JPH026023B2 - - Google Patents
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- JPH026023B2 JPH026023B2 JP55083630A JP8363080A JPH026023B2 JP H026023 B2 JPH026023 B2 JP H026023B2 JP 55083630 A JP55083630 A JP 55083630A JP 8363080 A JP8363080 A JP 8363080A JP H026023 B2 JPH026023 B2 JP H026023B2
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Description
本発明は、免疫反応の安定化剤および抗原―抗
体反応の測定法に関するものである。詳しくは、
免疫反応の特異性を高める安定化剤および抗原―
抗体反応の改良に関するものである。 近年、医学、生化学、衛生学および疫学等の
種々の分野において、別量物質とくに抗原および
抗体を定量することが極めて重要な課題となつて
いる。 従来、この様な方法としては、抗原または抗体
を感作させたラテツクスを、ガラス板上で抗体ま
たは抗原と反応させ、その凝集状態を肉眼で観察
する方法が広く用いられている。 また、希釈抗体を対応する抗原を含む検体と反
応させ、形成された抗原―抗体複合体の光散乱を
利用するとか、比濁、比色による測定法も古くか
ら用いられている。 さらに、免疫抗原―抗体反応系において、該抗
体を水に不溶な担体に感作し検定する方法として
放射免疫測定法〔ラジオイムノアツセイメンズ
（Redroimmunoassay Methods）481頁、1971
年、イギリス国参照〕、酸素免疫測定法〔クリニ
カルケミストリー（Clinical Chemistry）22巻、
1243―1255頁、1976年参照〕、光散乱あるいは比
濁による光学的測定法および凝集反応が公知であ
る。 〔例えば、クロアチア ケミカ アクタ
（CROATIA CHEMICA ACTA）42巻、457―
466頁、1970年、ユーゴスラビア国；ユーロピア
ン ジヤーナル オブ バイオケミストリー
（European Journal of Biochemistry）20巻、
４号、558―560頁、1971年、ドイツ国およびイム
ノケミストリー（Immunochemistry）12巻、349
―351頁、1975年、イギリス国参照〕 かかる免疫反応系においては、反応の迅速性、
高感度、操作の簡易性等の有利性はあるが、被検
体中に含まれる非特異的干捗因子に起因する主反
応以外の好ましくない非特異的反応が問題であ
る。かかる非特異的反応は該免疫反応の特異性を
著しく阻害し、往々にして不正確な結果を提供
し、この確認の為に繁雑な操作を必要とした。 また、Fc部分による非特異的な反応を防止す
るために、Ｆ（ab′）2部分のみを抗体として担体に
感作した免疫反応系もすでに公知である。（例え
ばジヤーナル オブ バイオケミストリー
（Journal of Biochemistry）81巻、1557頁1977
年およびヨーロピアン ジヤーナル オブ イム
ノロジー（European Journal of Immnnology）
５巻、274頁、1975年参照） 免疫化学的反応で頻用される抗体は免疫グロブ
リンＧ（IgG）クラスであり、IgG分子はFabとよ
ばれる部分２個とFcとよばれる部分とから成立
つている。抗体活性の上では、Fab部分に抗体の
特異活性を示す抗原結合部位が存在し、Fc部分
は補体の結合、ヒフ感作、リウマチ因子の結合な
どに関与している。IgGの各分画は、Ｆ（ab′）2，
Fab′，Fab，Fd.Fcなどの記号でも示される。 Ｆ（ab′）2は免疫グロブリンをペプシンで消化し
て得られ、これをメルカプトエタノールで還元切
断するとFab′2個に解離する。これらは酸化によ
つてまたＦ（ab′）2に再生される。Fabは免疫グロ
ブリンをパパインで分解して得られ、これを更に
還元、アルキル化してFdを得る。 しかし、本発明者等は、免疫グロブリンはもと
より、Ｆ（ab′）2抗体を用いる反応でさえも好まし
くない非特異的反応要因の存在を見出し、この反
応を防止するために鋭意検討を加えた結果、本発
明に到達した。 すなわち、本発明の要旨は、 １ 免疫グロブリンのＦ（ab′）2分画、Fab′分画、
Fab分画またはFd分画の構成分画を有効成分
とする免疫反応の安定化剤および ２ 反応媒体中で、測定すべき抗原または抗体
と、それに対応する抗体または抗原とを反応さ
せる抗原―抗体反応の測定法において、抗原と
抗体との反応を、測定すべき抗体または測定す
べき抗原に対応する抗体とは無関与の免疫グロ
ブリンのＦ（ab′）2分画、Fab′分画、Fab分画ま
たはFd分画の構成分画の存在下に行うか、測
定すべき抗原または抗体を含む検体と該構成分
画とを予め接触処理し、該構成分画の反応物を
分離除去後行うことを特徴とする抗原―抗体反
応の測定法に存する。 以下に本発明を詳細に説明する。 免疫グロブリンとしては、免疫グロブリンＭ
（IgM）、免疫グロブリンＡ（IgA）、免疫グロブリ
ンＤ（IgD）、免疫グロブリンＥ（IgE）およびIgG
が挙げられるが、通常はIgGに相当するものが用
いられる。 免疫グロブリンをその構成分画に導くには、常
法例えばペプシン、パパイン等の蛋白分解酵素等
によつて分解する方法、メルカプトエタノール等
でＳ―Ｓ結合を切断する方法、その他の化学修飾
法によつて行うことができる。 本発明に用いる免疫グロブリンの構成分画（以
下「本構成分画」という。）は、測定すべき抗原
または抗体（以下「測定物」と総称する。）に反
応させる抗体または抗原（以下「反応物」と総称
する。）の由来した動物と同種のものが好ましい
が、免疫学的に近縁の免疫グロブリン構成成分を
用いることもある。 本発明安定化剤は、本構成分画以外に、溶媒、
緩衝剤、血清アルブミン、卵アルブミンおよび膠
原繊維由来の蛋白質等を含んでいてもよい。とく
に、後三者の蛋白質を含むものは、検体の希釈に
際して膠原濃度の維持や反応の安定化、更には検
体中のある種の非特異反応物質の中和も期待でき
る等の点で好ましいものである。 本発明安定化剤の使用の形態としては、通常測
定物を含む検体に混合するが、それ以外にも反応
物が血球等に担持されている場合には、該担持物
と安定化剤を混合して予め凍結乾燥しておくこと
もできる。 本発明安定化剤の使用量は、非特異反応の大き
さによつても異なるが、反応媒体中で測定物と反
応物とを反応させる際か、検体と本構成分画との
接触処理の際の、本構成分画の使用量が通常
0.005％から１％である。本発明安定化剤の使用
量が少なすぎれば、好ましくない非特異反応を抑
止する効果が不確実となるし、また、量が多すぎ
ても格別それに伴う効果がなくむしろ主反応の反
応性低下をもたらし、かつ経済性を損うので好ま
しくない。 本発明方法で抗原―抗体反応を測定するには、
従来周知の方法により行うことができる。 これらの方法としては、測定物と反応物の何れ
も可溶性のものを用いるいわゆる溶液系と、反応
物を反応媒体に実施的に不溶性の粒子担体に感作
（担持）する、いわゆる担体系とに大別できる。 例えば、反応物も測定物も可溶性の形で反応さ
せる溶媒系では好ましくは測定物に介在する非特
異反応因子をあらかじめ不溶性あるいは可溶性本
構成分画と接触処理し、本構成分画の反応物を分
離除去して反応に供することもできるし、また本
構成分画の存在下で反応させることもできる。ま
た担体系では溶液系の如く被検体の前処理が好ま
しいが、本構成分画の存在下の反応も可能であ
る。 反応媒体としては、水性媒体、例えば水や緩衝
液が挙げられ、これらは安定剤、防腐剤、キレー
ト剤、界面活性剤等の添加物を含んでいてもよ
い。緩衝液としては、トリス〔トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン〕―塩酸緩衝液、トリス
―マレート緩衝液、アンモニア緩衝液、ホウ酸塩
緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられる。また、
尿等の検体をそのまま反応媒体とすることも可能
である。 測定物および反応物となる抗原としては、例え
ば蛋白質、ポリペプチド、ステロイド、多糖類、
脂質、花紛、塵あるいはハプテン等種々のものが
挙げられる。また、抗体としては、例えば上記し
た抗原に対する抗体である蛋白質が挙げられる。 次に一例として担体系について説明する。 この方法で用いられる微粒子担体は、通常水性
媒体に実質的に不溶性の粒子である。このような
微粒子担体の材質としては、有機高分子物質、例
えばポリスチレン、スチレン―ブタジエン共重合
体、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸
エステル、アクリロニトリル―ブタジエン―スチ
レン共重合体やこれらの重合体中にアクリル酸、
メタクリル酸、アクリルアミド等を共重合させて
カルボキシル基またはアミド基等を導入して活性
化した重合体のラテツクス；シリカ、シリカ―ア
ルミナ、アルミナ等の無機酸化物；鉱物粉末；金
属粉末；血球あるいはブドウ球菌、連鎖球菌等の
球菌型の細菌、霊菌またはリケツチアおよびそれ
らの破片等が挙げられる。 これらの微粒子担体の大きさは、その平均粒径
が通常0.05〜10μm、好ましくは0.1〜1.0μm、特
に好ましくは0.2〜0.8μmである。微粒子担体の粒
径が大きすぎると測定範囲が狭くなつたり、ある
いはより不安定となるし、また微粒子担体の粒径
が小さすぎると試薬調製上経済的損失が大きく、
さらに感度もあげにくくなるので、何れも好まし
くない。 これらの微粒子担体の濃度は、通常最終濃度で
0.03〜0.3％好ましくは0.05〜0.2％である。微粒
子担体の濃度が高すぎると、本発明試薬を使用す
る測定装置が複雑となり、また格別の効果もな
く、また低すぎても感度が低く、反応性が弱くな
るので何れも好ましくない。 前記微粒子担体への抗原または抗体感作には、
周知の方法すなわち抗原または抗体の、微粒子担
体への物理的吸着もしくは抗原または抗体と微粒
子担体との化学的結合の何れも用いられるし、こ
の両者を併用してもさしつかえない。 担体に感作させる抗原または抗体の量は、その
種類や試薬の目的とする測定の精度等の種々の条
件により、適宜選択決定すればよい。 抗原または抗体を感作させた微粒子担体は、水
性媒体への懸濁に先立ち他の安定剤で処理しても
よい。このような安定剤としては、目的とする免
疫反応に関与しないアミノ酸、ポリペプチド、蛋
白質等が用いられ、とくには血清アルブミンが好
適である。このような安定剤による処理は、従来
周知の方法により行ことができる。安定剤処理
は、保存および反応時の安定性の点で好ましく、
とくに担体に抗原または抗体を物理的に吸着させ
た場合にその効果が大きい。 水性媒体のPHは、通常５〜10、好ましくは６〜
9.5、最も好ましくは6.5〜8.5である。水性媒体の
PHが低すぎると感度は上昇するが、不安定となる
ことがあり、また水性媒体のPHが高すぎると感度
が低くなり、保存上も不安定となることがあるの
で好ましくない。 抗原または抗体を感作させた微粒子担体を水性
媒体に懸濁させる濃度は、通常0.01〜20％、好ま
しくは0.05〜10％である。濃度が低すぎると安定
性が低くなり、使用上も不便となり制約されるこ
とがあるし、また濃度が高すぎても安定性が減少
し、不都合であるので好ましくない。 免疫反応の測定法としては、例えばスライド上
または試験管で反応させて肉眼で観察する方法や
光学セル中で反応させて光学的に測定する方法が
挙げられる。 免疫反応の測定を行うには、以下に述べる様な
方法によればよい。 先ず、必要あれば上述の微粒子担体溶液を、緩
衝液により希釈し、抗原または抗体を感作させた
担体もしくはその両者の濃度を、免疫反応の測定
に好都合な様に調整する。その濃度は、測定すべ
き抗原や抗体の種類、濃度、反応性その他の種々
の条件により相異するので、適宜条件を決定する
必要があるが、一般的には免疫反応を光学的に測
定しようとする場合には、通常最終濃度が0.03重
量％以上、好ましくは0.05〜１重量％、特に好ま
しくは0.1〜0.5重量％であるのがよい。また、免
疫反応を肉眼により観察しようとする場合には、
通常最終濃度で0.05〜0.8％、好ましくは0.1〜0.5
％である。 希釈に用いられる緩衝液としては、トリス―塩
酸緩衝液、トリス―マレート緩衝液、アンモニア
緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、グリシン緩衝液等が挙
げられる。 緩衝液のPHは、通常7.6〜9.6、好ましくは8.0〜
9.0とする。緩衝液のPHが低すぎると感度は高く
なるが、凝集傾向を示し不安定となることがある
し、またPHが高すぎると感度が低くなり、高温で
の保存性が低下することもあるので好ましくな
い。 このようにすれば、従来良く知られている免疫
反応用感作粒子試薬が得られる。 この試薬を用いて免疫反応を測定するのは、常
法により行なうことができる。 すなわち、例えば肉眼により免疫反応を観察す
る場合には、スライド上、試験管中、もしくはマ
イクロプレート上で、所定量の試薬、所定量の本
発明安定化剤、および抗原または抗体を含む被検
液を混合し、感作粒子の凝集を観察すればよい。 また、免疫反応を光学的に測定しようとする場
合には、所定量の試薬および抗原または抗体を含
む被検液を混合し、光学セル中で光の透過率、散
乱光または濁度の変化を測定すればよい。 光は単色光であつてもよいし、多色光であつて
もよい。 測定に用いる光学セルの厚さは、通常0.2〜10
mmである。 本発明安定化剤および方法によれば、抗原また
は抗体を免疫化学的に測定しようとするときに起
る非特異反応を抑止し、その測定の特異性を高め
ることができる。 以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以
下の実施例により限定を受けるものではない。 なお、実施例において、「％」は特記しない限
り重量に基くものとする。 実施例 １ ラテツクス粒子の表面積1.52×10-9cm2当り800
から1400個の抗α―フエトプロテイン（AFP）
ウサギ抗体（Ｆ（ab′）2K＝5.40×109L／Ｍ）を感
作し、ラテツクス試薬を調整した。牛血清アルブ
ミン（BSA）を0.1％に含む生理食塩液で各濃度
のAFP標品を調整し、近赤外比濁法により反応
性を検討した。この標準反応曲線を第１図に示
す。 この光学的測定法（LPIAまたは単にPIA）は、
対応する抗原との反応の強弱により反応液の濁度
が変化し、特定の波長例えば940nmでの吸光度測
定により抗原抗体反応速度を定量的にとらえるこ
とができる。 非特異反応も略同様に反応するので、抗原を実
質的に含まないか検出限界以下の陰性検体をあた
かも陽性の如く判定することになる。 実施例 ２ 抗ヒトフイブリノゲン抗体を免疫グロブリンお
よびＦ（ab′）2分画で実施例１の如く調製し、同様
に標準曲線を作成した。標準フイブリノゲンは純
化ゼラチンを0.02％に含む0.1％BSA―生理食塩
液で調製した。 結果を第２図に示した。 実施例 ３ 抗ヒトミオグロビン抗体についても実施例１の
如く調製し標準曲線を作成した。結果を第３図に
示した。 実施例 ４ 抗ヒトβ2―マイクログロブリンウサギ抗体につ
いて実施例１の如く調製した。β2―マイクロブロ
ブリン標品は精製卵アルブミンを0.05％に含む生
理食塩液で調製した。 実施例 ５ 非リウマチ血清、リウマチ凝集反応検査依頼の
患者血清および明らかにリウマチと診断されまた
リウマチ凝集反応で（）と判定された患者血清
を0.1％BSA―生理食塩液で４倍に希釈し、その
200μlを７mm×７mmキユベツトに入れ、実施例１
で調製したラテツクス試薬50μlを注入１分間反応
させ、その間の透過光量（波長940nm）の時間当
りの変化を測定した。その結果を表１に示した。
陽性例については、２抗体法による放射免疫検定
法（RIA）により確認した。 実施例 ６ 実施例５で疑陽性を呈した検体に、抗体を作成
したと同じ動物の免疫グロブリン構成分画を最終
濃度が0.005から２％になるように加え、実施例
５と同様に反応させた（結果を表２に示した。）。
体反応の測定法に関するものである。詳しくは、
免疫反応の特異性を高める安定化剤および抗原―
抗体反応の改良に関するものである。 近年、医学、生化学、衛生学および疫学等の
種々の分野において、別量物質とくに抗原および
抗体を定量することが極めて重要な課題となつて
いる。 従来、この様な方法としては、抗原または抗体
を感作させたラテツクスを、ガラス板上で抗体ま
たは抗原と反応させ、その凝集状態を肉眼で観察
する方法が広く用いられている。 また、希釈抗体を対応する抗原を含む検体と反
応させ、形成された抗原―抗体複合体の光散乱を
利用するとか、比濁、比色による測定法も古くか
ら用いられている。 さらに、免疫抗原―抗体反応系において、該抗
体を水に不溶な担体に感作し検定する方法として
放射免疫測定法〔ラジオイムノアツセイメンズ
（Redroimmunoassay Methods）481頁、1971
年、イギリス国参照〕、酸素免疫測定法〔クリニ
カルケミストリー（Clinical Chemistry）22巻、
1243―1255頁、1976年参照〕、光散乱あるいは比
濁による光学的測定法および凝集反応が公知であ
る。 〔例えば、クロアチア ケミカ アクタ
（CROATIA CHEMICA ACTA）42巻、457―
466頁、1970年、ユーゴスラビア国；ユーロピア
ン ジヤーナル オブ バイオケミストリー
（European Journal of Biochemistry）20巻、
４号、558―560頁、1971年、ドイツ国およびイム
ノケミストリー（Immunochemistry）12巻、349
―351頁、1975年、イギリス国参照〕 かかる免疫反応系においては、反応の迅速性、
高感度、操作の簡易性等の有利性はあるが、被検
体中に含まれる非特異的干捗因子に起因する主反
応以外の好ましくない非特異的反応が問題であ
る。かかる非特異的反応は該免疫反応の特異性を
著しく阻害し、往々にして不正確な結果を提供
し、この確認の為に繁雑な操作を必要とした。 また、Fc部分による非特異的な反応を防止す
るために、Ｆ（ab′）2部分のみを抗体として担体に
感作した免疫反応系もすでに公知である。（例え
ばジヤーナル オブ バイオケミストリー
（Journal of Biochemistry）81巻、1557頁1977
年およびヨーロピアン ジヤーナル オブ イム
ノロジー（European Journal of Immnnology）
５巻、274頁、1975年参照） 免疫化学的反応で頻用される抗体は免疫グロブ
リンＧ（IgG）クラスであり、IgG分子はFabとよ
ばれる部分２個とFcとよばれる部分とから成立
つている。抗体活性の上では、Fab部分に抗体の
特異活性を示す抗原結合部位が存在し、Fc部分
は補体の結合、ヒフ感作、リウマチ因子の結合な
どに関与している。IgGの各分画は、Ｆ（ab′）2，
Fab′，Fab，Fd.Fcなどの記号でも示される。 Ｆ（ab′）2は免疫グロブリンをペプシンで消化し
て得られ、これをメルカプトエタノールで還元切
断するとFab′2個に解離する。これらは酸化によ
つてまたＦ（ab′）2に再生される。Fabは免疫グロ
ブリンをパパインで分解して得られ、これを更に
還元、アルキル化してFdを得る。 しかし、本発明者等は、免疫グロブリンはもと
より、Ｆ（ab′）2抗体を用いる反応でさえも好まし
くない非特異的反応要因の存在を見出し、この反
応を防止するために鋭意検討を加えた結果、本発
明に到達した。 すなわち、本発明の要旨は、 １ 免疫グロブリンのＦ（ab′）2分画、Fab′分画、
Fab分画またはFd分画の構成分画を有効成分
とする免疫反応の安定化剤および ２ 反応媒体中で、測定すべき抗原または抗体
と、それに対応する抗体または抗原とを反応さ
せる抗原―抗体反応の測定法において、抗原と
抗体との反応を、測定すべき抗体または測定す
べき抗原に対応する抗体とは無関与の免疫グロ
ブリンのＦ（ab′）2分画、Fab′分画、Fab分画ま
たはFd分画の構成分画の存在下に行うか、測
定すべき抗原または抗体を含む検体と該構成分
画とを予め接触処理し、該構成分画の反応物を
分離除去後行うことを特徴とする抗原―抗体反
応の測定法に存する。 以下に本発明を詳細に説明する。 免疫グロブリンとしては、免疫グロブリンＭ
（IgM）、免疫グロブリンＡ（IgA）、免疫グロブリ
ンＤ（IgD）、免疫グロブリンＥ（IgE）およびIgG
が挙げられるが、通常はIgGに相当するものが用
いられる。 免疫グロブリンをその構成分画に導くには、常
法例えばペプシン、パパイン等の蛋白分解酵素等
によつて分解する方法、メルカプトエタノール等
でＳ―Ｓ結合を切断する方法、その他の化学修飾
法によつて行うことができる。 本発明に用いる免疫グロブリンの構成分画（以
下「本構成分画」という。）は、測定すべき抗原
または抗体（以下「測定物」と総称する。）に反
応させる抗体または抗原（以下「反応物」と総称
する。）の由来した動物と同種のものが好ましい
が、免疫学的に近縁の免疫グロブリン構成成分を
用いることもある。 本発明安定化剤は、本構成分画以外に、溶媒、
緩衝剤、血清アルブミン、卵アルブミンおよび膠
原繊維由来の蛋白質等を含んでいてもよい。とく
に、後三者の蛋白質を含むものは、検体の希釈に
際して膠原濃度の維持や反応の安定化、更には検
体中のある種の非特異反応物質の中和も期待でき
る等の点で好ましいものである。 本発明安定化剤の使用の形態としては、通常測
定物を含む検体に混合するが、それ以外にも反応
物が血球等に担持されている場合には、該担持物
と安定化剤を混合して予め凍結乾燥しておくこと
もできる。 本発明安定化剤の使用量は、非特異反応の大き
さによつても異なるが、反応媒体中で測定物と反
応物とを反応させる際か、検体と本構成分画との
接触処理の際の、本構成分画の使用量が通常
0.005％から１％である。本発明安定化剤の使用
量が少なすぎれば、好ましくない非特異反応を抑
止する効果が不確実となるし、また、量が多すぎ
ても格別それに伴う効果がなくむしろ主反応の反
応性低下をもたらし、かつ経済性を損うので好ま
しくない。 本発明方法で抗原―抗体反応を測定するには、
従来周知の方法により行うことができる。 これらの方法としては、測定物と反応物の何れ
も可溶性のものを用いるいわゆる溶液系と、反応
物を反応媒体に実施的に不溶性の粒子担体に感作
（担持）する、いわゆる担体系とに大別できる。 例えば、反応物も測定物も可溶性の形で反応さ
せる溶媒系では好ましくは測定物に介在する非特
異反応因子をあらかじめ不溶性あるいは可溶性本
構成分画と接触処理し、本構成分画の反応物を分
離除去して反応に供することもできるし、また本
構成分画の存在下で反応させることもできる。ま
た担体系では溶液系の如く被検体の前処理が好ま
しいが、本構成分画の存在下の反応も可能であ
る。 反応媒体としては、水性媒体、例えば水や緩衝
液が挙げられ、これらは安定剤、防腐剤、キレー
ト剤、界面活性剤等の添加物を含んでいてもよ
い。緩衝液としては、トリス〔トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン〕―塩酸緩衝液、トリス
―マレート緩衝液、アンモニア緩衝液、ホウ酸塩
緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられる。また、
尿等の検体をそのまま反応媒体とすることも可能
である。 測定物および反応物となる抗原としては、例え
ば蛋白質、ポリペプチド、ステロイド、多糖類、
脂質、花紛、塵あるいはハプテン等種々のものが
挙げられる。また、抗体としては、例えば上記し
た抗原に対する抗体である蛋白質が挙げられる。 次に一例として担体系について説明する。 この方法で用いられる微粒子担体は、通常水性
媒体に実質的に不溶性の粒子である。このような
微粒子担体の材質としては、有機高分子物質、例
えばポリスチレン、スチレン―ブタジエン共重合
体、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸
エステル、アクリロニトリル―ブタジエン―スチ
レン共重合体やこれらの重合体中にアクリル酸、
メタクリル酸、アクリルアミド等を共重合させて
カルボキシル基またはアミド基等を導入して活性
化した重合体のラテツクス；シリカ、シリカ―ア
ルミナ、アルミナ等の無機酸化物；鉱物粉末；金
属粉末；血球あるいはブドウ球菌、連鎖球菌等の
球菌型の細菌、霊菌またはリケツチアおよびそれ
らの破片等が挙げられる。 これらの微粒子担体の大きさは、その平均粒径
が通常0.05〜10μm、好ましくは0.1〜1.0μm、特
に好ましくは0.2〜0.8μmである。微粒子担体の粒
径が大きすぎると測定範囲が狭くなつたり、ある
いはより不安定となるし、また微粒子担体の粒径
が小さすぎると試薬調製上経済的損失が大きく、
さらに感度もあげにくくなるので、何れも好まし
くない。 これらの微粒子担体の濃度は、通常最終濃度で
0.03〜0.3％好ましくは0.05〜0.2％である。微粒
子担体の濃度が高すぎると、本発明試薬を使用す
る測定装置が複雑となり、また格別の効果もな
く、また低すぎても感度が低く、反応性が弱くな
るので何れも好ましくない。 前記微粒子担体への抗原または抗体感作には、
周知の方法すなわち抗原または抗体の、微粒子担
体への物理的吸着もしくは抗原または抗体と微粒
子担体との化学的結合の何れも用いられるし、こ
の両者を併用してもさしつかえない。 担体に感作させる抗原または抗体の量は、その
種類や試薬の目的とする測定の精度等の種々の条
件により、適宜選択決定すればよい。 抗原または抗体を感作させた微粒子担体は、水
性媒体への懸濁に先立ち他の安定剤で処理しても
よい。このような安定剤としては、目的とする免
疫反応に関与しないアミノ酸、ポリペプチド、蛋
白質等が用いられ、とくには血清アルブミンが好
適である。このような安定剤による処理は、従来
周知の方法により行ことができる。安定剤処理
は、保存および反応時の安定性の点で好ましく、
とくに担体に抗原または抗体を物理的に吸着させ
た場合にその効果が大きい。 水性媒体のPHは、通常５〜10、好ましくは６〜
9.5、最も好ましくは6.5〜8.5である。水性媒体の
PHが低すぎると感度は上昇するが、不安定となる
ことがあり、また水性媒体のPHが高すぎると感度
が低くなり、保存上も不安定となることがあるの
で好ましくない。 抗原または抗体を感作させた微粒子担体を水性
媒体に懸濁させる濃度は、通常0.01〜20％、好ま
しくは0.05〜10％である。濃度が低すぎると安定
性が低くなり、使用上も不便となり制約されるこ
とがあるし、また濃度が高すぎても安定性が減少
し、不都合であるので好ましくない。 免疫反応の測定法としては、例えばスライド上
または試験管で反応させて肉眼で観察する方法や
光学セル中で反応させて光学的に測定する方法が
挙げられる。 免疫反応の測定を行うには、以下に述べる様な
方法によればよい。 先ず、必要あれば上述の微粒子担体溶液を、緩
衝液により希釈し、抗原または抗体を感作させた
担体もしくはその両者の濃度を、免疫反応の測定
に好都合な様に調整する。その濃度は、測定すべ
き抗原や抗体の種類、濃度、反応性その他の種々
の条件により相異するので、適宜条件を決定する
必要があるが、一般的には免疫反応を光学的に測
定しようとする場合には、通常最終濃度が0.03重
量％以上、好ましくは0.05〜１重量％、特に好ま
しくは0.1〜0.5重量％であるのがよい。また、免
疫反応を肉眼により観察しようとする場合には、
通常最終濃度で0.05〜0.8％、好ましくは0.1〜0.5
％である。 希釈に用いられる緩衝液としては、トリス―塩
酸緩衝液、トリス―マレート緩衝液、アンモニア
緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、グリシン緩衝液等が挙
げられる。 緩衝液のPHは、通常7.6〜9.6、好ましくは8.0〜
9.0とする。緩衝液のPHが低すぎると感度は高く
なるが、凝集傾向を示し不安定となることがある
し、またPHが高すぎると感度が低くなり、高温で
の保存性が低下することもあるので好ましくな
い。 このようにすれば、従来良く知られている免疫
反応用感作粒子試薬が得られる。 この試薬を用いて免疫反応を測定するのは、常
法により行なうことができる。 すなわち、例えば肉眼により免疫反応を観察す
る場合には、スライド上、試験管中、もしくはマ
イクロプレート上で、所定量の試薬、所定量の本
発明安定化剤、および抗原または抗体を含む被検
液を混合し、感作粒子の凝集を観察すればよい。 また、免疫反応を光学的に測定しようとする場
合には、所定量の試薬および抗原または抗体を含
む被検液を混合し、光学セル中で光の透過率、散
乱光または濁度の変化を測定すればよい。 光は単色光であつてもよいし、多色光であつて
もよい。 測定に用いる光学セルの厚さは、通常0.2〜10
mmである。 本発明安定化剤および方法によれば、抗原また
は抗体を免疫化学的に測定しようとするときに起
る非特異反応を抑止し、その測定の特異性を高め
ることができる。 以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以
下の実施例により限定を受けるものではない。 なお、実施例において、「％」は特記しない限
り重量に基くものとする。 実施例 １ ラテツクス粒子の表面積1.52×10-9cm2当り800
から1400個の抗α―フエトプロテイン（AFP）
ウサギ抗体（Ｆ（ab′）2K＝5.40×109L／Ｍ）を感
作し、ラテツクス試薬を調整した。牛血清アルブ
ミン（BSA）を0.1％に含む生理食塩液で各濃度
のAFP標品を調整し、近赤外比濁法により反応
性を検討した。この標準反応曲線を第１図に示
す。 この光学的測定法（LPIAまたは単にPIA）は、
対応する抗原との反応の強弱により反応液の濁度
が変化し、特定の波長例えば940nmでの吸光度測
定により抗原抗体反応速度を定量的にとらえるこ
とができる。 非特異反応も略同様に反応するので、抗原を実
質的に含まないか検出限界以下の陰性検体をあた
かも陽性の如く判定することになる。 実施例 ２ 抗ヒトフイブリノゲン抗体を免疫グロブリンお
よびＦ（ab′）2分画で実施例１の如く調製し、同様
に標準曲線を作成した。標準フイブリノゲンは純
化ゼラチンを0.02％に含む0.1％BSA―生理食塩
液で調製した。 結果を第２図に示した。 実施例 ３ 抗ヒトミオグロビン抗体についても実施例１の
如く調製し標準曲線を作成した。結果を第３図に
示した。 実施例 ４ 抗ヒトβ2―マイクログロブリンウサギ抗体につ
いて実施例１の如く調製した。β2―マイクロブロ
ブリン標品は精製卵アルブミンを0.05％に含む生
理食塩液で調製した。 実施例 ５ 非リウマチ血清、リウマチ凝集反応検査依頼の
患者血清および明らかにリウマチと診断されまた
リウマチ凝集反応で（）と判定された患者血清
を0.1％BSA―生理食塩液で４倍に希釈し、その
200μlを７mm×７mmキユベツトに入れ、実施例１
で調製したラテツクス試薬50μlを注入１分間反応
させ、その間の透過光量（波長940nm）の時間当
りの変化を測定した。その結果を表１に示した。
陽性例については、２抗体法による放射免疫検定
法（RIA）により確認した。 実施例 ６ 実施例５で疑陽性を呈した検体に、抗体を作成
したと同じ動物の免疫グロブリン構成分画を最終
濃度が0.005から２％になるように加え、実施例
５と同様に反応させた（結果を表２に示した。）。
【表】
【表】
＊ 同一検体
＊＊ 表３参照
抗体IgG感作ラテツクス試薬では、健常者でも
通常20ないし30％に凝陽性反応をみるが、Ｆ
（ab′）2抗体で調製したラテツクス試薬でも厳密に
は１ないし４％程度に疑反応が出現した。これら
の検体に正常ウサギの免疫グロブリン構成分画を
0.005から0.5％を加えると疑陽性は消失しラテツ
クス凝集反応の特異性を高度に向上させることが
できた（表２）。 実施例 ７ 実施例３で調製したラテツクス試薬をガラスス
ライド上で定性的に反応させることも可能であつ
た。即ちPIAで強く疑反応を呈した検体を１滴
（約40μl）ガラススライド上に滴下し、更にＦ
（ab′）2分画を0.2％に含むBSA―生理食塩液を１
滴追加混合しついでミオグロビン（Mb）のラテ
ツクス試薬を１滴加えて混合し、前后に揺動させ
乍ら３分間反応させ凝集の有無を検した。正常人
血清中のMb量は約30ngと低いので通常の検体で
はスライド反応では陽性反応を生じない。しかし
PIAで550ng相当量の反応を示した検体をスライ
ド上で再検すると１分30秒で凝集反応を呈した。
上記処理により反応は陰転した。 実施例 ８ 酵素免疫法（固相法）でも感作用抗体にFabか
Ｆ（ab′）2分画が用いられるが、かかる場合もある
種の検体で疑反応が出現する。かかる検体も正常
免疫グロブリン好ましくはFab分画かＦ（ab′）2分
画による検体処理で疑反応は完全に消失する。 具体的には正常ウサギＦ（ab′）2分画が0.05ない
し0.2％濃度になるよう調製した緩衝液を0.5μl試
験管にとり疑反応血清を20μl加え混和し、かかる
処置血清検体に抗AFPウサギＦ（ab′）2抗体感作ビ
ーズを１個入れ、37℃に加温反応させる。以下の
操作は常法に依る。（石川、加藤、医学のあゆみ
102巻58ページ、1977年） 実施例 ９ シアノジエンブロマイド活性化セフアロース
（フアルマシアフアインケミカルズ社商標）4B1
ｇに15mgの正常モルモツトのＦ（ab′）2分画を結合
し、抗MbモルモツトＦ（ab′）2抗体を使つたPIA
で疑陽性を示した検体と混合処理しその上清を
PIAで再検した。山羊Ｆ（ab′）2構成分画での処理
では若干疑反応性は低下したが該モルモツトＦ
（ab′）2構成分画での処理により疑反応は完全に消
失した。
＊＊ 表３参照
抗体IgG感作ラテツクス試薬では、健常者でも
通常20ないし30％に凝陽性反応をみるが、Ｆ
（ab′）2抗体で調製したラテツクス試薬でも厳密に
は１ないし４％程度に疑反応が出現した。これら
の検体に正常ウサギの免疫グロブリン構成分画を
0.005から0.5％を加えると疑陽性は消失しラテツ
クス凝集反応の特異性を高度に向上させることが
できた（表２）。 実施例 ７ 実施例３で調製したラテツクス試薬をガラスス
ライド上で定性的に反応させることも可能であつ
た。即ちPIAで強く疑反応を呈した検体を１滴
（約40μl）ガラススライド上に滴下し、更にＦ
（ab′）2分画を0.2％に含むBSA―生理食塩液を１
滴追加混合しついでミオグロビン（Mb）のラテ
ツクス試薬を１滴加えて混合し、前后に揺動させ
乍ら３分間反応させ凝集の有無を検した。正常人
血清中のMb量は約30ngと低いので通常の検体で
はスライド反応では陽性反応を生じない。しかし
PIAで550ng相当量の反応を示した検体をスライ
ド上で再検すると１分30秒で凝集反応を呈した。
上記処理により反応は陰転した。 実施例 ８ 酵素免疫法（固相法）でも感作用抗体にFabか
Ｆ（ab′）2分画が用いられるが、かかる場合もある
種の検体で疑反応が出現する。かかる検体も正常
免疫グロブリン好ましくはFab分画かＦ（ab′）2分
画による検体処理で疑反応は完全に消失する。 具体的には正常ウサギＦ（ab′）2分画が0.05ない
し0.2％濃度になるよう調製した緩衝液を0.5μl試
験管にとり疑反応血清を20μl加え混和し、かかる
処置血清検体に抗AFPウサギＦ（ab′）2抗体感作ビ
ーズを１個入れ、37℃に加温反応させる。以下の
操作は常法に依る。（石川、加藤、医学のあゆみ
102巻58ページ、1977年） 実施例 ９ シアノジエンブロマイド活性化セフアロース
（フアルマシアフアインケミカルズ社商標）4B1
ｇに15mgの正常モルモツトのＦ（ab′）2分画を結合
し、抗MbモルモツトＦ（ab′）2抗体を使つたPIA
で疑陽性を示した検体と混合処理しその上清を
PIAで再検した。山羊Ｆ（ab′）2構成分画での処理
では若干疑反応性は低下したが該モルモツトＦ
（ab′）2構成分画での処理により疑反応は完全に消
失した。
第１図は、抗AFP感作ラテツクスによるPIA
の標準曲線を示すグラフである。第２図は、抗ヒ
トフイブリノゲン抗体感作ラテツクスによるPIA
の標準曲線を示すグラフであり、―○―印は抗体
Ｆ（ab′）2感作ラテツクスについて、…○…は抗体
IgG感作ラテツクスについての結果を示す。第３
図は、抗ヒトミオグロビン抗体Ｆ（ab′）2感作ラテ
ツクスによるPIAの標準曲線を示すグラフであ
る。
の標準曲線を示すグラフである。第２図は、抗ヒ
トフイブリノゲン抗体感作ラテツクスによるPIA
の標準曲線を示すグラフであり、―○―印は抗体
Ｆ（ab′）2感作ラテツクスについて、…○…は抗体
IgG感作ラテツクスについての結果を示す。第３
図は、抗ヒトミオグロビン抗体Ｆ（ab′）2感作ラテ
ツクスによるPIAの標準曲線を示すグラフであ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 免疫グロブリンのＦ（ab′）2分画、Fab′分画、
Fab分画またはFd分画の構成分画を有効成分と
する免疫反応の安定化剤。 ２ 特許請求の範囲第１項に記載の安定化剤にお
いて、血清アルブミンまたは卵アルブミンを併せ
含むことを特徴とするもの。 ３ 特許請求の範囲第１項〜第２項のいずれかに
記載の安定化剤において、膠原繊維由来の蛋白質
を併せ含むことを特徴とするもの。 ４ 反応媒体中で、測定すべき抗原または抗体
と、それに対応する抗体または抗原とを反応させ
る抗原―抗体反応の測定法において、抗原と抗体
との反応を、測定すべき抗体または測定すべき抗
原に対応する抗体とは無関与の免疫グロブリンの
Ｆ（ab′）2分画、Fab′分画、Fab分画またはFd分画
の構成分画の存在下に行うか、測定すべき抗原ま
たは抗体を含む検体と該構成分画とを予め接触処
理し、該構成分画の反応物を分離除去後行うこと
を特徴とする抗原―抗体反応の測定法。 ５ 特許請求の範囲第４項に記載の測定法におい
て、血清アルブミンまたは卵アルブミンの存在下
に、抗原と抗体との反応を行うことを特徴とする
方法。 ６ 特許請求の範囲第４項〜第５項のいずれかに
記載の測定法において、膠原繊維由来の蛋白質の
存在下に、抗原と抗体との反応を行うことを特徴
とする方法。 ７ 特許請求の範囲第４項〜第６項のいずれかに
記載の測定法において、測定すべき抗原として可
溶性抗原を、それに対応する抗体として可溶性抗
体分画を用いることを特徴とする方法。 ８ 特許請求の範囲第４項〜第６項のいずれかに
記載の測定法において、測定すべき抗原または抗
体に対応する抗体または抗原として、生物細胞担
体に感作させたものを用いることを特徴とする方
法。 ９ 特許請求の範囲第４項〜第６項のいずれかに
記載の測定法において、測定すべき抗原または抗
体に対応する抗体または抗原として、合成担体に
感作させたものを用いることを特徴とする方法。 １０ 特許請求の範囲第４項〜第９項のいずれか
に記載の測定法において、抗原と抗体との反応を
光学的に測定することを特徴とする方法。 １１ 特許請求の範囲第４項〜第９項のいずれか
に記載の測定法において、抗原と抗体との反応を
放射免疫学的に測定することを特徴とする方法。 １２ 特許請求の範囲第４項〜第９項のいずれか
に記載の測定法において、抗原と抗体との反応を
酵素免疫学的に測定することを特徴とする方法。 １３ 特許請求の範囲第４項〜第９項のいずれか
に記載の測定法において、抗原と抗体との反応を
螢光免疫学的に測定することを特徴とする方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8363080A JPS579723A (en) | 1980-06-20 | 1980-06-20 | Stabilizing agent for immunological reaction and measuring method of antigen-antibody reaction |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8363080A JPS579723A (en) | 1980-06-20 | 1980-06-20 | Stabilizing agent for immunological reaction and measuring method of antigen-antibody reaction |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS579723A JPS579723A (en) | 1982-01-19 |
| JPH026023B2 true JPH026023B2 (ja) | 1990-02-07 |
Family
ID=13807780
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8363080A Granted JPS579723A (en) | 1980-06-20 | 1980-06-20 | Stabilizing agent for immunological reaction and measuring method of antigen-antibody reaction |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS579723A (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3266967D1 (en) * | 1982-01-05 | 1985-11-21 | Int Inst Cellular Molecul Path | Method of immunoassay |
| DE3206729A1 (de) * | 1982-02-25 | 1983-09-01 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Immunologisches agglutinationsverfahren |
| JPS5992353A (ja) * | 1982-11-19 | 1984-05-28 | Shinotesuto Kenkyusho:Kk | 不溶性担体粒子を用いる凝集反応測定方法 |
| JPH0634013B2 (ja) * | 1985-03-25 | 1994-05-02 | 栄治 石川 | 高感度免疫測定法 |
| JPH0778025B2 (ja) * | 1990-03-20 | 1995-08-23 | 日本赤十字社 | 免疫グロブリンｇの製造方法 |
| DE4439452A1 (de) * | 1994-11-04 | 1996-05-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Antikörperklassenspezifisches Entstörungsreagenz |
| JPH0968531A (ja) * | 1995-08-31 | 1997-03-11 | Sanyo Chem Ind Ltd | 免疫測定法 |
| JP6890444B2 (ja) * | 2017-03-27 | 2021-06-18 | 栄研化学株式会社 | 異なる担持方式で固定化した抗体担持不溶性担体粒子を用いる抗原測定法、抗原測定用試薬、及び、測定用キット |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5512419A (en) * | 1978-07-13 | 1980-01-29 | Teikoku Hormone Mfg Co Ltd | Immunological measurement and reagent therefor |
-
1980
- 1980-06-20 JP JP8363080A patent/JPS579723A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS579723A (en) | 1982-01-19 |
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