JPH0257177A - モノクローナル抗体産生細胞ラインおよびモノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体産生細胞ラインおよびモノクローナル抗体Info
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- JPH0257177A JPH0257177A JP63207642A JP20764288A JPH0257177A JP H0257177 A JPH0257177 A JP H0257177A JP 63207642 A JP63207642 A JP 63207642A JP 20764288 A JP20764288 A JP 20764288A JP H0257177 A JPH0257177 A JP H0257177A
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- Japan
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- tetrahydrocannabinol
- cell line
- monoclonal antibody
- thc
- immunogen
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は新規なモノクローナル抗体産生細胞ラインに関
するものである。この細胞ラインより産生されるモノク
ローナル抗体は、大麻の有効成分であるテトラヒドロカ
ンナビノールあるいはテトラヒドロカンナビノールの誘
導体を、血中あるいは大気中より免疫測定法によって高
感度に検知するために有用である。
するものである。この細胞ラインより産生されるモノク
ローナル抗体は、大麻の有効成分であるテトラヒドロカ
ンナビノールあるいはテトラヒドロカンナビノールの誘
導体を、血中あるいは大気中より免疫測定法によって高
感度に検知するために有用である。
従来の技術
テトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒドロカン
ナビノールの誘導体に対する抗体は例えばＪ、 Ｄ、
ティール、エルビネ Ｊ、 フォアマン、Ｌ、
Ｊ、 キング、エベリン Ｍ、ピアル及びＶ。
ナビノールの誘導体に対する抗体は例えばＪ、 Ｄ、
ティール、エルビネ Ｊ、 フォアマン、Ｌ、
Ｊ、 キング、エベリン Ｍ、ピアル及びＶ。
マークス、Ｊ、ファーム、ファーマックらによって報告
されている。しかしながら、報告されている抗体は免疫
した羊の血液を精製して得られるポリクローナル抗体で
ある。
されている。しかしながら、報告されている抗体は免疫
した羊の血液を精製して得られるポリクローナル抗体で
ある。
発明が解決しようとする課題
従来の技術であるポリクローナル抗体は、これを得るま
での全体の製造行程が簡単である長所を有する。反面、
得られる抗体の特性は羊の各個体に依存するため再現性
のある抗体を提供することが困難である。また、ポリク
ローナル抗体は抗原に対するアフィニティーが様々な抗
体の混合物であるため、平均としてのアフィニティーが
低く、高感度測定には用いることができないなどの問題
を有している。
での全体の製造行程が簡単である長所を有する。反面、
得られる抗体の特性は羊の各個体に依存するため再現性
のある抗体を提供することが困難である。また、ポリク
ローナル抗体は抗原に対するアフィニティーが様々な抗
体の混合物であるため、平均としてのアフィニティーが
低く、高感度測定には用いることができないなどの問題
を有している。
課題を解決するための手段
本発明のモノクローナル抗体産生細胞ラインは、テトラ
ヒドロカンナビノールまたはテトラヒドロカンナビノー
ルの誘導体と、ウシ血清アルブミンの結合物質からなる
免疫原で感作されマウスの脾臓細胞と、骨髄腫由来の細
胞ラインとを融合後、クローニングして得られ、培養上
清中に産生されるイムノグロブリンが、テトラヒドロカ
ンナビノールまたはテトラヒドロカンナビノールの誘導
体に特異的に結合するものである。
ヒドロカンナビノールまたはテトラヒドロカンナビノー
ルの誘導体と、ウシ血清アルブミンの結合物質からなる
免疫原で感作されマウスの脾臓細胞と、骨髄腫由来の細
胞ラインとを融合後、クローニングして得られ、培養上
清中に産生されるイムノグロブリンが、テトラヒドロカ
ンナビノールまたはテトラヒドロカンナビノールの誘導
体に特異的に結合するものである。
作用
免疫グロブリンを産生ずる細胞は脾臓内に蓄積される。
脾臓細胞はそれ自体増殖能力を持たないが骨髄腫細胞ラ
インと融合することによって、増殖しながら抗体を産生
ずるハイブリドーマ細胞ラインを作製することができる
。もっとも優れたアフィニティーを有する抗体を産生じ
、かつ高い増殖能力を有するハイブリドーマ細胞１個を
選択（クローニング）シ、これを培養すると高アフィニ
ティーのモノクローナル抗体が産生される。モノクロー
ナル抗体は同一種の抗体であるため、高アフィニティー
が得られる。またハイブリドーマ細胞ラインを培養する
ことにより、永続的に一定の特性のモノクローナル抗体
を提供することができる。
インと融合することによって、増殖しながら抗体を産生
ずるハイブリドーマ細胞ラインを作製することができる
。もっとも優れたアフィニティーを有する抗体を産生じ
、かつ高い増殖能力を有するハイブリドーマ細胞１個を
選択（クローニング）シ、これを培養すると高アフィニ
ティーのモノクローナル抗体が産生される。モノクロー
ナル抗体は同一種の抗体であるため、高アフィニティー
が得られる。またハイブリドーマ細胞ラインを培養する
ことにより、永続的に一定の特性のモノクローナル抗体
を提供することができる。
実施例
発明者らは、免疫したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫
由来細胞ラインを融合し、クローニングを行うことによ
ってテトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒドロ
カンナビノールの誘導体に対して高いアフィニティーを
有するモノクローナル抗体を産生ずる細胞ラインを作製
することに成功した。
由来細胞ラインを融合し、クローニングを行うことによ
ってテトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒドロ
カンナビノールの誘導体に対して高いアフィニティーを
有するモノクローナル抗体を産生ずる細胞ラインを作製
することに成功した。
本発明において、目的抗原はテトラヒドロカンナビノー
ルあるいはテトラヒドロカンナビノールの誘導体であり
、これらの物質は何れも低分子であるため、蛋白質等の
高分子に結合させることにより、初めて免疫原として作
用する。その際の蛋白質は、抗原性の高いものが望まし
い。この意味において好適な蛋白質の１つであるウシ血
清アルブミン（以下ＢＳＡ）を用いた。
ルあるいはテトラヒドロカンナビノールの誘導体であり
、これらの物質は何れも低分子であるため、蛋白質等の
高分子に結合させることにより、初めて免疫原として作
用する。その際の蛋白質は、抗原性の高いものが望まし
い。この意味において好適な蛋白質の１つであるウシ血
清アルブミン（以下ＢＳＡ）を用いた。
また、テトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒド
ロカンナビノールの誘導体と蛋白質の結合物質からなる
免疫原で感作されるマウスは、高い力価の抗体を産生ず
るものが望ましい。この点において好適な系統であるＡ
／Ｊ系統のマウスを用いた。
ロカンナビノールの誘導体と蛋白質の結合物質からなる
免疫原で感作されるマウスは、高い力価の抗体を産生ず
るものが望ましい。この点において好適な系統であるＡ
／Ｊ系統のマウスを用いた。
以下、本発明のモノクローナル抗体産生細胞ライン及び
モノクローナル抗体を作製する実験方法を順に記載する
。
モノクローナル抗体を作製する実験方法を順に記載する
。
免麦凰皇詐ｌ
以下に免疫原の合成方法をステップ毎に記して免疫原に
ついての実施例の説明を行う。
ついての実施例の説明を行う。
（Ａ）テトラヒドロカンナビノール（以下、ＴＨＣ）の
単離 大麻樹脂１８．２ｇから石油エーテルで５．８ｇの成分
を抽出した。この成分をシリカゲルカラム、溶媒（ジエ
チルエーテル：ヘキサン＝１： ５）を用いた液体クロ
マトグラフィーにより、７２０ｍｇのＴＨＣを抽出した
。テトラヒドロカンナビノールは、二重結合の位置の差
によって△９−ＴＨＣ及び△８−ＴＨＣに分別されるが
、ここで抽出されたＴＨＣは△９−ＴＨＣであることを
確認した。
単離 大麻樹脂１８．２ｇから石油エーテルで５．８ｇの成分
を抽出した。この成分をシリカゲルカラム、溶媒（ジエ
チルエーテル：ヘキサン＝１： ５）を用いた液体クロ
マトグラフィーにより、７２０ｍｇのＴＨＣを抽出した
。テトラヒドロカンナビノールは、二重結合の位置の差
によって△９−ＴＨＣ及び△８−ＴＨＣに分別されるが
、ここで抽出されたＴＨＣは△９−ＴＨＣであることを
確認した。
（Ｂ）テトラヒドロカンナビノール−１−０−へミスク
シニック酸（以下ＴＨＣ−ＣＯＯＨ）の合成（Ａ）項で
単離したＴＨＣを用いて Ｊ、Ｄ、ティールらの報告（
前出）に従って合成した。無水コハク酸２８０ｍｇをピ
ッ２フ４ ３０ｍｇ／４ｍＬピ，リジン）を加えて６時間還流した
。これを溶媒クロロホルムを用いて薄層クロマトグラフ
ィーで展開して、７Ｇ．５ｍｇのＴｌＩＣ−Ｃ００ＩＴ
を抽出した。
シニック酸（以下ＴＨＣ−ＣＯＯＨ）の合成（Ａ）項で
単離したＴＨＣを用いて Ｊ、Ｄ、ティールらの報告（
前出）に従って合成した。無水コハク酸２８０ｍｇをピ
ッ２フ４ ３０ｍｇ／４ｍＬピ，リジン）を加えて６時間還流した
。これを溶媒クロロホルムを用いて薄層クロマトグラフ
ィーで展開して、７Ｇ．５ｍｇのＴｌＩＣ−Ｃ００ＩＴ
を抽出した。
（Ｃ）ＢＳＡへのＴＨＣの導入
ＴＩＩＣ−０００１５０ｍｇを溶媒（ピリジン：ジオキ
サン＝１ ： ２） ３ｍＬに溶かし攪はんしている中
に、！ーエチルー３−（−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミドヒドロクロライド（ １６ 、８ｍｇ／
１ｍＬリン酸バッファー（０．１Ｍ，ＰＨ７））を加え
、さらに３時間攪はんを行った。冷却後、ＢＳＡ溶液（
３０ｍＬ， ０．３４％）を４℃で撹はんしている中
に徐々に加え、さらに４℃で１晩攪はんを続けた。この
中に含まれる変性した蛋白質を遠心分離（ １９０００
ｒｐｍ、４０ｍＩｎ）で除去した後、セファデックスＧ
−２５ （ファルマシア製）でゲル濾過し、吸光度２８
０ｎｍの分画を分取し、ＴＩＴＣ−ＢＳＡを得た。
サン＝１ ： ２） ３ｍＬに溶かし攪はんしている中
に、！ーエチルー３−（−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミドヒドロクロライド（ １６ 、８ｍｇ／
１ｍＬリン酸バッファー（０．１Ｍ，ＰＨ７））を加え
、さらに３時間攪はんを行った。冷却後、ＢＳＡ溶液（
３０ｍＬ， ０．３４％）を４℃で撹はんしている中
に徐々に加え、さらに４℃で１晩攪はんを続けた。この
中に含まれる変性した蛋白質を遠心分離（ １９０００
ｒｐｍ、４０ｍＩｎ）で除去した後、セファデックスＧ
−２５ （ファルマシア製）でゲル濾過し、吸光度２８
０ｎｍの分画を分取し、ＴＩＴＣ−ＢＳＡを得た。
（Ｄ）ＢＳＡに導入されたＴＨＣの定量ＢＳＡにＴＨＣ
を導入した前後のアミノ基をクマシブリリアントブルー
Ｇ（和光紬薬製）で定量して、結合したＴｌＩＣの数を
測定した。その結果、ＴＨＣ導入前のＢＳＡのアミン基
は４４個、導入後のＢＳＡのアミノ基は２２個であった
。したがって、Ｂ５Ａ１個当り２２個のＴＨＣが結合し
たＴＨＣ−ＢＳＡが得られた。
を導入した前後のアミノ基をクマシブリリアントブルー
Ｇ（和光紬薬製）で定量して、結合したＴｌＩＣの数を
測定した。その結果、ＴＨＣ導入前のＢＳＡのアミン基
は４４個、導入後のＢＳＡのアミノ基は２２個であった
。したがって、Ｂ５Ａ１個当り２２個のＴＨＣが結合し
たＴＨＣ−ＢＳＡが得られた。
（Ｅ）アジュバントエマルシロンの調製合成によって得
たＴＨＣ−ＢＳＡをＰＢＳで希釈して、１ｍｇ／ｍＬ溶
液８ｍＬを得た。アジュバント（ＡｄＪｕｖａｎｔ，
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄヒト結核死菌含、和光
紬薬製、■３７Ｒｖ）をよく攪はんしながら［ｉｍＬ取
り、ホモジナイザで攪はんしながら（１０．００Ｏｒｐ
ｍ） ＴＨＣ−ＢＳＡ溶液溶液６警Ｌ回に分けて加えた
。十分にエマルシロン化し、少量を水の上に落としても
広がらなくなったのを確認した。
たＴＨＣ−ＢＳＡをＰＢＳで希釈して、１ｍｇ／ｍＬ溶
液８ｍＬを得た。アジュバント（ＡｄＪｕｖａｎｔ，
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄヒト結核死菌含、和光
紬薬製、■３７Ｒｖ）をよく攪はんしながら［ｉｍＬ取
り、ホモジナイザで攪はんしながら（１０．００Ｏｒｐ
ｍ） ＴＨＣ−ＢＳＡ溶液溶液６警Ｌ回に分けて加えた
。十分にエマルシロン化し、少量を水の上に落としても
広がらなくなったのを確認した。
なお本実施例では、八〇−ＴｉｌＧを用いて免疫原を作
製したが、これはΔＢ−ＴＨＣおよびテトラヒドロカン
ナビノールの誘導体、例えば１１−ヒドロキシ−△９ー
テトラヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシ−Δ８
ーテトラヒドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−△
９ーテトラヒドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−
へ８ーテトラヒドロカンナビ ノール、カンナビノール
、カンナビジオール、カンナビジオール酸、カンナビジ
クロール、カンナビクロメエン、８α−ヒドロキシ−へ
キサヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシカンナビ
ノール、カンナビノール−１１−アルデヒド アセテー
トおよび８−アセトキシ−９−ヒドロキシ−へキサヒド
ロカンナビノールについてもまったく同様の合成方法を
用いて、モノクローナル抗体産生細胞ライン作製のため
の免疫原が作製できる。
製したが、これはΔＢ−ＴＨＣおよびテトラヒドロカン
ナビノールの誘導体、例えば１１−ヒドロキシ−△９ー
テトラヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシ−Δ８
ーテトラヒドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−△
９ーテトラヒドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−
へ８ーテトラヒドロカンナビ ノール、カンナビノール
、カンナビジオール、カンナビジオール酸、カンナビジ
クロール、カンナビクロメエン、８α−ヒドロキシ−へ
キサヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシカンナビ
ノール、カンナビノール−１１−アルデヒド アセテー
トおよび８−アセトキシ−９−ヒドロキシ−へキサヒド
ロカンナビノールについてもまったく同様の合成方法を
用いて、モノクローナル抗体産生細胞ライン作製のため
の免疫原が作製できる。
以下、モノクローナル抗体産生細胞およびモノクローナ
ル抗体の作製方法をステップごとに示し、実施例の説明
を行う。
ル抗体の作製方法をステップごとに示し、実施例の説明
を行う。
（Ａ）マウスの免疫
生後約８週のマウス（Ａ／Ｊ）１０匹の腹腔に実施例１
で作製した免疫原を含むアジュバントエマルシロンを１
００μＬずつ注射した。
で作製した免疫原を含むアジュバントエマルシロンを１
００μＬずつ注射した。
（Ｂ）抗体産生のチエツク
免疫注射後、２８日を経過したマウスについて、眼静脈
より５０〜１００μＬの血液を遠心管に採取した。
より５０〜１００μＬの血液を遠心管に採取した。
血清を遠心分離し、ＥＬＩＳＡ法（後出）によるスクリ
ーニングを行ったところ、全てのマウスについて抗テト
ラヒドロカンナビノール抗体の産生が確認された。
ーニングを行ったところ、全てのマウスについて抗テト
ラヒドロカンナビノール抗体の産生が確認された。
（Ｃ）マウスのブースト
（Ｂ）項のスクリーニングで特にタイターの高かった２
匹のマウスについてマウスの脾臓を肥大させるためにブ
ースト（弱い免疫原の注射）を行った。免疫原はＴＨＣ
−ＢＳＡをＰＢＳで希釈して得たｌｌｌ１ｇ／ｍＬ溶液
を、アジュバントを加えずにそのまま用いた。免疫後２
９日を経過した時点でこの免疫原を１００μＬ注射した
（ｉ．ｐ．）。
匹のマウスについてマウスの脾臓を肥大させるためにブ
ースト（弱い免疫原の注射）を行った。免疫原はＴＨＣ
−ＢＳＡをＰＢＳで希釈して得たｌｌｌ１ｇ／ｍＬ溶液
を、アジュバントを加えずにそのまま用いた。免疫後２
９日を経過した時点でこの免疫原を１００μＬ注射した
（ｉ．ｐ．）。
（Ｄ）細胞融合
ブースト後３日を経過したマウスの膵臓細胞を摘出し、
平均分子量１ 、５００のポリエチレングリコールを用
いた常法により、マウス骨髄腫由来細胞ライン（ Ｐ３
ＸＢ３−Ａｇ８．Ｇ５３）と融合した。フィーダー（成
長因子を供給する細胞）として同じマウスの婢臓細胞を
用い、９６ウ工ルプレート２枚の上で１０％のウシ胎児
血清を含むＨＡＴ培地で培養した。１週間後、１５％の
ウシ胎児血清を含むＩＴ培地と交換した。
平均分子量１ 、５００のポリエチレングリコールを用
いた常法により、マウス骨髄腫由来細胞ライン（ Ｐ３
ＸＢ３−Ａｇ８．Ｇ５３）と融合した。フィーダー（成
長因子を供給する細胞）として同じマウスの婢臓細胞を
用い、９６ウ工ルプレート２枚の上で１０％のウシ胎児
血清を含むＨＡＴ培地で培養した。１週間後、１５％の
ウシ胎児血清を含むＩＴ培地と交換した。
（Ｅ）クローニング
ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを行い、タイターの
高いものから上位１２ウエルを選択した。ウェルあたり
１ケの細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）Ｌ、９８
ウエルのマイクロプレート１２枚に分注した。フィーダ
ーとして生後５週のマウス（Ｂａ１ｂ／ｃ）の胸腺細胞
を用いて初期増殖を促した。
高いものから上位１２ウエルを選択した。ウェルあたり
１ケの細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）Ｌ、９８
ウエルのマイクロプレート１２枚に分注した。フィーダ
ーとして生後５週のマウス（Ｂａ１ｂ／ｃ）の胸腺細胞
を用いて初期増殖を促した。
プレートのサイズを上げながら培養を進め、適時上清に
ついてＥＬＩＳＡによるスクリーニングを繰り返し、Ｔ
ＨＣに対して高いタイターを示し、かつ良好な増殖を示
している細胞ラインを最終的に選別し、２００１中で５
ｘｌＧ５ケ／ｍＬの濃度に至るまで培養を進めた。
ついてＥＬＩＳＡによるスクリーニングを繰り返し、Ｔ
ＨＣに対して高いタイターを示し、かつ良好な増殖を示
している細胞ラインを最終的に選別し、２００１中で５
ｘｌＧ５ケ／ｍＬの濃度に至るまで培養を進めた。
（Ｆ）最終的に選別された細胞ラインは、上清を遠心分
離し、５Ｘ １０Ｂ／ｍＬ（７）濃度テＦＣＳ ： Ｄ
ＭＳＯ：９ ： １ ノ溶液１ｍＬに浮遊させ、−８０
℃で凍結した後、液体窒素内に移して長期保存状態にし
た。
離し、５Ｘ １０Ｂ／ｍＬ（７）濃度テＦＣＳ ： Ｄ
ＭＳＯ：９ ： １ ノ溶液１ｍＬに浮遊させ、−８０
℃で凍結した後、液体窒素内に移して長期保存状態にし
た。
（Ｇ）プロティンＡ結合ゲル（ファルマシア製Ｐｒｏｔ
ｅ１ｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ）を用い
たアフィニティークロマトグラフィにより細胞培養上清
からモノクローナル抗体を精製した。このモノクローナ
ル抗体はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により
、標準蛋白との比較から、精製抗体は分子量的５０，０
００の■鎖と約２ｏ、ｏｏｊのＬ鎖からなるＩｇＧであ
ることを確認した。
ｅ１ｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ）を用い
たアフィニティークロマトグラフィにより細胞培養上清
からモノクローナル抗体を精製した。このモノクローナ
ル抗体はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により
、標準蛋白との比較から、精製抗体は分子量的５０，０
００の■鎖と約２ｏ、ｏｏｊのＬ鎖からなるＩｇＧであ
ることを確認した。
なお本実施例では、八〇−ＴＨＣを用いた免疫原を使用
したが、これはΔ８−ＴＨＣおよびテトラヒドロカンナ
ビノールの誘導体例えば１１−ヒドロキシ−Δ９−テト
ラヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシ−へ８−テ
トラヒドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−△９−
テトラヒドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−へ８
−テトラヒドロカンナビ ノール、カンナビノール、カ
ンナビジオール、カンナビジオール酸、カンナビジクロ
ール、カンナビクロメエン、８α−ヒドロキシ−へキサ
ヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシカンナピノー
ル、カンナビノール−１１−アルデヒドアセテートおよ
び８−アセトキシ−９−ヒドロキシ−へキサヒドロカン
ナビノールを用いた免疫原としてもよい。この場合も同
様にモノクローナル抗体産生細胞ラインが作製できる。
したが、これはΔ８−ＴＨＣおよびテトラヒドロカンナ
ビノールの誘導体例えば１１−ヒドロキシ−Δ９−テト
ラヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシ−へ８−テ
トラヒドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−△９−
テトラヒドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−へ８
−テトラヒドロカンナビ ノール、カンナビノール、カ
ンナビジオール、カンナビジオール酸、カンナビジクロ
ール、カンナビクロメエン、８α−ヒドロキシ−へキサ
ヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシカンナピノー
ル、カンナビノール−１１−アルデヒドアセテートおよ
び８−アセトキシ−９−ヒドロキシ−へキサヒドロカン
ナビノールを用いた免疫原としてもよい。この場合も同
様にモノクローナル抗体産生細胞ラインが作製できる。
挽班方基
１．２を用いて作製したモノクローナル抗体を用いたＴ
ＨＣおよびＴＨＣ誘導体の検出方法について、その操作
法を以下に記載する。
ＨＣおよびＴＨＣ誘導体の検出方法について、その操作
法を以下に記載する。
（Ａ）抗原のコーティング
Δ９−ＴＨＣ−ＢＳＡと同様の合成法によって得た、ス
カシ貝由来のヘモシアニン（ＫＬＨ） １分子あたすＴ
Ｈｃが６分子量合したコンジュゲート（ＴＨＣ−ＫＬＨ
）を１％ＫＬＨおよび０．０４％のアジ化ナトリウムを
含むリン酸緩衝すリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆ
ｅｒｅｄ Ｓａ■ｎｅ （ＰＢＳ） ）で希釈して（Ｋ
ＬＨ・ＰＢＳ−Ａｚ） ＫＬＨの濃度として０．１ｍｇ
／ｍＬの抗原溶液を調製した。
カシ貝由来のヘモシアニン（ＫＬＨ） １分子あたすＴ
Ｈｃが６分子量合したコンジュゲート（ＴＨＣ−ＫＬＨ
）を１％ＫＬＨおよび０．０４％のアジ化ナトリウムを
含むリン酸緩衝すリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆ
ｅｒｅｄ Ｓａ■ｎｅ （ＰＢＳ） ）で希釈して（Ｋ
ＬＨ・ＰＢＳ−Ａｚ） ＫＬＨの濃度として０．１ｍｇ
／ｍＬの抗原溶液を調製した。
マイクロプレート（塩化ビニル製８Ｂウエルプレート
コスタ−社製）に抗原溶液を１００μＬ／ウエル注入し
、２０℃で１夜保存した。アスピレータで抗原溶液を除
去した後、ＰＢＳで３回洗浄し、アスピレータで残存す
るＰＢＳを除去した。
コスタ−社製）に抗原溶液を１００μＬ／ウエル注入し
、２０℃で１夜保存した。アスピレータで抗原溶液を除
去した後、ＰＢＳで３回洗浄し、アスピレータで残存す
るＰＢＳを除去した。
（Ｂ）ブロッキング
ＫＬＨ・ＰＢＳ−ＡＺを２５０μＬ／ウエル注入し、１
時間室温で放置した。その後、アスピレータでＫＬＨ・
ＰＢＳ−Ａｚを除去した。即日に以降の実験を行わない
ときは、この状態で、水で湿したろ紙と共に４℃で保存
した。
時間室温で放置した。その後、アスピレータでＫＬＨ・
ＰＢＳ−Ａｚを除去した。即日に以降の実験を行わない
ときは、この状態で、水で湿したろ紙と共に４℃で保存
した。
（Ｃ）抗体の反応
ＫＬＨ−ＰＢＳ−Ａｚで適時希釈した抗体（血清、培養
上清、精製抗体等）１００μＬ／ウエルを注入した。イ
ンヒビシドンの実験を行うときはインヒビタ溶液５０μ
Ｌ／ウエルを注入し、振とうしながら抗体溶液５０μＬ
／ウエルをさらに加えた。常温で３時間保存した後、ア
スピレータで抗体溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、
アスピレータで残存するＰＢＳを除去した。
上清、精製抗体等）１００μＬ／ウエルを注入した。イ
ンヒビシドンの実験を行うときはインヒビタ溶液５０μ
Ｌ／ウエルを注入し、振とうしながら抗体溶液５０μＬ
／ウエルをさらに加えた。常温で３時間保存した後、ア
スピレータで抗体溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、
アスピレータで残存するＰＢＳを除去した。
（Ｄ）第２抗体の反応
０．２μｇ／ｍＬのヤギ由来ペルオキシダーゼ標識抗マ
ウスＩｇＧ抗体（ＫＰＬ Ｃａｔ、１４１８０Ｂ ｌｏ
ｔ、 ＨＬＩＯ−５）を１％ＫＬＨのＰＢＳ溶液に溶解
したもの（第２抗体溶液）５０μＬ／ウエル注入し、常
温で３０分放置した。アスピレータで第２抗体溶液を除
去し、ＰＢＳで３回洗浄し、さらにアスピレータで残存
するＰＢＳを除去した。
ウスＩｇＧ抗体（ＫＰＬ Ｃａｔ、１４１８０Ｂ ｌｏ
ｔ、 ＨＬＩＯ−５）を１％ＫＬＨのＰＢＳ溶液に溶解
したもの（第２抗体溶液）５０μＬ／ウエル注入し、常
温で３０分放置した。アスピレータで第２抗体溶液を除
去し、ＰＢＳで３回洗浄し、さらにアスピレータで残存
するＰＢＳを除去した。
（Ｅ）基質の反応と停止
０−フェニレンジアミン（生化学用） ４０ｍｇを１０
ｍＬのクエン酸−リン酸バッファー（ｐＨ５）に溶解し
、使用直前に３０％過酸化水素水４μＬを加えた溶液（
基質溶液）を１００μＬ／ウエル注入し、室温放置した
。
ｍＬのクエン酸−リン酸バッファー（ｐＨ５）に溶解し
、使用直前に３０％過酸化水素水４μＬを加えた溶液（
基質溶液）を１００μＬ／ウエル注入し、室温放置した
。
１０分後、４Ｎ硫酸を２５μＬ／ウエル注入して反応を
停止した。
停止した。
（Ｆ）測定
東洋ソーダマイクロプレートリーダを用いて４９２ｎｍ
以上の吸光度を測定した。通常第１列は純水を注入して
参照値とし、適時（Ｃ）項のみを省いたブランク値を使
用した。
以上の吸光度を測定した。通常第１列は純水を注入して
参照値とし、適時（Ｃ）項のみを省いたブランク値を使
用した。
以上の方法によって、各濃度のＴＨＣを検出した例を図
に示す。図において、縦軸は吸光度、横軸はＴＨＣ濃度
（Ｍ）対数に−１を乗じた値である。
に示す。図において、縦軸は吸光度、横軸はＴＨＣ濃度
（Ｍ）対数に−１を乗じた値である。
この検出方法では、インヒビシロン法を用いているので
、ＴＨＣの濃度が高くなるほど吸光度が下がる。図に示
しているように本条件において、ｌｏ−７・６ＭのＴＨ
Ｃを検出することができた。なお、モノクローナル抗体
は、通常免疫原と類似の構造を有している物質にたいし
てもアフィニティーを示すことが知られている。したが
って、実施例１に示したようにΔ９−ＴＩ［Ｃを用いて
免疫をおこなったモノクローナル抗体を用いてもＴＨＣ
の誘導体を、やや感度が低下するものの、検出すること
ができる。以下、八８−ＴＨＣおよびテトラヒドロカン
ナビノールの誘導体について本実施例と同様の方法で検
出を行ったときの相対感度を以下に列挙する。
、ＴＨＣの濃度が高くなるほど吸光度が下がる。図に示
しているように本条件において、ｌｏ−７・６ＭのＴＨ
Ｃを検出することができた。なお、モノクローナル抗体
は、通常免疫原と類似の構造を有している物質にたいし
てもアフィニティーを示すことが知られている。したが
って、実施例１に示したようにΔ９−ＴＩ［Ｃを用いて
免疫をおこなったモノクローナル抗体を用いてもＴＨＣ
の誘導体を、やや感度が低下するものの、検出すること
ができる。以下、八８−ＴＨＣおよびテトラヒドロカン
ナビノールの誘導体について本実施例と同様の方法で検
出を行ったときの相対感度を以下に列挙する。
ここで相対感度はΔ９−ＴＨＣの最低検出濃度を１とし
たときの各物質の最低検出濃度を示し、従って数が高く
なるほど低感度である。
たときの各物質の最低検出濃度を示し、従って数が高く
なるほど低感度である。
ΔＢ−ＴＨＣ８
１１−ヒト°ロキシーΔ９−テトラヒト°ロカンナピノ
ール、 ６０１１−ヒト°ロキシーへ８−
テトラヒト°ロカンナビノール、 ７５８
β−ヒト°ロキ汁△９−テトラヒト°ロカンナビノール
、 ６２８β−ヒト０キ汁Δ８−テトラヒド
ロカンナビノール、 ８８カンナビノール、
３３カンナビジオール、
２８カンナビジオ
ール酸、
２８カンナピシクトル、
４２カンナピクロ
メエン、
４５８α−ヒドロキシーヘキ号七ト°ロカ
ンナビノール、 ６６１１−ヒト°
Ｕキシカンナビノール、
２６カンナピノート１１−アルテ゛ヒト°
アセテート １５０８−アセトキシ
−９−ヒト°Ｕキシーヘキ号ヒドロカンナビノール発明
の効果 本発明によれば、テトラヒドロカンナビノールあるいは
テトラヒドロカンナビノールの誘導体に対して高いアフ
ィニティーを有するモノクローナル抗体を提供すること
が可能になる。
ール、 ６０１１−ヒト°ロキシーへ８−
テトラヒト°ロカンナビノール、 ７５８
β−ヒト°ロキ汁△９−テトラヒト°ロカンナビノール
、 ６２８β−ヒト０キ汁Δ８−テトラヒド
ロカンナビノール、 ８８カンナビノール、
３３カンナビジオール、
２８カンナビジオ
ール酸、
２８カンナピシクトル、
４２カンナピクロ
メエン、
４５８α−ヒドロキシーヘキ号七ト°ロカ
ンナビノール、 ６６１１−ヒト°
Ｕキシカンナビノール、
２６カンナピノート１１−アルテ゛ヒト°
アセテート １５０８−アセトキシ
−９−ヒト°Ｕキシーヘキ号ヒドロカンナビノール発明
の効果 本発明によれば、テトラヒドロカンナビノールあるいは
テトラヒドロカンナビノールの誘導体に対して高いアフ
ィニティーを有するモノクローナル抗体を提供すること
が可能になる。
図は本発明の一実施例におけるモノクローナル抗体を用
いて、ＥＬＩＳＡ法によってＴＨＣを検出した際の結果
を示すグラフである。 代理人の氏名 弁理士 粟野重孝 ほか１名ｌ ￥ １
いて、ＥＬＩＳＡ法によってＴＨＣを検出した際の結果
を示すグラフである。 代理人の氏名 弁理士 粟野重孝 ほか１名ｌ ￥ １
Claims (4)
- （１）テトラヒドロカンナビノールまたはテトラヒドロ
カンナビノールの誘導体と、ウシ血清アルブミンの結合
物質からなる免疫原で感作されマウスの脾臓細胞と、骨
髄腫由来の細胞ラインとを融合後、クローニングして得
られ、培養上清中に産生されるイムノグロブリンが、テ
トラヒドロカンナビノールまたはテトラヒドロカンナビ
ノールの誘導体に特異的に結合することを特徴とするモ
ノクローナル抗体産生細胞ライン。 - （２）免疫原が、ヒト結核死菌を含むフロインドの完全
アジュバントの混合物からなることを特徴とする特許請
求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体産生細胞ライ
ン。 - （３）骨髄腫由来の細胞ラインがＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．
６５３であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載のモノクローナル抗体産生細胞ライン。 - （４）特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体
産生細胞ラインの培養上清を精製して得られるイムノグ
ロブリンであって、テトラヒドロカンナビノールまたは
テトラヒドロカンナビノールの誘導体に特異的に結合す
ることを特徴とするモノクローナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63207642A JPH0257177A (ja) | 1988-08-22 | 1988-08-22 | モノクローナル抗体産生細胞ラインおよびモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63207642A JPH0257177A (ja) | 1988-08-22 | 1988-08-22 | モノクローナル抗体産生細胞ラインおよびモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0257177A true JPH0257177A (ja) | 1990-02-26 |
Family
ID=16543161
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63207642A Pending JPH0257177A (ja) | 1988-08-22 | 1988-08-22 | モノクローナル抗体産生細胞ラインおよびモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0257177A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006029089A3 (en) * | 2004-09-03 | 2007-05-24 | Oakville Hong Kong Company Ltd | Tetrahydrocannabinoid- protein conjugates for the production of antibodies for the detection of tεtrahydrocannabinoid components in saliva |
| CN108690129A (zh) * | 2017-04-11 | 2018-10-23 | 艾博生物医药(杭州)有限公司 | 一种大麻抗原及制备方法 |
| EP3724657A4 (en) * | 2017-12-15 | 2021-12-29 | Bomi, Llc | Anti-cannabidiol antibody and uses thereof |
| CN114839367A (zh) * | 2022-04-25 | 2022-08-02 | 西南林业大学 | 一种大麻素单克隆抗体的制备及其应用 |
-
1988
- 1988-08-22 JP JP63207642A patent/JPH0257177A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006029089A3 (en) * | 2004-09-03 | 2007-05-24 | Oakville Hong Kong Company Ltd | Tetrahydrocannabinoid- protein conjugates for the production of antibodies for the detection of tεtrahydrocannabinoid components in saliva |
| CN108690129A (zh) * | 2017-04-11 | 2018-10-23 | 艾博生物医药(杭州)有限公司 | 一种大麻抗原及制备方法 |
| EP3724657A4 (en) * | 2017-12-15 | 2021-12-29 | Bomi, Llc | Anti-cannabidiol antibody and uses thereof |
| CN114839367A (zh) * | 2022-04-25 | 2022-08-02 | 西南林业大学 | 一种大麻素单克隆抗体的制备及其应用 |
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