JPH0261563A - 体液中のフルクトサミンを測定する方法 - Google Patents
体液中のフルクトサミンを測定する方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は体液中のフルクトサミンを確定する方法ならび
にこれに適した標準液に関する。
にこれに適した標準液に関する。
従来の技術
糖尿病の代謝状態では血液中に存在する過剰なグルコー
スによりタンパク質がグルコース化される。その際グル
コースのカルボニル基がまず遊離タンパク質アミノ基と
シッフ塩基の形成下に反応する。アマトリ再配列により
その後安定なケトアミン結合を有するフルクトサミンが
生じる。このケトアミン結合の安定性のためにフルクト
サミンの半減期は実際血清タンパク質のものと同一であ
る。この、タンパク質の非酵素グルコース化は、糖尿病
患者でしばしば生じる、種々の機能障害を生じるおそれ
がある。
スによりタンパク質がグルコース化される。その際グル
コースのカルボニル基がまず遊離タンパク質アミノ基と
シッフ塩基の形成下に反応する。アマトリ再配列により
その後安定なケトアミン結合を有するフルクトサミンが
生じる。このケトアミン結合の安定性のためにフルクト
サミンの半減期は実際血清タンパク質のものと同一であ
る。この、タンパク質の非酵素グルコース化は、糖尿病
患者でしばしば生じる、種々の機能障害を生じるおそれ
がある。
従って、グルコシルタンパク質の形成を監視することが
重要である。指示薬としてそのためにこれまで、HbA
lと呼ばれる、グルコシルヘモグロビンが指示された。
重要である。指示薬としてそのためにこれまで、HbA
lと呼ばれる、グルコシルヘモグロビンが指示された。
このパラメタの監視は糖代謝の長期の調節のために好適
である。グルコシルヘモグロビンがその長い半減期に基
づき代謝状態のより長期の変化を記録しかつヘモグロビ
ン分解の不活性が短期の代謝変動が認識できないことに
導くので、このパラメタは代謝挙動の中期間の調節のた
めに十分でない。他方糖尿病患者での糖代謝は血液グル
コース濃度の測定により監視される。しかし血液グルコ
ース濃度が強い変化を受けるので、これは医者に血液際
去の時点まで存在した物質代謝状態についての情報のみ
を与える。血液グルコース濃度による短期監視およびH
bAlcの測定による長期調節の間のこの欠落をフルク
トサミンと呼ばれるグルコース化されたタンパク質の測
定が満たす。種々の研究が血清フルクトサミン測定が糖
尿病患者の監視のための信頼できる固有のおよび実際使
用できる方法であることを示した。
である。グルコシルヘモグロビンがその長い半減期に基
づき代謝状態のより長期の変化を記録しかつヘモグロビ
ン分解の不活性が短期の代謝変動が認識できないことに
導くので、このパラメタは代謝挙動の中期間の調節のた
めに十分でない。他方糖尿病患者での糖代謝は血液グル
コース濃度の測定により監視される。しかし血液グルコ
ース濃度が強い変化を受けるので、これは医者に血液際
去の時点まで存在した物質代謝状態についての情報のみ
を与える。血液グルコース濃度による短期監視およびH
bAlcの測定による長期調節の間のこの欠落をフルク
トサミンと呼ばれるグルコース化されたタンパク質の測
定が満たす。種々の研究が血清フルクトサミン測定が糖
尿病患者の監視のための信頼できる固有のおよび実際使
用できる方法であることを示した。
たとえばJohnsonその他、Cl1n、Chem、
Acta(1982年)127.87〜95に記載され
ているような、フルクトサミンの測定のための公知方法
は、水性アルカリ性媒体中にエノール形で存在しかつこ
の形で容易に酸化できるフルクトサミンが、還元された
形で着色されている酸化剤たとえばテトラゾーリウム塩
と反応することに因る。”その際形成された7オルマザ
ン色素をその後測光法で測定することができかつフルク
トサミンの量はつり合ったものである。
Acta(1982年)127.87〜95に記載され
ているような、フルクトサミンの測定のための公知方法
は、水性アルカリ性媒体中にエノール形で存在しかつこ
の形で容易に酸化できるフルクトサミンが、還元された
形で着色されている酸化剤たとえばテトラゾーリウム塩
と反応することに因る。”その際形成された7オルマザ
ン色素をその後測光法で測定することができかつフルク
トサミンの量はつり合ったものである。
正確な測定を可能にするために、その後試料溶液での測
定の実施の際得られた値を較正曲線との比較により確定
するため、標準液で較正曲線を作成することが必要であ
る。さらに測定方法の精密調節および分析自動装置を標
準に合わせるために、公知の含量を有する標準液を使用
する。この目的のために使用される標準液は測定すべき
測定パラメタを公知の濃度で含有しなければならない。
定の実施の際得られた値を較正曲線との比較により確定
するため、標準液で較正曲線を作成することが必要であ
る。さらに測定方法の精密調節および分析自動装置を標
準に合わせるために、公知の含量を有する標準液を使用
する。この目的のために使用される標準液は測定すべき
測定パラメタを公知の濃度で含有しなければならない。
パラメタの濃度は医学的に重要な測定範囲になければな
らない。標準液の取扱いは容易でなければならずかつ殊
にこれはできる限り長い半減期を有しなければならない
。
らない。標準液の取扱いは容易でなければならずかつ殊
にこれはできる限り長い半減期を有しなければならない
。
フルクトサミン確定のためのこれまで公知の標準液はい
くつかのまたは多くのこれらの前提条件を満たさない。
くつかのまたは多くのこれらの前提条件を満たさない。
そこで一方では血清フルクトース濃度をモデル物質の形
で模造する、調節ないし較正血清を使用する。通常この
ために1デオキシ−1−モルホリノ−フルクトース(D
MF)を使用する。この公知標準液の欠点は、モデル物
質DMFが血清フルクトサミンとは全く異なった挙動を
し、そこで得られた値の、DMFで製−造された較正曲
線との比較が正確な値を生じないことである。従ってま
たこのように得られt;値はDMF−単位として表され
る。
で模造する、調節ないし較正血清を使用する。通常この
ために1デオキシ−1−モルホリノ−フルクトース(D
MF)を使用する。この公知標準液の欠点は、モデル物
質DMFが血清フルクトサミンとは全く異なった挙動を
し、そこで得られた値の、DMFで製−造された較正曲
線との比較が正確な値を生じないことである。従ってま
たこのように得られt;値はDMF−単位として表され
る。
血清フルクトサミンを含有する、他の公知の標準液は+
35℃で数日間の貯蔵後血清フルクトサミンー濃度の強
い非安定性を示す。さらに非酵素タンパク質グルコース
化に戻す、200%およびそれより多くの増加が確定さ
れる。発明が解決しようとする課題 従って本発明の課題は容易に取り扱いでき、その濃度が
容易に調節されかつその安定性を失うことなしに長時間
にわたって貯蔵できる、血清フルクトサミン測定のため
の標準液を提供することであった。
35℃で数日間の貯蔵後血清フルクトサミンー濃度の強
い非安定性を示す。さらに非酵素タンパク質グルコース
化に戻す、200%およびそれより多くの増加が確定さ
れる。発明が解決しようとする課題 従って本発明の課題は容易に取り扱いでき、その濃度が
容易に調節されかつその安定性を失うことなしに長時間
にわたって貯蔵できる、血清フルクトサミン測定のため
の標準液を提供することであった。
課題を解決するための手段
この課題は較正のための標準液として、そのpt−iが
6.0・〜5.0でありかつ少なくともlOmモル/l
緩衝液を含有する、フルクトサミンおよびアルブミンを
含有する、主にグルコース不含の溶液を使用することを
特徴とする、体液中のフルクトサミンの測定法により解
決する。
6.0・〜5.0でありかつ少なくともlOmモル/l
緩衝液を含有する、フルクトサミンおよびアルブミンを
含有する、主にグルコース不含の溶液を使用することを
特徴とする、体液中のフルクトサミンの測定法により解
決する。
本発明により、パラメタ血清フルクトサミンを類似のま
たはそれどころか同一の形のグルコース化血清タンパク
質の形で含有する、標準液を使用する。この溶液は驚異
的にも長時間にわたって貯蔵安定でありかつそれにより
長時間貯蔵安定である。
たはそれどころか同一の形のグルコース化血清タンパク
質の形で含有する、標準液を使用する。この溶液は驚異
的にも長時間にわたって貯蔵安定でありかつそれにより
長時間貯蔵安定である。
本発明による方法の際標準液としてアルブミン含有溶液
を使用する。このアルブミン含有溶液はタンパク質マト
リックスとして使用する。
を使用する。このアルブミン含有溶液はタンパク質マト
リックスとして使用する。
このためにたとえばヒト血清アルブミンまたは牛血清ア
ルブミンの水溶液が好適である。アルブミン含有溶液と
して有利にヒト血清を使用する。
ルブミンの水溶液が好適である。アルブミン含有溶液と
して有利にヒト血清を使用する。
長期の貯蔵安定性を保証するために、アルブミン含有溶
液が主にグルコース不合であることが重要である。ヒト
血清の使用の際これは従ってグルコース不合にされねば
ならない。これはたとえばヒト血清を、グルコースを除
いて全ての天然の血清成分を含有する、緩衝液に対して
透析することにより行う。有利にNaCQ150′rI
Lモル/ff、Na−リン酸塩Ionモル/lを含有し
かつNaOHで6.0〜8.0のpHに調節される、媒
体に対して透析する。
液が主にグルコース不合であることが重要である。ヒト
血清の使用の際これは従ってグルコース不合にされねば
ならない。これはたとえばヒト血清を、グルコースを除
いて全ての天然の血清成分を含有する、緩衝液に対して
透析することにより行う。有利にNaCQ150′rI
Lモル/ff、Na−リン酸塩Ionモル/lを含有し
かつNaOHで6.0〜8.0のpHに調節される、媒
体に対して透析する。
アルブミン含有溶液はさらに血清フルクトサミンを公知
の量で含有する。ヒト血清の使用の際フルクトサミンは
既に天然に含有されている。アルブミンの溶液はフルク
トサミンを添加されねばならない。双方の種類の溶液は
さらにフルクトサミンを添加することにより所望の含量
に増量される。
の量で含有する。ヒト血清の使用の際フルクトサミンは
既に天然に含有されている。アルブミンの溶液はフルク
トサミンを添加されねばならない。双方の種類の溶液は
さらにフルクトサミンを添加することにより所望の含量
に増量される。
そのI;めにアルブミン含有溶液に有利に人工的にグル
コース化された血清アルブミンを添加しかつそのつと所
望の血清フルクトサミンの濃度を調節する。添加される
量の変化によりそこで通常のおよび病理学的血清フルク
トサミン濃度が得られる。血清フルクトサミンの製造は
たとえばJ 、F 、Dayその他、J 、Biol、
Chem、245Nr、3(1979年)595−59
7に記載された方法と同様に行うことができる。その際
血清アルブミン水溶液をグルコースと25℃で8日間イ
ンキュベートしかつ引続き遊離グルコースの除去のため
に透析にかける。
コース化された血清アルブミンを添加しかつそのつと所
望の血清フルクトサミンの濃度を調節する。添加される
量の変化によりそこで通常のおよび病理学的血清フルク
トサミン濃度が得られる。血清フルクトサミンの製造は
たとえばJ 、F 、Dayその他、J 、Biol、
Chem、245Nr、3(1979年)595−59
7に記載された方法と同様に行うことができる。その際
血清アルブミン水溶液をグルコースと25℃で8日間イ
ンキュベートしかつ引続き遊離グルコースの除去のため
に透析にかける。
標準液のpHは緩衝液系の添加により5.0〜6.0の
範囲の値に調節される。血清アルブミンの等電点が4.
9のpHであるので、5.0より下のpHはタンパク質
沈澱による軽い混濁に導く。6.0より上のpH−価で
は満足な貯蔵安定性はもはや達成されない。5.4〜5
.9の範囲での標準溶液のpH−価が有利である。
範囲の値に調節される。血清アルブミンの等電点が4.
9のpHであるので、5.0より下のpHはタンパク質
沈澱による軽い混濁に導く。6.0より上のpH−価で
は満足な貯蔵安定性はもはや達成されない。5.4〜5
.9の範囲での標準溶液のpH−価が有利である。
pHは緩衝溶液の添加により調節される。緩衝液濃度は
その際10mモル/lより大きい。
その際10mモル/lより大きい。
緩衝液をlO〜70mモル/12の濃度で添加すること
が有利である。緩衝液としてそのpHが所望の範囲にあ
る、緩衝液系が好適である。リン酸塩緩衝液が特に好適
である。
が有利である。緩衝液としてそのpHが所望の範囲にあ
る、緩衝液系が好適である。リン酸塩緩衝液が特に好適
である。
標準液はさらに標準血清のために常用の物質を含有する
。そこでたとえば明化剤、安定化剤、界面活性剤および
保存剤が添加できる。明化剤としてたとえばペンタエリ
ドリフトを使用する。安定化剤として殊に亜鉛およびE
DTAが好適である。保存剤としてたとえばフェノール
または抗生物質を使用する。池の当業者に公知の助剤も
使用できる。
。そこでたとえば明化剤、安定化剤、界面活性剤および
保存剤が添加できる。明化剤としてたとえばペンタエリ
ドリフトを使用する。安定化剤として殊に亜鉛およびE
DTAが好適である。保存剤としてたとえばフェノール
または抗生物質を使用する。池の当業者に公知の助剤も
使用できる。
本発明により使用される標準液の製造は個々の成分の混
合むよび緩衝液系の添加によるpHの調節により行う。
合むよび緩衝液系の添加によるpHの調節により行う。
通常標準液を引続き無菌に濾別しかつより長期間の貯蔵
のために凍結乾燥する。
のために凍結乾燥する。
本発明の対象はさらに、グルコース不含のフルクトサミ
ンおよびアルブミンを含有する溶液が10mモル/lよ
り高い濃度で緩衝液を含有しかつ5.0〜6.OpHを
有することを特徴とする、体液中のフルクトサミンの測
定のための標準液である。
ンおよびアルブミンを含有する溶液が10mモル/lよ
り高い濃度で緩衝液を含有しかつ5.0〜6.OpHを
有することを特徴とする、体液中のフルクトサミンの測
定のための標準液である。
本発明により使用される標準液は非常に安定である。こ
れはフルクトサミンの正確なおよび感性の測定を可能に
する、急勾配の較正曲線を生じる。
れはフルクトサミンの正確なおよび感性の測定を可能に
する、急勾配の較正曲線を生じる。
本発明を次の実施例により詳述する。
実施例
例 !
得た後に数時間低温凍結された、f309/(1のタン
パク質含量を有するヒト血清300dを溶解しかつ透析
した。透析は2回6時間にわたッテ、そのつど、NaC
Ll 50 mモル/lおよびNaH2PO410mモ
ル/eを有する、6.5のpHの緩衝液の約40倍の容
量に対して行った。透析後、検出可能なグルコースをも
はや含有しない血清を菌の貧化のために濾別しくEKS
I−フィルター、FirmaSchleicher &
5chGll)およびZnc12 (0、1mモル/
12)およびTitriplexIll(1,0mモル
/12)の添加により血清のpHを5.9±0.1に調
節する。
パク質含量を有するヒト血清300dを溶解しかつ透析
した。透析は2回6時間にわたッテ、そのつど、NaC
Ll 50 mモル/lおよびNaH2PO410mモ
ル/eを有する、6.5のpHの緩衝液の約40倍の容
量に対して行った。透析後、検出可能なグルコースをも
はや含有しない血清を菌の貧化のために濾別しくEKS
I−フィルター、FirmaSchleicher &
5chGll)およびZnc12 (0、1mモル/
12)およびTitriplexIll(1,0mモル
/12)の添加により血清のpHを5.9±0.1に調
節する。
引続きエンドーゲン含有血清フルクトサミン濃度の測定
を行った。
を行った。
さらにグルコース化されt;ヒト血清アルブミンは次の
ように製造しt;: 無菌生理食塩溶液280dにグルコース(無水)254
9を添加した。溶液にヒト血清アルブミン29(−29
,4mモル)を加えかつ光排除下に25℃で8日間軽く
撹拌した。その後溶液を蒸留水に対しグルコース不合に
なるまで透析し、濃縮しく除外限界1000)、凍結乾
燥した。
ように製造しt;: 無菌生理食塩溶液280dにグルコース(無水)254
9を添加した。溶液にヒト血清アルブミン29(−29
,4mモル)を加えかつ光排除下に25℃で8日間軽く
撹拌した。その後溶液を蒸留水に対しグルコース不合に
なるまで透析し、濃縮しく除外限界1000)、凍結乾
燥した。
達成されたフルクトサミン含量は出発物質中にエンドー
ゲンを含有する血清フルクトサミンの約3〜8倍であっ
た。測定は前記の着色試験で行った。
ゲンを含有する血清フルクトサミンの約3〜8倍であっ
た。測定は前記の着色試験で行った。
製造はJ 、F 、Dayその他、J 、Biol、C
hem、245Nr、3(1979年)第595〜59
7ページに記載の方法を模して行った。
hem、245Nr、3(1979年)第595〜59
7ページに記載の方法を模して行った。
上記で得られ透析されたヒト血清、にフルクトサミンの
予定濃度の達成のために見積もられた量でグルコース化
されたヒト血清アルブミンを添加しかつ撹拌しながら溶
解することにより標準液を製造した。
予定濃度の達成のために見積もられた量でグルコース化
されたヒト血清アルブミンを添加しかつ撹拌しながら溶
解することにより標準液を製造した。
このようにして得られた溶液を菌除去のためにく2μm
の目幅を有する膜フィルターを通して濾過し、1d分量
でびんに充填しかつ凍結乾燥した。このようにして製造
された凍結乾燥物は再蒸留水1.OJ!+2での再構成
後0.27mモル/σの血清フルクトサミン濃度を含有
する。
の目幅を有する膜フィルターを通して濾過し、1d分量
でびんに充填しかつ凍結乾燥した。このようにして製造
された凍結乾燥物は再蒸留水1.OJ!+2での再構成
後0.27mモル/σの血清フルクトサミン濃度を含有
する。
例 2
509/12のタンパク質含量を有する新鮮なヒト血し
ょう600dが再石灰沈着(Recalzi−fizi
eren)および凝血ケークの分離によりヒト血清に変
えられた。血清をその本来の容量の約273、即ち約4
00j112に濃縮し、それによりタンパク質濃度は6
3 g/(lに変化した。透析、ZnCQ、2およびT
itriplexI[[の添加、pH−調節およびエン
ドーゲン含有フルクトサミンー濃度の測定は例1におけ
るように行っt;。標準血清のフルクトサミン−予定濃
度の達成のために見積もられたグルコース化されたヒト
血清アルブミンの量が例1に記載されたようにヒト血清
に溶解された。濾過およびIJ!I2配分での充填後凍
結乾燥した。
ょう600dが再石灰沈着(Recalzi−fizi
eren)および凝血ケークの分離によりヒト血清に変
えられた。血清をその本来の容量の約273、即ち約4
00j112に濃縮し、それによりタンパク質濃度は6
3 g/(lに変化した。透析、ZnCQ、2およびT
itriplexI[[の添加、pH−調節およびエン
ドーゲン含有フルクトサミンー濃度の測定は例1におけ
るように行っt;。標準血清のフルクトサミン−予定濃
度の達成のために見積もられたグルコース化されたヒト
血清アルブミンの量が例1に記載されたようにヒト血清
に溶解された。濾過およびIJ!I2配分での充填後凍
結乾燥した。
このようにして得られた凍結乾燥物は再蒸留水1.0d
での再構成後0.38mモル/Ity)血清フルクト
サミン−濃度を有する。
での再構成後0.38mモル/Ity)血清フルクト
サミン−濃度を有する。
例 3
そのフルクトサミン含量が病理学的範囲にある、標準液
を製造した。
を製造した。
そのためにグルコースの透析により貧化されたウシ血清
アルブミンの水溶液(6重量%)を例1に記載されたよ
うに処理した。
アルブミンの水溶液(6重量%)を例1に記載されたよ
うに処理した。
フルクトサミン−予定濃度の達成のために目算された量
のグルコース化されたウシ血清アルブミンを例1に記載
のように、ウシ血清アルブミン溶液に撹拌しながら溶解
した。ウシ血清アルブミン溶液をその後菌除去のために
≦2μmの目幅を有する膜フィルターを介して濾過し、
小びん中にl−配分で充填しかつ凍結乾燥したこのよう
にして製造された凍結乾燥物は再蒸留水1.0<での再
構成後0.49mモル/Cの血清フルクトサミン濃度を
有する。
のグルコース化されたウシ血清アルブミンを例1に記載
のように、ウシ血清アルブミン溶液に撹拌しながら溶解
した。ウシ血清アルブミン溶液をその後菌除去のために
≦2μmの目幅を有する膜フィルターを介して濾過し、
小びん中にl−配分で充填しかつ凍結乾燥したこのよう
にして製造された凍結乾燥物は再蒸留水1.0<での再
構成後0.49mモル/Cの血清フルクトサミン濃度を
有する。
Claims (1)
- 較正のための標準液として、そのpHが6.0〜5.0
でありかつ少なくとも10mモル/l緩衝液を含有する
、フルクトサミンおよびアルブミンを含有する、主にグ
ルコース不含の溶液を使用することを特徴とする、体液
中のフルクトサミンを測定する方法。
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Patent Citations (2)
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