JPH01108997A - 血液又は血液から導出した試料中の血清のフルクトスアミン含量を特異的に測定する方法及び試薬、及び非特異的還元作用を有するか、又は／及び溷濁を惹起する試料成分を除去する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、血、夜又は血液から導出し九試料中の血清の
フルクトスアミンを特別に測定する方法に関する。この
方法では妨邊試料成分ｔｓ　フルクトスアミン含量の測
定前に除去する。

元来の技術 血清のフルクトスアミンとは、非酵素グリコフル化血清
蛋白質の全含１２である。これは、血清のグルコースが
そのカルボニル基によって遊離蛋白質アミノ基と７ツツ
の塩基を形成して生じる。続いてこのものは、アマトリ
転位によって安定なケトアミン結合を有するフルクトス
アミンに変換する。

血清のフルクトスアミンの半減期は、ケトアミン結合の
安定性のために実際に血清蛋白質の半減期と同一であり
、その半減期は平均して約２１日間である。相応する研
究は、Ｌ、　Ｙ、　Ｓ＠ｎｇ及びＭ、　Ｊ、　８ｔａｌ
ｅｙ　：　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１ｉｎｉｃＣ１１
ｎｉｃａｌＣｈｅ　（１９８６年〕第６２巻、第５６０
頁に６己載された。

フルクトスアミンの形成量は、血液のグルコース含量に
比例する。これは、周知のように糖尿病患者では、不十
分な食餌上及び薬物上の物質代謝の場合には、はつ＠９
と現れた＠理学的現象に結合した著しい変動を蒙む９得
る。

血液のグルコース測定によって、医師には血液採取の時
点に存在する物質代謝の状態に関する対照が得られるの
に過ぎない。これに反して、最後の１２０日間の物質代
謝の状態に関する長い期間の対照は、グリコ／ル化ヘモ
グロビン（ＨｂＡｌ　）の測定で可能である。血清のフ
ルクトスアミン測定は、その半減期によって糖尿病患者
の物質代謝の営みｔ１生活基準及び治療法によって約６
週間の平均期間にさか上って確かめるために適当である
。それ故、確立された臨床的診断パラメータの血液のグ
ルコース並びにグリコジル化へモグロ♂ン（ＨｂＡｌ）
に関連して、血清のフルクトスアミンを測定する確実で
特別の実際的方法で、糖尿病患者を有用な平均期間のパ
ラメータについて監視する珍断法は拡大することができ
る。

原理から簡単に実施することのできる血清のフルクトス
アミン測定法は、Ｂａｋｅｒ　：ヨーロッパ特許第００
８５２６３号明細書及び ＪＯｈｎｌＯｎその他：　Ｃ１１ｎｉａａ　ｃｈｉｍｌ
ａａ　ＡＯｔｌｌ（１９８２年）第１２７巻、ｗＬ８７
〜９５頁に記載されている。これは、ケトアミン形がア
ルカＩＪ　ａ水媒体中でエノール形に変シ、エノール形
はテトラゾリウム塩、例えばニトロテトラゾリウムデル
−に還元作用し、その際ホルマデン色素を生じることに
基づく。一定間隔で６７℃で測光によって測定した色素
形成の量は、存在するフルクトスアミンの量に比例する
。

この試験は、試料として血清を便用する場合には妨４を
受けやすい。それというのも天然の血清成分、例えば♂
クルピン、尿酸及びＳＨ基は、同じようにしてテトラゾ
リウム塩に対して還元作中をするからである。アセチル
サリチル酸のメタポライドである薬品、例えばα−メチ
ルドパ、薬品の分解生成物、例えばデンチクン酸並びに
アスコルビン酸も、血清の濃度によって変造測定結果上
もたらす。

との妨沓は、既に正常な及び食餌療法患者の血清で作中
を発揮し、例えば８ｃｈｌｅｌｃｈａｒ及びＷｉａｌａ
ｎｄ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　１ｌｎｉｎｉａａｌ　
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　。

Ｃ１ｎ１ａａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、第１９
巻、第８１〜８７頁、１９８１年）によるフロシン／　
ＨＰＬＣ法と方法を比較すると、絶対的数値が非酵素グ
リコクル化の範囲に関して可能であｌ）　、Ｂａｋｅｒ
による血清のフルクトスアミン測定法にはフルクトスア
ミンの直線状相関性が得られるが、実際でない場合にＢ
ａｋｅｒ法は既に著しい非酵素グリコクル化を示す。こ
れは、図式上でＢａｋｌｉｌｒ法の結果がフロシン／　
ＨＰＬＣ法の結果に対して示される図表では、Ｂａｋｌ
Ｓｒ試験の側で、既に血清のフルクトスアミンが全く存
在しない場合に軸線部分が生じ、その値は平均して非糖
尿病患者の約５０優になる（第１図参照）。

更に、元来血清のフルクトスアミン測定は妨Ｗを受け、
これは試料から試料に変動する全蛋白質の含量に起因す
る。測定は測定値の変動をも友らし、測定法の不安定法
によって減少するこの結果は、例えば通常標準溶液を製
造する場合のように付加的蛋白質の添加で特に明らかで
ある。増大する蛋白質の量によって、フルクトスアミン
と色試薬との反応が遅延する （　ＴＬ、　、７．　Ｈ１ｎｄ’ｓその他：　Ａｎｎａ
ｌｓ　ｏｆ　Ｃ１ｉｎｉａＣ１１ｎｉａａｌＢｉｏｃｈ
ｅ　、第２２４．１９８５年、第８４〜８９頁参照）。

他の難点は、高脂肪血症性血清のフルクトスアミンの測
定で生じる。一般に試料中の低フルクトスアミン濃度の
場合でも、なお十分に大きい測定フグナルを得るｔめに
は、試料／試薬の容量比０．１が必要である。しかしな
がら過トリグリセリド濃度の場合、このように大きい試
料成分では、得られる試験パッチの溷濁は測光測定で負
である。フルクトスアミンの測定は著しくむづかしくな
るか又はむしろ阻止される。

発明が解決しようとする課題 それ故、更に前記欠点を有しない血液又は血液から導出
した試料中の血清のフルクトスアミン含有を特別に測定
する方法の必要がちる。本発明の課題は、かかる方法を
得ることである。

１１題を解決するための手段 この課題は、本発明の特許請求の範囲の記載によって解
決される。

本発明に工って血液又は血液から導出した試料中の血清
のフルクトス、アミン含ｉ’ｔ、適当な色試薬と反応さ
せ、これによって生じた色変化を測定して特別に測定す
る方法は、色反応の前に、非特定の還元性作用又は／及
び個ＩＩＩＪを惹起する試料成分をはゾ中性−で除去し
、続いてｐｌ（１０〜１２を調整し、色試薬を添加する
ことを特徴とする特 許 には、試料に１４又は数種の酸化注作用＃素金−１加す
る。好ましくは酵素酸化剤としては、アスコルベート−
オキ７ダーゼ、ビリルビンーオキクダーゼ又は／及びク
リカーゼを添加する。

ベルオキシダーゼは、場合により生じ，ろ過酸化水素と
一緒に付加的酸化分解工ｍ’ｒ生ぜしめ、これは酸化剤
の効力でなお付加的に高める。場合によυ添加したカタ
ラーゼは、なかんずく過剰址の過酸化水素を除去するの
に役立つ。

殊に脂肪血症性試料を検査するためには、１種又は数種
、の酸化性作用酵素に、場合によりリパーゼを、場合に
より１植又は数種の清浄剤又は／及び強酸塩と一緒に添
加するのが有利であることが判明した。かかる混合物に
よって、溷濁を惹起する物質を、続く色測定がもはや損
なわれかいように十分に除去することが達成される。し
かしながら、試料の希釈及び清浄剤の添加に応じて、脂
肪血症の妨害は、専ら非酵素的に１樵又は数種の清浄剤
によって除去することもできる。

意外なことにも、更に１種又は数種（ＤＢＨ基封鎖試薬
の添加によって、−緒に本発明による血清のフルクトス
アミン測定法の十分な相関性が、７０クン／　ＨＰＬＣ
−比較法で軸線部分を有しないで得られることが判明し
た。試料中に非ｆ＃素グリコクル化蛋白質が存在しない
場合には、このようにして実際に色反応も認められない
（第２図）。

ＳＨ基封鎖試薬は、ＢＨ基と反応するものである。これ
は文献に多く、記載されている。次の論文が挙げられる
： Ａ、　Ｎ、　Ｇｌａｇｅｒ　、　Ｒ，Ｊ、　Ｄａｌａｎ
ｇａ　、　　Ｄ、　８゜８１ｇｍａｎ著；　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　ｍｏｄｉｆｉａａｉｉｏｎ　ｏｆｐｒｏｔｅｉ
ｎａ、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｔａａｈｎｉｑｕａｓ
　ｓｎｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　ｍｏｌ・ｃ
ｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔ、　８．　Ｗｏｒｋ及び
Ｅ、　ＷｏｒｋＸ＠集）（１９７５年）。

Ｃ，Ｈ，Ｗ、　Ｈｌｒｅ　、８．　Ｎ、　Ｔｉｍａｓｈ
＠ｆｆ　、編集；ＭＯｄｉｆｉｏａｔｉｏｎ　　ｒｅｔ
ａｏｔｉｏｎａ　　：　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎｍｎ
ｚｙ＝ｏｘｏｇ７２５巻、３８７−６７１頁（１９７２
年）。

Ｃ，Ｈ，Ｗ、　Ｈｌｒｅ　、　８．　Ｎ、　Ｔｉｍａｇ
Ｍｆｆ　、編集；Ｃｈａｍｉａａｌ　　ｍ０ｄｉｆｉｏ
ａｔｉｏｎ　　：　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎＦｉｎｓ
ａｙｍｏｌｏｇｙ　４７巻、４０７−５００頁（１９７
７年）。

Ｒ，Ｌ、　Ｌｕｎａｂｌａｄ　、　Ｃ，Ｍ、　Ｎｏｙｅ
ａ著；ＣＭｍｉＯａｌ　　ｒｓａｇｓｎｔｓ　　ｔｏｒ
　　ｐｒｏｔｓｔｎｍｏｄｉｆｉａａｔｉｏｎ　、　Ｃ
ＲＣ出版、ポカーａタン（Ｂｏａａ　Ｒｏｔａｎ　）、
フロリダ（Ｆｌｏｒｉａ　）（１９８４年）。

適当なＳＨ封鎖剤は、例えばヨードアセトアミド、ヨー
ドアセテート、Ｎ−エチルマレインイミド、ｐ−ヒドロ
キシメルクリベンゾエートである。本発明方法の特に過
当なものとしては、ヨードアセトアミドが判明した。

妨畜成分金除去するための前記物質によつ二マトリック
ス効果として公知の試料中の変動する全蛋白質量による
測定値の変動も抑制するか又は完全に除かれる。これと
共に正確な蛋白質補正の前提条件は、フルクトスアミン
／全蛋白質の商によって得られる。

非特定の還元性作用又は／及び′／ｍｐＩＪを惹起する
試料成分を除去するためには、試料を、過当な非還元性
緩衝剤中に酸化性作用並びに場合により１種又は数種の
脂質分解酵素、ＢＨ基封鎖剤、並びに場合により１種又
は数４の清浄剤又は／及び強酸塩を含有する溶液で培養
するのが有利であることが判明し九。この溶液を製造す
るためには、非還元性作用を有し、その緩衝作用が中性
−であるすべての緩衝剤が過当である。

Ｐｔ′（６〜９、好ましくは７〜８．５、特に好ましく
は７．５〜８．０が好ましいことが判明した。緩衝剤の
ａ度は、好ましくは１０〜１００Ｆｌｌ−Ｔニル／１１
特に好ましくは２０〜７０Ｆ１１モル／ｌである。特に
好ましくは、燐酸カリウム緩衝剤水溶液が判明し比。

添加酵素の濃度は、除去すべき妨害化合物の１ａ度によ
る。通常この酵素の濃度は、０．０１〜１００００Ｕ／
１１４である。好ましい濃度範囲は、例えば次のもので
ある： ウリカーゼ　　　　　　　　　１　　−　１５０／ｄぎ
クルげンーオキシダーゼ　　　０．０５−　　５０／ｍ
Ａアスコルベートーオキシダーゼ　　２　　−　２０（
３，／ｌｊリパーゼ　　　　　　　　　［１，５−５［
］／ｄベルオキクダーゼ　　　　　０−５−　５［Ｊ／
ｍＡカタラーゼ　、　　、　　　　　１００　−１０［
ＤＤＵ／ｄこの酵素のノ時に好ましい範囲は、次のもの
である： ウリカーゼ　　　　　　　　２　−　１ＱＯ／ＩＬｔビ
リルビン−オキ７ダーゼ　　０．１−　　１Ｕ／ｍＡア
スコルベートーオキシダーゼ　　５　−　１５ｏ／ｙリ
パーゼ　　　　　　　　１−　３Ｕ／祷ペルオキシダー
ゼ　　　　　１　−　３［）／１７カタラーゼ　　　　
　　　５００　−２０００ｔｌ／ＩＩ！ｊＳＨ基封鎖剤
としては、原則として文献での公知試薬を包含するすべ
てものも、例えばヨードアセトアミド、ヨードアセテー
ト、Ｎ−エチルマレインイミド及びｐ−ヒドロキクメリ
クリベンゾエートである。特に適当なものとしては、ヨ
ードアセトアミドが判明した。囲碁封鎖剤の好ましい濃
度範囲としては、０．５Ｎ５００鵬モル／ｌ、特に好ま
しくは５〜５０簿モル／ｌである。

清浄剤は陽イオン性清浄剤を除いて、陰イオン性又は非
イオン性清浄剤であってもよい。陰イオン性清浄剤とし
ては、ガーレン酸のアルカリ金属塩又はアルカリ土類金
属塩及びその共役物が好ましい。陰イオン性清浄剤の好
ましい４度は、２〜１０ｍモル／ｅである。特に好まし
くは濃度４〜６ｍモル／ｌのコール酸ナトリウムである
ことが判明した。

非イオン性清浄剤としては、広いパレットの清浄剤が選
ばれる。適当なものとしては、なかんずくアルコール部
にＣ原子８〜２０個及び分子当りグリコール単位４〜１
５個を有する直鎖状又は分枝状アル−キル−又はアルキ
ルアリールーアルコールーホリグリコールエーテルが判
明し九。アルコール部にＣ原子８〜１２個及び分子当υ
グリコール単位４〜８個を有する直鎖状及び分校状アル
キル−アルコール−ポリグリコールエーテルが、特に好
ましい活性作用を及ぼす。

血清のフルクトスアミン含ｉ’ｉ−特別に測定する本発
明方法には、アルコール部の構造に関して単一であるか
又はアルコール部の構造に関して異なる数種のポリグリ
コールエーテルからなる混合物であってもよい非イオン
性清浄剤が適当である。適当な非イオン性清浄剤は、例
えばオキ−にタル（Ｏｘｅｔ、ａｌ）　　１Ｄ１０４（
ツシムマ−（ＺｇａｈｉｍｍＡｒ　）及び７エウアルツ
（３０ｈＷａｒｓａ　）、ドイツ国〕、ｆａデュクト（
Ｐｒ０ｄｕｉｃｔ　）　ＲＴ　２４０　　（Ｚａｃ′ｒ
Ｌｔｍｍ＠ｒ及びＳｃ’ｎＷａｒｆｆｌ　、　　ドイツ
国〕、ルチンゾル（Ｌ、ｕｔａｎｓｏｌ　）　　ＯＮ５
０、ＯＮ　６０．０Ｎ７０（ＢＡ８Ｆ、　　ドイツｌ〕
並びにソゾロホル（ｄｏｐｒｏｆｏｒ　　）ＲＤ　／　
９１６　（ロース・プラン（Ｒｈｏｎｅ　−ｐｏｕｌｅ
ｎｃ　）、フランス国〕である。

本発明にＬ９非特定の還元性作用又は／及び濶Ｑ　全惹
起する試料成分を除去するｔめに便用する非イオン性清
浄剤の濃度は、０．０５〜１５重量俤である。好ましい
濃度範囲としては、０．１〜５１ｉ俤である。

溷濁除去作用は、反応溶液中の高イオン強度によってな
お増大させることができる。この丸めには、アルカリ性
−１範囲内で溶解する強酸塩の６加が好ましいことが判
明した。好ましいものは、塩酸又は硫酸のアルカリ金属
塩又はアルカリ土類金属塩である。特に好ましくは塩化
カリウム又は−ナトリウムｋｉ！！！用する。添加強酸
塩の濃度は、２０〜１００１ルモル／ｌで６る。

特に好ましくは、塩ｔ（ｍ度４０〜６０ｍモル／ｊで添
加する。

非特定の還元性作用又は／及び澗ｐＡｔ惹起する試料成
分の除去は、温度２５〜４０°Ｃ１好ましくは３７℃で
１〜１５分間、好ましくは２〜６分間行なう。選ぶべき
培養時間は、非特定の還元性作用及び溷濁を惹起する試
料成分の量及びその除去に使・■した添加剤の量による
。

非特定の還元性作用又は／及び溷濁を忍起する試料成分
を除去する丸めの培養は、使用＃素の一最ａ１直のため
には望中注−で行なうが、色試薬とフルクトスアＺンと
の色反応はｐ）１１０〜１２で進行するので、培養後に
再び緩衝させるのが必要である。−の増大は、−が調差
すべき組以上である緩衝剤によって行次う。ｐＨ１０−
５〜１２．５、特に好ましくはｐｌ−１１０，７〜１２
．２に有する緩衝剤が特に有利である。このために好゛
ましくは炭酸塩緩衝剤を便用し、その濃度は１５０〜３
００ｍ４に／ｌ、　特ｔｌＣ好ましくは１８０〜２２０
　ｒａモル／ｌで６る。

公知方法で色試薬をアルカリ性範囲内で添加し−Ｃ１フ
ルクトスアミ／の還元性作用を明らかにすることができ
る。このために好ましくはテトラゾリウム塩を便用し、
そのホルマデン色素の形成を視覚によるか又は測光によ
って追求することができる。テトラゾリウム塩としては
、”　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｇｎｚｙｍａｔｉａ　Ａ
ｎａ１７ａｉｔｓ　”ＣＨａ　Ｕ、　Ｂｅｒｇ＋ｎａｙ
ａｒ　Ｘ第６版、ヘミ−（Ｃｈａｍｉｏ　）社、ワイン
ハイム（ＷｅｉｎＭｉｍ　）、１９８３年、第１巻、第
２．００頁〕に記載されている塩が好ましい。特に適当
なものは、ニトロテトラゾリウムデル−（ＮＢＴ　）又
は３−（４’　、　５’−ジメチルチアゾリル−２−）
−２゜４−ジフェニルーテトツゾリウムプロマイド（Ｍ
ＴＴ　）である。色試薬は、再緩＠後並びに緩衝剤と同
時に試験バッチに添加することができる。このためには
、色試薬を、再緩衝に必要な緩衝剤に溶解するのが好ま
しいことが判明したテトラゾリウム塩には、濃度０．２
〜２ｍモル／！が好ましく、０．４〜１．５ｎモ＃／Ｊ
が特に好ましいことが判明し次。

非特定の還元性作用又は／及び溷濁を惹起する試料成分
を除去した後の再緩衝には、緩衝剤ｔ１試験パッチのｐ
Ｈが色試薬の存在でＰＨＩＯ〜１２、好ましくは１０．
６〜１０．６’に有するように大量に添加する。

再緩衝溶液は温度２５〜４０°Ｃ１好ましくは３７°Ｃ
で培養する。色試薬の還元に基づく色変化は、再緩衝後
に一定の時間間隔で、好ましくは１〜１５分間測光によ
って追求する。最初の測定は再緩衝後１〜１０分間、最
後の測定は再緩衝ｖｋ２〜１５分間行なう。必要によっ
て、測定は２回又は数回性なうことができる。２回の測
定の間隔は変動する。間隔は装置の配置によって選ぶこ
とができ、数秒並びに数分であってもよい。

得られ次側定値を、標準溶液の測定値と比較するのが好
ましい。適当な標準溶液は公知である。このためには、
例えばＪＯｈｎｓＯｎその他：Ｃ１１ｎｉｏａ　Ｃｈｉ
ｍｉａａ　Ａｃｔ＆　（１９８２年）第１２７巻、第８
７〜９５頁に記載の標準物を使用することができる。こ
のものは合成フルクトスアミンの一定添加量を有する人
体のアルブミンからなるマトリックスを基質としている
。合成フルクトスアミンとしては、１−デスオキシ−１
−そルホリノーフルクトース（ＤＭＦ　）　を使用ス、
＆試料中の測定した血清のフルクトスアミン濃度は、こ
の標準物を便中する際にＤＭＦ単位で記載する。同じよ
うにして標準物として適当なのは、人体の血清アルブミ
ン又は牛の血清アルブミン又はそれぞれ公知グリコジル
化度を有する他の蛋白質である。

意外なことにも本発明方法によって、 ＪｏｈｎｓｏＨその他の方法によって常用である試料／
試薬の容量比０．１　ｋ、同じ測定間隔及び同じ温度で
の培養で、試料として使用したフルクトスアミ／類似物
の一定量での測定フグナルが、ＪｏｈｎｓＯｎその他に
記載の方法と比較して著しく小さくならないので下げる
ことが可能になる。

フルクトスアミン類似物として、例えばＤＭＦ　’ｉ便
用すると、この場合には試料／試薬の容量比を、測定の
感度を低下しないで０．０２に下げることができる。

本発明による血液又は血液から導出した試料中のフルク
トスアミンを測定する方法（その際非特定の還元性作用
又は／及び溷濁を惹起する試料成分を、１槌又は数攬の
酵素及びＳＨ基封鎖剤並びに場合により１種又は数種の
清浄剤及び／又は塩によって除去する）は、溶解してだ
けでは行なわれない。容易に乾燥化学的試験担持剤によ
る測定法に移行することができる。このためには、酵素
及びＳＨ基封鎖剤並びに場合により１種又は数種の清浄
剤又は／及び場合により他の助剤を有する塩は、公知方
法で固体担持剤に被覆する。適当な固体担持剤並びにか
かる担持剤にこれらの物質又は物質混合物を被僅する方
法は、公知である。担持剤材料としては、渕えばすべて
の可能な吸収性材料、例えば紙、フリス等である。被覆
すべき物質は、１種又は数４の含浸液に吸収させること
ができる。これらの溶液１に担持剤に含浸させるか又は
スプレーする。続いて乾燥する。

他の方法は、酵素及びＳＨ基封鎖剤並びに場合により清
浄剤又は／及び塩並びに場合により他の助剤を試薬フィ
ルムに被覆することである。

このためには化合物又は化合物混合物ｔ１例えばドイツ
特許第１５９８１５３号明細書又はドイツ公開特許第２
９１・０１３４号による方法に相応して処理して試薬フ
ィルムが得られる。

妨晋する非特定の還元性作用又は／及び溷濁を惹起する
試料成分を除去するためには、測定、すべき試料を、先
づ酵素及びＳＨ基封鎖試薬並びに場合により１種又は数
種の清浄剤又は／及び塩を含有する担持剤と接触させる
。十分な接触後に、予処理試料金色反応に必要な他の反
応成分を含有する層中に入れる。その除虫じる色反応は
公知方法で測光により、例えば反射測定によって測定す
る。予反応及び色反応の時間間隔に関しては、前記の実
施があてはまる。

本発明のもう１つの課題は、血液又は血液か濁を惹起す
る試料成分を除去する試薬、−１０，５〜１２．５を有
する緩衝剤を含有する再緩施するのに必要なすべての成
分を含有する。

血液又は血液から導出した試料中の非特定の還元性作用
又は／及び溷濁を惹起する試料成分を除去する試薬は、
中性ｐ）１１ｒ：有する緩衝剤にとかした１種又は数種
の酵薬酸化剤並びに場合によりペルオキシダーゼ又は／
及びカタラーゼ又は／及びリパーゼ、１．ｆ！ｉ又は数
種のＳＨ基封鎖試薬並びに場合により１種又は数種の清
浄剤及び／又は強酸塩並びに場合により常用の添加剤か
らなる。

酵素酸化剤とは、殊にアスコルベートーオΦ／ダーゼ、
ビリルビン−オキシダーゼ及びクリカーゼである。

ＳＨ基封鎖試薬は、殊にヨードアセトアミド、ヨードア
セテート、Ｎ−エチルマレインイミド、ｐ−ヒドロキシ
メルクリベンデエート及びこれらの物質に便用した化合
物である。

血液又は血液から導出した試料中の非特定の還元性作用
又は／及び溷濁を惹起する試料成分を除去し場合により
清浄剤金含有する本発明による試薬は、虐イオン性又は
非イオン性であってもよい。陰イオン注清浄剤としては
、なかんずくが−レン酸のアルカリ金属塩又はアルカリ
土類金属塩及びその共役物が好ましいが、非イオン性清
浄剤には巾広いパレットの清浄剤を選択する。適当なも
のとしては、なかんずくアルコール部にＣ原子８〜２０
個及び分子当シダリコール単位４〜１５個を有する直鎖
状又は分校状アルキル−又はアルキルアリール−アルコ
ール−ポリグリコールエーテルが判明した。しかしなが
ら、小加清浄剤は付加的に陽イオン注清浄剤、例えば燐
酸オキシエチルアルキルアンモ＝　ｆｙ　ムＣ例、ｔ　
Ｉｄ　ｆ　ヒフ７　ルト（”ｋＬ７（Ｌｕａｒｔ　）Ｒ
８Ｐ１ヘンケル、ドイツ国〕であってもよい。

特に有効なのは、酵素ペルオキシダーゼ及びウリカーゼ
、ＳＨｉ封鎖剤ヨードアセトアミド、非イオン性清浄剤
、例えばルチンゾル （Ｌｑｔａｎａｏｌ　）ＲＯＮ　６　Ｑ並びに陰イオン
性清浄剤コール酸塩を含有する混合物である。

強酸塩としては、本発明の試薬には塩酸又は硫酸のアル
カリ金属塩又はアルカリ土類金属塩が適当であることが
判明した。特に適当なのは、塩化カリウム又は−ナトリ
ウムでちる。

本発明による試薬の中・注ｐＨを得るのに必要な緩衝剤
は、−６〜９、好ましくは７〜８．５、特に好ましくは
７．５〜８．０を有する。緩衝剤の濃度は、好ましくは
１０〜１００ｍモル／ｌ、特に好ましくは２０〜７０ｒ
ｎモル／ｊである。特に好ましいものとしては、燐酸カ
リウム緩衝剤水浴液が判明し九〇 実施例 例　　１ Ｊｏｈｎｓｏｎその他の方法による自動分析機での血清
のフルクトスアミンの測定。

試薬の組成： 炭酸ナトリウム緩衝剤（４１０，３５）　　　０．１そ
ル／ｌニトロテトラゾリウムデル−０，２５ｍモル／！
測定の実施： 試料２０μｊを、試薬２００μ！及びＨ２Ｏ（希釈剤）
５０μｊと混合し、６７℃でコパス・ビオ（Ｃｏｂａｓ
　Ｂｉｏ　Ｒ）自動分析機〔ホフマン・２・ロツシエ（
ＨＯｆｆｍａｎｎ　−Ｌａ　Ｒｏａｈｅ　）、スイス国
バーゼル〕で５５０　ｎｍで吸光を時間に関して測定す
る。フルクトスアミンの濃度を確かめるために、動力学
を、試薬の添加後に１０〜１５分間判読する。

このＭ釆を、フロクン／　ＨＰＩ、Ｃ一対照法（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｒ　ｃｌｌｎｘｏａＩＣｈｅｍｉｓｔｒｙ
　。

Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ＢＬｏａｈｅｍｉｓｔ、ｒｙ　、第
１９巻（１９８１年）、ｍ８１〜８７頁〕で得られる測
定値に対して記載した。ＨＰＬＣ−測定値としては、そ
れぞれ相対ピーク面単位を１！！用する（第１図）。

次側でも、フロシン／　ＨＰＬＣ法を対照法としてｆ中
する。

例　　２ 本発明方法による自動分析機での血清のフルクトスアミ
ンの測定。

□□□）　試薬の組成 （ａ）　　試薬！ （ｂｌ　　試薬冨 （Ｂ）　　試験の実施 試験を、ヒタチ（Ｈｌｔａｃｈｉ　）　７０４自動分析
機で行なった。

波　　長　　：　　５４６　ｎｍ 温　　度　　：　６７°Ｃ 層の厚さ：１０龍（ハーフミクロクベット）クベットに
、次のもの金ピペットで採取する。

これを３７℃で５分間培養する。更に次のものを混合す
る： 更に培養し、色素形成の動力学（ΔＥｐ又は△”ＲＬ　
）を一定の時間間隔Δｔ（８〜１０分）で測定する。

前記のようにして試料に行なつ九相応する方法で、公知
フルクトスアミン含量を有する標鵡溶液（８）を測定し
、このようにして得られた値から三重法によって試料の
フルクトスアミンの濃度を計算する。

第２図には、このようにして得られた測定値がフロシン
／　ＨＰＬＣ法で測定した値に対して記載されている。

例１及び例２の結果の比較は、公知方法に対する本発明
方法で、！（ＰＬＯ対照法と比較する場合に、測定値の
相関性の改良及び軸線部分の著しい減少が得られること
を示す。

例　　３ 例２のようにして望あるが、ヨードアセトアミドを有し
ない血清のフルクトスアミンの測ち第６図には、このよ
うにして得られた測定値がフロ７ン／　ＨＰＬＣ法に対
して記載されている。

第３図は餓１図に対して著しく減少した軸線部分を示し
、これによって既に実際の血清のフルクトスアミン含量
の確実な記載が可能であるが、第６図と第２図との比較
からＳＨ基封鎖試薬の付加的妨害対抗の影響全推定する
ことができる。

例　　４ 増大量のＳＨ基、例えばグルタチオンの影響。

血清のフルクトスアミンの測定に関しては第４図に示さ
れている。

（ａｌでは例３と同じ試薬組成。

ｔｂ）では例２と同じ試薬組成。

フルクトスアミン含量の測定は、それぞれ相応する例２
及び例３に記載のようにして行なう。

ＳＨ基の封鎖によって、妨害は確実に除去されることが
確かめられる。ＳＨ基封鎖試薬ｔ″添加しなければ、Ｓ
Ｒ基によって非酵素グリコジル化蛋白質が見せかけられ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図はＪＯｈｎｓＯｎその他の方法による血清のフル
クトスアミンの測定図であシ、第２図は本発明方法によ
る血清のフルクトスアミンの測定図であシ、第６図は本
発明方法によるが、ＳＨ基封鎖剤を有しない血清のフル
クトスアミンの測定図でちゃ、第４図は本発明方法によ
る血清のフルクトスアミンの他の測定図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、血液又は血液から導出した試料中の血清のフルクト
   スアミン含量を、適当な色試薬と反応させ、生じた色変
   化を測定し、その際色反応の前に、非特定の還元性作用
   又は／及び溷濁を惹起する試料成分を除去し、続いてｐ
   Ｈ１０〜１２で色試薬を添加して特別に測定する方法に
   おいて、非特定の還元性作用試料成分を除去するために
   、試料を中性ｐＨで、１種又は数種の酵素酸化剤で、場
   合によりペルオキシダーゼ又は／及びカタラーゼ並びに
   １種又は数種のＳＨ基封鎖剤と一緒に処理することを特
   徴とする血液又は血液から導出した試料中の血清のフル
   クトスアミン含量を特別に測定する方法。 ２、酵素酸化剤として、アスコルベート−オキシダーゼ
   、ビリルビン−オキシダーゼ又は／及びウリカーゼ及び
   ＳＨ基封鎖剤として、ヨードアセトアミド、ヨードアセ
   テート、Ｎ−エチルマレインイミド又は／及びｐ−ヒド
   ロキシメルクリベンゾエートを使用する請求項１記載の
   方法。 ６、付加的に１種又は数種の清浄剤を添加する請求項１
   又は２記載の方法。 ４、ＳＨ基封鎖剤として、ヨードアセトアミド及び非イ
   オン性又は／及び陰イオン性清浄剤を添加する請求項３
   記載の方法。 ５、溷濁を惹起する試料成分を除去するために試料をリ
   パーゼで、場合により１種又は数種の清浄剤又は／及び
   強酸塩と一緒に処理する請求項１記載の方法。 ４　測定すべきフルクトスアミンを含有する試料に、予
   培養後に、非特定の還元性作用又は／及び溷濁を惹起す
   る試料成分を除去するために、ｐＨ１０〜１２の範囲内
   のｐＨで緩衝作用させるためｐＨ１０．５〜１２．５を
   有する緩衝剤を添加する請求項１記載の方法。 ７、非特定の還元性作用又は／及び溷濁を惹起する試料
   成分を除去する試薬、アルカリ性ｐＨを有する緩衝剤を
   含有する緩衝作用試薬及びフルクトスアミンを検出する
   色試薬からなる、血液又は血液から誘導した試料中の血
   清のフルクトスアミンを特別に測定する試薬組合せ物に
   おいて、非特定の還元性作用又は／及び溷濁を惹起する
   試料成分を除去する試薬は、中性ｐＨを有する緩衝剤中
   で１種又は数種の酵素酸化剤並びに場合によりペルオキ
   シダーゼ又は／及びカタラーゼ又は／及びリパーゼ並び
   に場合により１種又は数種の清浄剤又は／及び強酸塩並
   びに１種又は数種のＳＨ基封鎖剤、場合により常用の添
   加剤を含有する試薬組合せ物。 ８、酵素酸化剤として、アスコルベート−オキシダーゼ
   、ビリルビン−オキシダーゼ又は／及びウリカーゼ及び
   ＳＨ基封鎖剤として、ヨードアセトアミド、ヨードアセ
   テート、Ｎ−エチルマレインイミド又は／及びｐ−ヒド
   ロキシメルクリベンゾエートを含有する請求項１０記載
   の試薬組合せ物。 ９、清浄剤として、陽イオン性、陰イオン性又は／及び
   非イオン性清浄剤及び強酸塩として、塩酸又は硫酸のア
   ルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩を含有する請求項
   １０記載の試薬組合せ物。 １０、ＳＨ基封鎖剤として、ヨードアセトアミド及び非
   イオン性又は／及び陰イオン性清浄剤を含有する請求項
   １０記載の試薬組合せ物。 １１、血液又は血液から導出した試料中の血清のフルク
   トスアミンを測定するために、請求項１０記載の試薬を
   使用して非特定の還元性作用又は／及び溷濁を惹起する
   試料成分を除去する方法。