PT86772B - Processo para a preparacao de interleuquina-3 humana e de suas muteinas - Google Patents

Description

SCHERING BIOTECH CORPORATION

PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE INTERLEUQUINA-3 HUMANA E DE

SUAS MUTEÍNAS

envolvam a regeneração de e/ ou populações de células sanguí neas enfraquecidas tais como as da hipoplasia mieloide, de infecções crónicas e de terapias utilizando transplantações de medula óssea.

Segundo o processo do invento é | incorporado, nas referidas proteínas, em polipeptídeo glicosilado ou não glicosilado, 10 vezes substituído o qual ê produzido pelo seguinte método: a) construção de um vector compreendendo a se quência ne nucleotídeos codificadora do referido polipeptídeo; b) incorporação do vector num hospedeiro;

| c) manutenção do hospedeiro numa meio de cultura em condições adequadas para expressar a referida sequência de nucleotídeos no referido polipeptídeo.

Processo para a preparação de ínterleuquinas-3 humanas e de suas muteínas

O invento diz respeito, de um modo geral, a mediadores proteicos de desenvolvimento do sistema hematopoiético e a ácidos nucleicos que codificam aqueles. Em particular, o invento diz respeito a uma variante da inter leuquina-3 humana, a suas muteínas e aos ácidos nucleicos que as codificam.

As células sanguíneas em circulação estão a ser constantemente substituídas por novas células que se desenvolveram. As células sanguíneas de substituição formam-se num processo designado hematopoiesis que compreende a produção de, pelo menos, oito linhagens de células sanguíneas maturadas: células sanguíneas vermelhas (eritrôcitos), macrofagos (monôcitos), granulôcitos eosinofílicos, megacasiôcitos (plaquetas), granulôcitos neutropílicos, granulôcitos basofilicos (células másticas), T limfôcitos e B limfôcitos (Burgess and Nicola, Growth Factors and Stem Cells (Academic Press, New York, 1983)). Grande parte do controlo da formação de células sanguíneas ê mediado por um grupo de glicoproteínas que interactuam, designados factores de estimulação de colónia (colony stímulating factors”, CSFs). Estas glicoproteínas são assim chamadas por causa dos ensaios in vivo e in vitro utilizados para detectar a sua presença. As técnicas de cultura clonal de células hematopoiêticas em meio de cultura semi-sôlido foram especialmente importantes no desenvolvimento dos vários ensaios in vitro. Nessas culturas, células progenitor individuais (i.e. células destinadas, do ponto de vista do desenvolvimento, a uma linhagem particular, mas ainda assim capazes de proliferar) são capazes de poliferar a fim de formar uma colónia de descendentes em maturação, de um modo que se crê ser basicamente idêntico ao processo comparável que tem lugar in vivo. 0 papel dos CSFs na hematopoie sis foi objecto de vários trabalhos recentes, por ex. Metcalf,

The Hemopoietic Colony Stimulating Factors (Elsevier, New York, 1984); Metcalf, Science, Vol. 229, págs. 16-22 (1985); Nicola et al., Immunology Today, vol.5, págs. 76-80 (1984); e Whetton et al., TIBS, vol. 11, pâgs. 207-211 (1986).

A detecção, isolamento e purificaI ção destes factores é extremamente difícil, uma vez que ê frequentemente complicada pela natureza dos sobrenadantes em que geralmente se encontram, as divergências e cruzamentos de actividades dos vários componentes das misturas, a sensibilidade (ou ausência da mesma) dos ensaios utilizados para I determinar as propriedades dos factores, a semelhança frequeii te de gamas de massas moleculares e de outras caracteristicas dos factores, e a muito baixa concentração dos factores no seu ambiente natural.

A medida que se foram tornando dis poníveis mais CSFs, sobretudo por intermédio de clonagem molecular, cresceu o interesse em encontrar, para eles aplicações clínicas. As utilizações potenciais dos CSFs foram comparadas com as utilizações correntes de hormonas, devido às suas semelhanças fisiológicas (por ex. factores solúveis, mediadores do crescimento, acção por intermédio de receptores celulares), I por ex. Dexter, Nature, Vol. 321, pág. 198 (1986). Foi sugerida a sua utilização em diversas situações em que é desejável a estimulação da produção de células sanguíneas, tal como em terapia reabilitadora apôs quimioterapia ou terapia por intermédio de radiações de tumores, tratamento de hipoplasias I mielôides, tratamento de dificiência neutrofί1ica, tratamento para incrementar a regeneração hematopoiética apôs transplantação da medula óssea, e tratamento para aumentar a resi£ tência do hospedeiro a infecções estabelecidas por ex. Dexter (atrás citado), e Metcalf, Science (atrás citado).

Ao longo dos últimos anos, foi identificada, purificada e clonada uma actividade de CSF murina, denominada multi-CSF ou interleuquina-3 (IL-3); ver

Yokota et al; Proc. Natl. Acad. Sei., Vol. 81 pâgs. 1070-1074 (1984); Fung et al., Nature, Vol. 307, pâgs. 233-237 (1984);

Hapel et al., Blood, Vol. 65, pâgs. 1453-1459 (1985); Ihle et al., J. Immunol., Vol 128 pâgs 2431-2436 (1982); Ihle et al. J. Immunol., Vol 131, pâgs. 282-287 (1983); e Iscove et al. pâgs. 397-425 em Cellular and Molecular Biology of LymPhokines (Biologia Celular e Molecular de Linfoquinas) (Academic Press, Nova Yorque, 1985). A IL-3 murina exibe um amplo espectro de actividades de CSF, sendo capaz de estimular a poliferação e o desenvolvimento das células progenitoras de todas as linhagens mieloides reconhecidas, por ex. Dexter, I Nature, Vol 309, pâgs. 746-747 (1984); Ihle et al.. Lymphokines, Vol. 9, pâgs 153-200 (1984). Devido aos amplos efeitos de estimulação do factor, tem sido grande o interesse em isolar os factores análogos noutros mamíferos, em particular no homem.

Recentemente, foram revelados homólogos de IL-3 de murganho relativos a rato, gibão e ao homem por Cohem et al., Nucleic Acids Research, Vol. 14, pâgs. 3641-3658 (1986); e Yang et al., Cell, Vol. 47, pâgs. 3-10 (1986). As sequências de aminoâcidos das moléculas referidas apresentam um grau de homologia em relação a IL-3 de murganho ₍ relativamente baixo: 54 por cento para o rato, 29 por cento para o gibão e 29 por cento para o homem. Além disso, não se sabe ainda se o homólogo humano possui a mesma gama de actividades biológicas que o seu equivalente no murganho.

) Tendo em conta que atrás ficou dito, a disponibilidade de variantes do homólogo humano de IL-3 de murganho com actividades biológicas confirmadas seria altamente vantajosa para efeitos de possíveis utilizações cH nicas, em particular em situações em que a estimulação da geração de células sanguíneas poderia compensar hipoplasia mielóide induzida por doença, inverter os efeitos secundários perniciosos das terapias do cancro, incrementar a eficácia das transplantações de medula óssea ou outras situações aná-6

Iogas.

presente invento diz respeito a uma interleuquina-3 (IL-3) humana e as suas muteínas obtidas por manipulação genética. Inclui polipéptidos que compreendem uma sequência de aminoácidos seleccionada do conjunto | adiante definido pela Fórmula I, e que possuem uma actividade de factor de estimulação de colónia (CSF) tal como é defi. nida por ensaios convencionais. 0 invento inclui também ác£ dos nucléicos capazes de codificar os polipéptidos definidos pela Fórmula I, métodos de preparação desses polipéptidos | utilizando os ácidos nucléicos do invento, e métodos de utilização dos polipéptidos do invento, quer isoladamente, quer em conjunto com outros CSFs a fim de tratar afecçóes invol vendo hipoplasia nuclóide ou para incrementar a regeneração do sistema hematopoiêtico após transplatação da medula Óssea ou depois de cetas terapias relacionadas com o cancro.

Um modelo de execução preferido do invento é o conjunto de polipéptidos glicosilados ou não glicosilados que compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do conjunto de sequências definido pela fórmula seguinte:

X(Pro) W(Pro)	- X(Met) - W(Leu)	- X (Tre ) - W(LiS)	- X(Gln) 10 - X ( Tre)	- X (Tre ) - X(Ser)	- W (Tre ) - X(Trp)
X(Val)	- X(Asn) 20	Cis	- X(Ser)	- W(Asn)	- W(Met)
W(Ile)	- W(Asp)	- W(Glu)	- W(Ile)	- W(Ile)	- W (Tre ) 30
W(His)	- W(Leu)	- W(Lis)	- W(Gln)	- W(Pro)	- W(Pro)
X(Leu)	- X(Pro)	- X(Leu)	- X(Leu) 40	- X(Asp)	- X(Fen)
X(Asn)	- X(Asn)	- W(Leu)	- W (Asn)	- W(Gli)	- W(Glu)

W(Asp) W(Glu) W(Pro)	- W(Gln) 50 - W(Asn) - W(Asn)	- W(Asp) - W(Asn) - W(Leu)	- W(Ile) - - W(Leu) - - W(Glu) -	W(Leu) W(Arg) W(Ala)	- W(Met) - W(Arg) 60 - W (Fen
W(Asn)	-	W(Arg)	-	W(Ala)	-	W(Val) 70	-	W(L s)	-	W(Ser)
W (Leu)	-	W(Gln)	-	W(Asn)	-	W(Ala)	-	W(Ser)	-	W (Ala)
W(Ile)	-	W(Glu) 80	-	W(Ser)	-	W(Ile)	-	W(Leu)	-	X (Lis)
X(Asn)	—	X(Leu)		X(Leu)		X (Pro)		Cis		X(Leu) 90
X(Pro)	-	X(Leu)	-	X (Ala)	-	X(Tre)	-	X(Ala)	-	W(Ala)
W(Pro)	-	W (Tre)	-	W (Arg)	-	W(HÍS) 100	-	W(Pro)		W(Ile)
W(His)	—	W(Ile)	—	W(Lis)	—	W (Asp)	—	W(Gli )	—	W (Asp)
W(Trp)	-	W (Asn) 110	-	W(Glu)	-	W (Fen)	-	W(Arg)	-	W(Arg)
W(LÍS)	—	W(Leu)	—	X (Tre)		X (Fen)	—	X(Tir)	“	X(Leu) 120
X(LiS)	-	W(Tre)	-	W(Leu)	-	W(Glu)	-	W (Asn)	—	W(Ala)
W(Gln)	-	W(Ala)	-	W(Gln)	-	W(Gln) 130	-	X (Tre)	-	X (Tre)
X(Leu)	-	X(Ser)	-	X(Leu)	-	X(Ala)	-	X(Ile)	-	X (Fen)

na qual os termos W(Xaa) e X(Xaa) representam grupos de aminoâcidos sinónimos do aminoãcido Xaa localizados numa região hidrofílica ou hidrofôbica da proteína, respectivamente, tal | como se determina pela análise de Hopp-Woods. Aminoãcidos sinónimos no interior de um grupo possuem propriedades fisico-quimicas suficientemente semelhantes para que a substitu^ ção entre membros do grupo conserve a função biológica da mo lécula: Grantham, Science, vol.185, pâgs. 862-864 (1974);

| e Dayhoff et al., A model of Avolutionary Change in Proteín (Um modelo de modificação evolutiva em proteínas), Atlas of Proteín Sequence and Structure 1972 (Atlas de Sequências e Estruturas Proteicas 1972), vol. 5, pâgs.-89-99. E óbvio que é possivel fazer inserções e delecçóes de aminoãcidos na sequência atrás definida sem alterar a função biológica, em particular se as inserções e deleções envolverem apenas al guns aminoãcidos, por ex. até dez, e não removerem ou deslocarem aminoãcidos que são fundamentais para a conformação funcional, por ex. resíduos de cisteína: Anfinsen, Principies That Govern The Folding of Proteín Chains. (Princípios que governam a dobragem de cadeias proteicas), Science, Vol.181 pâgs. 223-230 (1973). As proteínas e muteínas produzidas por tais deleções e/ou inserções estão contidas no âmbito do presente invento. Onde quer que resíduos de aminoãcidos da proteína de Fórmula I forem aqui referidos por meio de numeros, tais números são relativos à extremidade N da proteína.

Deve notar-se que o polipêptido IL-3 humano representado por aminoãcidos Xaa na fórmula I (e aqui mais adiante indicado como fórmula II), contém uma substituição de aminoãcido não conservativa de serina por prolina na posição 7 relativamente a sequências de IL-3 humana previamente referidas por Yang et al. em Cell, Vol. 47, pâgs. 3-10.

Os grupos aminoácidos sinónimos são, de preferência, aqueles que são definidos nos Quadros I e II. De modo mais preferido, os grupos de aminoácidos sinónimos são aqueles que são indicados antes do segundo traço em cada linha dos Quadros I e II; e, de modo preferido em pr£ melro lugar, os grupos de aminoácidos sinónimos são aqueles que são indicados antes do primeiro traçõ em cada linha nos Quadros I e II (cada grupo W(Xaa) preferido em primeiro lugar, consistindo apenas no próprio Xaa).

ιο-

Quadro I.

Xaa

Grupos de aminoácidos sinónimos X(Xaa) preferidos» mais .preferidos e preferidos em primeiro lugar

X(Xaa)

Ser	Ser,//Tre, Gli, Asn, Cis
Arg	Arg,/Lis, His,/Gin, Glu
Leu	Leu, Ile, Met,/Fen/Val, Tir
Pro	Pro,/Ala,/Gli, Tre
Tre	Tre,//Pro, Ser, Ala, Gli, His, Gin
Ala	Ala,/Pro,/Gli, Tre
Vai	Vai,/Met, Ile,/Leu, Tir, Fen
Gli	GLi,//Aal, Tre, Pro, Ser
Ile	Ile, Met, Leu,/Fen, Vai,/Tir
Fen	Fen,/Met, Tir, Ile, Leu,/Vai, Trp
Tir	Tir,/Fen,/Trp, Met, Ile, Vai, Leu
His	His,/Gin, Arg,/Glu, Lis, Tre
Gin	Gin,/Glu, His,Tre, Arg, Lis, Asn
Asn	Asn,/Asp,/Ser, Gin
Lis	Lis,/Arg,/Glu, Gin, His
Asp	Asp,/Asn,/Glu
Glu	Glu,/Gin,/His, Arg, Asp, Lis, Asn
Met	Met, Ile, Leu,/Fen, Vai/
Trp	Trp//
Cis	Cis//

Quadro II	Grupos de aminoácidos sinónimos W(Xaa) preferidos, mais preferidos e preferidos em primeiro lugar
Xaa	W(Xaa)
Ser Arg Leu Pro Tre Ala Vai 61 i Ile Fen Tir His Gin Asn Lis Asp Glu Met Trp Cis	Ser,//Cis Arg,//His, Lis Leu,/Ile, Met, Fen Pro,//Ala Tre// Ala,//Pro Vai,//Met, Ile Gli// Ile,/Met, Leu,/Fen, Vai Fen,//Met, Tir, Ile, Leu Tir,//Fen His,//Gin, Arg Gin,//Glu, His Asn,//Asp Lis,//Arg Asp,//Asn Glu,//Gin Met,/Ile, Leu,/Fen, Vai Trp// Cis//

inventa inclui os polipêptidos de Fórmula I com substituições de aminoácidos (entre um aminoácido do polipêptido definido pela Fórmula II (a seguência nativa putativa) e um aminoácido sinónimo) numa única posi çáo ou em várias posições. 0 termo substituido N-vezes ê usado para descrever um subconjunto de polipêptidos defini dos pela Fórmula I em que 0-N aminoácidos da sequência nativa foram substituídos por aminoácidos sinónimos. Assim, por exemplo, o grupo de polipêptidos de Fórmula I substituídos 1 vez consiste em 381 polipêptidos para os grupos de aminoácidos sinónimos preferidos, 245 para os grupos de aminoácidos sinónimos mais preferidos, e 38 para os grupos de aminoácidos sinónimos preferidos em primeiro lugar. Estes numeros são obtidos adicionando duas somas: (i) a soma do numero de aminoácidos de cada espécie nas regiões hidrofóbicas da sequência nativa vezes a dimensão do grupo aminoácido sinónimo (grupo X) para esse aminoácido, e (ii) a zona do número de aminoácidos de cada espécie nas regiões hidrofilicas da se quência nativa vezes a dimensão do grupo aminoácido sinónimo (grupo W) para esse aminoácido.

De preferência, o grupo de polipéjp tidos 10 vezes substituídos de Fórmula I em que os aminoácidos das regiões definidas pelos resíduos 10-32 inclusivê, 47-60 inclusivê, 71-86 inclusivê, e 95-113 inclusivê não estão mais de 3 vezes substituídos. As sequências de aminoácidos nestas regiões estão mais altamente conservadas relativamente à restante molécula, quando comparadas com sequências de IL-3 no murganho, rato e gibão.

De modo mais preferido, o grupo de polipêptidos IL-3 humanos consiste nos polipêptidos 5 vezes substituídos de Fórmula I em que os aminoácidos nas re giões definidas pelos resíduos 10-32 inclusivê, 47-60 inclusivê, 71-86 inclusive e 95-113 inclusivê não estão substitui^ dos mais de 1 vez. De modo ainda mais preferido, o grupo de polipêptidos IL-3 humanos consiste nos polipêptidos 2 ve-

zes substituídos de Formula I em que os aminoácidos nas regiões definidas pelos resíduos inclusivé, 47-60 inclusivé, 71-86 inclusivé e 95-113 inclusivé não têm quaisquer substituições. De modo preferido em primeiro lugar, o polipéptido do invento compreende a sequência de aminoâcidos nativa definida pela seguinte fórmula:

Pro Li s Asn His Leu

- Met 10

- Tre

-

Gin Trp 20 Asp Gin Fen

-

Tre Vai Glu Pro Asn

-

Tre Asn Ile 30 Pro Asn

-

Pro - Cis -

Leu Ser Tre Pro 40 Asn

-

-

Ser Ile LiS Asp

-

Tre Met Leu Leu

Ile Leu Leu

-

G1 i

-

Glu 50

-

Asp

-

Gin

-

Asp

-

Ile

-

Leu

-

Met

Glu

“

Asn

Asn

Leu 60

Arg

Arg

—

Pro

—

Asn

—

Leu

Glu

Ala

Fen

Asn

Arg 70

—

Ala

—

Vai

—

Lis

Ser

Leu

““

Gin

Asn

Ala

—

Ser

—

Ala 80

—

Ile

—

Glu

—

Ser

—

Ile

—

Leu

-

LiS

-

Asn

-

Leu

-

Leu

-

Pro 90

-

C is

-

Leu

-

Pro

-?

Leu

-

Ala

-

Tre

-

Ala

-“

Ala

““

Pro

Tre 100

—

Arg

His

—

Pro

—

Ile

—

His

Ile

Lis

Asp

·“

Gli

Asp 110

•

Trp

*-

Asn

—

Glu

Fen

Arg

““

Arg

Lis

—

Leu

—

Tre

—

Fen 120

—

Tir

—

Leu

—

Lis

—

Tre

—

Leu

—

Glu

-

Asn

-

Ala

-

Gin Leu

—

Ala 130 Ala

—

Gin Ile

-

Gin Fen

-

Tre

-

Tre

-

Leu

-

Ser

-

Fórmula II

De modo análogo, o termo inserido N-vezes relativamente aos polipêptidos de Formula I ê us£ do para descrever um conjunto de polipêptidos em que foram inseridos 1 a N aminoâcidos na sequência definida pela fórmula I. De preferência, os aminoâcidos inseridos são seleccionados dos grupos preferidos de aminoâcidos sinónimos dos aminoâcidos que flanqueiam a inserção de modo mais preferido, são seleccionados dos grupos mais preferidos de aminoâcidos sinónimos dos aminoâcidos que flanqueiam a inserção, e de modo preferido em primeiro lugar dos grupos preferidos em primeiro lugar de aminoâcidos sinónimos dos aminoâcidos que flan queiam a inserção (ver Quadros I e II). Assim, por exemplo, um subgrupo do grupo de pêptidos inseridos 1 vez compreende um aminoâcido inserido entre o X(Pro) N-terminal e o X(Met) adjacente. As inserções que difinem os membros deste subgrupo são seleccionadas, de preferência, entre Pro, Ala, Gli, Tre, Met, Fen, Ile, Vai e Leu; com maior preferência são seleccionadas entre Ala, Pro, Met, Leu, Fen, Ile e Vai, e preferido em primeiro lugar, não seleccionados entre Pro, Met, Ile e Leu. As inserções podem ser feitas entre quaisquer aminóâcidos adjacentes de Fórmula I e também no início e no fim da sequência de aminoâcidos. Uma vez que existem 133 possíveis locais de inserção, e uma vez que podem ser feitas no mesmo local inserções múltiplas, um péptido inserido 2 vezes de fór mula I dâ origem a 17 689 subgrupos de pêptidos, e a dimensão de cada subgrupo depende das dimensões dos grupos de aminoâcidos sinónimos dos aminoâcidos que flanqueiam as inserções.

termo eliminado N-vezes relativamente aos polipêptidos de fórmula I é usado para descrever um conjunto de pêptidos com 1 a N aminoâcidos eliminados da sequência definida pela Fórmula I. Assim, o conjunto de polipêptidos de Fórmula I eliminados 1 vez consiste em 132 subgrupos de polipêptidos, cada qual com 131 aminoâcidos (13j_

-Ômeros). Cada um dos subgrupos consiste, por uma vez, em todos os 131-ómeros definidos pelos grupos de aminoácidos sinónimos preferidos, mais preferidos e preferidos em primeiro lugar, de acordo com a multiplicidade de substituições.

Quando quer que for definido um ) conjunto de polipéptidos em termos tamto de deleções relativamente à sequência de Formula I, e inserções relativamente à sequência de Fórmula I, forma-se primeiro o conjunto de po1ipéptidos definido pelas inserções e depois, para cada membro desse conjunto, forma-se um conjunto de polipéptidos deI finido por deleções. A soma dos membros de todos estes últimos conjuntos forma o conjunto de polipéptidos definidos por inserções e deleções.

Os polipéptidos de acordo com o invento podem fazer parte de um polipéptido mais longo que compreende um polipéptido adicional ligado δ terminação N do polipéptido de acordo com o invento. 0 polipéptido adicional pode ser uma sequência sinal para dirigir a secreção da proteína do organismo hospedeiro, por ex. sequências sinal MFalfal na levedura (Kurjan et al. Cell, Vol. 30, págs. 933-943 (1982)). Ou o péptido adicional pode ser usado para facilitar a purificação do polipéptido desejado, por ex. Sassen^ feld et al. A Polypeptide Fusion Designed for the Purification of Recombinant Proteins (Uma fusão polipeptídica destinada à purificação de proteínas recombinantes), Biotechnology, págs 76-81 (Janeiro 1984). Neste caso, o péptido adicional ) contém um local de dissociação selectiva adjacente à terminação N do polipéptido desejado para separação ulterior da sequência de aminoácidos supérfula (relativamente à actividade biológica) por meios enzimáticos ou químicos.

modelo de execução do invento preferido atrás mencionado inclui ainda sequências de nucleótidos capazes de codificarem os polipéptidos de Fórmula I dos grupos de aminoácidos sinónimos preferidos, mais preferidos

e preferidos em primeiro lugar. Em particular, o invento inclui ácidos nucleicos possuindo a sequência do fragmento de inserção de cDNA do clone pcD-huIL3-22-1 ilustrada na Figura 2. pcD-huIL3-22-1 foi depositado na American Type Culture CcH lection, Rockville, Maryland, sob o número de acesso 67318.

Em todo o texto são utilizadas abreviaturas usuais para designarem aminoácidos, nucleótidos, endonucleases de restrição, etc, por ex. Cohn, Nomenclature and Symbolism of ca-Amino Acids {Nomenclatura e Simbologia de ^-Aminoácidos), Methods in Enzymology (Métodos de Enzimologia), Vol 106, págs. 3-107 (1984); Wood et al. Biochemistry a Problems Approach (Bioquímica: uma abordagem problemática), 2* ed. (Benjamin, Menlo Park, 1981); e Roberts, Directory of Restriction Endonucleases (Lista de endonucleases de restrição), Methods in Enzymology, Vol. 68, págs. 27-40 (1979).

presente invento está indicado para problemas associados com a aplicação de agentes imunoreguladores para tratar afecções médicas e/ou veterinárias. Em particular, proporciona compostos capazes de estimular a regeneração de células sanguíneas e pode ser útil na terapia do cancro, no tratamento de certas doenças do sangue e no tra tamento de infecções persistentes.

Para uma melho. compreensão do invento, serão agora descritos modelos de execução preferidos, que remetem para os diagramas anexos, nos quais:

a Figura 1 ilustra os locais de restrição e regiões de codificação mais importantes do plasmídeo pcDV1 usado na construção do vector de expressão e clonagem pcD;

a Figura 2 ilustra os locais de restrição e regiões de codificação mais importantes do plasmídeo pL1 usado na construção do vector de expressão e clonagem pcD;

a Figura 3 ilustra a sequência de nuçleótidos e a sequência de aminoácidos prevista para um DNA de IL-3 humano de acordo com o invento; e a Figura 4 ilustra o vector pCD modificado, pSP6, usado para gerar mRNA para ser injectado em oócitos.

presente invento inclui polipéptidos glicosilados ou não glicosilados que apresentam actividade de IL-3 humana, e que podem ser derivados dos polipéptidos IL-3 aqui revelados usando técnicas de engenharia proteica usuais. O invento incluí também ácidos nucleicos possuindo sequências capazes de codificar os polipéptidos do invento. Finalmente, o invento inclui métodos de preparação dos polipéptidos glicosilados ou não glicosilados do invento que utilizam as sequências de nucléotidos aqui revelados, e métodos de utilização dos polipéptidos do invento.

As técnicas de preparação, utilização e identificação dos polipéptidos e ácidos nucleicos do invento são a seguir discutidos em termos genéricos. Em segu£ da, são apresentados vários exemplos em que as técnicas genéricas são empregadas utilizando-se tipos de células, vectores reagentes, etc. específicos.

I. Preparação de cDNAs de IL-3 humanas a partir de fontes naturais cDNAs de acordo com o presente invento podem ser obtidos construindo uma sonda de cDNA a partir da sequência de cDNA revelada na Figura 2. A sonda é depois, usada para identificar um clone de cDNA complementar

numa biblioteca de cDNA. De preferência, a biblioteca de cDNA é constituída a partir de uma população de clones de células T induzidos por raitogénio ou linfôcitos sanguíneos periféricos (peripheral blood lymphocytes, PBLs). A construção de bibliotecas de cDNA a partir de células induzidas a crescer e/ou a sintetizar certos produtos celulares ê uma técnica bem conhecida em biologica molecular: por ex., recentes artigos que passam em revista o assunto são os de Doherty,Cloning and Expression of cDNA (cionagem e expressão de cDNA), Capitulo 10 de Gottesman, ed. Molecular Cell Genetics (Genética Celular Molecular) (John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1985); e Brandis et al. Preparation of cDNA Libraries and the Detection of Specific Gene Sequences (Preparação de bibliotecas de cDNA e a detecção de sequências de genes específicas) em Setlow et al., eds. Genetic Engineering (Engenharia Genética), vol. 8, págs. 299-316 (Plenum Press, Nova Iorque, 1986).

A extracção da totalidade do mRNA, a sua conversão em cDNA de cadeia dupla, a cionagem do cDNA e a transformação de hospedeiros adequados são levadas a cabo do modo indicado no parágrafo que liga a página 30 à página 31 da Application PCT/US 86/02464, publicada como W087/02990.

A extracção da totalidade do mRNA, a sua conversão em cDNA de cadeia dupla, a cionagem do cDNA e a transformação de hospedeiros adequados são levados a cabo do modo indicado no parágrafo que liga a página 30 à página 31 da Application PCT/US 86/02464, publicada como W087/ 02990.

Uma fonte preferida de mRNA que codifica os polipêptidos desejados são células cujos sobrenadantes contêm uma actividade associada com os polipêptidos do presente invento. De um modo geral, células T adequadas podem ser obtidas a partir de uma multiplicidade de fontes, tal como baço, amígdalas e sangue periférico humanos. Clones de células T, tais como aqueles que são isolados a partir de T-liin fôcitos de sangue periférico, podem também ser usados (ver Research Monographs in Immunology, eds. von Doehmer, H. e Haaf, V.; Secção D: Human T-Cell Clones (Clones de células T humanas), vol. 8, pâgs. 243-333; Elsevier Science Publishers, Nova Iorque /1985/).

Sondas para a biblioteca de cDNA são preparados utilizando técnicas convencionais, por ex. tra^ dução de incisão (nick-translation) da totalidade ou da quase totalidade do comprimento de clones de cDNA do presente invento, ou por intermédio de oligonucleôtidos sintéticos marcados. Maniatis et al. (atrãs referidos) forneceu instruções pormenorizadas para a técnica de nick-translation, e os oligonucleôtidos sintéticos marcados com qualquer sequência de bases podem ser construídos usando agentes sintetizadores de DNA disponíveis no mercado, por ex. o modelo 381A de Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA) ou outro análogo.

A biblioteca de cDNA ê depois percorrida pela sonda utilizando técnicas convencionais, por ex. Beltz et al., Isolation of Multigene Families and Determination of Homologies by Filter Hybridization Methods (Isolamen to de famílias multigénicas e determinação de homologias por métodos de hibridização de filtro), Methods in Enzymology, vol. 100, pãgs. 266-285 (1983); Callahan et al. Detection and Cloning of Human DNA Sequences Related tô the Mouse Mammary Tumor Virus Genome, (Detecção e clonagem de sequências de DNA humano apresentadas do genoma do vírus do tumor mamãrio do murganho), Proc. Natl. Acad. Sei., Vol. 79, pâgs 5503-5507 (1982), Grunstein et al., Pro, Natl, Acad. Sei., Vol.72 pâgs. 3961-3965 (1975); ou Benton et al. Science, Vol. 196, pãgs. 180-183 (1977).

20II. Preparação de muteínas de IL-3 humanas por meio de en-

genharia proteica

Técnicas genéricas para mutar DNA e produzir muteínas são descritas na application PCT/US 86/ 02464 (atrás referida) na página 33, linha 4 a partir do fim até à pág. 3, linha 11; estas podem ser também aplicadas no presente invento.

Muteínas do polipêptido natural podem ser desejáveis numa actividade de variedade de circunstâncias. Por exemplo, efeitos secundários não desejados podem ser reduzidos por certas muteínas, em particular se a actividade de efeito secundário estiver associada com uma parte do polipêptido diferente da da actividade de sejada. Além disso, nalguns sistemas de expressão, o polipêptido nativo ê susceptível de degradação por meio de proteasos; nesse caso, substituições e/ou deleções seleccionadas de aminoácidos que modifiquem as sequências susceptíveis podem aumentar significativamente o rendimento: por ex. Pedido de Patente Britânica 2173-804-A em que Arg na posição 275 do activador de plasminogénio de tecido humano ê substituído por Gli ou Glu. As muteínas podem também aumentar o rendimento em processos de purificação e/ou aumentar o tempo de vida das proteínas na pra^ teleira mediante a eliminação de aminoácidos susceptíveis à oxidação, acilação, alquilação ou a outros modificações químicas. Por exemplo, a metionina sofre facilmente oxidação dan do origem a um sulfôxido, que em muitas proteínas provoca uma perda de actividade biológica: por ex. Brot e Weissbach, Arch. Biochem. Biophys, Vol. 223, pág. 271 (1983). As metioninas podem frequentemente ser substituídas por aminoácidos mais inertes com pequena ou nenhuma perda de actividade biológica;: por ex. Pedida de Patente Australiana AU-A-52451/86. Em sistemas de expressão bacteriana, os sedimentos podem por vezes ser aumentados mediante eliminação ou substituição de resíduos de cisteína não essenciais do ponto de vista conformacional: por ex. Mark et al., Patente dos E.U.A. 4 518 584.

Nas secções que se seguem, a notação usada por Estell et al. (atrás referido) para identificação de muteínas é seguida e generalizada. Por exemplo, mu4 0 4 0 teína IL-3 Leu Humana (ou simplesmente Leu se do contexto se depreender a proteína nativa) indica um polipéptido cuja sequência de aminoácidos é idêntica à da proteína nativa à excepção da posição 13 relativamente à terminação N. Vai foi substituída nessa posição por Leu. Pode-se indicar de modo análogo mais de uma substituição; por ex., uma muteína em que Leu substitui Vai na posição 13 e Feu substitui Met na

0 4 0 posição 18 será referida como muteína IL-3 (Leu , Fen ) humana. As delecções são indicadas por X's. Por exemplo, uma muteína em que falta Gen na posição 4 é referida como muteína IL-3 ⁴ humana. Uma inserção é indicada por IN (Xaa). Por exemplo, uma muteína com Leu inserida a seguir a Gen na posição 4 ê preferida como muteína IL-3 IN⁴ (Leu) humana. Assim, a muteína IL-3 (Ser¹⁰,^⁴, IN⁶ (Gli)) humana representa a sequência de IL-3 humana nativa que foi modificada substituído Tre por Ser na posição 10, eliminando Gin na posição 4 e inserindo Gli imediatamente a seguir a Tre na posição 6. A inserção múltipla de aminoácidos no mesmo local ê indicada por INⁱ(Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-...), em que Xaa^-Xaag-Xaag... ê a sequência inserida a seguir à posição i. Adições na terminação N são indicadas pelo índice superior O,*por ex. IN°(Xaa); e uma sequência de deleções dos aminoácidos 6-10, por exemplo, ê referida como ou como , , Δ⁹, A¹⁰)*

Prefere-se em primeiro lugar a ut£ lização de mutagénese de cassette para produzir muteínas IL-3 humanas. Tal como adiante se descreve mais pormenorizadamente, um gene de IL-3-humana sintético é construído com uma sequência de locais de restrição de endonuclease cínicos espaçados de modo aproximadamente uniforme ao longo do gene. A singularidade dos locais de restrição deverá manter-se quando o gene for inserido num vector apropriado, de modo que o gene possa ser ser convenientemente excisado e substituído por

22ο1igonucleotidos sintéticos (i.e. cassettes) que codificam mutações desejadas.

A determinação do número e distrj_ buição de locais de restrição únicos implica tomar em linha de conta vários factores incluindo (1) locais de restrição pré-existentes no vector a utilizar na expressão, (2) se é ou não desejada a utilização de codões especificos de espécies ou géneros, (3) o número de diferentes endonucleases disponiveis que não contam o vector (e as suas multiplicidades no interior do gene sintético), e (4) a conveniência e fiabilidade de sintetizar e/ou determinar a sequência dos segmentos entre os locais de restrição únicos.

De um modo geral, a Fórmula I define conjuntos de polipêptidos com substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos conservativas relativamente à sequência de IL-3 humana nativa putativa. Conservativo, na acepção em que aqui é utilizado, significa (1) que as altera, ções são do ponto de vista da conformação, tão neutras quanto possível, isto é, concebidas de modo a produzir alterações mínimas na estrutura terciária dos polipêptidos mutantes quaji do comparados com a IL-3 humana nativa, e (ii) qua as alterações são, do ponto de vista antigénico, tão neutras quanto possível, isto é, cancebidas de modo a produzir alterações mínimas nos determinantes antigénicos dos polipêptidos mutantes quando comparados com a IL-3 humana nativa. A neutralidade conformacial é desejével para conservar a actividade biológica, e a neutralidade antigénica é desejável para utili zar o desencadear de reacções imunogénicas em pacientes ou animais tratados com os compostos do invento. Embora seja d£ ficil seleccionar com certeza absoluta quais das alternati vas serão neutras do ponto de vista conformacional e antigênico, existem regras que podem ser seguidas pelos especialH tas na técnica para fazer alterações que tenham uma elevada probabilidade de serem neutras do ponto de vista conformado nal e antigénico, por ex. Anfinsen (atrás referido) e Berzopsly, Science, Vol,229, págs. 932-940 (1985). Algumas das vezes mais importantes são (1) substituições de resíduos hidrofóbicos têm menor probabilidade de produzir alterações na antigenicidade uma vez que se situam provavelmente no interior da proteína, por ex., Berzofsky (atrás referido); (2) subsU tuições de resíduos fisico-quimicamente análogos, i.e. sinónimos têm menor probabilidade de produzir alterações na conformação uma vez que os aminoácidos de substituição podem desempenhar o mesmo papel estrutural que os aminoácidos substituídos; e (3) alterações de sequências conservadas pela evo lução têm maior probabilidade de produzir efeitos conformacio nais perniciosos uma vez que o facto de terem sido conserva das pela evolução sugere que essas sequências podem ser fun cionalmente importantes.

Para além dessas regras básicas para seleccionar muteínas, existem ensaios para confirmar a actividade biológica e conformação das maléculas criadas. Os ensaios biológicos para os polípéptidos do invento são descri, tos mais pormenorizadamente adiante. As alterações de conformação podem ser testadas pelo menos por intermédio de dois ensaios bem conhecidos: o método de fixação de microcomplemeji to, por ex. Wasserman et al., J. Immunol., Vol. 87, págs. 290_ -295 (1961), ou Levine et al. Methods in Enzymology, Vol. 11, págs. 928-936 (1967), amplamente utilizado em estudos evolutivos da estrutura terciária das proteínas; e afinidades relativamente a conjuntos de anticorpos monoclonais específicos relativamente a certas conformações, por ex. Lewis et al. Biochemistry Vol. 22, págs. 948-954 (1983).

III.

Ensaios de actividade de CSF

A fim de determinar a actividade de CSF, células hemopoiéticas, por ex. células de medula Óssea ou células sanguíneas de cordão umbilical são transforma, das numa suspensão de célula única. As células individuais são depois imobilizadas num meio semi-sólido (agar) ou vis. coso (metilcelulose) contendo substâncias nutritivas e, ge ralmente, soro fetal de vitelo. Na presença de um factor de estimulação apropriado, células individuais irão proliferar e diferenciar-se. Uma vez que as células iniciais estão imo bilizadas, as colónias desenvolvem-se à medida que as célu las proliferam e maturam. Estas colónias podem ser analisadas passados 7-14 dias. São dadas instruções pormenorizadas para a realização de ensaios de CSF por Burgess, A. Growth Factors and Stem Cells (Factores de Crescimento e Células), pãgs. 52-55 (Academic Press, Nova Iorque 1984) e Metcalf, The Hemopoietic Colony Stimulating Factors (Os Factores de Estimulação de Colónia Hemopoieticos), pâgs. 103-125 (Elsevier, Nova Iorque 1984). Caso seja desejado, colónias individuais podem ser extraídas, colocadas em lâminas de microscópio, fixadas e coradas com Wright/Geimsa (Todd-Samford, Clinicai Diagnosis by Laboratory Methods (Diagnóstico Clínico por intermédio de Métodos Laboratoriais), 15« edição, eds. Davidson e Henry (1974). Pode-se então determinar a análise morfológica de tipos de célula presentes por colónia individual .

têlulas de medula óssea recolhi das de pacientes sofrendo de doença não-hematológica são colocadas em camada sobre Ficoll (tipo 400, Sigma Chemical Co. St. Louis, Mo) e centrifugadas (600 χ g, 20 min), sendo removidas as células na interface. As células são lavadas por duas vezes em Iscove's Modified Dumbecco's Médium contendo 10% do soro fetal de vitelo (FCS) e suspensas de novo para

no mesmo meio, e as células aderentes são removidas por aderência para caixas de Petri plásticas (as células aderentes são frequentemente células produtoras de GM-CSF (Metcalf, atrás referido)). As células são aderentes são adicionadas a 10⁵ células/ml a Iscove's Médium contendo 20% de FCS, 50 uM de 2-mercaptoetanol, 0,9% de metilcelulose e concentra.

) çóes variadas ou de sobrenadantes que se sabem possuírem actividade de estimulação de colónia ou sobrenadantes de ensaio. Partes alíquotas de um ml são semeadas em caixas de Petri de 35 mm e cultivadas a 37^flC numa atmosfera completa mente humidificada de C0₂ a 6% em ar. Três dias apôs o ini) cio da cultura, adiciona-se 1 unidade de eritropoietina a ca. da placa. As colónias de granulociternacrofagos e as acumulações eritsoides são contadas passadas 10-14 dias usando um microscópio invertido.

Células sanguíneas de cordão recolhidas em hepasina são resolvidas a 600xg durante 6 min. Os glóbulos brancos na interface entre o plasma e o pico de glóbulos vermelhos são transferidos para um tubo contendo cloreto de amónio 0,17 N e FCS a 6%. Apôs 5 min. em gelo, a suspen são é tratada com 4 ml de FCS e centrifugada durante 6 minutos a 600 x g. 0 sedimento celular é lavado com soro fisiológico tamponado com fosfato Dulbecco e submetido às etapas de Ficoll e aderência plástica atrás descritas para células de medula óssea. As células não-aderentes de baixa densidade são recolhidas e colocadas a 10 células/cultura no meio de cultura semí-sôlido tal como atrás se descreveu.

No final dos ensaios, a composição celular ê determinada após aplicação das colónias individuais a laminas de vidro e coloração com Wright-Geimsa. Eosinofilos são determinadas corando com Luxol Fast Blue, por ex. Johnson, G. e Metcalf, D, Exp. Hematol, Vol. 8, págs. 549-561, (1980).

IV. Purificação e Composições Farmacêuticas

Métodos gerais de purificação dos polipêptidos do presente invento, e de sua utilização em laboratórios ou como ingredientes activos em composições farma| cêuticas são reveladas na secção 5 de Application PCT/US 86/

02464, especialmente da página 43, linha 20, 3 página 44, linha 44, linha 15, e da página 44, linha 27 à página 45, linha

27. A quantidade de polipéptido activo numa dose unitária de acordo com o presente invento pode ir de 1,ug a 100 mg, depen| dendo da potência e aplicação.

Além disso, populações de células hematopoiêticas de uma pessoa podem ser mantidas e/ou expandidas ou feitas diferenciar-se ex vivo para uma eventual rei£ trodução na mesma ou noutra pessoa a fim de terem um efeito benéfico. As composições podem estimular selectivamente vários componentes do sistema imunitário, quer isoladamente quer com outros agentes bem conhecidos dos especialistas na técnica. Em particular, as composições podem ser incluídos outros agen tes imunorreactivos, tal como linfoquinas (por ex. IL-1, IL-2 IL-4, GM-CSF, etc.)

V. Sistemas de expressão

Pode ser escolhido qualquer sistema de expressão adequado; a sua natureza não constitui um aspecto critico do presente invento, desde que aquele seja apro priado. Discutem-se sistemas de expressão adequados na Secção

VI, Sistemas de Expressão, páginas 45-50 da Application PCT/

US 86-02464.

EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem servem para ilustrar o presente invento. A selecção de bibliotecas de cDNA, vectores e hospedeiros, bem como a concentração de reagentes, temperaturas e os valores de outras variáveis destinam-se apenas a exemplificar a aplicação do presente invento, não devendo ser considerados como constituindo uma sua 1 imitação.

EXEMPLO I

Preparação de cDNA de IL-3 humana mediante rastreio de uma bilioteca de pcD cDNA com uma sonda sintética e expressão em células de macaco COS 7 e oócitos de Xenopus.

Uma biblioteca de pcD DNA foi cans, truída de mRNA isolado de um clone de T-células humanas (6D11) induzido a sintetizar mRNA mediante exposição a concanvalina A (conA) (2-10 micrograma/ml durante 4-12 horas) usando as técnicas reveladas por Okayama e Berg, Mol. Cell. Biol.» Vol. 2, págs. 161-170 (1982) e vol 3, págs. 280-289 (1983). Outros compostos de indução, tal como fitohemaglutinina (PHA), poke weed mitogen, ionôforo de cálcio, antigénio anti-T3, etc. podem ser mais eficazes para alguns tipos de células e sob

algumas condições. Plasmídeos precusores de pcD, pcDV1 e pL1, podem ser obtidos convencionalmente de Pharmacia, Inc. (Piscataway, NJ).

A construção da biblioteca pcD . cDNA de Okayama e Berg é descrita de modo sumário em Appiica| tion PC/US 86/02464 no parágrafo que liga as páginas 31 e 32.

Uma vez terminada a biblioteca de cDNA nos vectores plasmídeos Okayama/Berg, ilustrada sob a forma de diagrama na Figura 1, os clones de cDNA são recolhi| dos, e amostras aleatórias analisadas relativamente à presença dos cDNAs desejados por métodos estandardizados, por ex. selecção híbrida, detecção de determinantes antigênicos em produtos exprimidos, e/ou ensaios funcionais.

A. Isolamento de mRNA

RNA celular total foi isolado de células 6D11 usando o procedimento de isotiocianato de guanidina de Chirgwin et al. Biochemistry, Vol. 18, págs. 5294-5299 (1979). 0 procedimento é também revelado por Maniates et al (atrás referido). Células 6D11 estimuladas com conA lavadas e sedimentadas foram suspensas em solução de lise de isotiocianato de guanidina (50 g de tiocianato de guanidínio com 0,5 g de N-lauroil sarcosina de sódio (concentração final 0,55»), 2,5 ml de citrato de sódio 1M, pH 7,0 (25 mM), 0,7 ml de 2-mercaptoetanol (0,1M) e 0,33 ml de Sigma 305 Antifoam A (0,1%); juntou-se água desionizada até o volume perfazer 100 ml à temperatura ambiente e o volume final foi filtrado e o pH ajustado para o valor 7 com NaOH 1N). Vinte ml de solução o de lise foram usados para 1,5 χ 10° células.

Λ

-29Os sedimentos resultantes foram depois processados de acordo com o procedimento da Application PCT/US 86/02464, Secção B, página 55, linha 22, até à página 56, linha 24.

B. Construção da biblioteca de pcD procedimento de Okayama e Berg (Mol. & Cell Biol. Vol. 2, pãgs. 161-170 f1982j) foi usado com apenas pequenas alterações. Os plasmídeos pcDV1 e pL1 são descritos por Okayama e Berg (Mol. & Cell. Biol. 3:380-389 £19837) e podem ser obtidos de Pharmacia (Piscataway, N.J.). Especificamente, utilizou-se um plasmídeo pcDV1 modificado que continha um local NsiI no sítio onde préviamente havia um local Kpnl e utilizou-se um pL1 modificado que continha uma inserção no local Xhol consistindo numa porção do longo segmento terminal repetido (LTR) de um retrovírus HTLV(I). A presença do segmento LTR provou de um modo geral, aumentar a expressão em hospedeiros de células de mamíferos por um factor 20-50. As construções modificadas são ilustradas nas Figuras 1 e 2.

LTRs retrovirais revelaram incrementar a expressão numa variedade de sistemas; ver por ex. Chen et al Proc. Natl. Acad. Sei., Vol. 82, pâgs. 7285-7288 (1985); Gorman et al Proc. Natl. Acad. Sei. Vol. 79 pãgs. 6777-6781 (1982); Temin, Cell, Vol. 33, pâgs. 1-3 (1981); e Luciw et al. Cell, Vol. 33, pâgs. 705-716 (1983). A porção do LTR de HTLV(I) inserida no local Xhol de pL1 consiste num segmente cie 267 bases incluindo a totalidade da região R e parte da região bS (designada U5‘ na Figura 2) que se prolonga da fronteira R/U5 até ao primeiro local Taql a jusante

(39 bases na totalidade). A sequência do LTR de HTLV (I) ê revelada por Yoshida et al. em Current Topics in MicrobioloVol. 115, págs. 157-175 (1985).

segmento LTR de HTLV(I) é inserido em pL1 em quatro passos utilizando procedimentos revelados no Exemplo II. Primeiro, pL1 é digerido com Bg11 e Xhol, e o fragmento grande é isolado. 0 fragmento grande é depois misturado com os sintéticos 1A/B e 2A/B (adiante defenidos) numa mistura de ligação comum. Os sintétiocs 1A/B e 2A/B consistem, em conjunto, na sequência na sequência do pequeno fragmento Bglí/Xhol, no fragmento 5' de 26 bases da região LTR R, e num polilinker que consiste em locais Smal, Smal, Saci, Nael e XJtgI na ordem indicada.

(Bgll)

TCGGCCTCTGAGCTATTCCAGCGGAGCCGGAGACTCGATAAGGTCAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGATTCATCACTCCTCCGAAAAAACCTGGCCTAGGCTTTT

CCGG

Sintéticos 1A/B

SV40 ori —>| R---->

GCAAAAAGCTCGGCTCG' ATCCGAAAACGTTTTTCGAGCCGAGCSmal R--->| Saci

CATCTCTCCTTCACGCGCCCGGGGAGGTAGAGAGGAAGTGCGCGGGCCCCTCNael Xhol

CTCGCCGGCC

GAGCGGCCGGAGCT .ς,-ί ni-Ai-i rn? 2A/B

Após ligação, o plasmídeo resultar te do passo 1 e propagado, isolado e digerido com Smal e Saci e o fragmento grande é isolado. 0 fragmento grande é depois misturado com sintéticos 3A'/B e 4A/B (definidos adiante) numa

-32mistura de ligação comum.

GCCGCCCTACCTCAGGCCGCCATCCGG CGGG ATGG ACTCCGG CGG TAGC ACG CCGG TTC AG TCG CG TTCT GTCCGGCCAACTC

Sintéticos 3Ã/B

GCCGCCTCCCGCCTCAG CG CAAG ACGGCGG AGGG CGG ACTGG TC CCTCCTG AACTG CGTCCGCACC ACGG AGG ACTTC ACG C AGG CG Saci

CG TCTAGG TAAG TTTAG AGCT

GCAGATCCATTCAAATC

Sintéticos 4A/B

Após ligação o plasmídeo resultante do passo 2 é propagado, isolado e digerido com ^cl e NacI e o fragmento é isolado. 0 fragmento grande é depois misturado com sintéticos 5A/B (a seguir definidos) numa mistura de ligação comum.

CAGG TCG AG ACCGGG CCTTTG TCG AG TCCAG CTCTGG CCCGG AAACTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGG CCG CG AGGG AACCTCGG ATGG ANael

AGACTCAGCC TCTGAGTCGG

Sintéticos 5A/B

Após ligação, o plasmídeo resultaji te do passo 3 é propagado, isolado e digerido com Naci e Xhol, e o fragmento grande é isolado. 0 fragmento grande é depois misturado com sintéticos 6A/B e 7A/B (adiante definidos) numa mistura de ligação comum a fim de dar origem ao fragmento de plasmídeo pL1 modificado, designado pL1‘.

t

-34Nael

GGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCCCGAGAGGTGCGAAACGGACTGGGTGCTTGCTCAACTCTACG ACGAACGAG

Sintéticos 6A/B

TCTTTGTTTCGTTTTTTGAGATGCAGAAACAAAGCAAAAXhol

CTGTTCTGCGCCGTTACAGATC

GACAAGACGCGGCAATGTCTAGAGCT

Sintéticos 7A/B

Uma amostra de 80 ug de pcDV1 DNA foi digerida a 30^sC com 20 U de endonuclease Kpnl numa mistura de reacção de 450 ,ul contendo Tris.HCl (pH7,5) 6mM, MgClg 6 mM, NaCI 6 mM, 2-Me 6mM e 0,1 mg de albumina de soro bovino (BSA) por ml. Apôs 16 horas a oigestão foi terminada com 40 pi de EDTA (pH8,0) 0,25 M e 20 pl de dodecilsulfato de sódio (SDS) a 10%; o DNA foi recuperado após extracção com fenol-CHClj 1:1 saturado de água (daqui para a frente referido como fenol CHCip e precipitado com etanol. Adicionaram-se extremidades homopoliméricas com uma média de 60 mas não de 80, resíduos de desoxitimidilato (dT) por extremidade às extremidades produzidas pela endonuclease Nsil com tramsferase

-35terminal de timo de vitelo, como se segue: A mistura de reacção (38 pl) continha cacodilato de sódio 30 mM Tris HC1 pH

6,8 como tampão, com CoCi₂ ditiotreitol 0,1 mM, dTTP 0,25 mM, o DNA digerido com endonuclease Nsil, e 68 U da transferase de desoxinucleotidilo terminal (P-L Biochemicals, Inc., Milwaukee, WI). Apôs 30 min a 37^SC a reacção foi gerada com 20 pl de EDTA 0,25 M (pH 8,0) e 10 pl de SDS a 10% e após várias extracções com fenol-CHCl^ o DNA foi recuperado por precipitação com etanol. 0 DNA foi então digerido com 15 0 de endonuclease EcoRI em 50 pl contendo Tris. HC1 pH 7,4 10 mM, MgClg 10 mM, ditiotreitol 1 mM e 0,1 mg de BSA por ml durante 5 horas a 37^aC. 0 fragmento grande contendo o local de poliadenilação de SV 40 e o gene JBR322 de origem de replicação e resistência à ampicilina foi purificado por meio de electroforese de gel de agarose (1%) e recuperado do gel por intermédio de uma modificação do método de pó de vidro (Vogelstein, B. & Gillespie, D., Proc. Natl. Acad. Sei. 76: 615-619 /1979J). 0 DNA com extermidade de dT foi ainda purificado por meio de absorção e eluição a partir de uma coluna de oligo (dA)-celulose como se segue: G DNA foi dissolvido em 1 ml tampão de Tris.HCl pH 7,3 10 mM contendo EDTA 1mM e NaCl 1M, arrefecido para 0^aC e aplicado a uma coluna de oligo (dA) -celulose (0,6 por 2,5 cm) e iquilibrada. com o mesmo tampão a 0-C e eluída com água à temperatura ambiente. 0 DNA eluido foi precipitado com etanol e dissolvido em Tris.HCl pH 7,3 10 mM com EDTA 1mM.

DNA ligado com extremidade de oligo (dG) foi preparado digerindo 75 pg de pL1' DNA com 20 U de endonuclease PstI em 450 pl contendo Tris.HCl pH 7,4 6 mM, MgCl₂ 6 mM, 2-ME 6 mM, NaCl 50 mM, e 0,01 mg de BSA por ml. Passadas 16 horas a 30^aC a mistura de reacção foi extraída com fenol-CHClg e o DNA foi precipitado com álcool. Extremides com 10 a 15 resíduos desoxiguanilato (dG) foram depois adicionadas por extremidade com 46 U de transferase terminal de desoxinucleotidilo na mesma mistura de reacção (38 pl) que atrás foi descrita, com a excepção de dGTP 0,1 mM substituiu dTTP. Passados 20 min. a 37^ÕC a mistura foi extraída com fenol-CHClg e o DNA foi precipitado cora etanol e depois digerido com 35 U de endonuclease HindlII em 50 pl contendo Tris. HC1 pH7,4 20 mM, MgCl₂ 7 mM, NaCi 60 mM e 0,1 mg de BSA a 37^fiC durante 4 horas. 0 pequeno DNA linker com extremidade oligo (dG) foi purificado por meio de eiectroforese de gel de agarose (1,8%) e recuperado tal como atrás sí descreveu.

Construção da biblioteca: Foi feita de acordo com a Secção (2), Preparação da biblioteca de cúNA, da página 48, linha 9 a contar do fim, £ página 61, linha 10 da Application PCT/US 86/02464. Depois, amostras da cultura foram congeladas era DMSO para serem armazenadas. Separadamente antes da adição de DMSO, vinte caixas de cultura de lõ cm foram inoculadas cada qual com cerca de 3000 clones.

Sondas marcadas radioactivamente para as colónias atrás referidas foram construídas como se segue: (1) utilizando os dados sobre a sequência da IL-3 humana revelados por Yang et al. Cell, Vol. 47, pâgs. 3-10 (1986), sintetizou-se um oligonucleótido sintético compreendendo os primeiros 55 nucleótidos da cadeia de codificação da referida sequência da 1L-3 humana (começando com ATG); (2) usando os mesmos dados sobre a sequência sintetizou-se uma cadeia de oligonucleótido anti-sense correspondente que compreendia as bases 45-100 da referida sequência; (3) as duas cadeias sintéticas foram aneladas e usadas como fragmentos de iniciação (primers) para fragmento Klenow de DNA polimerase I na presença de ATP, GTP, TTP e CTP marcado radioactivamente; (4) finalmente a reacção foi cold chased com precursões não marcadas para garantir extensão máxima de cadeia, (Cold chased significa que o percurso radioactivo CfP é substituído pela sua forma não radioactiva).

As 20 caixas atrás preparadas foram submetidas a rastreio relativamente a clones utilizando

as sondas sintéticas por um protocolo de hibridização de colónia padrão, por ex Maniatis et al. (atrás referido). Foram detectadas duas colónias positivas. Um dos clones, designado pcD-huIL3-22-1 foi seleccionado, amplificado e reclonado no plasmídeo M13 para efeitos de determinação de sequência pelo procedimento de terminação de cadeia didesoxi, por ex. Sanger > et al., Proc. Natl. Acad. Sei., Vol. 74, págs. 5363-5367 (1977). A sequência de cDNA é ilustrada na Figura 3 juntamente com a sequência de aminoácidos prevista do contexto de leitura (rea^ ding freme) aberto maior. A análise dos aminoácidos da terminação N de acordo com as regras empíricas publicadas por

I Perlman et al., J. Mol. Biol., Vol. 167, págs. 391-409 (1983) indica que a terceira prolina a partir do início do contexto de leitura (reading frame) aberto e a terminação N mais pro vável da proteína finalizada. Todavia, apesar destas regras, a Ala adjacente pode constituir a terminação H correcta da proteína nativa tendo em conta a descoberta de que a terminação N da IL-3 de murganho ê Ala. De qualquer modo, a sequência sinal não é uma porção critica da molécula activa, e pode compreender uma grande variedade de sequência sem quaisquer efeitos negativos sobre a secreção ou actividade, por ex. Kai_ ser et al. Science, Vol. 235, págs. 312-317 (1987). Os locais de N-glicosilação potenciais estão assinalados por caixas na I Figura 3.

Surpreendentemente, descobriu-se que o cDNA de IL-3 humanas isolado continha uma diferença de aminoácidos significativa da sequência referida por Yang et I al. (atrás referidos): o cDNA isolado codifica uma prolina na posição 7 (relativamente à terminação N da Fórmula II) em vez de uma serina tal como referido por Yang et al. (atrás citados). Uma tal modificação deverá corresponder a diferenças de conformação significativas nos dois polipéptidos dadas as dissemelhanças entre prolina e serina.

Ao mesmo tempo, o mesmo clone foi amplificado separadamente; os vectores de clonagem pcD foram

38-.- ι

isolados usando técnicas correntes, por ex. Maniatis et al. (atrás referidos); e o cDNA foi expresso em dois sistemas diferentes: células de macaco C0S7 e oócitos de Xenopus. Os vectores pcD foram usados para transfectar células COS7 como se segue. Um dia antes da transfecção, aproximadamente 10^ células de macaco COS 7 foram semeadas em caixas individuais de 100 mm em Dulbecco’s modified Eagle‘s médium (DME) contendo 10Í de soro fetal de vitelo e glutamina 2 mM. A fim de se realizar a transfecção, o melo foi aspirado de cada caixa e substituído por 4 ml de DME contendo Tris.HCl pH 7,4 50 mM, 400 jag)ml DEAE-dextrano e 50 pg dos DNAs plasmídeo a serem testados. As caixas foram incubadas durante quatro horas a 37*C, depois o meio contendo DNA foi removido e as caixas foram lavadas por duas vezes com 5 ml de DME isento de soro. DME contendo Cloroquina 150 pM foi adicionado às caixas que foram depois incubadas durante mais 3 horas a 37⁸C. As caixas foram lavadas uma vez com DME, e depois adicionaram-se DME contendo 4% de soro fetal de vitelo, glutamina 2 mM, penicilina e estreptomicina. As células foram depois incubadas durante 72 horas a 37*C. 0 meio de cultura foi recolhido e analisado relativamente a actividade de CSF usando o ensaio de sangue de cordão umbilical atrás descrito. Observou-se uma variedade de tipos de colónia.

Sobrenadantes de oócitos de Xenopus injectados com RNA transcrito do fragmento de inserção de cDNA de pcD-huIL3-22-1 foram analisados relativamente a actividade biológica. 0 protocolo seguido foi essencialmente aque le que é revelado por Melton et al. Nucleíc Acids Research, Vol. 12, pãgs. 7035-7056 (1984) e por Krieg et al. Nucleic Acids Research Vol. 12 pâgs. 7057-7060 (1984). Primeiro, o fragmento de inserção de cDNA de pcD-huIL3-22-1 foi reclonado no vector pcD modificado, p$P6. pSP6 foi construído substituto do a origem de replicação de SV40 em pcD com o promotor de SP6, tal como se indica na Figura 3. 0 vector pcD modificado continha também um local PstI desactivado no gene de resistên cia & ampicilina (indicando por *PstI na Figura 3) e uma re-

-39gilo polilinker inserida no local Xhol da região políA do pcD. A região polilinker continha locais EcoRI, Saci, Smal, BamHI, Xbal, SalI, SsTI e HindIII. 0 local PstI desactivado permite que a região de origem de SV40 seja extraída por meio de digestão (antes da inserção do polilinker) com HindIII e PstI. 0 fragmento de inserção promotor de SP6 adequada (com cerca de 60 bases de comprimento) pode ser sintetizado usando técnicas usuais a partir da sequência revelada por Melton et al. (atrás referidos). Após inserção do promotor de SP6, ó plasmídeo resultante foi amplificado, isolado e digerido com Xhol. 0 polilinker sintetizado usando técnicas correntes ê inserido no local Xhol. Altermativamente, plasmídeos à venda no mercado contendo o promotor de SP6 e regiões polilinker podem ser usados» por ex. pSP62-PL que pode ser obtido de NEN Research Produts (Boston, MA) ou psP18 ou psP19 que podem ser obtidos de BRL Life Technologies (Gaithersburg, MD).

cDNA de IL-3 humana foi extrída de pcD-hmIL-3-22-1 digerindo-o com PstI e BamHI, isolado e ligado com SP6 digerido com PstI/BamHI para formar pSP6-huIL3. pSP6-huIL3 foi amplificado em E. coli MC1061, isolado e linearizado com Xbal. RNA para injecção em oócitos foi preparado transcrevendo o psP6-hmlL3 linearizado com SP6 RNA polimerase que pode ser obtida de BRL Life Technologies) seguindo o pro tocolo de Kreig et al. (atrás referidos) e Melton et al. (atrás referidos). A SP6 RNA polimerase foi tratada com DNAse (por ex. DNAse livre de RNAsina e RNAse a 1 unidade/microlitro e 20 microgramas (ml, respectivamente) e injectada no citoplasma dos oócitos de Xenopus e o sobrenadante das culturas Xenopus foi analisado relativamente a actividade de CSF. Observou-se uma variedade de tipos de colónia.

EXEMPLO II

Construção de um gene de IL-3 humana sintético para mutagénese de cassete em pcD e expressão em células de macaco COS 7

Técnicas de construção e expressão do gene sintético deste exemplo são correntes na técnica da biologia molecular, por ex. especialmente Sproat e Gait, Nucleic Acids Research Vol. 13, págs. 2959-2977 (1985), e Ferretti et al., Proc» Natl, Acad, Sei, Vol. 83, págs. 599-603 (1986); e também Mullenbach et al. J. Biol Chem, Vol. 261, págs. 719-722 (1986); Wells et al. Gene, Vol. 34 págs. 315-323 (1985); e Estell et al. Science, Vol 233, págs. 659-663 (1986). Sucintamente, o gene de IL-3 humana sintético é montado a partir de uma variedade de fragmentos de DNA de cadeia dupla sintetizadas quimicamente. São seleccionadas sequências de bases do gene sintético de modo que o gene sintético contenha uma série de locais de restrição únicos relativamente ao vector que transporta o gene.

A série de locais de restrição 0n£ cos define uma série de segmentos que podem ser facilmente extraídos e substituídos por segmentos com sequências de bases alteradas. Os fragmentos sintéticos são inseridos quer directamente quer apôs ligação com outros fragmentos num vector adequado, tal como um plasmídeo pcD ou outro análogo. Os segmentos atrás referidos correspondem às cassettes” de Wells et al. (atrás citados). Os fragmentos sintéticos são sintetizados usando técnicas correntes, por ex. Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (Síntese de Oligonucleôtidos: Uma Abordagem Prática) (IRL Press, Oxford, fteino Unido, 1984). Utiliza-se de preferência um sintetizador automatizado, Tal como um modelo 380A de Applied Biosystems Inc (Foster City, CA). Plasmídeos pcD e outros vectores adequados estão disponíveis comercialmente, por ex. Pharmacia. Para pcD, a clonagem pode ser a cabo un E.coli MC1061 ou HB101 e a expresΒ'^ρ

são pode ser levada a cabo em células de macaco COS ou células de ovários de hamsters chineses.

Neste exemplo um gene de IL-3 humana sintética é construído para inserção num plasmídeo pcD. Brevemente, o vector pcD ê construído ligando primeiro quatro fragmentos uns aos outros com T4 DNA ligase: o fragmento gran de HindiII/BamHI de pcDVI contendo pBR322 ori e Ampr, o fragmento HindiII/PstI de ptl contendo o promotor de região primeira SV40 e intrões de região posterior, e os sintéticos 11A/B e 12A/B, adiante descritos. A seguir, numa série de I três passos adicionais de amplificação, purificação e inserção, o resto dos sintéticos 13A/B a 18Α/Β são adicionados até estar presente no vector pcD um gene de IL-3 sintético comple to.

As digestões de endonucleases de restrição e as reacções de ligases são levados a cabo utilizando protocolos convencionais, por ex. Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonagem Molecular: Um Manual de Laboratório)(Cold Sprinh Harbor Laboratory, Nova Iorque, 1982).

I 0 método alcalino ê usado para pre parações de plasmídeos em pequena escala. Para preparações em grande escala emprega-se uma modificação do método alcalino em que se usa um igual volume de isopropanol para precipitar ácidos nucleicos a partir do lisato clarificado. A precipitaI ção acetato de amónio 2,5M frio é usada para retirar RNA antes da centrifugação de densidade em equilíbrio com cloreto de césio e da detecção com brometo de etídio.

Cadeias complementares de DNAs sin téticos a serem clonades (cerca de 400 mg cada qual) são misturadas e fosfosiladas com polinucleôtido quinase num volume de reacção de 50 jil. Este DNA é ligado com 1 pg de dna vector digerido com enzimas de restrição apropriadas, e as ligações

-42estão num volume de 50 «1 I temperatura ambiente durante 4 a 12 horas. As condições de fosfosilação, digestão por enzi mas de restrição, reacções de pollmevases, ligações e transfecçfies bacterianas foram já descritas (Maniatis et al;» atrás referidos).

) No passo 1, pcDVl é amplificado, isolado e digerido com Hind III e BamHI. 0 fragmento conten do as regiões pBR322 ori e Amp^r é isolado por meio de electroforese de gel usando técnicas correntes, por ex. Mania * tis et al. (atrás referido). pL1 é amplificaod, isolado e

I digerido com Hind III e Pstl. 0 fragmento contendo o promo tor de região primeira de SV40 é isolado por meio de electro forese de gel. Os dois fragmentos isolados de pcDVl e pL1 são depois misturados com sintéticos 11A/B e 12A/B (a seguir ilustrados) numa solução de T4 SNA ligase convencional. Os sintéticos 11A/B e 12A/B anulam-se para formar um fragmento de inserção no vector pcD agora criado» que ê amplificado em E. Coli de depois isolado.

No passo 2, o vector pcD isolado do passo 1 é digerido com Spel e Saul. 0 fragmento grande é separado e misturado com os sintéticos 13A/B e 14A/B numa I solução de T4 DNA ligase convencional para formar o vector pcD do passo 2, que é amplificado em E. coli MC1061 e isolado.

No passo 3, o vector pcD isolado

I do passo 2 é digerido com MluI e Saul. 0 fragmento grande ê separado e misturado com os sintéticos 15A/B e 16A/B numa so lução de T4 DNA ligase convencional para formar o vector pcD do passo 3, que é amplificado em E. coli MC1061 e isolado.

No passo 4, o vector pcD isolado do passo 3 é digerido com EcoRI e Saul. 0 fragmento grande ê separado e misturado com os sintéticos 17A/B e 18A/B numa so lução de T4 DNA ligase convencional para formar o gene de

-43IL-3 sintético completo em pcD. o vector pcD do passo 4 é amplificado em E· coli MC1061, isolado e transfectado para células COS 7 tal como se descreve no Exemplo I. Os sobrena dantes da cultura são recolhidos e analisados relativamente a actividade de CSF tal como atrás se descreveu.

As sequências dos sintéticos 11a/b a 18A/B são a seguir indicadas. As localizações e os tipos dos locais de restrição Qnicos são indicados por cima das st quências.

(Pstl)BclI

G TC ATCAATC AG CCGCCTC CCCG TCCTC CTCACG TC AC TAG TTACTCGG CGG ACGGG C AGG ACG AG CTCCTCCAACTCCTCGTC

GACGAGGTT

Sintéticos 11A/B

NarI

CG CCCCGG AC TCCAGG CG CCCATC ACCG AGG ACCAGGCGGGGCCTC AGG TCCGCGGG TACTCG Spel Saul (BamHI) CAG ACAACG CCCTTC AAG AC TAG TCCTTAGGG G TCTCTTG CC^G AACTTCTC ATCAGG AATCCCCTAG *44

Sintéticos 12A/B

Spel

CTAG TTGGG TTAACTCCTCTAACATGATCG ATCAAAACCCAATTC ACG AG ATTG TACTAGCTACTTXbal ATTATAACACACTTAAAGCAG CCACCTTTG CCTCTTTAATATTG TC TC AATTTCG TCGG TCG AAACGG AG AACTAG ACTTCAACAACCTCAAT

GATCTGAAGTTG

Sintéticos 13A/B

GGGG AAG ACCAAG ACATTCTC ATCG AATTGG AG TTACCCCTTCTGG TTCTGTAAG ACTACCTTXmalII

AATAACCTTCGACGGCCGAACCTCGAGGCATTCAACTTATTGG AAGCTG CCGGCTTGG ACCTCCG TAAG TIG MluI (Saul)

AGGGCTC TC AAG AG TTTACAG AACGCG TCC

TCCCGACAGTTCTCAAATCTCTTCCGCAGGAAT

-Λ

Sintéticos 14Α/Β

MluI

CG CG TCAG CAATTG AG AG CATTCTTAAAAATCTCAG TCG TTAACTCTCG TAAG AATTTTTAG AG CTCCCATCTCTGCCC GACGGT

Sintéticos 15A/B

SacII

CTCGCCACCGCGGCACCCACGCGACATAC AG ACGGGG ACCGG TGG CG CCG TGGG TG CG CTG TACCAATCCATATCAAGGACGGTCACTCGATTGG TTAGG TATAG TTCCTGCCACTCACCTAAEcoRI (Saul) GAATTCCC CTTAAGGGAAT

Sintéticos 16A/B

EcoRI

TTCCGGAGGAAACTCACGTTCTATCTCAAGGCCTCCTTTC ACTGCAAGATAG ACAAAACCCTTCAGAAT TTTTGG

Sintéticos 17A/B

GCGCAGGCTCAACAG ACGACTG AACTCTTACG CG TC CG AG TTG TCTGCTG ANhel (Saul)

TTGTCGCTAGOGATCTTTTAGCC AACAG CGATCGCTAG AAAATCGG ATT

Sintéticos 18A/B

131

Exempio III. Construção e expressão de muteína Leu de IL-3 humana

Ile na posição 131 é alterada pa131 ra Leu a fim de formar muteína Leu de IL-3 humana. 0 pias mídeo pcD do Exemplo II contendo o gene completo de IL-3 humaça é digerido com Saul e Nhel. 0 fragmento grande é isola, do e combinado com o sintético seguinte numa solução de T4 DNA ligase convencional* vector pcD resultante é amplificado em E- coli MC1061, iso lado e transfectado para células de macaco COS 7 de acordo com os protocolos atris descritos. Após incubação durante 3-4 dias os sobrenadantes da cultura de COS 7 são recolhidos e analisados relativamente a actividade de CSF*

Exemplo IV Construção e expressão de muteína Ile de IL-3 humana

Met na posição 2 é alterada para Ile para formar a muteina Ile² da IL-3 humana. 0 plasmídeo pcD do Exemplo II contendo o gene de IL-3 humana completo é digerido com NarI e Spel. 0 fragmento grande é isolado e com binado com o sintético seguinte numa solução de T4 DNA ligase convencional:

CG CCCATAACCCAG ACAACG CCCGGG TATTGGG TCTG TTG CGGGTTGAAGA

AACTTCTGATC vector pcD resultante é amplificado em E. coli MC1061, iso lado, e transfectado para células de macaco COS 7 de acordo com os protocolos atrSs descritos. Apôs incubação durante

3-4 dias os sobrenadantes da cultura de COS 7 são recolhi dos e analisados relativamente a actividade de CSF.

As descrições dos modelos de execução do invento precedentes foram apresentadas apenas a título de ilustração e descrição. Não são exaustivas e não restringem o invento às formas particulares aqui reveladas.

Aqueles que pediram esta patente depositaram pcD em-IL3-22~1 junto da American Type Culture Collection, Rockville, MD, EUA (ATCC) sob o número de acesso 6731B.

Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES:

   1*. - Processo para a preparação de uma proteina revelando uma actividade de factor de estimu lação de colónias, caracterizado por se incorporar na referi da proteina um polipeptídeo glicosilado ou não glicosilado 10 vezes substituído, defenido pela fórmula

   I

   X(Pro) W(Pro) - X(Met) - W(Leu) - X ( Tr^ ~ - W(Lis) - X(Gln) 10 X (Tre) - X (Tre) - X(Ser) ~ W(Tre) - X(Trp) X(Val) - X(Asn) 20 - Cis - X(Ser) - W(Asn) - W(Met) W(Ile) ·“ W(Asp) W(Glu) W(Ile) W(Ile) W (Tre) 30 W(His) — W(Leu) — W(LÍS) — W(Gln) — W(Pro) — W(Pro) X(Leu) - X(Pro) - X(Leu) - X(Leu) 40 - X(Asp) - X (Fen) X(Asn) — X (Asn) — W(Leu) — W (Asn) - W(G1 ) — W(Glu) W (Asp) - W(Gln) 50 - W(Asp) - W(Ile) - W(Leu) - W(Met) W(Glu) W(Asn) W(Asn) W(Leu) W(Arg) — W(Arg) 60 W(Pro) — W (Asn) — W (Leu) — W(Glu) - W(Ala) — W(Fen-) W(Asn) - W(Arg) - W(Ala) - W(Val) 70 - W(Lis) W(Ser) W(Lau) — W(Gln) — W(Asn) — W(Ala) — W(Ser) — W(Ala) W(Ile) - W(Glu) 80 - W(Ser) - W(Ile) - W(Leu) - X(L S) X(Asn) “ X(Leu) X(Leu) X(Pro) — Cis X(Leu) 90 X(Pro) — X(Leu) — X(Ala) — X(Tre) - X(Ala) — W(Ala) W(Pro) - W(Tre) - W(Arg) - W(His) 100 - W(Pro) - W(Ile) W(His) — W(lle) — W(Lis) — W (Asp) - W(Gli) - W(Asp) W(Trp) - W(Asn) 110 - W(Glu) - W(Fen) W(Arg) - W(Arg) W(LÍs) W(Leu) X ('Tre) X (Fen), X(Tir) X(Leu) 120 X(Lis) - W(Thr) — W(Leu) — W(G1U) - W(Asn) — W(Ala) W(Gln) - W(Ala) W(Gln) - W(Gln) 130 - X(Tre) - X ( Tre) X(Leu) - X(Ser) - X(Leu) - X(Ala) - X(Ile) - X ( Fen)

   em que:

   X (Ser) representa Ser, Cis, Tre, Gli ou Asn;

   X (Arg) representa Arg, His, Gin, Lis ou Glu;

   X (Leu) representa Leu, Ile, Fen, Tir, Met ou Vai;

   X (Pro) representa Pro ou Ala;

   X (Tre) representa Tre, Pro, Ala, Gli, His ou Gin;

   X (Ala) representa Ala, Gli, Tre ou Pro;

   X (Vai) representa Vai, Met, Tir, Fen, Ile ou Leu;

   X (Gli) representa Gli, Ala, Tre, Pro ou Ser;

   X (Ile) representa Ile, Met, Tir, Fen, Vai ou Leu;

   X (Fen) representa Fen, Trp, Met, Tir, Ile, Vai ou Leu;

   X (Tir) representa Tir, Trp, Met, Fen, Ile, Vai ou Leu;

   X (His) representa His, Glu, Lis, Gin, Tre ou Arg;

   X (Gin) representa Gin, Glu, Lis, Asn, His, Tre ou Arg;

   X (Asn) representa Asn, Glu, Asp, Gin ou Ser;

   X (Lis) representa Lis, Glu, Gin, His ou Arg;

   X (Asp) representa Asp, Glu ou Asn;

   X (Glu) representa Glu, Asp, Lis, Asn, Gin, His ou Arg;

   X (Met) representa Met, Fen, Ile, Vai, Leu ou Tir;

   X (Trp) ê Trp;

   W (Ser) é Ser;

   W (Arg) representa Arg, His ou Lis;

   W (Leu) representa Leu, Ile, Fen ou Met;

   W (Pro) representa Pro ou Ala;

   W (Tre) ê Tre;

   W (Ala) representa Ala ou Pro;

   W (Vai) representa Vai, Met ou Ile;

   W (Gli) ê Gli;

   W (Ile) representa Ile, Met, Fen, Vai ou Leu;

   W (Fen) representa Fen, Met, Tir, Ile ou Leu;

   W (Tir) representa Tir ou Fen;

   W (His) representa His, Gin ou Arg;

   W (Gin) representa Gin; Glu ou His;

   W (Asn) representa Asn ou Asp;

   W (Lis) representa Lis ou Arg;

   W (Asp) representa Asp ou Asn;

   W (Glu) representa Glu ou Gin;

   W (Met) representa Met, Fen, Ile, Vai ou Leu;

   *53

   W (Trp) é Trp;

   e em que as regiões do referido polipeptídeo definidas pelos aminoácidos 10-32 inclusivê, 47-60 inclusivé, 71-86 inclusivé e 95-113 inclusivé não são em conjunto, mais de 3 vezes substituídas.
2. 2». - Processo para a preparação da proteina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido polipeptídeo ser 5 vezes substituído de tal modo que as referidas regiões definidas pelos aminoácidos 10-32 inclusivé, 47-60 inclusivé e 95-113 inclusivê não são, em conjunto, mais de 1 vez substituídas.
3. 3*. - Processo para a preparação da proteina de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido polipeptídeo ser 2 vezes substituído de tal modo que as referidas regiões definidas pelos aminoácidos 10-32 inclusivé, 47-60 inclusivê, 71-86 inclusivê e 95-113 inclusivé não sofrem substituições.
4. 4«, - Processo para a preparação da proteina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por:

   X (Ser) ser Ser;

   X (Arg) representar Arg, His ou Lis;

   X (leu) representar Leu, Ile, Fen ou Met;

   X (Pro) representar Pro ou Ala;

   X (Tre) ser Tre;

   X (Ala) representar Ala ou Pro;

   X (Vai) representar Vai, Met ou Ile;

   X (Gli) ser Gli;

   X (Ile) representar Ile, Met, Fen, Vai ou Leu;

   X (Fen) representar Fen, Met, Tir, Ile ou Leu;

   X (Tir) representar Tir ou Fen;

   X (His) representar His, Gin ou Arg;

   X (Gin) representar Gin, Glu ou His;

   X (Asn) representar Asn ou Asp;

   X (Lis) representar Lis ou Arg;

   X (Asp) representar Asp ou Asn;

   X (Glu) representar Glu ou Gin;

   X (Met) representar Met, Fen, Ile, Vai ou Leu;

   W (Arg) ser Arg;

   W (Leu) representar Leu, Ile ou Met;

   W (Pro) ser Pro;

   W (Ala) ser Ala;

   W (Vai) ser Vai;

   W (Ile) representar Ile, Met ou Leu;

   W (Fen) ser Fen;

   W (Tir) ser Tir;

   W (His) ser His;

   W (Gin) ser Gin;

   W (Asn) ser Asn;

   W (Lis) ser Lis;

   W (Asp) ser Asp;

   W (Glu) ser Glu e

   W (Met) representar Met, Ile ou Leu.
5. 5*. - Processo para a preparação da proteina de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido polipeptídeo ser 5 vezes substituído de tal modo que as regiões pelos aminoácidos 10-32 inclusivê, 47-60 inclusivé, 71-86 inclusivê não são, em conjunto, mais de 1 vez substituídas.
6. 6·. - Processo para a preparação da proteina de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o referido polipeptídeo ser 2 vezes substituído de tal modo que as referidas regiões definidas pelos aminoácidos 10 -32 inclusivé, 47-60 inclusivé, 71-86 inclusivê e 95-113 inclusivé não sofrem substituições.
7. 7». - Processo para a preparação da proteina de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por:

   X (Arg) ser Arg;

   X (Leu) representar Leu, Ile ou Met;

   X (Pro) ser Pro;

   X (Ala) ser Ala;

   X (Vai) ser Vai;

   X (Ile) representar Ile, Met ou Leu;

   X (Fen) ser Fen;

   X (Tir) ser Tir;

   X (Hís) ser His;

   X (Gin) ser Gin;

   X (Asn) ser Asn;

   X (Lis) ser Lis;

   X (Asp) ser Asp;

   X (Glu) ser Glu;

   X (Met) representar Met, Ile ou Leu;

   W (Leu) ser Leu;

   W (Ile) ser Ile e

   W (Met) ser Met.
8. 8*. - Processo para a preparação da proteina de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o referido polipeptídeo ser 5 vezes substituído de tal modo que as referidas regiões definidas pelos aminoãcidos 10 -32 inclusivé, 47-60 inclusivé, 71-86 inclusivê e 95-113 inclusivé não são, em comjunto, mais de 1 vez substituídas.
9. 9«. - Processo para a preparação da proteína de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o referido polipeptídeo glicosilado ou não-glicosilado I ser 2 vezes substituído de tal modo que as referidas regiões definidas pelos aminoãcidos 10-32 inclusivê, 71-86 inclusivé e 95-113 inclusivé não sofrem substituições.
10. 10*. - Processo para a preparação da proteína de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o referido polipeptídeo glicosilado ou não-glicosilado compreender um sequência de aminoãcidos definida pela fórmula

    Pro Lis - Met - 10 - Tre - Tre Ser Asn - Met - Ile His - Leu - Lis Leu - Leu - Asp Gli - Glu 50 - Asp Glu - Asn — Asn Leu - Glu - Ala Lis - Ser - Leu Ile - Glu Ser

    - Gin - Tre - Tre - Pro - Leu - Trp 20 - Vai - Asn - Cis - Ser Asp “· Glu Ile 30 — Ile Tre Gin Pro Pro Leu “ Pro 40 Fen — Asn — Asn — Leu — Asn - Gin - Asp - Ile - Leu - Met - Leu 60 - Arg - Arg - Pro - Asn Fen Asn — Arg 70 — Ala — Vai Gin Asn — Ala Ser — Ala 80 - Ile - Leu - li s - Asn - Leu

    Leu - Pro - Cis - Leu - Pro - Leu - Ala - Tre - Ala 90 - Ala - Pro - Tre - 100 - Asp - Arg - His - Pro - Ile - His - Ile - Li s Gli. - Asp - Trp - Asn - 110 Glu - Fen - Arg - Arg - L is - Leu - Tre - Fen - 120 Tir - Leu - Lis - Tre - Leu - Glu - Asn - Ala - Gin - Ala - Gin - Gin - Tre - Tre - Leu - Ser -

    130

    Leu - Ala - Ile - Fen·
11. 11*. - Processo para a preparação de uma proteína revelando uma actividade de factor de estimulação de colónias, caracterizado por se incorporar na referida proteína um polípeptídeo glicosilado ou não glicosilado com 5 inserções, 5 deleções e 5 substituições, apresentando uma sequência de aminoácidos definidos pela fórmula da reivin dicação 1, e em que asregiões do referido polipeptideo definidas pelos aminoácidos 10-32 inclusivê, 47-60 inclusivê, 71-86 inclusivê e 95-113 inclusivê não são, em conjunto, mais de 3 vezes substituídas.
12. 12*. - Processo para a preparação da proteína de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o referido polipeptideo ter 2 inserções, 2 deleções e 2 substituições, de tal modo que a referida região definida pelos aminoácidos 10-32 inclusivê, 47-60 inclusivê, 71-86 incl£ sivé 95-113 inclusivê, não sofre substituições, deleções e inserções.

    r
13. 13*. - Processo para a preparação da proteina de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o polipeptideo ser difinido pela fórmula:

    Ala Leu Ser Tre Pro - Pro 10 - Lis — Met Tre Met Leu Leu - Tre Ser 20 Ile Li s Asp - Gin - Trp - Asp - Tre - Vai - Tre - Pro Cis Ile Leu 40 Leu - - Asn Ile Pro Asn - - Asn His Leu - Glu 30 Pro Asn - Gin Fen Asn - Gli 50 - Glu - Asp - Gin - Asp - Ile - Leu - Met - Glu - Asn - Asn 60 Leu - Arg - Arg - Pro - Asn Leu Glu · Ala — Fen - Asn 70 - Arg - Ala - Vai — Lis — Ser — Leu - Gin - Asn - Ala - Ser - Ala - Ile - Glu - Ser - Ile - Leu - Lis - 80 Asn - Leu - Leu 90 - Pro - Cis - Leu - Pro - Leu - Ala - Tre - Ala - Ala - Pro 100 - Tre - Arg - His - Pro - Ile His Ile * Lis — Asp - Gli 110 - Asp - Trp - Asn Glu Fen Arg — Arg — Li’s - Leu - Tre 120 - Fen Tir Leu Li s — Tre - Leu - Glu - Asn -

    Ala

    Gin

    - Gin - Tre

    Leu ~ Tre

    Ser

    - Gin - Ala 130

    - Leu - Ala

    Ile ácido nucleico,
14. 14*. - Processo para a preparação caracterizado por se incorporar no reuma sequência de nucleotídeos selecciode níicleotídeos capazes de codificar de um ferido ácido nucleico nada entre sequências polipeptídeos 10 vezes substituídos definidos pela fórmula da reivindicação 1, em que as regiões do referido polipeptldeo definidas pelos aminôácidos 10-32 inclusivé, 47-60 inclusivé, 71-86 inclusivé e 95-113 inclusivé não são, em conjunto, mais de 3 vezes substituídas.
15. 15*. - Processo para a preparação do ácido nucleico de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a referida sequência de nucleotídeos ser seleccionada entre sequências de nucleotídeos capazes de codificar um polipeptídeo definido pela fórmula da reivindicação 10.
16. 16^a. - Método para a produção de um polipeptídeo revelando actividade de factor de estimulação de colónias, caracterizado por compreender os seguintes pas sos:

    (a) construção de um vector compreendendo uma sequêin cia de nucleotídeos que codificam o referido polipeptídeo, em que a sequência de nucleotídeo ê capaz de ser expressa por um hospedeiro contendo o vector e em que a sequência de nucleotídeos é seleccionada entre sequências de nucleotídeos capazes de codificar um polipeptideos 10 vezes substituído definido pela fórmula da reivindicação 1; e em que as regiões do referido polipeptídeo definidas pelos aminoácidos 10-32 incl£ sivé, 47-60 inclusivé, 71-86 inclusivé e 95-113 inclusivé não são, em conjunto mais de 3 vezes substituídas;

    (b) incorporação do vector no hospedeiro; e (c) manutenção do hospedeiro num meio de cultura em condições adaquadas para expressar a referida sequência de nucleotídeos no referido polipeptídeo.
17. 17*. - Método de acordo com a rei vindlcação 16, caracterizado por a referida sequência de nucleotídeos ser seleccionada entre sequências de nucleotídeos capazes de codificar um polipeptídeo definido pela fórmula da reivindicação 10.
18. 18*. - Método de acordo com a rei vindlcação 17, caracterizado por compreender ainda a fase de separação do referido polipeptídeo do referido meio de cultu ra e do referido hospedeiro.
19. 19«. - Processo de preparação de uma composição farmacêutica para a estimulação in vitro ou in vivo do crescimento e desenvolvimento de células sanguíneas, caracterizado por se incluir na referida composição um veiculo terapeuticamente compatível e uma quantidade eficaz de uma proteina obtida de acordo com a reivindicação 1.
20. 20«. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19 caracterizado por a proteina compreender uma sequência de aminoâcidos definidos pela fórmula da reivindicação 10 ou p pela referida fórmula precedida por Ala.