JPH0260587A - コクシジウム症ワクチン - Google Patents
コクシジウム症ワクチンInfo
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- JPH0260587A JPH0260587A JP1165162A JP16516289A JPH0260587A JP H0260587 A JPH0260587 A JP H0260587A JP 1165162 A JP1165162 A JP 1165162A JP 16516289 A JP16516289 A JP 16516289A JP H0260587 A JPH0260587 A JP H0260587A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ＤＮＡフラグメント及び該ＤＮＡフラグメン
トによりコードされるＥｉｍｅｒｉａポリペプチド、特
定のＤＮＡフラグメントを含む組換体ＤＮＡ、この組換
体ＤＮＡを有する宿主細胞、及びこれらの生成物をベー
スとする抗コクシジウム症ワクチンに係る。
トによりコードされるＥｉｍｅｒｉａポリペプチド、特
定のＤＮＡフラグメントを含む組換体ＤＮＡ、この組換
体ＤＮＡを有する宿主細胞、及びこれらの生成物をベー
スとする抗コクシジウム症ワクチンに係る。
コクシジウム症は＾ｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ亜門及びＥｉ
ｍｅｒｉａ属の細胞内寄生虫である原虫類プロトシアに
起因する疾患である。これらの寄生虫は宿主の胃腸管及
び消化器官の一部を形成する細胞内で繁殖する。
ｍｅｒｉａ属の細胞内寄生虫である原虫類プロトシアに
起因する疾患である。これらの寄生虫は宿主の胃腸管及
び消化器官の一部を形成する細胞内で繁殖する。
集約的生産の増加により、これらの寄生虫によって家禽
産業で生じる損害はここ数十年間に驚くほど増加してい
る。オランダの家禽飼養業者が年間に受ける損害は百方
ギルダー以上に及び、１９８６年の損害は約１３，００
０，０００ギルダーであった。同年に米国では抗コクシ
ジウム剤を使用したにも拘わらず３００，０００，０Ｏ
ＯＵ、Ｓ、ドルの損害があった。
産業で生じる損害はここ数十年間に驚くほど増加してい
る。オランダの家禽飼養業者が年間に受ける損害は百方
ギルダー以上に及び、１９８６年の損害は約１３，００
０，０００ギルダーであった。同年に米国では抗コクシ
ジウム剤を使用したにも拘わらず３００，０００，０Ｏ
ＯＵ、Ｓ、ドルの損害があった。
ニワトリのコクシジウム症の病原体は９種類の異なる型
、即ちＥｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ＋Ｅ、
ｍａｘｉ＋ｎａ、分類することができる。しかしながら
、後者の２種類の型の存在については疑問をもつ者もあ
る。
、即ちＥｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ＋Ｅ、
ｍａｘｉ＋ｎａ、分類することができる。しかしながら
、後者の２種類の型の存在については疑問をもつ者もあ
る。
これらの型はいずれもニワトリのみを宿主とし、高度の
組織特異性を示す。一方、該型の生活環は類似している
。
組織特異性を示す。一方、該型の生活環は類似している
。
ニワトリに及ぼす病原効果は型によって異なるが、ニワ
トリの型もある程度影響し、例えば、Ｌａｃｅｒｖｕ
ｌ ｉｎａ又はＥ、 ｍａｘｉｍａのような寄生虫は食
物消化が主要な役割を占める小腸の大部分に寄生するの
で、若鶏に多大な損害を与える。
トリの型もある程度影響し、例えば、Ｌａｃｅｒｖｕ
ｌ ｉｎａ又はＥ、 ｍａｘｉｍａのような寄生虫は食
物消化が主要な役割を占める小腸の大部分に寄生するの
で、若鶏に多大な損害を与える。
生活環の間に、Ｅｉｍｅｒｉａ寄生虫は多数の段階分経
過する。感染段階（胞子形成オーシスト）は経口であり
、ニワトリの胃に入り、粉砕作用の結果としてシストの
外皮が破裂する。このオーシストに含まれる４つのスポ
ロシストは放出され、十二指腸に入り、こうして胆汁及
び消化酵素に暴露される。その結果、スポロシストの壁
に穴があき、スポロシスト中に存在するスポロゾイトが
放出される。これらのスポロゾイトは可動性であり、侵
入及び増殖するために適当な宿主細胞（例えば上皮細胞
）を探す。型に依存してこの第１の増殖相は２０〜４８
時間続き、数千のメロゾイトが形成され、夫々新しい宿
主細胞に侵入して増殖する。これらの無性生殖サイクル
が２〜５回行われた後、細胞内メロゾイトは有性邪悪に
成長し、雌雄有性生殖母細胞となる。雄生殖体により雌
生殖体が受精後、受精卵が形成され、周囲にシスト壁を
形成する。
過する。感染段階（胞子形成オーシスト）は経口であり
、ニワトリの胃に入り、粉砕作用の結果としてシストの
外皮が破裂する。このオーシストに含まれる４つのスポ
ロシストは放出され、十二指腸に入り、こうして胆汁及
び消化酵素に暴露される。その結果、スポロシストの壁
に穴があき、スポロシスト中に存在するスポロゾイトが
放出される。これらのスポロゾイトは可動性であり、侵
入及び増殖するために適当な宿主細胞（例えば上皮細胞
）を探す。型に依存してこの第１の増殖相は２０〜４８
時間続き、数千のメロゾイトが形成され、夫々新しい宿
主細胞に侵入して増殖する。これらの無性生殖サイクル
が２〜５回行われた後、細胞内メロゾイトは有性邪悪に
成長し、雌雄有性生殖母細胞となる。雄生殖体により雌
生殖体が受精後、受精卵が形成され、周囲にシスト壁を
形成する。
このオーシストは宿主細胞を離れ、糞便と共に排出され
る。ニワトリの外部の温度及び湿度が比較的高く、同時
に空気中の酸素が十分である場合、オーシストは胞子を
形成して感染段階に入り得る。
る。ニワトリの外部の温度及び湿度が比較的高く、同時
に空気中の酸素が十分である場合、オーシストは胞子を
形成して感染段階に入り得る。
このように、ニワトリからニワトリへと寄生虫が移動す
るために中間宿主は必要ない。従って、有効表面積の占
める割合が高いと、養鶏場の感染の切迫は迅速に増加す
ると考えられる。
るために中間宿主は必要ない。従って、有効表面積の占
める割合が高いと、養鶏場の感染の切迫は迅速に増加す
ると考えられる。
寄生虫は種々の方法で対処され得る。
良好な管理の使用以外に、駆除剤をしばしば飼料又は飲
用水に混合して使用することによりコクシジウム症に対
処することができる。しかしながら、寄生虫が種々の駆
除剤に対する抵抗を生じる遺伝的能力が高いなどの理由
により、これらの駆除剤の効力は近年低下している。更
に、これらの駆除剤の多数は食肉に残留物を残し、消費
に問題を生じかねない。
用水に混合して使用することによりコクシジウム症に対
処することができる。しかしながら、寄生虫が種々の駆
除剤に対する抵抗を生じる遺伝的能力が高いなどの理由
により、これらの駆除剤の効力は近年低下している。更
に、これらの駆除剤の多数は食肉に残留物を残し、消費
に問題を生じかねない。
従って、免疫的予防法のほうがずっと好ましい対処方法
である。十分高い感染の間に生存し続けたニワトリは後
で同−型のＥｉｍｅｒｉａと接触した場合にこれに抵抗
することが可能である。Ｅｉｍｅｒｉａに対する抵抗は
、ニワトリを低用量のオーシスト又は希釈（非病原体）
株のオ・−シスＩ・で数回感染させることによっても誘
導することができる６しがしながら、特に屠殺用の多数
のニワトリへの管理下の投与は、この場合、実買的に克
服し難い問題である。従って、不活性化ワクチンが唯一
の残された解決方法であると思われる。
である。十分高い感染の間に生存し続けたニワトリは後
で同−型のＥｉｍｅｒｉａと接触した場合にこれに抵抗
することが可能である。Ｅｉｍｅｒｉａに対する抵抗は
、ニワトリを低用量のオーシスト又は希釈（非病原体）
株のオ・−シスＩ・で数回感染させることによっても誘
導することができる６しがしながら、特に屠殺用の多数
のニワトリへの管理下の投与は、この場合、実買的に克
服し難い問題である。従って、不活性化ワクチンが唯一
の残された解決方法であると思われる。
不活性化ワクチンは寄生虫に由来する抗原から構成され
得、場合によってはアジュバントを含む。
得、場合によってはアジュバントを含む。
寄生虫から単離される抗原の代わりに、ＤＮＡ組換技術
により作製された生成物を使用することができ、この技
術は既知方法に従って実施され得る。
により作製された生成物を使用することができ、この技
術は既知方法に従って実施され得る。
更に、ワクチン接種は、抗原をコードする遺伝子が会合
した細菌、真菌又はウィルスのような生体宿主生物を投
与することにより実施され得る。
した細菌、真菌又はウィルスのような生体宿主生物を投
与することにより実施され得る。
この生物は抗原の十分な長期間の合成を確保し、こうし
てニワトリの免疫系は十分に刺激される。
てニワトリの免疫系は十分に刺激される。
同時に、抗原又はその一部を合成により複製し、例えば
アジュバントの存在下でキャリアタンパクに結合された
免疫的に認識可能な刺激形として該抗原をニワトリに投
与することが可能である。
アジュバントの存在下でキャリアタンパクに結合された
免疫的に認識可能な刺激形として該抗原をニワトリに投
与することが可能である。
本発明によると、Ｅ、 ａｃｅｒｖｕｌｉｎａに由来し
且つ大腸菌株に１２Ｊ八２２１を形質転換させたプラス
ミドｐＥａｌ＾（Ｂａａｒｎ（オランダ）に所在のＣｅ
ｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅ
ｌｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託番号ＣＢ５１４３．８８で寄
託）のインサージョンとして存在するデオキシポリヌク
レオチドによりコードされるポリペプチド又はその免疫
等傷物又はその一部を、家禽をコクシジウム症に対して
免疫するために使用することが可能である。
且つ大腸菌株に１２Ｊ八２２１を形質転換させたプラス
ミドｐＥａｌ＾（Ｂａａｒｎ（オランダ）に所在のＣｅ
ｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅ
ｌｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託番号ＣＢ５１４３．８８で寄
託）のインサージョンとして存在するデオキシポリヌク
レオチドによりコードされるポリペプチド又はその免疫
等傷物又はその一部を、家禽をコクシジウム症に対して
免疫するために使用することが可能である。
更に、本発明は、Ｅｉｍｅｒｉａ種に由来するデオキシ
ポリヌクレオチドによりコードされ且つ挿入されたデオ
キシポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするＥｉＩ
Ｉｌｅｒｉａ種のポリペプチド又はその免疫等価物°又
はその一部の、コクシジウム症に対する家禽の免疫のた
めの使用にも及ぶ。
ポリヌクレオチドによりコードされ且つ挿入されたデオ
キシポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするＥｉＩ
Ｉｌｅｒｉａ種のポリペプチド又はその免疫等価物°又
はその一部の、コクシジウム症に対する家禽の免疫のた
めの使用にも及ぶ。
上記プラスミドｐＥａ ｌ＾は、第１図に関して本明細
書中の実施例に概略的に説明するような方法により作製
される。
書中の実施例に概略的に説明するような方法により作製
される。
ファージλ、１ｔｔｔ（参考資料４）は、該ファージが
単一の制限部位を有する制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した
。Ｅ、 ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ ｍＲＮ＾に基づいて作
製されたｃＤＮＡをこの制限部位：λｇｔｌｌＥａｌ＾
に挿入する。制限酵素Ｋｐｎ ｌ及びＳａｃ ｌで処理
後、こうして得られた組換体ファージからファージフラ
グメントが単離され、該フラグメントは該ｃＤＮＡと、
ＬａｃＺ遺伝子におけるλｇｔｌｌのＥｃｏＲＩ制限部
位の位置がら由来するフランキングＤＮＡセクションと
から構成される。同様にプラスミドｐＵｃ１８（参考資
料６）をＫｐｎ ｉ及びＳａｃ Ｉで処理し、次にｃＤ
ＮＡ：ｐＵＣ１８／Ｅａｌ八を含む上記ファージフラグ
メントに連結した。
単一の制限部位を有する制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した
。Ｅ、 ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ ｍＲＮ＾に基づいて作
製されたｃＤＮＡをこの制限部位：λｇｔｌｌＥａｌ＾
に挿入する。制限酵素Ｋｐｎ ｌ及びＳａｃ ｌで処理
後、こうして得られた組換体ファージからファージフラ
グメントが単離され、該フラグメントは該ｃＤＮＡと、
ＬａｃＺ遺伝子におけるλｇｔｌｌのＥｃｏＲＩ制限部
位の位置がら由来するフランキングＤＮＡセクションと
から構成される。同様にプラスミドｐＵｃ１８（参考資
料６）をＫｐｎ ｉ及びＳａｃ Ｉで処理し、次にｃＤ
ＮＡ：ｐＵＣ１８／Ｅａｌ八を含む上記ファージフラグ
メントに連結した。
この挿入のｃＤＮＡＤＮＡョンに決定されるヌクレオチ
ド配列を第２図に示す。同様にアミノ酸配列も決定され
る。
ド配列を第２図に示す。同様にアミノ酸配列も決定され
る。
所与のアミノ酸では、しばしば数種類の異なるコドン（
ヌクレオチド塩基のトリブレット）がＤＮＡ中でコード
し得ることが知られている。即ち、ＧＬＵ（グルタミン
酸）のコドンは例えばＧＡＴ又はＧＡＡである。当然の
ことながら第２図のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（又はそのフラグメント）を発現させるために、別の同
様のコドン組成を有するＤＮＡを使用してもよい。
ヌクレオチド塩基のトリブレット）がＤＮＡ中でコード
し得ることが知られている。即ち、ＧＬＵ（グルタミン
酸）のコドンは例えばＧＡＴ又はＧＡＡである。当然の
ことながら第２図のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（又はそのフラグメント）を発現させるために、別の同
様のコドン組成を有するＤＮＡを使用してもよい。
本発明のポリペプチドを発現させるなめに、過酷な条件
下で既知の方法に従ってプラスミドＥａｌ八のｃＤＮＡ
ＤＮＡョンとハイブリダイズするＥｉｍｅｒｉａ種のゲ
ノムＤＮＡ又はｃＤＮＡからＤＮＡフラグメントを単離
することにより得られるＤＮＡフラグメントを使用する
こともできる。必要に応じてこの型のＤＮＡフラグメン
トは、上記ｃＤＮＡＤＮＡョン以外にポリペプチドをコ
ードする別のフランキングＤＮＡ部分も有し得る。
下で既知の方法に従ってプラスミドＥａｌ八のｃＤＮＡ
ＤＮＡョンとハイブリダイズするＥｉｍｅｒｉａ種のゲ
ノムＤＮＡ又はｃＤＮＡからＤＮＡフラグメントを単離
することにより得られるＤＮＡフラグメントを使用する
こともできる。必要に応じてこの型のＤＮＡフラグメン
トは、上記ｃＤＮＡＤＮＡョン以外にポリペプチドをコ
ードする別のフランキングＤＮＡ部分も有し得る。
ハイブリダイゼーションにより得られるこの型のＤＮＡ
フラグメント及びこれらのフラグメントを含む組換体Ｄ
ＮＡへ子も本発明の一部をなす。
フラグメント及びこれらのフラグメントを含む組換体Ｄ
ＮＡへ子も本発明の一部をなす。
これらのＤＮＡフラグメントによりコードされ且つ保護
免疫性を有するポリペプチドも本発明の一部をなす。
免疫性を有するポリペプチドも本発明の一部をなす。
更に、コクシジウム症に対する家禽の免疫のために使用
可能なこれらのポリペプチドのフラグメントも本発明の
一部をなす。既知又は未知のアミノ酸配列内でこのよう
な使用可能なポリペプチドフラグメント（エピト−プと
呼称される）を検出するための種々の方法が知られてい
る。既知のアミノ酸配列に基づき、例えば特許公開明細
書１ｌＩｏ ８４１０３５６４及びＷｏ ８６１０６４
８７に記載のスクリーニング方法によりこれらのエピト
ープを実験的に決定することができる。
可能なこれらのポリペプチドのフラグメントも本発明の
一部をなす。既知又は未知のアミノ酸配列内でこのよう
な使用可能なポリペプチドフラグメント（エピト−プと
呼称される）を検出するための種々の方法が知られてい
る。既知のアミノ酸配列に基づき、例えば特許公開明細
書１ｌＩｏ ８４１０３５６４及びＷｏ ８６１０６４
８７に記載のスクリーニング方法によりこれらのエピト
ープを実験的に決定することができる。
更に、理論的考察及び既知のエピトープとの構造的一致
に基づき、上記アミノ酸配列を有するポリペプチドの多
数の領域をエピトープとして指定することができる。こ
れらの領域の決定は、Ｊ、Ｉ’。
に基づき、上記アミノ酸配列を有するポリペプチドの多
数の領域をエピトープとして指定することができる。こ
れらの領域の決定は、Ｊ、Ｉ’。
ｔｌ ｏ １１１）及びに、Ｒ，Ｗｏｏｄｓ（参考資料
５）による親水性度基準と、Ｐ、Ｙ、 Ｃｈｏｕ及びＧ
、Ｄ、 Ｆａｓｍａｎ（参考資料８）の二次構造相を基
にした。
５）による親水性度基準と、Ｐ、Ｙ、 Ｃｈｏｕ及びＧ
、Ｄ、 Ｆａｓｍａｎ（参考資料８）の二次構造相を基
にした。
領域：Ｉ、ｅｕ２ｏ−Δｒｇ３ｔ、Ｇｌｙ＜＋−Ｍｅｔ
５１、Ｈ＋ Ｓ ２ ｓ ２ＣＹＳ２４ｓ、Ｇｌｕ：＋
２ｓ−Ｇｌｙｚ３４、Ｇｌｙ３３５−Ｖａｌｚ４ｓ、Ｇ
ＩＶｔｓｓＧｌｕｚａｓが抗体の予想されるエピトープ
を含む。
５１、Ｈ＋ Ｓ ２ ｓ ２ＣＹＳ２４ｓ、Ｇｌｕ：＋
２ｓ−Ｇｌｙｚ３４、Ｇｌｙ３３５−Ｖａｌｚ４ｓ、Ｇ
ＩＶｔｓｓＧｌｕｚａｓが抗体の予想されるエピトープ
を含む。
必要と思われるＴ細胞エピトープは、同様にＢｅｒｚｏ
ｆｓｋｙの両親媒性度基準（参考前ｆＪ９）により理論
根拠に基づいて誘導することもできる。
ｆｓｋｙの両親媒性度基準（参考前ｆＪ９）により理論
根拠に基づいて誘導することもできる。
本発明によるコクシジウム症惑染に対する免疫のために
は、例えば抗イデイオタイプ抗体又はその抗原結合フラ
グメントを使用することも可能である。このような抗体
は、本発明のポリペプチドに指向される抗体のイディオ
タイプに指向される。
は、例えば抗イデイオタイプ抗体又はその抗原結合フラ
グメントを使用することも可能である。このような抗体
は、本発明のポリペプチドに指向される抗体のイディオ
タイプに指向される。
以上に挙げた本発明のポリペプチドの免疫等価物は特に
この型の抗イデイオタイプ抗体を意味するものと理解さ
れたい。
この型の抗イデイオタイプ抗体を意味するものと理解さ
れたい。
所期の免疫は、例えばニワトリに本発明のポリペプチド
又はその免疫セクション又は等価物を投与することによ
り、又はＦＡ＃ＩＡ体ＤＮＡにより遺伝的に修飾されて
おり且つポリペプチド又はその免疫的セクション又はそ
の等価物を元々産生ずることが可能な微生物を免疫すべ
きニワトリに投与することにより実施され得る。
又はその免疫セクション又は等価物を投与することによ
り、又はＦＡ＃ＩＡ体ＤＮＡにより遺伝的に修飾されて
おり且つポリペプチド又はその免疫的セクション又はそ
の等価物を元々産生ずることが可能な微生物を免疫すべ
きニワトリに投与することにより実施され得る。
本発明に従って家禽をコクシジウム症に対して免疫する
ためには、一方でニワトリ等に本発明のポリペプチド、
フラグメント又は免疫等価物を投与することが可能であ
り、他方では、必要に応じて遺伝的操作により本発明の
ポリペプチド等を産生ずる能力を獲得した微生物を投与
することが可能である。前者の場合には「サブユニット
ワクチン」なる用語がしばしば使用され、後者の場合に
は「ベクターワクチン」なる用語が通常使用されており
、本明細書でもこの名称を使用する。
ためには、一方でニワトリ等に本発明のポリペプチド、
フラグメント又は免疫等価物を投与することが可能であ
り、他方では、必要に応じて遺伝的操作により本発明の
ポリペプチド等を産生ずる能力を獲得した微生物を投与
することが可能である。前者の場合には「サブユニット
ワクチン」なる用語がしばしば使用され、後者の場合に
は「ベクターワクチン」なる用語が通常使用されており
、本明細書でもこの名称を使用する。
本発明のサブユニットワクチンは一般に、場合によって
医薬上許容可能な賦形剤の存在下で精製形のポリペプチ
ドを含有している。ポリペプチドは場合によっては、例
えば融合生成物の精製に有利であり得る非関連タンパク
質に共有結合している。具体例はβ−ガラクトシダーゼ
、プロティン＾、プロキモシン、血液凝固因子Ｘａ等で
ある。
医薬上許容可能な賦形剤の存在下で精製形のポリペプチ
ドを含有している。ポリペプチドは場合によっては、例
えば融合生成物の精製に有利であり得る非関連タンパク
質に共有結合している。具体例はβ−ガラクトシダーゼ
、プロティン＾、プロキモシン、血液凝固因子Ｘａ等で
ある。
このような用途のポリペプチドは、ＤＮＡ組換技術又は
ペプチド合成により例えばＥ、 ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ
又は他のＥｉｍｅｒｉａ種から単離することにより、既
知方法を利用して作製され得る。
ペプチド合成により例えばＥ、 ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ
又は他のＥｉｍｅｒｉａ種から単離することにより、既
知方法を利用して作製され得る。
必要に応じて、ポリペプチドは例えばグリコジル化、ア
ミド化、カルボキシル化又はホスホリル化によりｉｎ
ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで修飾され得る。
ミド化、カルボキシル化又はホスホリル化によりｉｎ
ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで修飾され得る。
ベクターワクチンの場合、本発明のポリペプチド生成物
は免疫すべき個体にそのまま投与され且つ体内で所定期
間自己維持し、あるいは増殖するような遺伝的に操作さ
れた生物により作製される。
は免疫すべき個体にそのまま投与され且つ体内で所定期
間自己維持し、あるいは増殖するような遺伝的に操作さ
れた生物により作製される。
この目的のための宿主としては種々の生物を使用するこ
とができ、例えば、大腸菌、桿菌、もしくはサルモネラ
薗のような細菌、又は牛痘もしくは鶏痘ウィルスのよう
なウィルスが使用される。この型の宿主生物を使用する
と、ポリペプチドは表面抗原として発現することができ
る。この点では、該ポリペプチドをＯＭＰプロティン又
は大腸菌の線毛タンパクと融合させるか、又は生物によ
り認識されるシグナル又はアンカー配列の合成が考えら
れる。必要に応じて該免疫ポリペプチドの一部又は全体
を免疫すべき動物の体内に放出することも可能である。
とができ、例えば、大腸菌、桿菌、もしくはサルモネラ
薗のような細菌、又は牛痘もしくは鶏痘ウィルスのよう
なウィルスが使用される。この型の宿主生物を使用する
と、ポリペプチドは表面抗原として発現することができ
る。この点では、該ポリペプチドをＯＭＰプロティン又
は大腸菌の線毛タンパクと融合させるか、又は生物によ
り認識されるシグナル又はアンカー配列の合成が考えら
れる。必要に応じて該免疫ポリペプチドの一部又は全体
を免疫すべき動物の体内に放出することも可能である。
また、これらのケースのいずれにおいても、種々の病原
体及び／又は所与の病原体の種々の抗原に対する予防を
生じる１種以上の免疫生成物を発現させることも可能で
ある。
体及び／又は所与の病原体の種々の抗原に対する予防を
生じる１種以上の免疫生成物を発現させることも可能で
ある。
５Ｘ１０”個のＥ、 ａｃｅｒｖｕｌｉｎａオーシスト
を６０１１の１０−″門並ジチオン酸ナトリウムに懸濁
した懸濁液を遠心分離した後、ベレットを１００Ｒｊ！
の無菌水で１回洗った。細胞を５００ａ＋４の２％重ク
ロム酸カリウムに再懸濁した後、強い曝気作用下に３０
℃で７時間インキュベートした。次にオーシストを遠心
分離により収集し、２００ｚＮの無菌水で３回洗った。
を６０１１の１０−″門並ジチオン酸ナトリウムに懸濁
した懸濁液を遠心分離した後、ベレットを１００Ｒｊ！
の無菌水で１回洗った。細胞を５００ａ＋４の２％重ク
ロム酸カリウムに再懸濁した後、強い曝気作用下に３０
℃で７時間インキュベートした。次にオーシストを遠心
分離により収集し、２００ｚＮの無菌水で３回洗った。
肥匙υＬ」
ＲＮＡを単離（参考資料１）するために、１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ酢酸塩（ｐ１１７．６）、７５ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、１％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴ＾、０．２ｚｇ／ｗｌ
タンパク分解酵素Ｋ及び１０ ＩＩＩ Ｍバナジルリボ
ヌクレオシド複合体を含有する緩衝液２．８ｘ１に細胞
ペレットを加えた。１３ｇのガラスピーズ（φ０．５ｍ
ｍ）の存在下で６０秒間（最大）渦動させることにより
オーシストを破壊した。抽出物全体に５′Ｒ１のフェノ
ールを加え、混合物を更に６０秒間渦動させた。遠心分
離後、上清液をとベットでとり、等量のフェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）
で再び抽出した。２．５容量のエタノールを加えた後に
ＲＮＡが沈降したので、形成された沈降物を８００．ｆ
のＴｒｉｓ １０ｍＭ、 ＥＤＴ八Ｏへ１ｍＭｐＨ７，
６（Ｔ＋ｏＥｏ、＋）に溶解させ、その後、生成物を等
量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール
（２５：２４：１）で更に２回、クロロホルム／イソア
ミルアルコール（２４：Ｌ）で２回抽出し、エタノール
で沈降させた。オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグ
ラフィ（参考資料２）によりｐｏｌｙＡ”−ＲＮＡを単
離した。５Ｘ１０”個のオーシストから約１００１Ｊｙ
のｐｏ Ｉ ｙＡ ′□−ＲＮ＾が単離された。
ｒｉｓ酢酸塩（ｐ１１７．６）、７５ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、１％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴ＾、０．２ｚｇ／ｗｌ
タンパク分解酵素Ｋ及び１０ ＩＩＩ Ｍバナジルリボ
ヌクレオシド複合体を含有する緩衝液２．８ｘ１に細胞
ペレットを加えた。１３ｇのガラスピーズ（φ０．５ｍ
ｍ）の存在下で６０秒間（最大）渦動させることにより
オーシストを破壊した。抽出物全体に５′Ｒ１のフェノ
ールを加え、混合物を更に６０秒間渦動させた。遠心分
離後、上清液をとベットでとり、等量のフェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）
で再び抽出した。２．５容量のエタノールを加えた後に
ＲＮＡが沈降したので、形成された沈降物を８００．ｆ
のＴｒｉｓ １０ｍＭ、 ＥＤＴ八Ｏへ１ｍＭｐＨ７，
６（Ｔ＋ｏＥｏ、＋）に溶解させ、その後、生成物を等
量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール
（２５：２４：１）で更に２回、クロロホルム／イソア
ミルアルコール（２４：Ｌ）で２回抽出し、エタノール
で沈降させた。オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグ
ラフィ（参考資料２）によりｐｏｌｙＡ”−ＲＮＡを単
離した。５Ｘ１０”個のオーシストから約１００１Ｊｙ
のｐｏ Ｉ ｙＡ ′□−ＲＮ＾が単離された。
Ｑ１七１滅工
酵素ＭＭＬＶ逆転写酵素によりｐｏｌｙＡ”−ＲＮＡを
ｃＤＮＡに転化した。このために、２５．ｇのｐｏｌｙ
Ａ”−ＲＮＡを９０１Ｊｌの水に溶解し、水酸化メチル
水銀を１１０ｆｆ１まで加えることにより２０℃で５分
間変性させた後、β−メルカプトエタノールを４５ｍＭ
まで加え、混合物を２０°Ｃで更に３分間インキュベー
トした。酵素反応は、ｈｙのオリゴ（ｄＴ）１５．１５
０ＵのｆｔＮＡｓ１ｎ”’、２０ＩｌＩＭＴｒｉｓ（ｐ
Ｈ７，６）、３０ｍＭ ＫＣＩ、４＋ｎＭジチオトレイ
１ヘール（ＤＴＴ）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２．１＋ｎＨ（
７） 各ｄＴＴＰ及び３００ＵノＭＭＬＶ逆転写酵素を
含有する緩衝液１９〇−中で実施した。
ｃＤＮＡに転化した。このために、２５．ｇのｐｏｌｙ
Ａ”−ＲＮＡを９０１Ｊｌの水に溶解し、水酸化メチル
水銀を１１０ｆｆ１まで加えることにより２０℃で５分
間変性させた後、β−メルカプトエタノールを４５ｍＭ
まで加え、混合物を２０°Ｃで更に３分間インキュベー
トした。酵素反応は、ｈｙのオリゴ（ｄＴ）１５．１５
０ＵのｆｔＮＡｓ１ｎ”’、２０ＩｌＩＭＴｒｉｓ（ｐ
Ｈ７，６）、３０ｍＭ ＫＣＩ、４＋ｎＭジチオトレイ
１ヘール（ＤＴＴ）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２．１＋ｎＨ（
７） 各ｄＴＴＰ及び３００ＵノＭＭＬＶ逆転写酵素を
含有する緩衝液１９〇−中で実施した。
３７°Ｃで１時間インキュベーション後に１０−の０．
５ＭＥＤＴ＾を加えることにより反応を停止した。等量
のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（
２５：２４二１）で抽出後、２Ｍまで酢酸アンモニウム
及び２．５容量のエタノールを加えることによりＲＮＡ
１０Ｎ＾ハイブリツドを沈降させた。酵素ＤＮＡ−ポリ
メラーゼＩ及びＲＮａｓｅＨ（参考資料３）の作用を組
み合わせることにより、第２の系列を合成した。２０ｍ
ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７，６）、５ｍＭ ＭｇＣＬ、１００
ｆｆ１Ｍ（ＮＨｌｏｏｆｆｌ、０．６ｍＭβ−ＮＡＤ、
１６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｈ１２００［１のＤＭＡ−ポリメ
ラーゼＩ及び２０ＵのＤＭＡ−リガーゼ（大腸菌）を含
有するＩＩ液９６０．ｆにベレ・ントを溶解した。１２
℃で１時間、次いで２２℃で１時間インキュベーション
後、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアル
コール（２５：２４：１）を加え、エタノールで沈降さ
せることにより反応を停止した。
５ＭＥＤＴ＾を加えることにより反応を停止した。等量
のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（
２５：２４二１）で抽出後、２Ｍまで酢酸アンモニウム
及び２．５容量のエタノールを加えることによりＲＮＡ
１０Ｎ＾ハイブリツドを沈降させた。酵素ＤＮＡ−ポリ
メラーゼＩ及びＲＮａｓｅＨ（参考資料３）の作用を組
み合わせることにより、第２の系列を合成した。２０ｍ
ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７，６）、５ｍＭ ＭｇＣＬ、１００
ｆｆ１Ｍ（ＮＨｌｏｏｆｆｌ、０．６ｍＭβ−ＮＡＤ、
１６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｈ１２００［１のＤＭＡ−ポリメ
ラーゼＩ及び２０ＵのＤＭＡ−リガーゼ（大腸菌）を含
有するＩＩ液９６０．ｆにベレ・ントを溶解した。１２
℃で１時間、次いで２２℃で１時間インキュベーション
後、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアル
コール（２５：２４：１）を加え、エタノールで沈降さ
せることにより反応を停止した。
この目的に適当なベクターでｃＤＮＡをクローニングす
る前に、まずｃＤＮＡを修飾した。３０ｍＭの酢酸ナト
リウム（ｐｌ＋５．６）、５０ｍＭ ＮａＣ１，１ｍＭ
ＺｎＳＯ４及び２１０のＨｕｎｇＢｅａｎ Ｎｕｃｌ
ｅａｓｅを含有する１１％液１００μＮにｃＤＮＡ（５
Ｕｇ）を溶解した。３７℃で３０分間インキュベーショ
ン後、ＥＤＴ＾を１０ｎＭまで、Ｔｒｉｓを２５ｎ＋Ｍ
まで加えることにより反応を停止した。フェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）
で抽出後、混合物を５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラム上
で脱塩した。
る前に、まずｃＤＮＡを修飾した。３０ｍＭの酢酸ナト
リウム（ｐｌ＋５．６）、５０ｍＭ ＮａＣ１，１ｍＭ
ＺｎＳＯ４及び２１０のＨｕｎｇＢｅａｎ Ｎｕｃｌ
ｅａｓｅを含有する１１％液１００μＮにｃＤＮＡ（５
Ｕｇ）を溶解した。３７℃で３０分間インキュベーショ
ン後、ＥＤＴ＾を１０ｎＭまで、Ｔｒｉｓを２５ｎ＋Ｍ
まで加えることにより反応を停止した。フェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）
で抽出後、混合物を５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラム上
で脱塩した。
溶離液（１２５，１）に５０ｍＭまでのＴｒｉｓ ｐｔ
１７．８．２．５ｍｔ４までのＥＤＴ＾、５ｍＭまでの
ＤＴＴ、０．５ＵｍまでのＳｏ−アデノシルメチオニン
及び１００ＵのＥｃｏＲＩ−メチラーゼを加えた。３７
℃で３０分間インキュベーション後、６５℃で１５分間
加熱することにより反応を停止し、その後、Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ １００ｍＭ、ＭＨＣｈ １００ｍＭ及びＮａＣ
１５００ｍＭ（ｐＨ７，５）を含有する１／１０容量の
溶液を加え、同時に各ｄＮＴＰを１ｍＭまでと、１２．
５ＵのクレノウＤＮへ−ポリメラーゼも加えた。２２℃
で６０分間インキュベートした後に等量のフェノール／
クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１
）を加えることにより反応を停止した。３５０．ＮのＮ
２０及び５０．ｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐｌ＋５．６
）を加えた後に、上清を５００μｒのイソプロパツール
で沈降させた。ペレットを１０Ｑμ／のＮ２０に溶解し
た後、５ｅｐｂａｄｅｘ Ｇ５０で脱塩し、溶ＩＩＩ液
をエタノールで沈降させた。
１７．８．２．５ｍｔ４までのＥＤＴ＾、５ｍＭまでの
ＤＴＴ、０．５ＵｍまでのＳｏ−アデノシルメチオニン
及び１００ＵのＥｃｏＲＩ−メチラーゼを加えた。３７
℃で３０分間インキュベーション後、６５℃で１５分間
加熱することにより反応を停止し、その後、Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ １００ｍＭ、ＭＨＣｈ １００ｍＭ及びＮａＣ
１５００ｍＭ（ｐＨ７，５）を含有する１／１０容量の
溶液を加え、同時に各ｄＮＴＰを１ｍＭまでと、１２．
５ＵのクレノウＤＮへ−ポリメラーゼも加えた。２２℃
で６０分間インキュベートした後に等量のフェノール／
クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１
）を加えることにより反応を停止した。３５０．ＮのＮ
２０及び５０．ｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐｌ＋５．６
）を加えた後に、上清を５００μｒのイソプロパツール
で沈降させた。ペレットを１０Ｑμ／のＮ２０に溶解し
た後、５ｅｐｂａｄｅｘ Ｇ５０で脱塩し、溶ＩＩＩ液
をエタノールで沈降させた。
２４−のＮ２０にベレットを溶解した後、２μｓのＥｃ
ｏＲＩリンカ−１３０ｍＭまでのＴｒｉｓ−ＨＣＩ （
ｐＨ８，０）、１０ｎ＋ＭまでのＭｇＣＩ ２．１０ｍ
Ｍまでのジチオトレイトール、１ｍＭまでの＾ＴＰ、
Ｏ，Ｌｘｇ／ｚ（ｌまでのゼラチン及び１００のＴ、Ｄ
ＭＡ−リガーゼを加えることにより、５０μ！中で連結
させた。４℃で１６時間インキュベーション後に加熱（
７０℃で１５分間）することにより反応を停止し、その
後、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６＞、５
０ｍＭ ＮａＣ１，１０ｍＭ ＭｇＣＩｚ、２．５ｍＭ
ＤＴＴ及び５０００ ＥｃｏＲＩを含有する緩衝液２
１０１Ｊ１中で制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切
断した。３７℃で９０分間インキュベーション後に、等
量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール
（２５：２４：１）で抽出することにより反応を停止し
た。酢酸ナトリウム（ｐＨ５，６）を３００ｍＭｃＤＮ
Ａに加えた後に上清を２．５容量のエタノールで沈降さ
せ、Ｂｉｏｇｅｌ＾１５ｍカラムによりリンカ−を分離
した。ｃＤＮＡをエタノールで沈降させた後、沈降物を
Ｔｒｉｓ−ＩＣ１１０ｍＭ、ＥＤＴ＾０．１ｍＭ（ｐＨ
７，６）に溶解させた０次にｃＤＮＡＤＭＡファージ＾
ｇｔｌｌ（参考資料４）にクローニングした。
ｏＲＩリンカ−１３０ｍＭまでのＴｒｉｓ−ＨＣＩ （
ｐＨ８，０）、１０ｎ＋ＭまでのＭｇＣＩ ２．１０ｍ
Ｍまでのジチオトレイトール、１ｍＭまでの＾ＴＰ、
Ｏ，Ｌｘｇ／ｚ（ｌまでのゼラチン及び１００のＴ、Ｄ
ＭＡ−リガーゼを加えることにより、５０μ！中で連結
させた。４℃で１６時間インキュベーション後に加熱（
７０℃で１５分間）することにより反応を停止し、その
後、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６＞、５
０ｍＭ ＮａＣ１，１０ｍＭ ＭｇＣＩｚ、２．５ｍＭ
ＤＴＴ及び５０００ ＥｃｏＲＩを含有する緩衝液２
１０１Ｊ１中で制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切
断した。３７℃で９０分間インキュベーション後に、等
量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール
（２５：２４：１）で抽出することにより反応を停止し
た。酢酸ナトリウム（ｐＨ５，６）を３００ｍＭｃＤＮ
Ａに加えた後に上清を２．５容量のエタノールで沈降さ
せ、Ｂｉｏｇｅｌ＾１５ｍカラムによりリンカ−を分離
した。ｃＤＮＡをエタノールで沈降させた後、沈降物を
Ｔｒｉｓ−ＩＣ１１０ｍＭ、ＥＤＴ＾０．１ｍＭ（ｐＨ
７，６）に溶解させた０次にｃＤＮＡＤＭＡファージ＾
ｇｔｌｌ（参考資料４）にクローニングした。
スポロゾイトに指向された抗体でｃＤＮＡＤＭＡをスク
リーニングした処、１０００個のファージクローンにつ
き１個の割合で陽性反応が認められた。これらの抗体は
プロティン八５ｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）で予め精
製しておき、ＩＸＴｒｉｓ塩（Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ １
０ｍＭ、ＮａＣ１１５０ｍＭ、ｐｌ＋８．０） ＋ ０
．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋ １０％ウシ胎児結成（Ｆｅ
２）で４倍に希釈し、フィルターと共に３７℃で２時間
インキュベートした。
リーニングした処、１０００個のファージクローンにつ
き１個の割合で陽性反応が認められた。これらの抗体は
プロティン八５ｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）で予め精
製しておき、ＩＸＴｒｉｓ塩（Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ １
０ｍＭ、ＮａＣ１１５０ｍＭ、ｐｌ＋８．０） ＋ ０
．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋ １０％ウシ胎児結成（Ｆｅ
２）で４倍に希釈し、フィルターと共に３７℃で２時間
インキュベートした。
次にフィルターを５０ｘｌ ＩＸＴｒｉｓ塩＋〇、０５
％Ｔｕ＋ｅｅｎ２０で１０分間ずつ４回洗った。２度目
の抗体インキュベーションにはヒツジ−抗マウス抗体と
アルカリフォスファターゼの抱合体（ＩＸＴｒｉｓ塩＋
０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０＋ １０％ＦＣＳ中に１
ニア５００の割合で希釈）を使用し、３７℃で３０分間
インキュベートした後、最初の抗体インキュベーション
について記載したようにフィルターを洗浄した。Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ １００ｍＭ、ＮａＣ１１００ｍＭ、ＭｇＣ
ｌ□１０ｍＭ（ｐｌ（９，６）に０．３３ｍｇ７ｘ１の
Ｎ１ｔｒｏ−ｂｌｕｅテトラゾリウム及び０．１７ｚｙ
／肩！の５−ブロモ−４クロロ−３−インドリルホスフ
ェートを溶解し、色反応を行った。室温で３０分間イン
キュベーション後にフィルターを調べた。
％Ｔｕ＋ｅｅｎ２０で１０分間ずつ４回洗った。２度目
の抗体インキュベーションにはヒツジ−抗マウス抗体と
アルカリフォスファターゼの抱合体（ＩＸＴｒｉｓ塩＋
０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０＋ １０％ＦＣＳ中に１
ニア５００の割合で希釈）を使用し、３７℃で３０分間
インキュベートした後、最初の抗体インキュベーション
について記載したようにフィルターを洗浄した。Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ １００ｍＭ、ＮａＣ１１００ｍＭ、ＭｇＣ
ｌ□１０ｍＭ（ｐｌ（９，６）に０．３３ｍｇ７ｘ１の
Ｎ１ｔｒｏ−ｂｌｕｅテトラゾリウム及び０．１７ｚｙ
／肩！の５−ブロモ−４クロロ−３−インドリルホスフ
ェートを溶解し、色反応を行った。室温で３０分間イン
キュベーション後にフィルターを調べた。
免疫陽性クローンがプラーク精製されたので、このクロ
ーン即ちＥ、 ａｃｅｒｖｕｌｉｎａｌ＾クローンくλ
ｇｔ１１ＥａｌＡ）の特徴を決定したく第１図）。
ーン即ちＥ、 ａｃｅｒｖｕｌｉｎａｌ＾クローンくλ
ｇｔ１１ＥａｌＡ）の特徴を決定したく第１図）。
ファージＤＮＡを単離（参考資料２）シ、酵素ＥｃｏＲ
１で切断した。
１で切断した。
ＥｃｏＲＩフラグメントをＭ １３ ｍ ｐ １８及び
ｐＢＲ３２７でサブクローニングした。更に、完全なｃ
ＤＮＡフラグメントをｐＨｃ１８でサブクローニングし
た。ｐＢＲ３２７におけるこれらのサブクローンの制限
地図を作成し、Ｍ１３クローンのヌクレオチド配列を完
全に決定したく第２図）。
ｐＢＲ３２７でサブクローニングした。更に、完全なｃ
ＤＮＡフラグメントをｐＨｃ１８でサブクローニングし
た。ｐＢＲ３２７におけるこれらのサブクローンの制限
地図を作成し、Ｍ１３クローンのヌクレオチド配列を完
全に決定したく第２図）。
融合タンパクを発現させるために、大腸菌Ｙ１０８９−
（参考資料４）で溶原株を作製した。ニワトリ予防実
験で使用する前にタンパク質をＰｒｏｔ。
（参考資料４）で溶原株を作製した。ニワトリ予防実
験で使用する前にタンパク質をＰｒｏｔ。
５ｏｒｂ ＬａｃＺカラム（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標
））で精製した。
））で精製した。
夫１」しＬ
大腸菌Ｙ１０８９−でクローンλｇｔｌｌＥａｌ＾によ
り産生された融合タンパクを実施例１に従って精製した
。
り産生された融合タンパクを実施例１に従って精製した
。
このために、生成物を適当な緩衝液中でアブリジン（参
考資料７）と合わせ、１ｚｌの懸濁液が１！１ｇのアブ
リジン及び０．１ｘｇの生成物を含有するようにした。
考資料７）と合わせ、１ｚｌの懸濁液が１！１ｇのアブ
リジン及び０．１ｘｇの生成物を含有するようにした。
この材料を４週齢のニワトリ（ホワイトレグホン）に生
成物約５０１１？／羽の用量の割合で筋肉内注射した。
成物約５０１１？／羽の用量の割合で筋肉内注射した。
２週間後、同一用量でこの接種を繰り返した。１０日後
に５００００個の胞子形成したＥ、 ａｃｅｒｖｕｌｉ
ｎａオーシストをニワトリに経口投与（感作）し、感染
させた。糞便中のオーシストの数を毎日計数した。コン
トロールとして、夫々１用量当たり５００μｇのアブリ
ジンに懸濁したＥ、 ａｃｅｒｖｕｌｉｎａの死後スポ
ロゾイト及びメロゾイト並びにβ−ガラクトシダーゼを
注射した。この実験の結果を第１表に示す、各群は５羽
のニワトリを含んでおり、ニットリ１羽当たりのオーシ
ストの数と、４日間の合計排泄量を記録した（感染臼を
含む感染後３白目〜６日日）。
に５００００個の胞子形成したＥ、 ａｃｅｒｖｕｌｉ
ｎａオーシストをニワトリに経口投与（感作）し、感染
させた。糞便中のオーシストの数を毎日計数した。コン
トロールとして、夫々１用量当たり５００μｇのアブリ
ジンに懸濁したＥ、 ａｃｅｒｖｕｌｉｎａの死後スポ
ロゾイト及びメロゾイト並びにβ−ガラクトシダーゼを
注射した。この実験の結果を第１表に示す、各群は５羽
のニワトリを含んでおり、ニットリ１羽当たりのオーシ
ストの数と、４日間の合計排泄量を記録した（感染臼を
含む感染後３白目〜６日日）。
実施例１により得られた生成物でニワトリに誘導された
抗体は、１：１６００までの希釈度でＥ。
抗体は、１：１６００までの希釈度でＥ。
ｔｅｎｅｌｌａ、 Ｅ、 ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ及びＥ
、 ｍａｘｉｍａのような型のスポロゾイト及びメロゾ
イトの侵入段階の成分と反応することが判明しな。これ
らの成分は主に、これらの段階の最前セクションに限定
され、このセンジョンには侵入細胞器官、ｒｈｏｐｔｒ
ｉｅｓ及びｍｉｃｒｏｎｅｍａも位置する。数羽のニワ
トリでは、抗体が特にＥ、 ｔｅｎｅｌｌａのスポロゾ
イトのＲｅｆｒａｃ−ｔｉｌｅ Ｂｏｄｙの周囲で反応
することが認められた。
、 ｍａｘｉｍａのような型のスポロゾイト及びメロゾ
イトの侵入段階の成分と反応することが判明しな。これ
らの成分は主に、これらの段階の最前セクションに限定
され、このセンジョンには侵入細胞器官、ｒｈｏｐｔｒ
ｉｅｓ及びｍｉｃｒｏｎｅｍａも位置する。数羽のニワ
トリでは、抗体が特にＥ、 ｔｅｎｅｌｌａのスポロゾ
イトのＲｅｆｒａｃ−ｔｉｌｅ Ｂｏｄｙの周囲で反応
することが認められた。
感作コントロールは１ｘ１の１５％スクロース溶液中に
５００００個の胞子形成したＥ、 ａｃｅｒｖｕｌｉｎ
ａのオーシストを含むものとし、経口で投与した。
５００００個の胞子形成したＥ、 ａｃｅｒｖｕｌｉｎ
ａのオーシストを含むものとし、経口で投与した。
去」１舛」−
抗」Ｌ
精製した融合タンパク質を適当なＭＩ街液液中ジオクタ
デシルアンモニウムブロマイド（ＤＤ八）と合わせ、懸
濁液１ｍｌが０．５ｘｇのＤＤ＾及び約５０μｇの融合
タンパクを含有するようにした。この材料を融合タンパ
ク約５０１ＪＦＩ／羽の用量で３〜４週齢のニワトリ（
ホワイトレグホン）に筋肉内注射した。２週間後、７５
００個の胞子形成したＥ、 ｔｅｎｅｌｌａオーシスト
（Ｗｅｙｂｒｉｄｇｅ株）をニワトリに経口で感作した
。感作注入から７日後にニワトリを殺し、各ニワトリの
左右盲腸の病変を記録した。Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＲｅ１
ｄ（参考資料１０）のガイドラインに従って病変を記録
した。この実験の結果を第２表に示す。この結果から明
らかなように、Ｅａｌ＾ポリペプチドに対応する少なく
とも一部を含むタンパク買又はそのフラグメントは他の
Ｅｉｍｅｒｉａ種かに−ＩＧることかできる。
デシルアンモニウムブロマイド（ＤＤ八）と合わせ、懸
濁液１ｍｌが０．５ｘｇのＤＤ＾及び約５０μｇの融合
タンパクを含有するようにした。この材料を融合タンパ
ク約５０１ＪＦＩ／羽の用量で３〜４週齢のニワトリ（
ホワイトレグホン）に筋肉内注射した。２週間後、７５
００個の胞子形成したＥ、 ｔｅｎｅｌｌａオーシスト
（Ｗｅｙｂｒｉｄｇｅ株）をニワトリに経口で感作した
。感作注入から７日後にニワトリを殺し、各ニワトリの
左右盲腸の病変を記録した。Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＲｅ１
ｄ（参考資料１０）のガイドラインに従って病変を記録
した。この実験の結果を第２表に示す。この結果から明
らかなように、Ｅａｌ＾ポリペプチドに対応する少なく
とも一部を含むタンパク買又はそのフラグメントは他の
Ｅｉｍｅｒｉａ種かに−ＩＧることかできる。
各群は５羽のニワＩ・りを含む。
犬１ｊ［−
定−
Ｅ、ＬｅｎｅｌｌａからｃＤＮＡＤＮＡラリーの胞子形
成したＥ、 ｔｅｎｅｌｌａのオーシストからｃＤＮＡ
ライブラリーを構築するために、最終的なｃＤＮＡ作製
物をファージλｇＬ１１（参考資料４）でなくファージ
λｇｔｌＯにクローニングした以外は、実施例１に記載
したと厳密に同一の手順を繰り返した。
成したＥ、 ｔｅｎｅｌｌａのオーシストからｃＤＮＡ
ライブラリーを構築するために、最終的なｃＤＮＡ作製
物をファージλｇＬ１１（参考資料４）でなくファージ
λｇｔｌＯにクローニングした以外は、実施例１に記載
したと厳密に同一の手順を繰り返した。
ＳＤ−標準偏差
第Ｕ
マイハイムに所在のＢｏｅｈｒ １ｎ）Ｈｅｒ社から市
販されている「非放射性型ＤＮＡ標識及び検出キット」
（カタログ番号１０９３６５７）に付随のプロトコール
に厳密に従うランダムプライミングにより−ｐＵｃ１８
／Ｅａｌ八からの２９６ｂｐのＥｃｏＲｌフラグメント
をジゴキシゲニン〜ｄＵＴＰで標識した。
販されている「非放射性型ＤＮＡ標識及び検出キット」
（カタログ番号１０９３６５７）に付随のプロトコール
に厳密に従うランダムプライミングにより−ｐＵｃ１８
／Ｅａｌ八からの２９６ｂｐのＥｃｏＲｌフラグメント
をジゴキシゲニン〜ｄＵＴＰで標識した。
上記Ｅ、 ｔｅｎｅｌｌａ ｃＤＮＡＤＮＡラリーから
の固定ＤＮＡを含むフィルターをＭａｎｉａｔｉｓ他（
参考資料２）に記載されているように作製し、（９５℃
で１０分間）新たに変性させた標識化Ｅ、 ａｃｅｒｖ
ｕｌｉｎａフラグメントにより製造業者の指示に従って
４２℃で１６時間プローブした。フィルターを室温で２
ｘＳＳＣ１０，１％（ｌｌｌ／Ｖ）ＳＤＳ（Ｉ Ｘ Ｓ
ＳＣは０．０１５ｍｏｌ／ｊ！のクエン酸ナトリウムｐ
Ｈ７，０＋ ０．１５ｎｏ１７ｔ’のＮａＣＩに対応す
る）で１５分間２回洗い、６８℃でｔｘｓｓｃ、０．１
％（Ｗ／Ｖ）ＳＯ３で１５分間２回洗い、６８℃で０．
１ｘＳＳＣ１０，１％（ｗ／ｖ）ＳＯＳで３０分間２回
及び１５分間１回洗い、室温でＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ＜７
．６５ｇ／ｌ ＮａＣ１，０，９１ｙ／ｌＮａ２ＨＰＯ
，４ｔ１２０．０．２１ｇ／ｆＫ１１２ＰＯ，，０，０
５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７，３）で１５分
間２回洗った。
の固定ＤＮＡを含むフィルターをＭａｎｉａｔｉｓ他（
参考資料２）に記載されているように作製し、（９５℃
で１０分間）新たに変性させた標識化Ｅ、 ａｃｅｒｖ
ｕｌｉｎａフラグメントにより製造業者の指示に従って
４２℃で１６時間プローブした。フィルターを室温で２
ｘＳＳＣ１０，１％（ｌｌｌ／Ｖ）ＳＤＳ（Ｉ Ｘ Ｓ
ＳＣは０．０１５ｍｏｌ／ｊ！のクエン酸ナトリウムｐ
Ｈ７，０＋ ０．１５ｎｏ１７ｔ’のＮａＣＩに対応す
る）で１５分間２回洗い、６８℃でｔｘｓｓｃ、０．１
％（Ｗ／Ｖ）ＳＯ３で１５分間２回洗い、６８℃で０．
１ｘＳＳＣ１０，１％（ｗ／ｖ）ＳＯＳで３０分間２回
及び１５分間１回洗い、室温でＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ＜７
．６５ｇ／ｌ ＮａＣ１，０，９１ｙ／ｌＮａ２ＨＰＯ
，４ｔ１２０．０．２１ｇ／ｆＫ１１２ＰＯ，，０，０
５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７，３）で１５分
間２回洗った。
次に、フィルターをアルカリホスファターゼと抱合した
ポリクローナルヒツジ抗ジゴキシゲニンＦａｂ−フラグ
メントのＰＢＳ−ｔｕ＋ｅｅｎ（１：５０００の希釈度
）と室温で３０分間反応させた。フィルターを室温でＰ
ＢＳ−ｔｗｅｅｎで１５分間４回、０．ＯＩＭ Ｔｒｉ
ｓ−ｔｌｃｌ ｐＨ８，ｏ、０．１５８ ＮａＣ１で１
５分間１回洗った後、０．ＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｐｌ
（９，６，０，ＩＭ ＮａＣｌ、０．ＯＩＭ ＭｇＣｌ
２中の０．３ｈ＃！のＮ１ｔｒｏｂｌｕｅテトラゾリウ
ム及び０．１ｈ／１の５−ブロモ４−クロロ−３−イン
ドリルホスフェートの溶液と共にインキユベーショした
処、アルカリフォスファターゼとフィルターとの結合が
検出された。
ポリクローナルヒツジ抗ジゴキシゲニンＦａｂ−フラグ
メントのＰＢＳ−ｔｕ＋ｅｅｎ（１：５０００の希釈度
）と室温で３０分間反応させた。フィルターを室温でＰ
ＢＳ−ｔｗｅｅｎで１５分間４回、０．ＯＩＭ Ｔｒｉ
ｓ−ｔｌｃｌ ｐＨ８，ｏ、０．１５８ ＮａＣ１で１
５分間１回洗った後、０．ＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｐｌ
（９，６，０，ＩＭ ＮａＣｌ、０．ＯＩＭ ＭｇＣｌ
２中の０．３ｈ＃！のＮ１ｔｒｏｂｌｕｅテトラゾリウ
ム及び０．１ｈ／１の５−ブロモ４−クロロ−３−イン
ドリルホスフェートの溶液と共にインキユベーショした
処、アルカリフォスファターゼとフィルターとの結合が
検出された。
Ｅ、 ａｃｅｒｖｕｌｉｎａプローブと反応したλｇｔ
］、ＯＥ。
］、ＯＥ。
ｔｅｎｅｌｌａクローン４００個につき１個を取り出し
、これらの１０個即ちＥ、 Ｌｅｎｅｌｌａ１＾１〜１
０（λｇｔｌＯＥｔｌΔ１〜１０）をプラーク精製した
。＾ｇｔｌＯＥｔｌ＾１を大腸菌株ＢＮＮ１０２と共に
Ｂａａｒｎ （オランダ）所在のＣｅｎｔｒａａｌＢｕ
ｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｎ＋ｅｌｃｕｌｔｕｒ
ｅｓに寄託した。
、これらの１０個即ちＥ、 Ｌｅｎｅｌｌａ１＾１〜１
０（λｇｔｌＯＥｔｌΔ１〜１０）をプラーク精製した
。＾ｇｔｌＯＥｔｌ＾１を大腸菌株ＢＮＮ１０２と共に
Ｂａａｒｎ （オランダ）所在のＣｅｎｔｒａａｌＢｕ
ｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｎ＋ｅｌｃｕｌｔｕｒ
ｅｓに寄託した。
１慮１
１）Ｊ、Ｐａ５ｔｅｒｎａ）ｃ ｅｔ ａｌ、：
Ｍｏ１．＆ Ｂｉｏｃｈ、Ｐａｒ、３（１９８１）
、 １３３−１４２゜ ２） Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、： Ｍｏ
１ａｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） １９
８２゜３） Ｕ、 Ｇｕｂｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ、：
Ｇｅｎｅ ２５ （１９８３）、 ２６３−２６９゜４
） Ｔ、Ｖ、 Ｈｕｙｎｋ ｅｔ ａｌ、： ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｌｑｕｅｓ：Ａ Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ； Ｄ、 Ｇｌ
ｏｖｅｒ ０ｘｆｏｒｄ（１９８４）。
Ｍｏ１．＆ Ｂｉｏｃｈ、Ｐａｒ、３（１９８１）
、 １３３−１４２゜ ２） Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、： Ｍｏ
１ａｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） １９
８２゜３） Ｕ、 Ｇｕｂｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ、：
Ｇｅｎｅ ２５ （１９８３）、 ２６３−２６９゜４
） Ｔ、Ｖ、 Ｈｕｙｎｋ ｅｔ ａｌ、： ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｌｑｕｅｓ：Ａ Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ； Ｄ、 Ｇｌ
ｏｖｅｒ ０ｘｆｏｒｄ（１９８４）。
５） Ｊ、Ｐ、 Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ、：
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
Ｕ、Ｓ、Ａ、 ７Ｂ （１９８１）、 ３８２４
−３８２８゜６） Ｇａｎ１ｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ Ｃ
，： Ｇｅｎｅ ３３ （１９８５） １０３−１
１９゜７） Ｋ、Ｅ、 Ｈｅｎ５ｅｎ ｉｎ ”
Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｃａｒｒｉｅｒｓ ａ
ｎｄａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ Ｖｅｔｅｒｅｎａｒ
ｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ” ｅｄ、 Ｒ，Ｍ。
−３８２８゜６） Ｇａｎ１ｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ Ｃ
，： Ｇｅｎｅ ３３ （１９８５） １０３−１
１９゜７） Ｋ、Ｅ、 Ｈｅｎ５ｅｎ ｉｎ ”
Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｃａｒｒｉｅｒｓ ａ
ｎｄａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ Ｖｅｔｅｒｅｎａｒ
ｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ” ｅｄ、 Ｒ，Ｍ。
Ｎｅｒｖｉｇ、 Ｐ、Ｍ、 Ｇｏｕｇｈ、 Ｍ、
Ｌ、 Ｋａｅｂｅｒｌｅ、 Ｃ，Ａ。
Ｌ、 Ｋａｅｂｅｒｌｅ、 Ｃ，Ａ。
Ｗｈｅｔｓｔｏｎｅ、 工ｏｗａ ５ｔａｔｅ Ｕｎ
ｉｖ−Ｐｒｅｓｓ、１９８６．ｐｐ。
ｉｖ−Ｐｒｅｓｓ、１９８６．ｐｐ。
７７−９１ 。
８）Ｐ、Ｙ、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ、： Ａｄｖａｎ
ｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７（１９８７
）、 ４５−１４８゜ ９）Ｍ−Ｆ、Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ、： ５ｃｉｅｎ
ｃｅ ２３５ （１９８７）、１０５９−１０６２゜ １０）σ、 Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｗ、Ｍ、
Ｒｅ１ｄ； Ｅｘｐ、 Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ
２Ｂ （１９７０）、 ３０−３６゜
ｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７（１９８７
）、 ４５−１４８゜ ９）Ｍ−Ｆ、Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ、： ５ｃｉｅｎ
ｃｅ ２３５ （１９８７）、１０５９−１０６２゜ １０）σ、 Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｗ、Ｍ、
Ｒｅ１ｄ； Ｅｘｐ、 Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ
２Ｂ （１９７０）、 ３０−３６゜
第１図はプラスミドｐＥ＾１＾の作製方法を示す説明図
、第２図は本発明の組換体ＤＮＡのＤＮＡセクションに
含まれるデオキヌクレオチド配列を示す配列図である。
、第２図は本発明の組換体ＤＮＡのＤＮＡセクションに
含まれるデオキヌクレオチド配列を示す配列図である。
Claims (11)
- （１）ＤＮＡセクションを有するベクター核酸分子から
構成される組換体核酸であって、このＤＮＡセクション
が大腸菌Ｋ１２ＪＡ２２１を形質転換させたプラスミド
ｐＥｎ１Ａに挿入された￥Ｅｉｍｅｒｉａ￥のタンパク
質の少なくとも一部をコードするＤＮΛの全部もしくは
一部に対応するか、又は該挿入したＤＮＡとハイブリダ
イズし、￥Ｅｉｍｅｒｉａのタンパク質をコードするＤ
ＮＡ配列に対応するか、又はこれら配列のものと異なる
コドンを使用して￥Ｅｉｍｅｒｉａ￥の上記タンパク質
の少なくとも一部をコードするＤＮＡ配列に対応するこ
とを特徴とする組換体核酸。 - （２）該ＤＮＡセクションが￥Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅ
ｒｖｕｌｉｎａ￥又は￥Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌ
ａ￥のタンパク質の少なくとも一部をコードすることを
特徴とする請求項１に記載の組換体核酸。 - （３）該ＤＮＡセクションが第２図に示すアミノ酸配列
を有するポリペプチドの少なくとも一部をコードするこ
とを特徴とする請求項１又は２に記載の組換体ＤＮＡ分
子。 - （４）該ＤＮＡセクションが第２図に示すデオキシヌク
レオチド配列の少なくとも一部に対応することを特徴と
する請求項１に記載の組換体ＤＮＡ分子。 - （５）請求項１から４のいずれか一項に記載のＤＮＡセ
クションの少なくとも一部に対応する配列を有するＤＮ
Ａフラグメント。 - （６）請求項３に記載のポリペプチドの少なくとも一部
をコードすることを特徴とする請求項５に記載のＤＮＡ
フラグメント。 - （７）第２図に示すデオキシヌクレオチド配列の少なく
とも一部に対応することを特徴とする請求項５に記載の
ＤＮＡフラグメント。 - （８）少なくとも一部が請求項５から７のいずれか一項
に記載のＤＮＡフラグメントによりコードされるアミノ
酸配列を有するポリペプチド。 - （９）１以上の翻訳後修飾を含むことを特徴とする請求
項８に記載のポリペプチド。 - （１０）請求項８又は９に記載のポリペプチドを含む￥
Ｅｉｍｅｒｉａ￥寄生虫に起因するコクシジウム症から
家禽を予防するためのワクチン。 - （１１）請求項５から７のいずれか一項に記載のＤＮＡ
フラグメントを有する組換体ＤＮＡを含む微生物から構
成される、￥Ｅｉｍｅｒｉａ￥寄生虫に起因するコクシ
ジウム症から家禽を予防するためのワクチン。
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|---|---|---|---|
| NL8801627 | 1988-06-27 | ||
| NL8801627 | 1988-06-27 |
Publications (2)
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP01165162A Expired - Fee Related JP3086227B2 (ja) | 1988-06-27 | 1989-06-27 | コクシジウム症ワクチン |
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|---|---|
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| JP (1) | JP3086227B2 (ja) |
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| NZ (1) | NZ229679A (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000219635A (ja) * | 1998-10-07 | 2000-08-08 | Akzo Nobel Nv | コクシジウム症ワクチン |
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