JPH0346562A - 免疫方法および免疫測定方法 - Google Patents
免疫方法および免疫測定方法Info
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- JPH0346562A JPH0346562A JP1182920A JP18292089A JPH0346562A JP H0346562 A JPH0346562 A JP H0346562A JP 1182920 A JP1182920 A JP 1182920A JP 18292089 A JP18292089 A JP 18292089A JP H0346562 A JPH0346562 A JP H0346562A
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- Japan
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- tetrahydrocannabinol
- hydroxy
- analogs
- immunization method
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明（ｉ、モノクローナル抗体及び抗血清等の作製の
ための免疫方法 この方法によって作製された抗体およ
びこの抗体の抗原に対する結合能を測定する免疫測定方
法 さらにこのモノクローナル抗体を用いた検出方法に
関するものである。
ための免疫方法 この方法によって作製された抗体およ
びこの抗体の抗原に対する結合能を測定する免疫測定方
法 さらにこのモノクローナル抗体を用いた検出方法に
関するものである。
従来の技術
特定の物質（抗原）に特異的に結合する抗体は抗原を動
物に注射することによって作られる。抗原が分子量致方
の蛋白質等の場合は抗原をそのまま注射できる力交 低
分子（ハプテン）の場合は適当な蛋白質にこれを結合し
疑似的に分子量を高くした免疫原を注射する必要があ
り、例えば テトラヒドロカンナビノールあるいはテト
ラヒドロカンナビノール類似体に対する抗体もこのよう
な方法を用いてＪ、Ｄ、ティール、エル上１ネ Ｊ、７
オアマン、Ｌ、Ｊ、キンク０、エヘゝリンＭ、ビアル及
び■、マークスらによって作製されている（Ｊ、Ｄ、Ｔ
ｅａｌｅ、 Ｅｌｖｙｎｅ Ｊ、Ｆｏｒｍａｎ、 Ｌ、
Ｊ、Ｋｉｎｇ。
物に注射することによって作られる。抗原が分子量致方
の蛋白質等の場合は抗原をそのまま注射できる力交 低
分子（ハプテン）の場合は適当な蛋白質にこれを結合し
疑似的に分子量を高くした免疫原を注射する必要があ
り、例えば テトラヒドロカンナビノールあるいはテト
ラヒドロカンナビノール類似体に対する抗体もこのよう
な方法を用いてＪ、Ｄ、ティール、エル上１ネ Ｊ、７
オアマン、Ｌ、Ｊ、キンク０、エヘゝリンＭ、ビアル及
び■、マークスらによって作製されている（Ｊ、Ｄ、Ｔ
ｅａｌｅ、 Ｅｌｖｙｎｅ Ｊ、Ｆｏｒｍａｎ、 Ｌ、
Ｊ、Ｋｉｎｇ。
Ｅｖｅｌｙｎ Ｍ、Ｐｉａｌｌ ａｎｄ ＶｏＭａｒｋ
ｓ、Ｊ、Ｐｈａｒｍ、Ｐｈａｒｍａｃ、。
ｓ、Ｊ、Ｐｈａｒｍ、Ｐｈａｒｍａｃ、。
（１９７５） ２７，４６５−４７２）。しかしなが転
報告されている抗体は免疫した羊の血液を精製して得
られるポリクローナル抗体である。また 作製した抗゛
体の評価（よ 放射性元素で標識した抗原を用いた免疫
測定法が使用されている。
報告されている抗体は免疫した羊の血液を精製して得
られるポリクローナル抗体である。また 作製した抗゛
体の評価（よ 放射性元素で標識した抗原を用いた免疫
測定法が使用されている。
発明が解決しようとする課題
従来のポリクローナル抗体は ウサギ、羊等の比較的大
きな動物を免疫感作動物として使用しており、その血液
から得られるため全体の製造行程が簡単である長所を有
している反直 得られるポリクローナル抗体の特性が使
用する動物の各個体に依存するため再現性のある抗原結
合能を所持した抗体を取得することが困難である。
きな動物を免疫感作動物として使用しており、その血液
から得られるため全体の製造行程が簡単である長所を有
している反直 得られるポリクローナル抗体の特性が使
用する動物の各個体に依存するため再現性のある抗原結
合能を所持した抗体を取得することが困難である。
一方、作製した評価方法についても放射性元素を用いて
いるため安全性が問われる。
いるため安全性が問われる。
本発明ζよ このような従来技術の課題を解決すること
を目的とする。
を目的とする。
課題を解決するための手段
本発明（＆ テトラヒドロカンナビノールあるいはそ
の類似体に対する抗体作製のための免疫方法においてテ
トラヒドロカンナビノールあるいはその類似体にｐ−ア
ミノ安息香酸を結合することによりカルボキシル基を導
入した誘導体をタンパク質と共有結合したものを免疫原
とし 免疫感作動物としてＡ／Ｊ系統のマウスを用いる
ことを特徴とする免疫方法である。
の類似体に対する抗体作製のための免疫方法においてテ
トラヒドロカンナビノールあるいはその類似体にｐ−ア
ミノ安息香酸を結合することによりカルボキシル基を導
入した誘導体をタンパク質と共有結合したものを免疫原
とし 免疫感作動物としてＡ／Ｊ系統のマウスを用いる
ことを特徴とする免疫方法である。
すなわち、テトラヒドロカンナビノールあるいはテトラ
ヒドロカンナビノール類似体にｐ−アミノ安息香酸を結
合することによりカルボキシル基を導入した誘導体とタ
ンパク質（ＫＬＨ，ＣＧＧ）との結合体を免疫原として
免疫したマウス（Ａ／Ｊ系統）の脾臓細胞とマウス骨髄
腫由来細胞を融合し クローニングを行うことによって
テトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒドロカン
ナビノール類似体に対して高いアフィニティーを有する
モノクローナル抗体およびその抗体を産生ずるハイブリ
ドーマ細胞を作製できる。
ヒドロカンナビノール類似体にｐ−アミノ安息香酸を結
合することによりカルボキシル基を導入した誘導体とタ
ンパク質（ＫＬＨ，ＣＧＧ）との結合体を免疫原として
免疫したマウス（Ａ／Ｊ系統）の脾臓細胞とマウス骨髄
腫由来細胞を融合し クローニングを行うことによって
テトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒドロカン
ナビノール類似体に対して高いアフィニティーを有する
モノクローナル抗体およびその抗体を産生ずるハイブリ
ドーマ細胞を作製できる。
本発明において、目的抗原はテトラヒドロカンナビノー
ルあるいはテトラヒドロカンナビノール類似体であり、
これらの物質は何れも低分子であるた取 蛋白質等の高
分子に結合させることにより、初めて免疫原として作用
する。その際の蛋白質（よ 免疫応答性がよいものが望
ましい。この点で好適な蛋白質であるチキン由来のＴ−
グロブリン（ＣＧＧ）あるいはスカシ貝由来のヘモシア
ニン（ＫＬＨ）のいずれかを用いる。さらに テトラヒ
ドロカンナビノールあるいはテトラヒドロカンナビノー
ル類似体それぞれに特異的に結合する抗体を作製するた
めテトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒドロカ
ンナビノール類似体の構造（特にフェノール性ＯＨ基）
をなるべく保持した状態で免疫原を合成する。
ルあるいはテトラヒドロカンナビノール類似体であり、
これらの物質は何れも低分子であるた取 蛋白質等の高
分子に結合させることにより、初めて免疫原として作用
する。その際の蛋白質（よ 免疫応答性がよいものが望
ましい。この点で好適な蛋白質であるチキン由来のＴ−
グロブリン（ＣＧＧ）あるいはスカシ貝由来のヘモシア
ニン（ＫＬＨ）のいずれかを用いる。さらに テトラヒ
ドロカンナビノールあるいはテトラヒドロカンナビノー
ル類似体それぞれに特異的に結合する抗体を作製するた
めテトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒドロカ
ンナビノール類似体の構造（特にフェノール性ＯＨ基）
をなるべく保持した状態で免疫原を合成する。
また 免疫原で感作されるマウス（よ 高い力価の抗体
を産生ずるものが望ましい。この点において好適な系統
であるＡ／Ｊ系統のマウスを用いｔも一方、ハイブリド
ーマ細胞の選別あるいは作製した抗体の評価に（戴 固
相抗原としてテトラヒドロカンナビノールあるいはテト
ラヒドロカンナビノール類似体にカルボキシル基を導入
した誘導体と牛由来の血清アルブミン（ＢＳＡ）との結
合体を用いて酵素免疫測定法を行う。
を産生ずるものが望ましい。この点において好適な系統
であるＡ／Ｊ系統のマウスを用いｔも一方、ハイブリド
ーマ細胞の選別あるいは作製した抗体の評価に（戴 固
相抗原としてテトラヒドロカンナビノールあるいはテト
ラヒドロカンナビノール類似体にカルボキシル基を導入
した誘導体と牛由来の血清アルブミン（ＢＳＡ）との結
合体を用いて酵素免疫測定法を行う。
作用
免疫グロブリンを産生ずる細胞は脾臓内に蓄積される。
脾臓細胞はそれ自体増殖能力を持たないが骨髄腫細胞と
融合することによって増殖しながら抗体を産生ずるハイ
ブリドーマ細胞を作製することができる。もっとも優れ
たアフィニティーを有する抗体を産生し かつ高い増殖
能力を有するハイブリドーマ細胞１個を選択（クローニ
ング）し これを培養すると高アフィニティーのモノク
ローナル抗体が産生される。モノクローナル抗体は同一
種の抗体であるた数 高アフィニティーが得られる。ま
たハイブリドーマ細胞を培養することにより、永続的に
一定の特性のモノクローナル抗体を提供することができ
る。
融合することによって増殖しながら抗体を産生ずるハイ
ブリドーマ細胞を作製することができる。もっとも優れ
たアフィニティーを有する抗体を産生し かつ高い増殖
能力を有するハイブリドーマ細胞１個を選択（クローニ
ング）し これを培養すると高アフィニティーのモノク
ローナル抗体が産生される。モノクローナル抗体は同一
種の抗体であるた数 高アフィニティーが得られる。ま
たハイブリドーマ細胞を培養することにより、永続的に
一定の特性のモノクローナル抗体を提供することができ
る。
また 免疫原とタンパク質部分が異なった物を使用する
ことにより正確に目的抗原だけを認識する抗体およびそ
の抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を得ることができ
、かつ作製した抗体の評価もできる。
ことにより正確に目的抗原だけを認識する抗体およびそ
の抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を得ることができ
、かつ作製した抗体の評価もできる。
実施例
以下に 本発明の実施例について図面を参照しながら説
明する。
明する。
以下、本発明のテトラヒドロカンナビノールあるいはテ
トラヒドロカンナビノール類似体に対する抗体（抗血清
およびモノクローナル抗体）、そのモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマ細胞及び抗体の抗原（テトラヒドロ
カンナビノールあるいはテトラヒドロカンナビノール類
似体）に対する結合能を測定する免疫測定の実験方法を
順に記９− 載する。
トラヒドロカンナビノール類似体に対する抗体（抗血清
およびモノクローナル抗体）、そのモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマ細胞及び抗体の抗原（テトラヒドロ
カンナビノールあるいはテトラヒドロカンナビノール類
似体）に対する結合能を測定する免疫測定の実験方法を
順に記９− 載する。
１： 免疫原の作製
以下に免疫原の合成の実施例を示す。
（Ａ）テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）の単離大
麻樹脂１７．３ｇから石油エーテルで５．２ｇの威勢を
抽出し１． この威勢を溶媒としてジエチルエーテル
： ヘキサン−１＝４を用いたシリカゲルカラムの液体
クロマトグラフィーおよび溶媒としてメタノールを用い
た高速液体クロマトグラフィーにより６８０ｍｇのＴＨ
Ｃを単離した テトラヒドロカンナビノール（よ 二重
結合の位置の差によって△９−ＴＨＣ及び△８−ＴＨＣ
に分別されるバ ここで抽出されたＴＨＣは△９−ＴＨ
Ｃであることを確認した （Ｂ）テトラヒドロカンナビノール−２−ｐ−アゾ安息
香酸（ａｚ ｏＴＨＣ−ＣＯＯＨ）の台底（Ａ）項で単
離したＴＨＣを用いて Ｖ、 Ｋ、 マルチイーら
の報告に従って台底を行った まず、ｐ−アミノ安息香酸１５１ｍｇをＩＮＨＣ］１４
ｍ１に溶解し それに９２ｍｇ亜硝酸ナトリウムを徐々
に添加した １〇− 一方、３１２ｍｇのＴＨＣを１９ｍ１ＭｅＯＨに溶解Ｌ
ｌＮＮａＯＨでｐＨ１０〜ＩＬに調整した このＴ
ＨＣ溶液に先のｐ−アミノ安息香酸溶液をｐ）（約１０
に保持しながら添加した その後、 ＩＮＨｃＩでｐＨ
約２に調整した後ジクロロメタンにより抽出した溶液を
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にか１す、ａ
ｚｏＴＨＣ−ＣＯＯＨを精製しｔも （Ｃ）ＴＨＣ誘導体とＣＧＧの結合方法ａｚｏＴＨＣ−
Ｃ○ＯＨ４０ｍｇを溶媒（ピリジン：ジオキサン−１：
２） ３ｍｌに溶かし 撹はんしなから１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒ
ドロクロリド（１６，８ｍｇ／ １ｍ ｌリン酸バッフ
ァー（０，１Ｍ、 ＰＨ７））を徐々に加えた後３時間
撹はんしながら放置した ＣＧＧ溶液（３０ｍ ｌ、 ０．３４％）を４℃で撹
はんしながら先のａ ｚ ｏＴＨＣ−ＣＯＯＨ溶液を徐
々に加えさらに４℃で１晩撹はんした その後、変性し
た蛋白質を遠心分離（１９０００ｒｐｍ、４０ｍ１ｎ）
で除去した後、セファデックスＧ−２５（ファルマシア
製）でゲル濾１ 過Ｌ ２８０ｎｍの光に対して吸光を示す分画を分取
することによりａｚｏＴＨＣ−ＣＧＧを得１゜（Ｄ）ア
ジュバントエマルジョンの調製ａ ｚ ｏ ＴＨＣ−Ｃ
ＧＧをＰＢＳで希釈して、１ｍｇ／ｍ ］溶液６ｍｌと
した 完全フロイトアジュバント（和光純薬観Ｈ３７Ｒ
ｖ）あるいζよ 不完全フロイトアジュバント（和光純
薬製）をよく撹はんしながら各々６ｍｌ取り、それらを
ホモジナイザで撹はんしながら（１０，００Ｏｒｐｍ）
先に調整したａ ｚ ｏ ＴＨＣ−ＣＧＧ溶液を６ｍｌ
ずつ各々のアジュバントに加えた後十分にエマルジョン
化した なお本実施例で（よ △９−ＴＨＣを用いて免疫原を作
製したが、 これは△８−ＴＨＣおよびテトラヒドロカ
ンナビノール類似体例えば１１−ヒドロキシ−△９−テ
トラヒドロカンナピノーｊｌ、、１１−ヒドロキシ−△
８−テトラヒドロカンナビノール、 ８βヒドロキシ−
△９−テトラヒドロカンナビノール、 ８β−ヒドロキ
シ−△８−テトラヒドロカンナピノーに、 カンナビ
ノールｋ カンナビジオーツにカンナビジオール酸、カ
ンナビジクロール、カン２− ナビクロメン、 ８α−ヒドロキシ−ヘキサヒドロカン
ナビノールＬ／、 １１−ヒドロキシカンナビノール、
カンナビノール−１１−アルデヒド アセテートおよび
８−アセトキシ−９−ヒドロキシ−ヘキサヒドロカンナ
ビノールについてもまったく同様の合成方法を用いて、
抗体（抗血清、モノクローナル抗体）および抗体産生ハ
イブリドーマ細胞作製のための免疫原が作製できる。
麻樹脂１７．３ｇから石油エーテルで５．２ｇの威勢を
抽出し１． この威勢を溶媒としてジエチルエーテル
： ヘキサン−１＝４を用いたシリカゲルカラムの液体
クロマトグラフィーおよび溶媒としてメタノールを用い
た高速液体クロマトグラフィーにより６８０ｍｇのＴＨ
Ｃを単離した テトラヒドロカンナビノール（よ 二重
結合の位置の差によって△９−ＴＨＣ及び△８−ＴＨＣ
に分別されるバ ここで抽出されたＴＨＣは△９−ＴＨ
Ｃであることを確認した （Ｂ）テトラヒドロカンナビノール−２−ｐ−アゾ安息
香酸（ａｚ ｏＴＨＣ−ＣＯＯＨ）の台底（Ａ）項で単
離したＴＨＣを用いて Ｖ、 Ｋ、 マルチイーら
の報告に従って台底を行った まず、ｐ−アミノ安息香酸１５１ｍｇをＩＮＨＣ］１４
ｍ１に溶解し それに９２ｍｇ亜硝酸ナトリウムを徐々
に添加した １〇− 一方、３１２ｍｇのＴＨＣを１９ｍ１ＭｅＯＨに溶解Ｌ
ｌＮＮａＯＨでｐＨ１０〜ＩＬに調整した このＴ
ＨＣ溶液に先のｐ−アミノ安息香酸溶液をｐ）（約１０
に保持しながら添加した その後、 ＩＮＨｃＩでｐＨ
約２に調整した後ジクロロメタンにより抽出した溶液を
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にか１す、ａ
ｚｏＴＨＣ−ＣＯＯＨを精製しｔも （Ｃ）ＴＨＣ誘導体とＣＧＧの結合方法ａｚｏＴＨＣ−
Ｃ○ＯＨ４０ｍｇを溶媒（ピリジン：ジオキサン−１：
２） ３ｍｌに溶かし 撹はんしなから１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒ
ドロクロリド（１６，８ｍｇ／ １ｍ ｌリン酸バッフ
ァー（０，１Ｍ、 ＰＨ７））を徐々に加えた後３時間
撹はんしながら放置した ＣＧＧ溶液（３０ｍ ｌ、 ０．３４％）を４℃で撹
はんしながら先のａ ｚ ｏＴＨＣ−ＣＯＯＨ溶液を徐
々に加えさらに４℃で１晩撹はんした その後、変性し
た蛋白質を遠心分離（１９０００ｒｐｍ、４０ｍ１ｎ）
で除去した後、セファデックスＧ−２５（ファルマシア
製）でゲル濾１ 過Ｌ ２８０ｎｍの光に対して吸光を示す分画を分取
することによりａｚｏＴＨＣ−ＣＧＧを得１゜（Ｄ）ア
ジュバントエマルジョンの調製ａ ｚ ｏ ＴＨＣ−Ｃ
ＧＧをＰＢＳで希釈して、１ｍｇ／ｍ ］溶液６ｍｌと
した 完全フロイトアジュバント（和光純薬観Ｈ３７Ｒ
ｖ）あるいζよ 不完全フロイトアジュバント（和光純
薬製）をよく撹はんしながら各々６ｍｌ取り、それらを
ホモジナイザで撹はんしながら（１０，００Ｏｒｐｍ）
先に調整したａ ｚ ｏ ＴＨＣ−ＣＧＧ溶液を６ｍｌ
ずつ各々のアジュバントに加えた後十分にエマルジョン
化した なお本実施例で（よ △９−ＴＨＣを用いて免疫原を作
製したが、 これは△８−ＴＨＣおよびテトラヒドロカ
ンナビノール類似体例えば１１−ヒドロキシ−△９−テ
トラヒドロカンナピノーｊｌ、、１１−ヒドロキシ−△
８−テトラヒドロカンナビノール、 ８βヒドロキシ−
△９−テトラヒドロカンナビノール、 ８β−ヒドロキ
シ−△８−テトラヒドロカンナピノーに、 カンナビ
ノールｋ カンナビジオーツにカンナビジオール酸、カ
ンナビジクロール、カン２− ナビクロメン、 ８α−ヒドロキシ−ヘキサヒドロカン
ナビノールＬ／、 １１−ヒドロキシカンナビノール、
カンナビノール−１１−アルデヒド アセテートおよび
８−アセトキシ−９−ヒドロキシ−ヘキサヒドロカンナ
ビノールについてもまったく同様の合成方法を用いて、
抗体（抗血清、モノクローナル抗体）および抗体産生ハ
イブリドーマ細胞作製のための免疫原が作製できる。
２： モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞およ
びモノクローナル抗体の作製方法 以下、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞およ
びモノクローナル抗体の作製の実施例を示す。
びモノクローナル抗体の作製方法 以下、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞およ
びモノクローナル抗体の作製の実施例を示す。
（Ａ）マウスの免疫
生後約８週日のマウス（Ａ／Ｊ） １０匹の腹腔に実
施例１で作製した免疫原を含む完全フロイトアジュバン
トエマルジョンを１００μｍずつ注射しｔ、 ２１日
後に今度は免疫原を含む不完全フロイトアジュバントを
１００μｍずつ注射した （Ｂ）抗体産生のチエツク ３− 免疫原を含む不完全フロイトアジュバントで免疫注射後
、 ７日を経過したマウスについて、眼静脈より５０〜
１００μｌの血液を遠心管に採取したその血液を３７℃
の恒温槽でｌＯ分間放置後遠心分離し 血清を得ｔも
その血清についてＥＩＩＳＡ法（後出）によるスクリ
ーニングを行ったところ抗テトラヒドロカンナビノール
抗体の産生を確認した （Ｃ）マウスのブースト （Ｂ）項のスクリーニングで特にタイターの高かった２
匹のマウスについてマウスの脾臓を肥大させるためにブ
ーストを行った 免疫原はａｚｏＴＨＣＣＧＧをＰＢＳ
で希釈して得た１ｍｇ／ｍ］溶液を用いて１００μｌず
つ注射した （Ｄ）細胞融合 ブーストして３日後マウスの脾臓細胞を摘出し平均分子
量１．５００のポリエチレングリコールを用いた公知の
方法により、マウス骨髄腫由来細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ
８．６５３）と融合しｔ−ｏ フィーダー細胞として
同じマウスの脾臓細胞を用ＬＮ、９６ウエルプレート４
− ２枚の上で１０％のウシ胎児血清゛を合むＨＡＴ培地で
培養しｔも１週間後、１５％のウシ胎児血清を含むＨＴ
培地と交換した （Ｅ）クローニング ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを行１．Ｘ、力価の
高いものから上位１２ウエルを選択した ウェルあたり
１ケの細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）ｌＡ ９
６ウエルのマイクロプレート１２枚に分注し１． フ
ィーダー細胞として生後５週のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）
の胸腺細胞を用いて初期増殖を促したプレートのサイズ
を上げながら培養を進取 適時上清についてＥＬＩＳＡ
法によるスクリーニングを繰り返ＬＴＨＣに対して高い
タイターを示し かつ良好な増殖を示しているハイブリ
ドーマ細胞を最終的に選別Ｌ２００ｍｌ中で５ｘｌＯ’
ケ／＋ｎｌの濃度に至るまで培養し氾 （Ｆ）ハイブリドーマ細胞の保存 最終的に選別されたハイブリドーマ細胞５Ｘ１０’をＦ
ｅ２：ＤＭＳＯ＝９：１の溶液１ｍｌに懸濁Ｌ−１３５
℃で凍結保存しｔも ５− （Ｇ）モノクローナル抗体の精製 プロティンＡ結合ゲル（ファルマシア製Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ）を用いたアフ
ィニティークロマトグラフィにより細胞培養上清からモ
ノクローナル抗体を精製した このモノクローナル抗体
はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分子量
が約５０．０００のＨ鎖と約２５．０００のＬ鎖からな
るＩｇＧであることを確認しｔも なお本実施例で（よ △９−ＴＨＣを用いた免疫原を使
用したが、 これは△８−ＴＨＣあるいはテトラヒドロ
カンナビノール類似体例えば１１−ヒドロキシ△９−テ
トラヒドロカンナビノーノＩｔ／Ｓ １１−ヒドロキシ
−△８−テトラヒドロカンナビノーノに８β−ヒドロキ
シ−△９−テトラヒドロカンナビノーノＩ／、８β−ヒ
ドロキシ−△８−テトラヒドロカンナピノー／ｌｚ、
カンナビシクロｋ カンナビジオー／ｌｚ、 カン
ナビジオール酸 カンナビシクロ−／ｌｚ。
施例１で作製した免疫原を含む完全フロイトアジュバン
トエマルジョンを１００μｍずつ注射しｔ、 ２１日
後に今度は免疫原を含む不完全フロイトアジュバントを
１００μｍずつ注射した （Ｂ）抗体産生のチエツク ３− 免疫原を含む不完全フロイトアジュバントで免疫注射後
、 ７日を経過したマウスについて、眼静脈より５０〜
１００μｌの血液を遠心管に採取したその血液を３７℃
の恒温槽でｌＯ分間放置後遠心分離し 血清を得ｔも
その血清についてＥＩＩＳＡ法（後出）によるスクリ
ーニングを行ったところ抗テトラヒドロカンナビノール
抗体の産生を確認した （Ｃ）マウスのブースト （Ｂ）項のスクリーニングで特にタイターの高かった２
匹のマウスについてマウスの脾臓を肥大させるためにブ
ーストを行った 免疫原はａｚｏＴＨＣＣＧＧをＰＢＳ
で希釈して得た１ｍｇ／ｍ］溶液を用いて１００μｌず
つ注射した （Ｄ）細胞融合 ブーストして３日後マウスの脾臓細胞を摘出し平均分子
量１．５００のポリエチレングリコールを用いた公知の
方法により、マウス骨髄腫由来細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ
８．６５３）と融合しｔ−ｏ フィーダー細胞として
同じマウスの脾臓細胞を用ＬＮ、９６ウエルプレート４
− ２枚の上で１０％のウシ胎児血清゛を合むＨＡＴ培地で
培養しｔも１週間後、１５％のウシ胎児血清を含むＨＴ
培地と交換した （Ｅ）クローニング ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを行１．Ｘ、力価の
高いものから上位１２ウエルを選択した ウェルあたり
１ケの細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）ｌＡ ９
６ウエルのマイクロプレート１２枚に分注し１． フ
ィーダー細胞として生後５週のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）
の胸腺細胞を用いて初期増殖を促したプレートのサイズ
を上げながら培養を進取 適時上清についてＥＬＩＳＡ
法によるスクリーニングを繰り返ＬＴＨＣに対して高い
タイターを示し かつ良好な増殖を示しているハイブリ
ドーマ細胞を最終的に選別Ｌ２００ｍｌ中で５ｘｌＯ’
ケ／＋ｎｌの濃度に至るまで培養し氾 （Ｆ）ハイブリドーマ細胞の保存 最終的に選別されたハイブリドーマ細胞５Ｘ１０’をＦ
ｅ２：ＤＭＳＯ＝９：１の溶液１ｍｌに懸濁Ｌ−１３５
℃で凍結保存しｔも ５− （Ｇ）モノクローナル抗体の精製 プロティンＡ結合ゲル（ファルマシア製Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ）を用いたアフ
ィニティークロマトグラフィにより細胞培養上清からモ
ノクローナル抗体を精製した このモノクローナル抗体
はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分子量
が約５０．０００のＨ鎖と約２５．０００のＬ鎖からな
るＩｇＧであることを確認しｔも なお本実施例で（よ △９−ＴＨＣを用いた免疫原を使
用したが、 これは△８−ＴＨＣあるいはテトラヒドロ
カンナビノール類似体例えば１１−ヒドロキシ△９−テ
トラヒドロカンナビノーノＩｔ／Ｓ １１−ヒドロキシ
−△８−テトラヒドロカンナビノーノに８β−ヒドロキ
シ−△９−テトラヒドロカンナビノーノＩ／、８β−ヒ
ドロキシ−△８−テトラヒドロカンナピノー／ｌｚ、
カンナビシクロｋ カンナビジオー／ｌｚ、 カン
ナビジオール酸 カンナビシクロ−／ｌｚ。
カンナビシロメン、 ８α−ヒドロキシ−ヘキサヒドロ
カンナビノールｌ／、 １１−ヒドロキシカンナビノー
ノｋ カンナビノール−１１−アルデヒド ア６− セテートおよび８−アセトキシ−９−ヒドロキシへキサ
ヒドロカンナビノールを用いた免疫原も使用でき、それ
らの場合も同様にモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マ細胞が作製できる。
カンナビノールｌ／、 １１−ヒドロキシカンナビノー
ノｋ カンナビノール−１１−アルデヒド ア６− セテートおよび８−アセトキシ−９−ヒドロキシへキサ
ヒドロカンナビノールを用いた免疫原も使用でき、それ
らの場合も同様にモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マ細胞が作製できる。
３： 免疫測定方法
１．２により作製した抗体（抗血清、モノクローナル抗
体）の評価あるいは抗体産生ハイブリドーマ細胞のスク
リーニングさらにはＴＨＣあるいはＴＨＣ類似体を検出
方法について以下に記載する。
体）の評価あるいは抗体産生ハイブリドーマ細胞のスク
リーニングさらにはＴＨＣあるいはＴＨＣ類似体を検出
方法について以下に記載する。
（Ａ）固相抗原の合成
ａ ｚ ｏＴＨＣ−ＣＯＯＨ４０ｍｇを溶媒（ピリジン
：ジオキサン−１： ２） ３ｍｌに溶かし 撹はんし
なからｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミドヒドロクロライド（１６，８ｍｇ／
１ｍｌリン酸バッファー（０，１Ｍ、 ＰＨ７））を角
丸 さらに３時間撹はん放置した ＢＳＡ溶液（３０＋ｎ ｌ、 １０ｍｇ／ｍｌ）を４
℃で撹はんしながら先のａｚＯＴＨＣ−ＣＯＯＨ溶液を
徐々に角丸 さらに４℃でｌ晩撹はんを続けた その恢
＝１７− 変性した蛋白質を遠心分離（１９０００ｒｐｍ、４０ｍ
１ｎ）で除去した後、セファデックスＧ−２５（ファル
マシア製）でゲル濾過ＬＡ２８Ｏｒ＋＋＋＋の波長光に
対して吸光を示す分画を分取することによりａ ｚ ｏ
ＴＨＣ−Ｂ Ｓ Ａを得た （Ｂ）固相抗原のコーティング 合成したａ ｚ ｏ ＴＨＣ−ＢＳＡを１％ＢＳＡおよ
び０．０４％のアジ化ナトリウムを含むＰｈｏｓｐｈａ
ｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ ５ａｌｉｎｅ （ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳ−Ａｚ）で希釈してａｚｏＴＨＣ−ＢＳＡの濃度が
００１ｍｇ／ｍ Ｉになるように調製し氾マイクロプレ
ート（ポリスチレン製９６ウエルプレート Ｃ０３ＴＡ
Ｒ社製）にこの抗原溶液を１００μｍ／ウェル注入ＬＡ
２０℃で１夜放置した （Ｃ）ブロッキング アスピレータで抗原溶液を吸引除去した後、ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳ−Ａｚを２５０μｌ／ウエル注入Ｌ １時間室温で
放置し１． その後、ＰＢＳで３回洗浄し アスピレ
ータで残存液を吸引除去し１゜ （Ｄ）抗体の反応 抗血？敵 培養上清、精製抗体あるいはモノクロ８− −ナル抗体の評価を行うときｌｉ ＢＳＡ−ＰＢＳ−
Ａｚで適時希釈した溶液（抗血清、培養上ｔｉ 精製
抗体モノクローナル抗体）１００μｍ／ウェルを注入し
たテトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒドロカ
ンナビノール類似体の検出すなわちインヒビジョンの実
験を行うときはインヒビタ溶液（テトラヒドロカンナビ
ノールあるいはテトラヒドロカンナビノール類似体）５
０μｌ／ウエルを注入し さらにモノクローナル抗体溶
液５０μｌ／ウエルを加えた 常温で３時間保存した後
、アスピレータで抗体溶液を除去Ｌ ＰＢＳで３回洗
浄し アスピレータで残存するＰＢＳを除去した （Ｅ）第２抗体の反応 ０．２μｇ／ｍｌヤギ由来のペルオキシダーゼ標識抗マ
ウス■ｇＧ抗体（ＫＰＬ Ｃａｔ、１４１８０６ ｌｏ
ｔ、 ＨＬＩＯ−５）を含むＢＳＡ −ＰＢＳ溶液（第
２抗体溶液）を２５μｍ／ウェル注入し 室温で３０分
間放置した アスピレータで第２抗体溶液を除去Ｌ
ＰＢＳで３回洗浄し さらにアスピレータで残存するＰ
ＢＳを除去しｆ。
：ジオキサン−１： ２） ３ｍｌに溶かし 撹はんし
なからｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミドヒドロクロライド（１６，８ｍｇ／
１ｍｌリン酸バッファー（０，１Ｍ、 ＰＨ７））を角
丸 さらに３時間撹はん放置した ＢＳＡ溶液（３０＋ｎ ｌ、 １０ｍｇ／ｍｌ）を４
℃で撹はんしながら先のａｚＯＴＨＣ−ＣＯＯＨ溶液を
徐々に角丸 さらに４℃でｌ晩撹はんを続けた その恢
＝１７− 変性した蛋白質を遠心分離（１９０００ｒｐｍ、４０ｍ
１ｎ）で除去した後、セファデックスＧ−２５（ファル
マシア製）でゲル濾過ＬＡ２８Ｏｒ＋＋＋＋の波長光に
対して吸光を示す分画を分取することによりａ ｚ ｏ
ＴＨＣ−Ｂ Ｓ Ａを得た （Ｂ）固相抗原のコーティング 合成したａ ｚ ｏ ＴＨＣ−ＢＳＡを１％ＢＳＡおよ
び０．０４％のアジ化ナトリウムを含むＰｈｏｓｐｈａ
ｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ ５ａｌｉｎｅ （ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳ−Ａｚ）で希釈してａｚｏＴＨＣ−ＢＳＡの濃度が
００１ｍｇ／ｍ Ｉになるように調製し氾マイクロプレ
ート（ポリスチレン製９６ウエルプレート Ｃ０３ＴＡ
Ｒ社製）にこの抗原溶液を１００μｍ／ウェル注入ＬＡ
２０℃で１夜放置した （Ｃ）ブロッキング アスピレータで抗原溶液を吸引除去した後、ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳ−Ａｚを２５０μｌ／ウエル注入Ｌ １時間室温で
放置し１． その後、ＰＢＳで３回洗浄し アスピレ
ータで残存液を吸引除去し１゜ （Ｄ）抗体の反応 抗血？敵 培養上清、精製抗体あるいはモノクロ８− −ナル抗体の評価を行うときｌｉ ＢＳＡ−ＰＢＳ−
Ａｚで適時希釈した溶液（抗血清、培養上ｔｉ 精製
抗体モノクローナル抗体）１００μｍ／ウェルを注入し
たテトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒドロカ
ンナビノール類似体の検出すなわちインヒビジョンの実
験を行うときはインヒビタ溶液（テトラヒドロカンナビ
ノールあるいはテトラヒドロカンナビノール類似体）５
０μｌ／ウエルを注入し さらにモノクローナル抗体溶
液５０μｌ／ウエルを加えた 常温で３時間保存した後
、アスピレータで抗体溶液を除去Ｌ ＰＢＳで３回洗
浄し アスピレータで残存するＰＢＳを除去した （Ｅ）第２抗体の反応 ０．２μｇ／ｍｌヤギ由来のペルオキシダーゼ標識抗マ
ウス■ｇＧ抗体（ＫＰＬ Ｃａｔ、１４１８０６ ｌｏ
ｔ、 ＨＬＩＯ−５）を含むＢＳＡ −ＰＢＳ溶液（第
２抗体溶液）を２５μｍ／ウェル注入し 室温で３０分
間放置した アスピレータで第２抗体溶液を除去Ｌ
ＰＢＳで３回洗浄し さらにアスピレータで残存するＰ
ＢＳを除去しｆ。
（Ｆ）ペルオキシダーゼによる発色反応と停止９−
０−フェニレンジアミン（生化学用） ４０ｍｇを１０
ｍ ｌのクエン酸−リン酸バッファー（ｐＨ５）に溶解
し使用直前に３０％過酸化水素水４μＩを加えた溶液（
基質溶液）を１００μＩ／ウエル注入し 室温放置しり
１０分後、４Ｎ硫酸を２５μｍ／ウェル注入して反応を
停止した （Ｇ）測定 東洋ソーダマイクロプレートリーダを用いて４９２ｎｍ
光での吸光度を測定しｆ、・。
ｍ ｌのクエン酸−リン酸バッファー（ｐＨ５）に溶解
し使用直前に３０％過酸化水素水４μＩを加えた溶液（
基質溶液）を１００μＩ／ウエル注入し 室温放置しり
１０分後、４Ｎ硫酸を２５μｍ／ウェル注入して反応を
停止した （Ｇ）測定 東洋ソーダマイクロプレートリーダを用いて４９２ｎｍ
光での吸光度を測定しｆ、・。
この免疫測定方法（インヒビジョン法）を用いることに
より抗体の評価あるいは１０−’Ｍという極微量のＴＨ
Ｃを検出することができた（図面参ＩＧＩ。
より抗体の評価あるいは１０−’Ｍという極微量のＴＨ
Ｃを検出することができた（図面参ＩＧＩ。
ＥＬＩＳＡ法（インヒビジョン実験）によるＴＨＣの検
出）。
出）。
図は本発明の実施例で示したＴ ＨＣによるインヒビジ
ョン実験の結果図である（縦軸ＣＬ ４９２ｎｍの吸
光度を示しており、横軸４１ＴＨＣの濃度を対数で示し
ている）。
ョン実験の結果図である（縦軸ＣＬ ４９２ｎｍの吸
光度を示しており、横軸４１ＴＨＣの濃度を対数で示し
ている）。
また モノクローナル抗体（よ 通常免疫原と類似の構
造を有している物質にたいしてもアフィニティーを示す
ことが知られている。したがって、−旬一 △９−ＴＨＣに対するモノクローナル抗体を用いてもＴ
ＨＣ類似体を検出することができる。
造を有している物質にたいしてもアフィニティーを示す
ことが知られている。したがって、−旬一 △９−ＴＨＣに対するモノクローナル抗体を用いてもＴ
ＨＣ類似体を検出することができる。
以下、△８−ＴＨＣおよびテトラヒドロカンナビノール
類似体について本実施例と同様の検出方法で行ったとき
の相対感度を列挙する。ここで相対感度は△９−ＴＨＣ
の最低検出濃度を１としたときの各物質の最低検出濃度
を示している。数値が高くなるほど最低検出濃度が高い
ことを示している。
類似体について本実施例と同様の検出方法で行ったとき
の相対感度を列挙する。ここで相対感度は△９−ＴＨＣ
の最低検出濃度を１としたときの各物質の最低検出濃度
を示している。数値が高くなるほど最低検出濃度が高い
ことを示している。
△８−ＴＨＣ５
１１−ヒト加キシー△９−デトラヒトゝロカンナヒ９ノ
ール、３４１１−ヒト加キシー△８−デトラヒＦロカン
ナヒ１ノール、３６８β−ヒトゝロキシー△９−デトラ
ヒドロカンナヒゝノール、２４８β−ヒトゝロキシー△
８−テトラヒドロカンナヒゝノール、３２カンナヒ９ノ
ール、
５２カンナヒゞシゝオール、
ｌ ０３カ
ンナビシ゛オール酸、
８２カンナヒゝシクロール、
８５カンナ七゛クロメエン、
１０２８α−ヒト加キシ
ーヘキサヒト加カンナヒ勺−ル、 １
０８１１−ヒト加キシカンナヒゝノール、６８２１ カンナヒゝノールー１１−アルデゝヒト アセテート
３０５８−アセトキシ−９−ヒト
ゝロキシーへキサヒト加カンナヒゝノール ５０１
発明の効果 本発明により、テトラヒドロカンナビノールあるいはテ
トラヒドロカンナビノール類似体に対する抗体（抗血清
、モノクローナル抗体）およびモノクローナル抗体を再
現性良く産生ずる方法を提供できる。さらに このモノ
クローナル抗体を用いたテトラヒドロカンナビノールあ
るいはテトラヒドロカンナビノール類似体の検出方法を
提供することが可能になった また テトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒド
ロカンナビノール類似体と牛由来の血清アルブミンとの
結合物を固相抗原として用いることにより安全、正確な
抗体評価を行うことが可能となっ丸
ール、３４１１−ヒト加キシー△８−デトラヒＦロカン
ナヒ１ノール、３６８β−ヒトゝロキシー△９−デトラ
ヒドロカンナヒゝノール、２４８β−ヒトゝロキシー△
８−テトラヒドロカンナヒゝノール、３２カンナヒ９ノ
ール、
５２カンナヒゞシゝオール、
ｌ ０３カ
ンナビシ゛オール酸、
８２カンナヒゝシクロール、
８５カンナ七゛クロメエン、
１０２８α−ヒト加キシ
ーヘキサヒト加カンナヒ勺−ル、 １
０８１１−ヒト加キシカンナヒゝノール、６８２１ カンナヒゝノールー１１−アルデゝヒト アセテート
３０５８−アセトキシ−９−ヒト
ゝロキシーへキサヒト加カンナヒゝノール ５０１
発明の効果 本発明により、テトラヒドロカンナビノールあるいはテ
トラヒドロカンナビノール類似体に対する抗体（抗血清
、モノクローナル抗体）およびモノクローナル抗体を再
現性良く産生ずる方法を提供できる。さらに このモノ
クローナル抗体を用いたテトラヒドロカンナビノールあ
るいはテトラヒドロカンナビノール類似体の検出方法を
提供することが可能になった また テトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒド
ロカンナビノール類似体と牛由来の血清アルブミンとの
結合物を固相抗原として用いることにより安全、正確な
抗体評価を行うことが可能となっ丸
図は本発明の実施例で示したＴＨＣによるインヒビジョ
ン実験の結果を示すグラフである。
ン実験の結果を示すグラフである。
Claims (11)
- （１）テトラヒドロカンナビノールあるいはその類似体
に対する抗体作製のための免疫方法において、そのテト
ラヒドロカンナビノールあるいはその類似体にｐ−アミ
ノ安息香酸を結合することによりカルボキシル基を導入
した誘導体をタンパク質と共有結合したものを免疫原と
し、免疫感作動物としてＡ／Ｊ系統のマウスを用いるこ
とを特徴とする免疫方法 - （２）抗体（抗血清あるいはモノクローナル抗体）のテ
トラヒドロカンナビノールあるいはその類似体に対する
結合能を測定するために、固相抗原としてテトラヒドロ
カンナビノールあるいはその類似体にｐ−アミノ安息香
酸を結合することによりカルボキシル基を導入した誘導
体を牛由来の血清アルブミン（ＢＳＡ）と共有結合した
ものを使用することを特徴とする免疫測定方法。 - （３）類似体が、１１−ヒドロキシ−△９−テトラヒド
ロカンナビノール、１１−ヒドロキシ−△８−テトラヒ
ドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−△９−テトラ
ヒドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−△８−テト
ラヒドロカンナビノール、カンナビノール、カンナビジ
オール、カンナビジオール酸、カンナビシクロール、カ
ンナビクロメン、８α−ヒドロキシ−ヘキサヒドロカン
ナビノール、１１−ヒドロキシカンナビノール、カンナ
ビノール−１１−アルデヒドアセテート又は８−アセト
キシ−９−ヒドロキシ−ヘキサヒドロカンナビノールで
あることを特徴とする請求項１記載の免疫方法 - （４）類似体が、１１−ヒドロキシ−△９−テトラヒド
ロカンナビノール、１１−ヒドロキシ−△８−テトラヒ
ドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−△９−テトラ
ヒドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−△８−テト
ラヒドロカンナビノール、カンナビノール、カンナビジ
オール、カンナビジオール酸、カンナビシクロール、カ
ンナビクロメン、８α−ヒドロキシ−ヘキサヒドロカン
ナビノール、１１−ヒドロキシカンナビノール、カンナ
ビノール−１１−アルデヒドアセテート又は８−アセト
キシ−９−ヒドロキシ−ヘキサヒドロカンナビノールで
あることを特徴とする請求項２記載の免疫測定方法 - （５）免疫原のタンパク質がスカシ貝由来のヘモシアニ
ン（ＫＬＨ）あるいはチキン由来のγ−グロブリン（Ｃ
ＧＧ）であることを特徴とする請求項１記載の免疫方法
。 - （６）共有結合が、ジクロロヘキシルカルボジイミドあ
るいは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）−カルボジイミドを用いることによるアミド結合であ
ることを特徴とする請求項１記載の免疫方法。 - （７）共有結合が、ジクロロヘキシルカルボジイミドあ
るいは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）−カルボジイミドを用いることによるアミド結合であ
ることを特徴とする請求項２記載の免疫測定方法。 - （８）請求項１記載の免疫方法により作製されることを
特徴とする抗体。 - （９）請求項１記載の免疫方法により感作された動物の
脾臓細胞とミエローマ細胞を融合して作製されることを
特徴とするハイブリドーマ細胞。 - （１０）請求項９項記載のハイブリドーマ細胞の培養上
清を精製して得られることを特徴とするモノクローナル
抗体。 - （１１）請求項１０記載のモノクローナル抗体を用いる
ことを特徴とする検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1182920A JPH0346562A (ja) | 1989-07-14 | 1989-07-14 | 免疫方法および免疫測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1182920A JPH0346562A (ja) | 1989-07-14 | 1989-07-14 | 免疫方法および免疫測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0346562A true JPH0346562A (ja) | 1991-02-27 |
Family
ID=16126693
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1182920A Pending JPH0346562A (ja) | 1989-07-14 | 1989-07-14 | 免疫方法および免疫測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0346562A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006029089A3 (en) * | 2004-09-03 | 2007-05-24 | Oakville Hong Kong Company Ltd | Tetrahydrocannabinoid- protein conjugates for the production of antibodies for the detection of tεtrahydrocannabinoid components in saliva |
| JP4721522B2 (ja) * | 1999-05-10 | 2011-07-13 | 中外製薬株式会社 | 細胞の培養方法 |
-
1989
- 1989-07-14 JP JP1182920A patent/JPH0346562A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4721522B2 (ja) * | 1999-05-10 | 2011-07-13 | 中外製薬株式会社 | 細胞の培養方法 |
| WO2006029089A3 (en) * | 2004-09-03 | 2007-05-24 | Oakville Hong Kong Company Ltd | Tetrahydrocannabinoid- protein conjugates for the production of antibodies for the detection of tεtrahydrocannabinoid components in saliva |
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