JPH0257174A

JPH0257174A - 浮遊細胞培養装置

Info

Publication number: JPH0257174A
Application number: JP20886288A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Hattori; 服部　博行
Original assignee: Nissho Corp
Current assignee: Nissho Corp
Priority date: 1988-08-22
Filing date: 1988-08-22
Publication date: 1990-02-26
Anticipated expiration: 2009-10-05
Also published as: JPH0677517B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は浮遊細胞培養装置に関する。

〔従来の技術・発明が解決しようとする課題〕近年、バ
イオテクノロジーの進歩にともない微生物や細胞などを
培養して利用する装置も種々提案されてきている。

たとえば浮遊細胞を培養する装置として、回分操作の必
要な反応器を一部連続化した半回分反応器、さらには回
分操作を連続操作に改善した連続槽型反応器などの種型
反応器や、連続操作に適した管型反応器などが提案され
、利用されてきている。

前記改善は、回分操作を半連続化、連続化するという点
ではそれなりの効果があるが、いずれも浮遊細胞と培地
およびその他必要とされる成分（たとえば血清、リンホ
カインなどの生理活性物質など）とを１つの系とし、こ
れを撹拌などすることにより所望の細胞や有用産生物を
つる方法である。

培養によりえられた細胞や有用産生物は多量の培地など
とともに存在するため、目的物の分離・精製が容易でな
く、前記細胞や有用産生物の濃度をいかにして高めるか
、また前記細胞や有用産生物の取出操作の妨げとなる培
地などを、いかにして少なくするかなどか、重要な課題
となっている。

このような課題を解決するための装置として、培養槽の
内部に設けられた菌体または細胞は透過しないが培地は
透過する膜製の袋中で菌体または細胞を培養する装置が
提案されている（特開昭８２−１２２５８０号公報）。

この装置を用いると袋中のものを取出すことにより、多
量の培地からの分離・精製の手間が軽減されるという効
果が達成され、それなりの成果かえられるか、袋中と袋
外との培地が必すしも同一の条件になりにくいという問
題、とくに動物性細胞の培養のばあいに重要なｐｌの安
定、ＩＩ　００３−レベルの維持（細胞の種類にもよる
が、通常３６〜４０ｍ　ｅｑ／ρであることが好ましい
）などがはかりにくいという問題があり、従って培養で
きる細胞の濃度に制約があった。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は上述のごとき課題に鑑み、とくに培養される浮
遊細胞の濃度を高め、かつ分離・精製される溶液中の培
地の割合をなるべく少なくすることを目１白としてなさ
れたものであり、培地を収容する培地容器内に、細胞培
養手段およびガス交換手段が収納配置された細胞培養袋
置であって、前記培地容器には培地供給手段および培地取出手段か設
けられており、前記細胞培養手段が、内部に設けられた培地は透過する
が血清や生理活性物質は透過しない柔軟な袋体と、該袋
体を支持するための培地が自由に通過しうる空隙をそな
えた枠体、および前記袋体への細胞や血清や細胞活性化
物質の供給および細胞や産生物の回収のための手段から
なり、前記ガス交換手段が、中空糸束と該中空糸束を支持する
ためのガス通過用空隙を有する枠体からなることを特徴とする浮遊細胞培養装置に関する。

〔作　用〕

本発明の装置では、培地容器中に特定の細胞培養手段を
配置し、この中で細胞培養を行なうため、細胞、血清お
よび細胞活性化物質と多量の培地とが１つの系にならな
い。

また、培地容器中に中空糸束を用いたガス交換手段を配
置しているため、培地とのガス交換が効率よく、容易に
行なえ、培地を一定の好ましい状態に保ちうる。

この結果、浮遊細胞を１０７〜１０８個／　ｍｌという
ような高密度で培養することができ、培養された細胞の
分離・精製が容易になる。さらに培養装置のコンパクト
化が可能である。

〔実施例〕

本発明の浮遊細胞培養装置をその一実施例に関する説明
図である第１図に基づき説明する。

本発明の浮遊細胞培養装置（４）は、培地を収容する培
地容器（１）ならびに該容器内に収納配置された細胞培
養手段（２）およびガス交換手段（３）を有する。

前記培地容器（１）とは、従来からの浮遊細胞培養装置
におけるいわゆるカルチャーボトルにあたるものであり
、その大きさ、形状、材質などにはとくに限定はなく、
従来からのカルチャボトルのごとき大きさ、形状、材質
などのものであれば使用しつる。

このような容器（１）の好ましい具体例としては、たと
えば容量５００〜５０００　ｍｌ程度の小型のもののば
あい、硬質ガラス、合成樹脂、金属などから形成された
底面積５０〜３００　ｃ＃程度で高さ１０〜３０ｃｍ程
度の円筒状容器や、角柱状容器、球状容器などがあげら
れる。

このような小型の装置では、通常、培地供給手段（５）
、培地取出手段の、細胞培養手段（２）、ガス交換手段
（３）などか容器の口の部分に取付けられるため、口広
のものであるのか好ましい。これらの手段が設けられた
口の部分の残りの部分は、栓、蓋などで密封され、雑菌
などの混入が防止される。

また、容量か５ｇ程度以上の中〜大型のもののばあい、
合成樹脂や金属などから形成された直径０．１５〜２　
ｍ程度で、高さが０．３−２ｍ程度の円筒状容器や、角
柱状容器、球状容器などがあげられる。

このような大型の容器のはあい、培地供給手段（５）、
培地取出手段の、細胞培養手段（２）、ガス交換手段（
３）などを容器の栓や蓋などに設ける必然性がないばか
りでなく、むしろこれらに取付けたばあいには、容器の
開閉が必要になったばあいなどには取扱いづらい、重量
のある細胞培養手段（２）やガス交換手段（３）などを
つり下げるのは好ましくない、などの理由から、通常は
底面にすえつけ台を設けた一トにすえつけたり、側面に
取付手段を設けて取付けるなどするのが好ましい。

前記細胞培養手段（２）は、培地は透過するか浮遊細胞
はもちろんのこと、血清や生理活性物質は透過しない柔
軟な袋体（６）、該袋体（６）を支持するための培地が
自由に通過しつる空隙をそなえた枠体（刀および袋体（
６）に浮遊細胞などを供給し、浮遊細胞やその産生物を
回収するための手段（８）からなる。

なお、培地容器（１）に収納配置される細胞培養手段（
２）は１個である必要はなく、培地容器（１）の大きさ
にもよるが、２個以上の数であってもよい。

前記袋体（６）とは、前記のように浮遊細胞や血清や生
理活性物質は透過させないが、培地容器（１）に収容さ
れた培地や浮遊細胞の排出物、とくに廃棄すべき排出物
は透過し、浮遊細胞に必要な養分や酸素や炭酸ガスなど
は充分供給され、不要物は除去される膜からなる袋状の
入物のことである。

該袋体（６）の大きさ、形状などにはとくに限定はない
が、培地容器（１）の容量の１０〜５０％程度になるの
が好ましく、培地との接触面積が大きくなる方が好まし
い。なお、細胞培養手段（２）が２個以」二設けられて
いるばあいには、前記袋体（６）の容量の合計が前記範
囲になるのが好ましい。

また該袋体（６）は、これを支持するための培地が自由
に通過しつる空隙をそなえた枠体（刀の内部に支持され
るため、該枠体（力の内側の形状・容量とほぼ同じであ
るのが好ましい。

前記袋体（６）は、培地は透過するか、細胞、血清、生
理活性物質は透過しない必要かあるから、前記透過物質
、不透過物質の種類にもよるか、通常、平均ポアサイズ
３０〜８０人程度の孔を有する膜から形成される。

前記膜を構成する材料には、とくに限定はないが、培地
を透過させる必要かあるから、表面は親水性を有するも
のであることが必要である。

それゆえ、膜を構成する材料の好ましい具体例としては
、たとえば再生セルロースなどの親水性材料があげられ
る。たとえばセルローストリアセテート、セルロースジ
アセテート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテト
ラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリアミドまたは
ポリエステルなどの親水性でない材料からなる膜のばあ
いには、たとえばエタノールに浸漬させたり、水酸基を
膜表面にグラフト重合させるなどの方法で膜を親水性に
しうる。

前記培地が自由に通過しつる空隙をそなえた枠体（７）
は、袋体（６）が充分な強度を有さず、僅かな力で変形
する膜で形成されたものであるため、これを支持して補
うとともに、袋体（６）に培地が充分供給されるのを妨
げないようにしたものである。

枠体（７）の形状、大きさ、材質などにはとくに限定は
なく、袋体（６）を包囲して支持するとともに保護する
ものであり、袋体（６）に培地が自由に供給されうるよ
うなものであるかぎり使用しうる。このような枠体（７
）の好ましい具体例としては、たとえは袋体（６）をそ
の内部にうまく支持しつるような形状である円筒状、角
柱状、球状などの形状で、袋体（６）の大きさと同程度
〜やや太き目の大きさに形成されており、スリット状、
格子状、円形〜楕円形などの形状の空隙を有するもので
ある。該空隙は実質的に均等、すなわち同じ形状かつ同
じ大きさのものか等間隔に形成されるのが好ましい。

第１図の（８）は袋体に浮遊細胞や血清や細胞活性化物
質を供給し、増殖した細胞やその産生物である生理活性
物質を回収する手段であり、このような働きをするかぎ
りとくに限定はないか、たとえばインジェクションプラ
グを用いたものかあげられ、その下端か袋体（６）の最
下部付近まで達している方が浮遊細胞などの回収がやり
やすい。また第１図では浮遊細胞などの供給と回収とを
１本の管で行なっているが、別々の管を用いて連続的に
行なうようにしてもよい。

前記ガス交換手段（３）はガス供給用のライン０９１と
ガス排出用のライン０８）とを備えており、培養に必要
なガス、たとえば０２を供給し、培養により生ずるガス
、たとえばＣＯ２を排出する手段であり、たとえば詳細
には第２図に示すように、中空糸束（９）と該中空糸束
（９）を支持するためのガス通過用空隙００）を有する
枠体０１）からなる。

中空糸束（９）を構成する中空糸としては、ガス交換能
を有するものであるかぎりとくに限定はないか、たとえ
ば平均ポアサイズ３０人〜１μｍ程度、さらには３０人
〜０．２．ａｍ程度の中空糸が好ましく使用される。

該中空糸を構成する材質などにもとくに限定はなく、た
とえば再生セルロースや、セルロストリアセテート、セ
ルロースジアセテ−１・、ポリプロピレン、ポリエチレ
ン、ボリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリ
アミド、ポリエステルなどが通常使用される。

前記中空糸束（９）はガス交換のために使用されるが、
ばあいによってはガス交換の他に培地取出のためにも使
用するばあいかある。このばあいには培地が中空糸を透
過する必要かあるため、親水性材料からなる中空糸また
は親水性でない材料からなる中空糸のばあいには、表面
を親水化した中空糸を用いる必要かある。

前記中空糸は培地の容量によって異るが、容量１０１０
０Ｏのばあい、通常３００〜６００本程度束ねて両端を
、たとえばウレタン樹脂などでポツティングすることに
より中空糸束（９）とされる。

中空糸を束ねた際の断面形状、長さなどは、適宜選択す
れはよいが、培地との接触面積が大きくなるようにする
のか好ましく、通常、断面形状円形のものが採用される
。

中空糸束（９）を支持するガス通過用空隙（ＩＱ）を有
する枠体０１）は、それのみては一定の形状を有さす、
取扱いにくい中空糸束（９）を取扱いやすくするだめの
ものであるから、なるべく培地とのガス交換、ばあいに
よっては培地の通過がおこりやすいものであるのが好ま
しく、このような目的を達成しうるちのであるかぎり、
形状、大きさなどにはとくに限定はない。それゆえ、枠
体０１）に存在するガス透過用空隙００）の形状も、た
とえば第２図に示すように、巾広く、長いストリップ状
の空隙であってもよく、スリット状、格子状、円形〜楕
円形などの形状の空隙であってもよい。

なお前記ガス通過用とはガスのみが通過することを意味
するものではなく、培地と中空糸とが接触する必要があ
るから、培地をも通過させることは当然のことである。

たとえば第２図に示すガス交換手段において、」一方か
らガス交換用のガスを供給するばあい、培養により消費
されるガスの中空糸内の分圧が高いため、該ガスは培地
中にとけこんでいき、一方、培養により排出されるガス
の溶解量は該ガスの中空糸中の分圧に対するよりも多く
なっているため、培地から中空糸中に排出され、ガス交
換が行なわれる。この際、中空糸の表面が親水性である
ばあいには、交換用ガスの圧力が水圧よりも小さいと培
地は中空糸の内部に浸透してしまうので、ガス交換を行
なうばあいには、交換用ガスの圧力を水圧よりも大きく
する必要かある。さらに交換用ガス圧を水圧よりも低く
したばあいには、培地（排液）が中空糸を透過して外部
に排出されるので、ガス交換手段（３）か培地取出手段
をも兼ねることになる。

培地容器（１）内に設けられるガス交換手段（３）は１
個でもよいか、要すれば２個以上設けてもよい。

細胞培養手段（２）およびガス交換手段（３）の培地交
換やガス交換かおこる部分か培地中に存在しなければな
らないことは当然である。また培地供給手段（５）から
の培地の供給は、培地容器（１）上部から行なわれるよ
うにするのが好ましい。

本発明の装置には撹拌手段は必ずしも必要ではないが、
第１図に示すように、撹拌手段０２）を設けて培地を撹
拌すると、培地とガス交換手段との間のガス交換かおこ
りやすくなり、培地を一定の状態に維持しやすくなり、
また培地が袋体（６）を透過しやすくなる。また培地を
撹拌するため、強く撹拌しても細胞を傷つけることがな
０゜さらに袋体（６）を常にゆらし、細胞を浮遊させや
すくするため、細胞か袋体（６）の表面に付着するのが
防止され、増殖しやすくなる。

なお第１図における０３）は初めに培地を供給する際の
ガス抜き手段であり、第２図における０４）はポツティ
ング部である。

第１図には培養中の培地の状態をモニターする手段など
は記載されていないが、随時設置しうろことは当然のこ
とである。

本発明の装置により培養される細胞としては、たとえば
リンパ球、骨髄細胞、マクロファージなどが、その際に
使用される細胞活性化物質としては、たとえばリンホカ
インやインターフェロンなどが、さらに培地としては、
たとえば牛胎児血清培地、無血清培地、ヒト血清培地な
どがあげられる。

つぎに本発明の装置を実施例に基づいて説明する。

実施例１本発明の装置におけるガス交換手段を、ガス交換および
培地取出機能を有するガス交換手段とした第３図に示す
装置を用いた。

第３図における培地容器（１）は硬質ガラス製で容量３
３００　ｍｌ、直径約１５０正×高さ約１９０　＋＋＋
＋ｎの円筒状容器、細胞培養手段（２）は平均ポアサイ
ズ４０人の再生セルロース膜で、内容量３００　ｍｌ、
高さ１５０ｍｍ、直径５０ｍｍで表面積２３０　ａｔの
袋体（６）であり、略円柱状の形状を有する枠体（力で
支持されており、袋体の上部には袋体の下部まで達する
パイプを有する細胞の供給および回収手段（８）が設け
られている。ガス交換兼培地取出手段叱は、セルロース
トリアセテート製の平均ポアサイズ０．１左の中空糸３
００本を束ねて有効長が１２０ｍｍになるようにポツテ
ィングしたもの（全表面積２５０ｃＩＩｌ′）を、円筒
状の形状を有し、内径が２０　＋＋＋＋ｎでその側面に
ほぼ８０ｍｍ　Ｘ　１０＋＋＋ｎ＋のｌＪ広スストリッ
プ形状空隙を２個設けた枠体で支持したものであり、そ
の上部にガス供給口、その下部にガス排気兼培地排出口
か設けられたものである（第２図参照）。そして培地容
器（１）を外部から遮断する蓋体に、前記細胞培養手段
（２）、ガス交換兼培地取出手段叱、培地供給手段（５
）および０．２．ａｍのエアフィルター００を有するガ
ス抜き手段（１３１が配置され、撹拌手段０２）か設け
られている。なお前記ガス供給口には、エアフィルター
（０，２ρ）００を有するガス供給ライン０９に接続さ
れたエアポンプ０７）が、また前記ガス排気兼培地排出
口から外部には排気ガスおよび培地が排出されるための
ライン（２１）が設けられている。

ガス抜き手段０３）の開放下、培地としてＲＰ旧−１６
４０（味の素■製）　１０００　ｍｌが供給されたのち
、リンパ球１０６個／　ｍｌ　Ｘ　　ｌｏｏｍｌ　、血
清１０ｍ１、リンホカイン２００単位からなる細胞浮遊
成約１１０ｍ１を袋体（６）に供給した。

そののち、２００ｒｐｍの速さで撹拌を行ないなから３
７°Ｃで培養を行なった。この間、培地供給手段（５）
から培地を１　ｍｌ　／　ｍｉｎの割合で供給するとと
もに、エアポンプを用いてＣＯ２を５容量％含有する空
気を流量１０ｍ１　／　ｍｉｎで供給して２０日間培養
した。

培養中、１日ごとに培地のｐｌｌ、炭酸ガス分圧（ＰＣ
Ｏ２）を測定し、７．２≦ＩＩＨ≦７．３．３［ｉｎ＋
＋ｎＨｇ≦ＰＣＯ２≦４０ｍｍ１１ｇであることを確め
た。

培養成績を第１表に示す。

〔以下余白〕

第　　１　　表に保たれるため、培養された細胞や産生物の分離、精製
か容易となる。さらに、培地の交換、培養細胞やその産
生物の回収を無菌的に連続でも行なうことができる。そ
して血清、細胞活性化物質は袋体内に保持されるため、
その消費も少なくなる。

このように本発明の装置を用いることにより、高濃度の
培養細胞や産生物が効率よくえられるため、装置のコン
パクト化がはかられる。

〔発明の効果〕本発明の装置を用いると細胞培養中も安定して一定の培
地条件を維持することができる。また、ガス交換が細胞
の存在しない培地中、中空糸束を用いたガス交換手段で
行なわれるため、バブリングなとて生じる細胞の損傷は
おこらない。また、細胞、血清、生理活性物質は袋体内

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の装置の一実施例に関する説明図、第２
図は本発明の装置に用いるガス交換手段の一例に関する
説明図、第３図は実施例１で用いた本発明の装置に関す
る説明図である。（図面の主要符号）（１）：培地容器（２）：細胞培養手段（３）：ガス交換手段（４）：細胞培養装置（５）：（６）：（７）：（８）：（９）二００二旧頒：培地供給手段袋　　体袋体を支持するための枠体細胞などの供給・回収手段中空糸束ガス通過用空隙中空糸束を支持するだめの枠体ガス交換兼培地取出手段培地取出手段ガス廃棄兼培地取出ライン出願人株式会社ニッショ手続補正書（鮭）５補正の対象（１）明細書の「特許請求の範囲」の欄（２）　　明細
書の「発明の詳細な説明」の欄（３）　　明細書の「図
面の簡単な説明」の欄１事件の表示昭和６３年特許願第２０８８６２号２発明の名称浮遊細胞培養装置３補正をする者事件との関係　　特許出願人住　所　　大阪市大淀区本庄西３丁目９番３号６補正の
内容（１）明細書の「特許請求の範囲」を別紙「補正された
特許請求の範囲」のとおり補正する。（２）明細書５頁１１行のｒ　３Ｂ〜４０＋ｎ　ｅｑ／
　ｉ）　Ｊを「２６〜３２ｍｅｑ／、Ｉｌｌ」と補正す
る。（３）同２０頁８行の「確めた」を「確かめた」と補正
する。（４）同２３頁１０行の「廃棄」を「排気」と補正する
。住所大阪市東区谷町２丁目３７番地　ＮＳビルほか１名補正された特許請求の範囲［１培地を収容する培地容器内に、細胞培養手段および
ガス交換手段が収納配置された細胞培養装置であって、前記培地容器には培地供給手段および培地取出手段が設
けられており、前記細胞培養手段が、内部に設けられた培地は透過する
が血清や生理活性物質は透過しない柔軟な袋体と、該袋
体を支持するための培地が自由に通過しうる空隙をそな
えた枠体、および前記袋体への細胞や血清や細胞活性化
物質の供給および細胞や産生物の回収のための手段から
なり、前記ガス交換手段が、中空糸束と該中空糸束を支持する
ためのガス通過用空隙を有する枠体からなることを特徴とする浮遊細胞培養装置。２　前記細胞培養手段における柔軟な袋体が、平均ポア
サイズ３０〜８０人のセルローストリアセテート、セル
ロースジアセテート、再生セルロース、ポリプロピレン
、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリス
ルホン、ポリアミドまたはポリエステル製の膜からなる
袋体である請求項１記載の装置。３　前記ガス交換手段における中空糸束が、セルロース
トリアセテート、セルロースジアセテート、再生セルロ
ース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフル
オロエチレン、ポリスルホン、ポリアミドまたはポリエ
ステル製の中空糸束である請求項１記載の装置。４　前記ガス交換手段が前記培地取出手段を兼ねる請求
項１記載の装置。５　前記細胞培養手段における柔軟な袋体か、平均ポア
サイズ３０〜８０人のセルローストリアセテート、セル
ロースジアセテート、再生セルロース、ポリプロピレン
、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリス
ルホン、ポリアミドまたはポリエステル製の膜からなる
袋体であり、前記ガス交換手段か、セルロストリアセテ
ート、セルロースジアセテト、再生セルロース、ポリプ
ロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン
、ポリスルホン、ポリアミドまたはポリエステル製の中
空糸束を用いたものであり、かつ培地取出手段を兼ねる
請求項１記載の装置。」以　　上

Claims

【特許請求の範囲】１　培地を収容する培地容器内に、細胞培養手段および
ガス交換手段が収納配置された細胞培養装置であって、前記培地容器には培地供給手段および培地取出手段が設
けられており、前記細胞培養手段が、内部に設けられた培地は透過する
が血清や生理活性物質は透過しない柔軟な袋体と、該袋
体を支持するための培地が自由に通過しうる空隙をそな
えた枠体、および前記袋体への細胞や血清や細胞活性化
物質の供給および細胞や産生物の回収のための手段から
なり、前記ガス交換手段が、中空糸束と該中空糸束を支持する
ためのガス通過用空隙を有する枠体からなることを特徴とする浮遊細胞培養装置。２　前記細胞培養手段における柔軟な袋体が、平均ポア
サイズ３０〜８０Åのセルローストリアセテート、セル
ロースジアセテート、再生セルロース、ポリプロピレン
、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリス
ルホン、ポリアミドまたはポリエステル製の膜からなる
袋体である請求項１記載の装置。３　前記ガス交換手段における中空糸束が、セルロース
トリアセテート、セルロースジアセテート、再生セルロ
ース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフル
オロエチレン、ポリスルホン、ポリアミドまたはポリエ
ステル製の中空糸束である請求項１記載の装置。４　前記ガス交換手段が前記培地取出手段を兼ねる請求
項１記載の装置。５　前記細胞培養手段における柔軟な袋体が、平均ポア
サイズ３０〜８０Åのセルローストリアセテート、セル
ロージアセテート、再生セルロース、ポリプロピレン、
ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスル
ホン、ポリアミドまたはポリエステル製の膜からなる袋
体であり、前記ガス交換手段が、セルローストリアセテ
ート、セルロースジアセテート、再生セルロース、ポリ
プロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレ
ン、ポリスルホン、ポリアミドまたはポリエステル製の
中空糸束を用いたものであり、かつ培地取出手段を兼ね
る請求項１記載の装置。