α−MEM培地、
ヌクレオチド添加）を添加して２日間インキユ
ベートし選択培地（ヌクレオチド無添加）で
１：10に細胞を分割した。次いで２日毎に選択
培地にて培地交換を行いながら培養を続行し生
じたコロニーを選別して新しいプレートに移し
た。 新しいプレートでは0.02μMメトトレキセー
ト（MTX）存在下で増殖し、0.05μM、更に
0.1μM MTX存在下で増殖させてクローニング
を行つた。なおCHO細胞の形質転換はCHO細
胞に対しpHGG4とpAdD26SVpAを同時形質転
換（Co transformation）することによつても
行うことができる（Scahill等．Proc.Natl.
Acad.Sci.USA80巻4654−4658（1983）参照）。 また、以下に述べる方法にによつてもCHO
細胞の形質転換を行つた。即ち、上記(2)の項で
調製したpG4DR1あるいはpG4DR2をあらかじ
めそれぞれSalおよびKpnで処理してDNA
断片を得て、そのうちの10μｇを上記と同様に
CHO細胞に形質転換させた。このようにして
形質転換された細胞を選択培地にて上記の如く
倍養を続けると約７日目で明らかなコロニーが
１プレートにつき100個以上出現した。コロニ
ーを一つ一つ選別することなしに、再び新しい
プレートに移しかえた後、0.01μM MTX存在
下に選択培地で培養を続けると、十数個のコロ
ニーが出現した。更にこのような手法により
MTXの濃度を0.02μM、0.05μM、0.1μMと上
昇させ、生き残つてきたコロニーを選別した。
また、得られた十数個のコロニーをそれぞれ選
別した後、MTX濃度を上昇させても同様のコ
ロニーの選別を行うことができた。 又いわゆるポリシストロニツク遺伝子を有す
る組換えベクターを構築し、これを用いて
CHO細胞を形質転換することができた。即ち、
pAdD26SVpAをPst処理し、２つの断片を
回収しこれらとpBRG4由来のCSFcDNA断片
を結合することにより、アデノウイルスプロモ
ーター、CSFcDNA、DHFR、SV40のポリＡ
部位の順序に配列した組換えベクターを構築し
CHO細胞にいれて実施した。 実施例 15 発現物質のＧ−CSF活性検定（＋VSE） 実施例13及び実施例14で得られたC127細胞及
びCHO細胞の培養上清を夫々1N酢酸によりPH４
に調整し、等容量のｎ−プロパノールを加えた
後、生じた沈澱を遠心除去し、C8逆相系担体
（山村化学社製）を充填したオープンカラム（1φ
×２cm）に通し、50％ｎ−プロパノールで溶出さ
せた。溶出液を水で２倍に希釈した後、YMC−
C8カラム（山村化学社製）を用いた逆相高速液
体クロマトグラフイーにて0.1％TFAを含む30〜
60％の直線濃度勾配のｎ−プロパノールにて溶出
を行つた。ｎ−プロパノール濃度が40％付近の位
置で溶出される画分を分取した後、凍結乾燥し、
0.1Mグリシン緩衝液（PH９）に溶解せしめた。
このような過程を経ることによつて、ヒトＧ−
CSFはC127及びCHO細胞上清から約20倍に濃縮
された。 コントロールとして、前述の方法に従つてヒト
Ｇ−CSFcDNAを含まないプラスミドで細胞を形
質転換した後その培養上清を濃縮した。得られた
標品について参考例に記載された「ヒトＧ−
CSAの測定方法(a)」に基づいた方法にてヒトＧ
−CSF活性を検定した。尚、発現効率が十分に高
い場合には培養上清を直接検定に供してもよい。
ここでは濃縮した例について結果を示した。その
結果は表−１の通りであつた。
【表】
【表】
実施例 16
アミノ酸分析および糖分析（＋VSE）
(1) アミノ酸組成の分析
実施例15で得た粗CSF試料を更に実施例２の
(iii)の方法にしたがつて精製した。この精製CSF
試料を常法により加水分解し、そのタンパク部
分のアミノ酸組成を日立835アミノ酸自動分析
装置（日立製作所社製）を用いて特殊アミノ酸
分析法により分析した。この結果を表−２に示
した。尚、加水分解条件は次の如くである。 6N HCl、110℃、24時間、真空中 4N メタンスルホン酸＋0.2％３−（２−
アミノエチル）インドール、110℃、24時間、
48時間、72時間、真空中 試料は、40％ｎ−プロパノールと0.1％トリ
フルオロ酢酸を含む溶液（1.5ml）に溶かした
後、各々0.1mlをとり、乾燥窒素ガスにより乾
燥させた後、又はの試薬を加えて真空封管
し、加水分解に供した。 表中、実測値はの24時間値との24、48、
72時間値の合計４回の平均値である。但し、
Thr、Ser、1/2Cys、Met、Val、Ileおよび
Trpは以下の方法で算出した。（生化学実験講
座、タンパク質化学（東京化学同人出版）を
参照） ●Thr、Ser、1/2Cys、Metはの24、48、72
時間値の経時変化をとり、零時間に補外。 ●Val、Ileはの72時間値。 ●Trpはの24、48、72時間値の平均値
(iii)の方法にしたがつて精製した。この精製CSF
試料を常法により加水分解し、そのタンパク部
分のアミノ酸組成を日立835アミノ酸自動分析
装置（日立製作所社製）を用いて特殊アミノ酸
分析法により分析した。この結果を表−２に示
した。尚、加水分解条件は次の如くである。 6N HCl、110℃、24時間、真空中 4N メタンスルホン酸＋0.2％３−（２−
アミノエチル）インドール、110℃、24時間、
48時間、72時間、真空中 試料は、40％ｎ−プロパノールと0.1％トリ
フルオロ酢酸を含む溶液（1.5ml）に溶かした
後、各々0.1mlをとり、乾燥窒素ガスにより乾
燥させた後、又はの試薬を加えて真空封管
し、加水分解に供した。 表中、実測値はの24時間値との24、48、
72時間値の合計４回の平均値である。但し、
Thr、Ser、1/2Cys、Met、Val、Ileおよび
Trpは以下の方法で算出した。（生化学実験講
座、タンパク質化学（東京化学同人出版）を
参照） ●Thr、Ser、1/2Cys、Metはの24、48、72
時間値の経時変化をとり、零時間に補外。 ●Val、Ileはの72時間値。 ●Trpはの24、48、72時間値の平均値
【表】
(2) 糖組成分析
上記アミノ酸組成分析で用いた精製CSF試料
200ngに内部標準としてイノシトール25nmolを
加えた後、1.5N HClを含むメタノール溶液
（500μ）を加えて窒素ガス置換した封管中、
90℃で４時間反応させた。開管後炭酸銀
（Ag2CO3）を加えて中和した後、無水酢酸50μ
を加え振とう後、室温にて暗所に一晩放置し
た。上層をサンプルチユーブにとり、窒素ガス
にて乾燥した。沈澱にメタノールを加え洗浄後
軽く遠沈し、上層を同じサンプルチユーブに加
え乾燥した。これに50μのTMS化試薬（ピリ
ジン：ヘキサメチルジシラザン：トリメチルク
ロロシラン＝５：１：１に混合したもの）を加
え40℃で20分反応させた後、Deep Freezerに
保存した。尚、スタンダードとしてガラクトー
ス（Gal）、Ｎ−アセチルガラクトサミン
（GalNAc）、シアル酸などを各50nmol及びイ
ノシトール25nmolを合わせ同様の操作を行つ
た。 このサンプルについて以下に示す条件でガス
クロマト分析を行つた。 （分析条件） カラム：２％OV−17VINport HP60〜80メツ
シユ、３ｍ、ガラス 温度：110℃〜250℃まで４℃／分の昇温 キヤリヤーガス（窒素圧）：最初は1.2〜1.6
Kg／cm2 終了時は２〜2.5Kg／cm2 感度：103MΩレンジ0.1〜0.4V 圧：水素ガス0.8Kg／cm2 空気0.8Kg／cm2 サンプル量：2.5〜3.0μ 分析の結果、本発明のCSFからガラクトー
ス、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびシアル
酸が確認された。 実施例 17 pHGV2ベクターの調製（動物細胞用、−VSE
系） 実施例10で得られた図４Ａで示されるcDNAの
EcoR断片を制限酵素Draにて37℃で２時間
で処理した後、DNAポリメラーゼのKlenow
断片（宝酒造社製）で処理し、末端を平滑末端と
した。1μｇのBglリンカー（8mer；宝酒造社
製）をATPを用いてリン酸化した後、上記で得
られた約1μｇのDNA断片混合物と結合させた。
次いで制限酵素Bglで処理してアガロースゲル
電気泳動を行い、最も大きいDNA断片だけを回
収した。 このDNA断片は図５に示すようにヒトＧ−
CSFポリペプチドをコードする部分を含む約700
塩基対に相当していた。ベクターpdKCR
（Fukunaga等；Proc.Natl.Acad.Sci.USA；81巻
5086頁（1984））を制限酵素BamHで処理した
後、アルカリフオスフアターゼ（宝酒造社製）で
脱リン酸して得られたベクターDNAをT4DNA
リガーゼ（宝酒造社製）を加えてcDNA断片と結
合させpHGV2を得た（図９）。図９に示される
ごとくこのプラスミドは、SV40初期遺伝子のプ
ロモーター、SV40の複製開始領域、ウサギβ−
グロビン遺伝子の一部、pBR322の複製開始領域
およびpBR322由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子
（Ampr）を含み、SV40初期遺伝子のプロモータ
ー下流にヒトＧ−CSF遺伝子が接続されている。 実施例 18 C127細胞用組換えベクターの構築（−VSE） (1) pHGV2(H)の構築 実施例17で得られたpHGV2プラスミド（図
９）20μｇを用いて、実施例12の(1)に記載した
方法と同様にしてpHGV2(H)と命名するプラス
ミドを得た（図１０）。 (2) 発現用組換えベクターpTN−V2ならびに
pTNVAαおよびpTNVAβの構築 上記(1)で得られたpHGV2(H)20μｇを用いて、
実施例12の(2)に記載した方法と同様にして
pHGV2由来Ｇ−CSFのcDNAを有するプラス
ミドを保持するE.coliコロニーを選別した。得
られたプラスミドをpTN−V2と命名する（図
１０）。 一方アデノウイルスType〔蛋白質核酸酵素
27巻12月号（1982年）、共立出版発行〕よりVA
およびVAを含む約1700bpのSal−Hind
断片を含むプラスミド△pVAよりVAおよび
VAを含む断片を回収した。この断片を先に述
べたpTN−V2のHind部位に挿入して
pTNVAαおよびpTNVAβを得た（図１０）。こ
のプラスミドはアデノのVA遺伝子によりSV40
の初期プロモーターからの転写産物の発現効率を
高めるようにしたものである。 実施例 19 C127細胞の形質転換およびその発現（−VSE） 実施例18で得たpTN−V2をマウスC127細胞に
形質転換する前に制限酵素BamHで処理する。 次いでマウスC127細胞を上記調製DNAで形
質転換して発現させ（実施例13参照）Ｇ−CSF生
産能の高いクローンを選別した。その結果〜１
mg／のレベルのＧ−CSF生産がみられた。 更にクローニングを続けていくことにより、10
mg／レベルのＧ−CSF生産能を有するクローン
が選別できた。同様にして実施例19で得た
pTNVAαおよびpTNVAβでC127細胞をそれぞ
れ形質転換し、Ｇ−CSF生産能の高いクローンを
選別した結果、pTNVAαについては20mg／以
上の高生産クローンを得ることができた。また
pTNVAβからは数mg／の生産能を有するクロ
ーンを得ることができた。 尚、宿主細胞には上記のC127細胞のほかに
NIH3T3細胞も用いることができる。 実施例 20 CHO細胞によるＧ−CSFの発現（−VSF） (1) pHGV2−dhfrの構築 実施例17で得たpHGV2プラスミド20μｇか
ら実施例14の(1)に記載した方法によつて得られ
る約2.7kbの断片とpAdD26SVpAの断片のそれ
ぞれ0.5μｇずつをアニールした。このプラスミ
ドをE.coli DH株に塩化ルビジウム法により
形質転換してpHGV2−dhfrのプラスミドを保
持するコロニーを選択した。得られたプラスミ
ドをpHGV2−dhfrと命名した（図１１ａ）。 尚、上記の別法として、pHV2プラスミドを
Sal処理し、EcoRリンカーを付加すること
なしにEcoRで部分消化し、約2.7kbの断片を
回収し、E.coli DNAポリメラーゼ−Klenow
断片で該DNA断片を処理し末端をブラントエ
ンド化した。 一方前述と同じ方法でpAdD26SVpAのブラ
ントエンド化したEcoR断片を調製し、両者
をT4DNAリガーゼ処理してpHGV2−dhfrを
調製することもできた。 また実施例18の(1)で得られたpHGV2(H)を実
施例12の(2)で記載した如く制限酵素、Hind
およびSalにて処理し、Hind−Sal断片
を上記pAdD26SVpAのブラントエンド化した
EcoR断片に連結してもpHGV2−dhfrを得る
ことができた（図１１ｂ）。 (2) pV2DR1およびpV2DR2の構築 (1)の項で述べたpAdD26SVpA10ｇを50ｍＭ
Tris−HCl（PH7.5）、７ｍＭ MgCl2、100ｍ
Ｍ NaCl、７ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、0.01％BSAを含む反応液50mlに溶解し、制
限酵素EcoRおよびBamHそれぞれ10単位
を加え、37℃10時間反応させた。常法に従いフ
エーノル処理、エーテル洗浄を行つた。１％低
融点アガロース電気泳動にて、約2KbのDNA
断片を回収した後、DNAポリメラーゼ−
Klenow断片にて、常法に従いブラントエンド
化して、フエノール処理、エーテル洗浄、エタ
ノール沈澱を行つた。 一方、実施例19の(1)で得られたpHGV2(H)
10μｇを10ｍＭ Tris−HCl（PH7.5）、７ｍＭ
MgCl2、60ｍＭ NaClを含む反応液50μに溶
解し、Hind10単位を加えて37℃、６時間反
応させた。常法に従い１％低融点アガロース電
気泳動にてDNA断片を回収し、更に、BAP処
理をした後、Klenow断片にてブラントエンド
化した。フエノール処理、エーテル洗浄を行つ
た後、先に述べた約2KbのDNA断片と
T4DNAリガーゼを用いてブラントエンド結合
させた。即ち、それぞれのDNA断片1μｇを66
ｍＭ Tris−HCl（PH7.5）、6.6ｍＭ MgCl2、
５ｍＭ DTT、１ｍＭ ATPを含む反応液
30μに溶解せしめ、T4DNAリガーゼ50単位
を加え、６℃、12時間反応せしめた後、E.
coliDH株に形質転換した。このようにして、
図１１ｃに示すpV2DR1およびpV2DR2を得
た。 (3) 形質転換と発現 上記(1)で調製したpHGV2−dhfrプラスミド
を用いて、実施例14の(3)に記載の方法と同様に
してCHO細胞株を形質転換して発現させた。 なお、CHO細胞の形質転換はCHO細胞に対
しpHGV2とpAdD26SVpAを同時形質転換
（Co transformation）することによつても行
うことができる。 また、以下に述べる方法によつてもCHO細
胞の形質転換を行つた。即ち、上記(2)の項で調
製したpV2DR1あるいはpV2DR2をあらかじめ
それぞれSalおよびKpnで処理してDNA断
片を得て、そのうちの10μｇを上記と同様に
CHO細胞に形質転換させた。このようにして
形質転換された細胞を選択培地にて上記の如く
培養を続けると約７日目で明らかなコロニーが
１プレートにつき100個以上出現した。コロニ
ーを一つ一つ選別することなしに、再び新しい
プレートに移しかえた後、0.01μM MTX存在
下に選択培地で培養を続けると、十数個のコロ
ニーが出現した。更にこのような手法により
MTXの濃度を0.02μM、0.05μM、0.1μMと上
昇させ、生き残つてきたコロニーを選別した。
また、得られた十数個のコロニーをそれぞれ選
別した後、MTX濃度を上昇させても同様のコ
ロニーの選別を行うことができた。 又、いわゆるポリシストロニツク遺伝子を有
する組換えベクターを構築し、これを用いて
CHO細胞を形質転換することができた。即ち、
pAdD26SVpAをPst処理し、２つの断片を
回収しこれらとpBRV2由来のCSF cDNA断片
を結合することにより、アデノウイルスプロモ
ーター、CSFcDNA、DHFR、SV40のポリＡ
部位の順序に配列した組換えベクターを構築し
CHO細胞にいれて実施した。 実施例 12 発現物質のＧ−CSF活性検定（−VSE） 実施例19および実施例20で得られたC127細胞
及びCHO細胞の培養上清から、実施例15に記載
の方法と同様にしてヒトＧ−CSFを得、そのヒト
Ｇ−CSF活性を検定した。その結果は表−３の通
りであつた。
200ngに内部標準としてイノシトール25nmolを
加えた後、1.5N HClを含むメタノール溶液
（500μ）を加えて窒素ガス置換した封管中、
90℃で４時間反応させた。開管後炭酸銀
（Ag2CO3）を加えて中和した後、無水酢酸50μ
を加え振とう後、室温にて暗所に一晩放置し
た。上層をサンプルチユーブにとり、窒素ガス
にて乾燥した。沈澱にメタノールを加え洗浄後
軽く遠沈し、上層を同じサンプルチユーブに加
え乾燥した。これに50μのTMS化試薬（ピリ
ジン：ヘキサメチルジシラザン：トリメチルク
ロロシラン＝５：１：１に混合したもの）を加
え40℃で20分反応させた後、Deep Freezerに
保存した。尚、スタンダードとしてガラクトー
ス（Gal）、Ｎ−アセチルガラクトサミン
（GalNAc）、シアル酸などを各50nmol及びイ
ノシトール25nmolを合わせ同様の操作を行つ
た。 このサンプルについて以下に示す条件でガス
クロマト分析を行つた。 （分析条件） カラム：２％OV−17VINport HP60〜80メツ
シユ、３ｍ、ガラス 温度：110℃〜250℃まで４℃／分の昇温 キヤリヤーガス（窒素圧）：最初は1.2〜1.6
Kg／cm2 終了時は２〜2.5Kg／cm2 感度：103MΩレンジ0.1〜0.4V 圧：水素ガス0.8Kg／cm2 空気0.8Kg／cm2 サンプル量：2.5〜3.0μ 分析の結果、本発明のCSFからガラクトー
ス、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびシアル
酸が確認された。 実施例 17 pHGV2ベクターの調製（動物細胞用、−VSE
系） 実施例10で得られた図４Ａで示されるcDNAの
EcoR断片を制限酵素Draにて37℃で２時間
で処理した後、DNAポリメラーゼのKlenow
断片（宝酒造社製）で処理し、末端を平滑末端と
した。1μｇのBglリンカー（8mer；宝酒造社
製）をATPを用いてリン酸化した後、上記で得
られた約1μｇのDNA断片混合物と結合させた。
次いで制限酵素Bglで処理してアガロースゲル
電気泳動を行い、最も大きいDNA断片だけを回
収した。 このDNA断片は図５に示すようにヒトＧ−
CSFポリペプチドをコードする部分を含む約700
塩基対に相当していた。ベクターpdKCR
（Fukunaga等；Proc.Natl.Acad.Sci.USA；81巻
5086頁（1984））を制限酵素BamHで処理した
後、アルカリフオスフアターゼ（宝酒造社製）で
脱リン酸して得られたベクターDNAをT4DNA
リガーゼ（宝酒造社製）を加えてcDNA断片と結
合させpHGV2を得た（図９）。図９に示される
ごとくこのプラスミドは、SV40初期遺伝子のプ
ロモーター、SV40の複製開始領域、ウサギβ−
グロビン遺伝子の一部、pBR322の複製開始領域
およびpBR322由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子
（Ampr）を含み、SV40初期遺伝子のプロモータ
ー下流にヒトＧ−CSF遺伝子が接続されている。 実施例 18 C127細胞用組換えベクターの構築（−VSE） (1) pHGV2(H)の構築 実施例17で得られたpHGV2プラスミド（図
９）20μｇを用いて、実施例12の(1)に記載した
方法と同様にしてpHGV2(H)と命名するプラス
ミドを得た（図１０）。 (2) 発現用組換えベクターpTN−V2ならびに
pTNVAαおよびpTNVAβの構築 上記(1)で得られたpHGV2(H)20μｇを用いて、
実施例12の(2)に記載した方法と同様にして
pHGV2由来Ｇ−CSFのcDNAを有するプラス
ミドを保持するE.coliコロニーを選別した。得
られたプラスミドをpTN−V2と命名する（図
１０）。 一方アデノウイルスType〔蛋白質核酸酵素
27巻12月号（1982年）、共立出版発行〕よりVA
およびVAを含む約1700bpのSal−Hind
断片を含むプラスミド△pVAよりVAおよび
VAを含む断片を回収した。この断片を先に述
べたpTN−V2のHind部位に挿入して
pTNVAαおよびpTNVAβを得た（図１０）。こ
のプラスミドはアデノのVA遺伝子によりSV40
の初期プロモーターからの転写産物の発現効率を
高めるようにしたものである。 実施例 19 C127細胞の形質転換およびその発現（−VSE） 実施例18で得たpTN−V2をマウスC127細胞に
形質転換する前に制限酵素BamHで処理する。 次いでマウスC127細胞を上記調製DNAで形
質転換して発現させ（実施例13参照）Ｇ−CSF生
産能の高いクローンを選別した。その結果〜１
mg／のレベルのＧ−CSF生産がみられた。 更にクローニングを続けていくことにより、10
mg／レベルのＧ−CSF生産能を有するクローン
が選別できた。同様にして実施例19で得た
pTNVAαおよびpTNVAβでC127細胞をそれぞ
れ形質転換し、Ｇ−CSF生産能の高いクローンを
選別した結果、pTNVAαについては20mg／以
上の高生産クローンを得ることができた。また
pTNVAβからは数mg／の生産能を有するクロ
ーンを得ることができた。 尚、宿主細胞には上記のC127細胞のほかに
NIH3T3細胞も用いることができる。 実施例 20 CHO細胞によるＧ−CSFの発現（−VSF） (1) pHGV2−dhfrの構築 実施例17で得たpHGV2プラスミド20μｇか
ら実施例14の(1)に記載した方法によつて得られ
る約2.7kbの断片とpAdD26SVpAの断片のそれ
ぞれ0.5μｇずつをアニールした。このプラスミ
ドをE.coli DH株に塩化ルビジウム法により
形質転換してpHGV2−dhfrのプラスミドを保
持するコロニーを選択した。得られたプラスミ
ドをpHGV2−dhfrと命名した（図１１ａ）。 尚、上記の別法として、pHV2プラスミドを
Sal処理し、EcoRリンカーを付加すること
なしにEcoRで部分消化し、約2.7kbの断片を
回収し、E.coli DNAポリメラーゼ−Klenow
断片で該DNA断片を処理し末端をブラントエ
ンド化した。 一方前述と同じ方法でpAdD26SVpAのブラ
ントエンド化したEcoR断片を調製し、両者
をT4DNAリガーゼ処理してpHGV2−dhfrを
調製することもできた。 また実施例18の(1)で得られたpHGV2(H)を実
施例12の(2)で記載した如く制限酵素、Hind
およびSalにて処理し、Hind−Sal断片
を上記pAdD26SVpAのブラントエンド化した
EcoR断片に連結してもpHGV2−dhfrを得る
ことができた（図１１ｂ）。 (2) pV2DR1およびpV2DR2の構築 (1)の項で述べたpAdD26SVpA10ｇを50ｍＭ
Tris−HCl（PH7.5）、７ｍＭ MgCl2、100ｍ
Ｍ NaCl、７ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、0.01％BSAを含む反応液50mlに溶解し、制
限酵素EcoRおよびBamHそれぞれ10単位
を加え、37℃10時間反応させた。常法に従いフ
エーノル処理、エーテル洗浄を行つた。１％低
融点アガロース電気泳動にて、約2KbのDNA
断片を回収した後、DNAポリメラーゼ−
Klenow断片にて、常法に従いブラントエンド
化して、フエノール処理、エーテル洗浄、エタ
ノール沈澱を行つた。 一方、実施例19の(1)で得られたpHGV2(H)
10μｇを10ｍＭ Tris−HCl（PH7.5）、７ｍＭ
MgCl2、60ｍＭ NaClを含む反応液50μに溶
解し、Hind10単位を加えて37℃、６時間反
応させた。常法に従い１％低融点アガロース電
気泳動にてDNA断片を回収し、更に、BAP処
理をした後、Klenow断片にてブラントエンド
化した。フエノール処理、エーテル洗浄を行つ
た後、先に述べた約2KbのDNA断片と
T4DNAリガーゼを用いてブラントエンド結合
させた。即ち、それぞれのDNA断片1μｇを66
ｍＭ Tris−HCl（PH7.5）、6.6ｍＭ MgCl2、
５ｍＭ DTT、１ｍＭ ATPを含む反応液
30μに溶解せしめ、T4DNAリガーゼ50単位
を加え、６℃、12時間反応せしめた後、E.
coliDH株に形質転換した。このようにして、
図１１ｃに示すpV2DR1およびpV2DR2を得
た。 (3) 形質転換と発現 上記(1)で調製したpHGV2−dhfrプラスミド
を用いて、実施例14の(3)に記載の方法と同様に
してCHO細胞株を形質転換して発現させた。 なお、CHO細胞の形質転換はCHO細胞に対
しpHGV2とpAdD26SVpAを同時形質転換
（Co transformation）することによつても行
うことができる。 また、以下に述べる方法によつてもCHO細
胞の形質転換を行つた。即ち、上記(2)の項で調
製したpV2DR1あるいはpV2DR2をあらかじめ
それぞれSalおよびKpnで処理してDNA断
片を得て、そのうちの10μｇを上記と同様に
CHO細胞に形質転換させた。このようにして
形質転換された細胞を選択培地にて上記の如く
培養を続けると約７日目で明らかなコロニーが
１プレートにつき100個以上出現した。コロニ
ーを一つ一つ選別することなしに、再び新しい
プレートに移しかえた後、0.01μM MTX存在
下に選択培地で培養を続けると、十数個のコロ
ニーが出現した。更にこのような手法により
MTXの濃度を0.02μM、0.05μM、0.1μMと上
昇させ、生き残つてきたコロニーを選別した。
また、得られた十数個のコロニーをそれぞれ選
別した後、MTX濃度を上昇させても同様のコ
ロニーの選別を行うことができた。 又、いわゆるポリシストロニツク遺伝子を有
する組換えベクターを構築し、これを用いて
CHO細胞を形質転換することができた。即ち、
pAdD26SVpAをPst処理し、２つの断片を
回収しこれらとpBRV2由来のCSF cDNA断片
を結合することにより、アデノウイルスプロモ
ーター、CSFcDNA、DHFR、SV40のポリＡ
部位の順序に配列した組換えベクターを構築し
CHO細胞にいれて実施した。 実施例 12 発現物質のＧ−CSF活性検定（−VSE） 実施例19および実施例20で得られたC127細胞
及びCHO細胞の培養上清から、実施例15に記載
の方法と同様にしてヒトＧ−CSFを得、そのヒト
Ｇ−CSF活性を検定した。その結果は表−３の通
りであつた。
【表】
実施例 22
アミノ酸分析および糖分析（−VSE）
(1) アミノ酸組成の分析
実施例21で得た粗CSF試料を更に実施例２の
(iii)の方法にしたがつて精製した。この精製CSF
試料を実施例16の(1)に記載の方法によつてアミ
ノ酸組成分析に付した。この結果を表−４に示
す。
(iii)の方法にしたがつて精製した。この精製CSF
試料を実施例16の(1)に記載の方法によつてアミ
ノ酸組成分析に付した。この結果を表−４に示
す。
【表】
(2) 糖組成分析
上記アミノ酸組成分析で用いた精製CSF試料
をもちいて、実施例16の(2)に記載したのと同じ
方法及び同じ分析条件によつて糖組成を分析し
た。分析の結果、本発明のCSFからガラクトー
ス、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びシアル酸
が確認された。 実施例 23 ヒトＧ−CSFの感染防御効果 ＜試験方法＞ １ シユードモナス アエルギノーザ
（Pseudom onas aeruginosa）感染に対する防
御効果 ８〜９週令（体重35.3±1.38ｇ）のICR系
マウス（雄）にエンドキサン（シオノギ社社
製、商品名）200mg／Kgを腹腔内投与した後３
群に分け、その２群にヒトＧ−CSF（25000u／
マウス又は50000u／マウス）を含む溶媒（生
理食塩水中１％プロパノール、0.5％（Ｗ／Ｖ）
マウス血清アルブミン）を、そして別の１群に
は溶媒のみを、それぞれ24時間毎に0.1mlずつ
４回皮下投与した。４回目の投与後３時間して
各々の群にシユードモナス アエルギノーザ
（Pseudo monas aeruginosa）GNB−139（3.9
×105CFU／マウス）を皮下投与して感染させ
た。感染後21時間して、さらにもう一度ヒトＧ
−CSF（25000u／マウス又は50000u／マウス）
を含む溶媒又は溶媒のみをそれぞれ対応する群
に皮下投与した。 感染後10日目までの生存マウス数により感染
防御効果を調べた。 （菌液の調製） ハートインフユージヨン液体培地（Difco社
製、商品名）を用いて37℃で一夜シユードモナス
アエルギノーザGNB−139を振とう培養する。
培養液を生理食塩水に懸濁させて調製した。 ＜結果＞ 実施例16のアミノ酸組成分析に用いたのと同
じCHO細胞由来の精製ヒトＧ−CSF試料（＋
VSE）について上記試験を行つた。 その結果を表−５に示す。
をもちいて、実施例16の(2)に記載したのと同じ
方法及び同じ分析条件によつて糖組成を分析し
た。分析の結果、本発明のCSFからガラクトー
ス、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びシアル酸
が確認された。 実施例 23 ヒトＧ−CSFの感染防御効果 ＜試験方法＞ １ シユードモナス アエルギノーザ
（Pseudom onas aeruginosa）感染に対する防
御効果 ８〜９週令（体重35.3±1.38ｇ）のICR系
マウス（雄）にエンドキサン（シオノギ社社
製、商品名）200mg／Kgを腹腔内投与した後３
群に分け、その２群にヒトＧ−CSF（25000u／
マウス又は50000u／マウス）を含む溶媒（生
理食塩水中１％プロパノール、0.5％（Ｗ／Ｖ）
マウス血清アルブミン）を、そして別の１群に
は溶媒のみを、それぞれ24時間毎に0.1mlずつ
４回皮下投与した。４回目の投与後３時間して
各々の群にシユードモナス アエルギノーザ
（Pseudo monas aeruginosa）GNB−139（3.9
×105CFU／マウス）を皮下投与して感染させ
た。感染後21時間して、さらにもう一度ヒトＧ
−CSF（25000u／マウス又は50000u／マウス）
を含む溶媒又は溶媒のみをそれぞれ対応する群
に皮下投与した。 感染後10日目までの生存マウス数により感染
防御効果を調べた。 （菌液の調製） ハートインフユージヨン液体培地（Difco社
製、商品名）を用いて37℃で一夜シユードモナス
アエルギノーザGNB−139を振とう培養する。
培養液を生理食塩水に懸濁させて調製した。 ＜結果＞ 実施例16のアミノ酸組成分析に用いたのと同
じCHO細胞由来の精製ヒトＧ−CSF試料（＋
VSE）について上記試験を行つた。 その結果を表−５に示す。
【表】
同様にして前記実施例16のアミノ酸組成分析
に用いたのと同じC127細胞由来の精製ヒトＧ
−CSF試料を用いて上記試験の感染防禦効果を
調べたところ、ほぼ同様の結果が得られた。 実施例22のアミノ酸組成分析に用いたのと同
じCHO細胞由来の精製ヒトＧ−CSF試料（−
VSE）について上記試験を行つた。 その結果を表−６に示す。
に用いたのと同じC127細胞由来の精製ヒトＧ
−CSF試料を用いて上記試験の感染防禦効果を
調べたところ、ほぼ同様の結果が得られた。 実施例22のアミノ酸組成分析に用いたのと同
じCHO細胞由来の精製ヒトＧ−CSF試料（−
VSE）について上記試験を行つた。 その結果を表−６に示す。
本発明のヒトＧ−CSF活性を有する糖蛋白質
は、白血球減少症治療剤、骨髄性白血病治療剤、
造血機能回復促進剤或いは感染防禦剤等の有効成
分として極めて有用なものである。 又、待望されていたこれら医薬品を具現化せし
めた遺伝子組換えによるヒトＧ−CSFの製法確立
も、本発明の大きな成果ということができよう。
は、白血球減少症治療剤、骨髄性白血病治療剤、
造血機能回復促進剤或いは感染防禦剤等の有効成
分として極めて有用なものである。 又、待望されていたこれら医薬品を具現化せし
めた遺伝子組換えによるヒトＧ−CSFの製法確立
も、本発明の大きな成果ということができよう。
図１はプローブIWQ、プローブＡおよびプロ
ーブLCの配列を示す。図２はpHCS−１インサ
ートの塩基配列を示す。図３ＡはpBRG4の
cDNAインサートの塩基配列を示す。図３Ｂ，
はpBRG4cDNAから演えきしたヒトＧ−CSF前
駆体のアミノ酸配列を示す。図３Ｂ，は
pBRG4cDNAから演えきしたヒト成熟Ｇ−CSF
のアミノ酸配列を示す。図４ＡはpBRV2の
cDNAインサートの塩基配列を示す。図４Ｂ，
はpBRV2cDNAから演えきしたヒトＧ−CSF前
駆体のアミノ酸配列を示す。図４Ｂ，は
pBRV2cDNAから演えきしたヒト成熟Ｇ−CSF
のアミノ酸配列を示す。図５はpBRS4または
pBRV2由来ヒトＧ−CSFcDNAの制限酵素切断
部位を示す。図６はpHGA410の概略構造を示
す。図７は発現用組換えベクターpTN−G4、
pTN−G4VAαおよびpTN−G4VAβの構築プロ
セスを示す。図８ａおよび図８ｂはpHGG4−
dnfrの構築プロセスを示す。図８ｃはpG4DR1お
よびpG4DR2の構築プロセスを示す。図９は
pHGV2の概略構造を示す。図１０は発現用組換
えベクターpTN−V2、pTN−VAαおよびpTN
−VAβの構築プロセスを示す。図１１ａおよび
図１１ｂは発現用組換えベクターpHGV2−dhfr
の構築プロセスを示す。図１１ｃはpV2DR1およ
びpV2DR2の構築プロセスを示す。
ーブLCの配列を示す。図２はpHCS−１インサ
ートの塩基配列を示す。図３ＡはpBRG4の
cDNAインサートの塩基配列を示す。図３Ｂ，
はpBRG4cDNAから演えきしたヒトＧ−CSF前
駆体のアミノ酸配列を示す。図３Ｂ，は
pBRG4cDNAから演えきしたヒト成熟Ｇ−CSF
のアミノ酸配列を示す。図４ＡはpBRV2の
cDNAインサートの塩基配列を示す。図４Ｂ，
はpBRV2cDNAから演えきしたヒトＧ−CSF前
駆体のアミノ酸配列を示す。図４Ｂ，は
pBRV2cDNAから演えきしたヒト成熟Ｇ−CSF
のアミノ酸配列を示す。図５はpBRS4または
pBRV2由来ヒトＧ−CSFcDNAの制限酵素切断
部位を示す。図６はpHGA410の概略構造を示
す。図７は発現用組換えベクターpTN−G4、
pTN−G4VAαおよびpTN−G4VAβの構築プロ
セスを示す。図８ａおよび図８ｂはpHGG4−
dnfrの構築プロセスを示す。図８ｃはpG4DR1お
よびpG4DR2の構築プロセスを示す。図９は
pHGV2の概略構造を示す。図１０は発現用組換
えベクターpTN−V2、pTN−VAαおよびpTN
−VAβの構築プロセスを示す。図１１ａおよび
図１１ｂは発現用組換えベクターpHGV2−dhfr
の構築プロセスを示す。図１１ｃはpV2DR1およ
びpV2DR2の構築プロセスを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列を
有するcDNA断片を含む組換えベクターで形質転
換された哺乳動物細胞を培養し、次いで産生され
たヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する糖蛋
白質を分離することを特徴とするヒト顆粒球コロ
ニー刺激因子活性を有する糖蛋白質の製造方法。 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro
Met Lys Leu Met Ala Leu Gln Leu Leu Leu
Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu
Ala Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu
Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu
Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala
Ala Leu Gln Glu Lys Leu （Val Ser Glu）n
Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu
Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly
Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro
Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu
Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr
Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr
Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr
Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly
Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly
Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln
Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser
His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr
Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro（ただ
しｍは０または１を表わす） ２ 塩基配列が下記の塩基配列である特許請求の
範囲第１項記載の製造方法。 ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG
AGC CCC ATG AAG CTG ATG GCC CTG
CAG CTG CTG CTG TGG CAC AGT GCA
CTC TGG ACA GTG CAG GAA GCC ACC
CCC CTG GGC CCT GCC AGC TCC CTG
CCC CAG AGC TTC CTG CTC AAG TGC
TTA GAG CAA GTG AGG AAG ATC
CAG GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG
GAG AAG CTG （GTG AGT GAC）nTGT
GCC ACC TAC AAG GTG TGC CAC CCC
GAG GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC
TCT CTG GGC ATC CCC TGG GCT CCC
CTG AGC AGC TGC CCC AGC CAG GCC
CTG CAG CTG GCA GGC TGC TTG AGC
CAA CTC CAT AGC GGC CTT TTC CTC
TAC CAG GGG CTC CTG CAG GCC CTG
GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT
CCC ACC TTG GAC ACA CTG CAG CTG
GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC
ATC TGG CAG CAG ATG GAA GAA
CTG GGA ATG GCC CCT GCC CTG CAG
CCC ACC CAG GGT GCC ATG CCG GCC
TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC CGG
GCA GGA GGG GTC CTG GTT GCC TCC
CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GTG
TCG TAC CGC GTT CTA CGC CAC CTT
GCC CAG CCC（ただしｍは０または１を表わ
す） ３ 塩基配列が下記の塩基配列(イ)又は塩基配列(ロ)
に示されている塩基配例である特許請求の範囲第
１項記載の製造方法。 塩基配例 (イ) 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】
Priority Applications (20)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IE242786A IE63992B1 (en) | 1985-09-17 | 1986-09-11 | Human granulocyte colony stimulating factor |
| IE930852A IE64489B1 (en) | 1985-09-17 | 1986-09-11 | Human granulocyte colony stimulating factor |
| NO863674A NO179373C (no) | 1985-09-17 | 1986-09-15 | Rekombinant vektor istand til å uttrykke et glykoprotein, transformant som uttrykker et glykoprotein og fremgangsmåte for fremstilling av et glykoprotein |
| HU863963A HU209147B (en) | 1985-09-17 | 1986-09-16 | Method for producing stimulating factor of human granulocytae colony |
| CA000518286A CA1341389C (en) | 1985-09-17 | 1986-09-16 | Human granulocyte colony stimulating factor |
| DK198604432A DK175336B1 (da) | 1985-09-17 | 1986-09-16 | DNA-sekvens, som koder for et peptid med granulocytstimulerende virkning, rekombinantvektor og transformant indeholdende denne sekvens, samt fremgangsmåde til fremstilling af polypeptidet |
| CN 86106815 CN1021461C (zh) | 1985-09-17 | 1986-09-17 | 人粒性白细胞集落刺激因子 |
| KR1019860007835A KR910005624B1 (ko) | 1985-09-17 | 1986-09-17 | 인체 과립성 백혈구의 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 당단백질의 제조방법 |
| FI863757A FI104982B (fi) | 1985-09-17 | 1986-09-17 | Menetelmä ihmisen granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän valmistamiseksi, sitä koodittava geenisekvenssi, vektori ja isäntäsolu |
| AU62980/86A AU598477C (en) | 1985-09-17 | 1986-09-17 | Human granulocyte colony stimulating factor |
| IL80058A IL80058A (en) | 1985-09-17 | 1986-09-17 | Human granulocyte colony stimulating factor |
| DE8686113446T DE3681551D1 (de) | 1985-09-30 | 1986-09-30 | Menschlicher granulozyten-colony stimulierender faktor. |
| EP86113446A EP0220520B1 (en) | 1985-09-30 | 1986-09-30 | Human granulocyte colony stimulating factor |
| AT86113446T ATE67517T1 (de) | 1985-09-30 | 1986-09-30 | Menschlicher granulozyten-colony stimulierender faktor. |
| KR1019890006201A KR920002312B1 (ko) | 1985-09-17 | 1989-05-09 | 인체 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자 |
| KR1019910019455A KR920005752B1 (ko) | 1985-09-17 | 1991-11-01 | 인체 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자 |
| HR920628A HRP920628B1 (en) | 1985-09-17 | 1992-09-30 | Human granulocyte colony stimulating factor |
| SG650/93A SG65093G (en) | 1985-09-30 | 1993-05-18 | Human granulocyte colony stimulating factor |
| HK655/93A HK65593A (en) | 1985-09-30 | 1993-07-08 | Human granulocyte colony stimulating factor |
| YU75295A YU48523B (sh) | 1985-09-30 | 1995-12-04 | Faktor koji stimuliše humanu koloniju granulocita |
Applications Claiming Priority (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20606685 | 1985-09-17 | ||
| JP20963885 | 1985-09-20 | ||
| JP21715085 | 1985-09-30 | ||
| JP26945685 | 1985-12-02 | ||
| JP60-270839 | 1985-12-03 | ||
| JP27083985 | 1985-12-03 | ||
| JP60-269456 | 1985-12-03 | ||
| JP60-209638 | 1985-12-03 | ||
| JP60-206066 | 1985-12-03 | ||
| JP60-217150 | 1985-12-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62236497A JPS62236497A (ja) | 1987-10-16 |
| JPH025395B2 true JPH025395B2 (ja) | 1990-02-01 |
Family
ID=27529395
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61166710A Granted JPS62236497A (ja) | 1985-09-17 | 1986-07-17 | 顆粒球コロニー刺激因子活性を有する糖蛋白質の製造方法 |
| JP61166709A Expired - Lifetime JPH0657152B2 (ja) | 1985-09-17 | 1986-07-17 | Ｃｓｆ遺伝子類 |
| JP63184486A Expired - Lifetime JPH0657156B2 (ja) | 1985-09-17 | 1988-07-26 | 新糖蛋白質の製法 |
| JP5183134A Expired - Lifetime JPH0783717B2 (ja) | 1985-09-17 | 1993-06-30 | ヒト顆粒球コロニー刺激因子をコードする遺伝子 |
Family Applications After (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61166709A Expired - Lifetime JPH0657152B2 (ja) | 1985-09-17 | 1986-07-17 | Ｃｓｆ遺伝子類 |
| JP63184486A Expired - Lifetime JPH0657156B2 (ja) | 1985-09-17 | 1988-07-26 | 新糖蛋白質の製法 |
| JP5183134A Expired - Lifetime JPH0783717B2 (ja) | 1985-09-17 | 1993-06-30 | ヒト顆粒球コロニー刺激因子をコードする遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (4) | JPS62236497A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010131382A1 (ja) | 2009-05-14 | 2010-11-18 | Fukuda Keiichi | 筋肉修復促進剤 |
| WO2012067262A1 (ja) | 2010-11-17 | 2012-05-24 | Fukuda Keiichi | 筋ジストロフィー治療剤 |
| JPWO2017072880A1 (ja) * | 2015-10-28 | 2018-03-08 | 三菱重工コンプレッサ株式会社 | 弁装置、蒸気タービン設備 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06102021B2 (ja) * | 1985-12-03 | 1994-12-14 | 中外製薬株式会社 | 新規なポリペプチド |
| US4810643A (en) * | 1985-08-23 | 1989-03-07 | Kirin- Amgen Inc. | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
| JPS63500636A (ja) * | 1985-08-23 | 1988-03-10 | 麒麟麦酒株式会社 | 多分化能性顆粒球コロニー刺激因子をコードするｄｎａ |
| JPH0618779B2 (ja) * | 1986-01-22 | 1994-03-16 | 中外製薬株式会社 | 造血機能回復促進剤 |
| ZA872705B (en) * | 1986-04-22 | 1987-10-05 | Immunex Corporation | Human g-csf protein expression |
| US6166183A (en) * | 1992-11-30 | 2000-12-26 | Kirin-Amgen, Inc. | Chemically-modified G-CSF |
| WO1990006952A1 (fr) * | 1988-12-22 | 1990-06-28 | Kirin-Amgen, Inc. | Facteur de stimulation de colonies de granulocytes modifies chimiquement |
| DE69327247T2 (de) * | 1992-09-09 | 2000-05-18 | Nippon Kayaku K.K., Tokio/Tokyo | Physiologisch aktive substanz nk175203, verfahren zu deren herstellung und pharmazeutische verwendung |
| US20030053982A1 (en) | 1994-09-26 | 2003-03-20 | Kinstler Olaf B. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| US5824784A (en) | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| US6559322B1 (en) | 2001-12-21 | 2003-05-06 | Council Of Scientific And Industrial Research | Process for preparation of a lactone from a cyclic ketone |
| EP2042196B1 (en) | 2001-10-10 | 2016-07-13 | ratiopharm GmbH | Remodelling and glycoconjugation of Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF) |
-
1986
- 1986-07-17 JP JP61166710A patent/JPS62236497A/ja active Granted
- 1986-07-17 JP JP61166709A patent/JPH0657152B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-07-26 JP JP63184486A patent/JPH0657156B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-06-30 JP JP5183134A patent/JPH0783717B2/ja not_active Expired - Lifetime
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|---|---|---|---|---|
| WO2010131382A1 (ja) | 2009-05-14 | 2010-11-18 | Fukuda Keiichi | 筋肉修復促進剤 |
| WO2012067262A1 (ja) | 2010-11-17 | 2012-05-24 | Fukuda Keiichi | 筋ジストロフィー治療剤 |
| JPWO2017072880A1 (ja) * | 2015-10-28 | 2018-03-08 | 三菱重工コンプレッサ株式会社 | 弁装置、蒸気タービン設備 |
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|---|---|
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| JPH0657152B2 (ja) | 1994-08-03 |
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