JPH0261707B2 - - Google Patents
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- JPH0261707B2 JPH0261707B2 JP57165174A JP16517482A JPH0261707B2 JP H0261707 B2 JPH0261707 B2 JP H0261707B2 JP 57165174 A JP57165174 A JP 57165174A JP 16517482 A JP16517482 A JP 16517482A JP H0261707 B2 JPH0261707 B2 JP H0261707B2
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
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- Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は免疫蛍光試薬およびその製法に係わ
る。
る。
臨床検査において、免疫法によつてホルモン、
薬物または代謝物の如き少量化合物を定量するこ
とはきわめて重要である。免疫反応の定量法のう
ち１つの方法は、抗原また抗体をフルオレセイン
またはローダミンイソチオシアネートの如き螢光
発色団でマークするものである。この方法の利用
に伴う主な問題点は、生化学検体の固有の螢光で
ある。これについて、フラビン、ピリジン補酵素
および血清蛋白質の如き多くの物質は、試料とし
て通常使用される発色団も放射するスペクトル域
で強い螢光を発する。
薬物または代謝物の如き少量化合物を定量するこ
とはきわめて重要である。免疫反応の定量法のう
ち１つの方法は、抗原また抗体をフルオレセイン
またはローダミンイソチオシアネートの如き螢光
発色団でマークするものである。この方法の利用
に伴う主な問題点は、生化学検体の固有の螢光で
ある。これについて、フラビン、ピリジン補酵素
および血清蛋白質の如き多くの物質は、試料とし
て通常使用される発色団も放射するスペクトル域
で強い螢光を発する。
赤―近赤外域（600ないし900nm）、したがつて
検体の固有螢光（300ないし450nm）からなり離
れた域で螢光を発する試料を使用することによ
り、天然物によるバツクグラウンドを排除するこ
とができ、該方法の感度を改善することが可能と
なる。
検体の固有螢光（300ないし450nm）からなり離
れた域で螢光を発する試料を使用することによ
り、天然物によるバツクグラウンドを排除するこ
とができ、該方法の感度を改善することが可能と
なる。
溶液中で遊離する多くの染料は、螢光の強度が
かなり弱いものではあつても、これらの特性を有
していることは知られている。しかしながら、そ
の構造が他の分子との共有結合によつて何らかの
方法で変性される場合にも、これらの特性が維持
されることは自明なことではない。
かなり弱いものではあつても、これらの特性を有
していることは知られている。しかしながら、そ
の構造が他の分子との共有結合によつて何らかの
方法で変性される場合にも、これらの特性が維持
されることは自明なことではない。
本発明者らは、近赤外域で螢光を発する染料
を、螢光発色団の―NH2基と反応する二官能性
物質を使用して、各種の蛋白質に共有結合させる
場合にも、これら染料はそのスペクトル特性を失
なわないとの結果を得て、本発明に至つた。この
場合、螢光は２ないし４倍に増大する（第１図お
よび第２図参照）。
を、螢光発色団の―NH2基と反応する二官能性
物質を使用して、各種の蛋白質に共有結合させる
場合にも、これら染料はそのスペクトル特性を失
なわないとの結果を得て、本発明に至つた。この
場合、螢光は２ないし４倍に増大する（第１図お
よび第２図参照）。
第１図は抗γ―免疫グロブリン―ナイルブルー
複合体（曲線２）およびナイルブルー溶液（曲線
１）の発光スペクトルを示す。発色団の濃度は２
×10-6Mである。励起波長は600nmである。スペ
クトルは、光電子増倍管HAMAMATSU R446
を具備する分光螢光光度計Perkin−Elmer MPE
−2Aにより測定したものである。図中、横軸は
波長（nm）を示し、縦軸は螢光を示す。
複合体（曲線２）およびナイルブルー溶液（曲線
１）の発光スペクトルを示す。発色団の濃度は２
×10-6Mである。励起波長は600nmである。スペ
クトルは、光電子増倍管HAMAMATSU R446
を具備する分光螢光光度計Perkin−Elmer MPE
−2Aにより測定したものである。図中、横軸は
波長（nm）を示し、縦軸は螢光を示す。
第２図はアルゴンレーザーによりλ＝515nmで
励起することにより得られた、Protein Ａ―ナイ
ルブルー複合体（曲線３）、HCS―ナイルブルー
複合体（曲線２）およびナイルブルー単独（曲線
１）の発光スペクトルを示す。発色団の濃度は６
×10-6Mである。横軸は波長（nm）を示し、縦
軸は螢光を示す。
励起することにより得られた、Protein Ａ―ナイ
ルブルー複合体（曲線３）、HCS―ナイルブルー
複合体（曲線２）およびナイルブルー単独（曲線
１）の発光スペクトルを示す。発色団の濃度は６
×10-6Mである。横軸は波長（nm）を示し、縦
軸は螢光を示す。
一般に、架橋剤により表される二官能性物質
は、蛋白質および染料の両者と直接反応し、下記
の一般式で表わされる錯体を形成する 〔染料〕―oLn・蛋白質 二官能性物質がカルボジイミドである場合に
は、これら反応体は作用し、カルボキシル基を活
性化してカルボキシル基と染料のアミノ基との間
でカルボアミド結合を形成するため、次式で表わ
される錯体が生成される。
は、蛋白質および染料の両者と直接反応し、下記
の一般式で表わされる錯体を形成する 〔染料〕―oLn・蛋白質 二官能性物質がカルボジイミドである場合に
は、これら反応体は作用し、カルボキシル基を活
性化してカルボキシル基と染料のアミノ基との間
でカルボアミド結合を形成するため、次式で表わ
される錯体が生成される。
これら複合体の蛋白質部分もその生化学特性、
たとえば抗原または抗体である場合には免疫性、
を維持している。
たとえば抗原または抗体である場合には免疫性、
を維持している。
これら免疫蛍光試薬を使用する場合にも、装置
における特別な変更はない。すなわち、通常の分
光螢光光度計に赤外線感応光電子増倍管を取付け
るだけである。特殊な感度の測定は、ヘリウム―
ネオンレーザー、ルビーレーザーまたは簡便には
色素レーザーの如き赤色光または近赤外の連続レ
ーザーまたはパルス化レーザーにより螢光発色団
を励起させることにより行なわれる。
における特別な変更はない。すなわち、通常の分
光螢光光度計に赤外線感応光電子増倍管を取付け
るだけである。特殊な感度の測定は、ヘリウム―
ネオンレーザー、ルビーレーザーまたは簡便には
色素レーザーの如き赤色光または近赤外の連続レ
ーザーまたはパルス化レーザーにより螢光発色団
を励起させることにより行なわれる。
これらの複合体、特に螢光抗体を検鏡の際使用
することは、何ら問題点を生ずるものではなく、
赤外線感光フイルムが必要とされるのみである。
また、同一検鏡プレパーラトにおいて、スペクト
ルの緑―黄色域で螢光を発する従来の螢光発色団
によりマークした抗体で着色した区域に対しての
識別が可能になる利点がある。
することは、何ら問題点を生ずるものではなく、
赤外線感光フイルムが必要とされるのみである。
また、同一検鏡プレパーラトにおいて、スペクト
ルの緑―黄色域で螢光を発する従来の螢光発色団
によりマークした抗体で着色した区域に対しての
識別が可能になる利点がある。
本発明は、下記一般式を有する新規な免疫蛍光
試薬に係わる。
試薬に係わる。
式中、
ｎ：１ないし４の整数
ｍ：ｎに等しい整数（ただし、架橋剤がカルボイ
ミドの場合には、ｍ＝０） Ｐ：抗原または抗体から選ばれる蛋白質 Ｌ：架橋剤残基 Ｘ：酸素またはイオウ原子 Ｙ：NH、NH2、NR″、NR′R″（こでR′および
R″は同一または異なる置換または未置換の
アルキル基、アリール基、アリールアルキル
基またはアルキルアリール基である）または
OCOR′（ここでR′は前記と同意義である）の
中から選ばれる基 R1、R2、R3、R4、R5、R7およびR8：同一または
異なる水素原子またはアミノ基、または置換
または未置換のアルキル基、アリール基、ア
ルキルアリール基またはアリールアルキル基
（R1およびR2および／またはR7およびR8は
互いに結合して芳香環との縮合環を形成する
２価の基であつてもよい。これらのうち少な
くとも１つ（多くの場合R3）は架橋剤との
反応の際、―NH―Ｌまたは―Ｎ＝Ｌ―基を
形成するアミノ基でなければならない。） 上記試薬は、以下の各群から選ばれる各々少な
くとも１種類の化合物を反応させることにより調
製される。
ミドの場合には、ｍ＝０） Ｐ：抗原または抗体から選ばれる蛋白質 Ｌ：架橋剤残基 Ｘ：酸素またはイオウ原子 Ｙ：NH、NH2、NR″、NR′R″（こでR′および
R″は同一または異なる置換または未置換の
アルキル基、アリール基、アリールアルキル
基またはアルキルアリール基である）または
OCOR′（ここでR′は前記と同意義である）の
中から選ばれる基 R1、R2、R3、R4、R5、R7およびR8：同一または
異なる水素原子またはアミノ基、または置換
または未置換のアルキル基、アリール基、ア
ルキルアリール基またはアリールアルキル基
（R1およびR2および／またはR7およびR8は
互いに結合して芳香環との縮合環を形成する
２価の基であつてもよい。これらのうち少な
くとも１つ（多くの場合R3）は架橋剤との
反応の際、―NH―Ｌまたは―Ｎ＝Ｌ―基を
形成するアミノ基でなければならない。） 上記試薬は、以下の各群から選ばれる各々少な
くとも１種類の化合物を反応させることにより調
製される。
(a) 抗原または抗体から選ばれる蛋白質
(b) 一般式
（式中、R1、R2、R3、R4、R5、R7、R8、Ｘお
よびＹは前記と同意義である）で表される可視
域に吸収（λmaxは550ないし800nm）を有し
かつ少なくとも１つの遊離NH2および600ない
し900nmでの螢光を有するオキサジンまたはチ
アジンから選ばれ染料 (c) 架橋剤（一般に、染料のアミノ基と反応しう
る基を有する二官能性物質） 各群を構成するいくつかの化合物を参考のため
に例示する。
よびＹは前記と同意義である）で表される可視
域に吸収（λmaxは550ないし800nm）を有し
かつ少なくとも１つの遊離NH2および600ない
し900nmでの螢光を有するオキサジンまたはチ
アジンから選ばれ染料 (c) 架橋剤（一般に、染料のアミノ基と反応しう
る基を有する二官能性物質） 各群を構成するいくつかの化合物を参考のため
に例示する。
蛋白質
(i) スタフイロコツカス アウレウス
（Staphylococcous aureus）からのProtein Ａ (ii) ホルモン蛋白質 (iii) 各種のγ―免疫グロブリン（Ig）（たとえば
IgG、IgM、IgA、IgD、IgE） 染 料 (i) ナイルブルー（C.I.51180） (ii) クレジルバイオレツト（Cresyl violet） (iii) トルイジンブルー（C.I.52040） (iv) ブリリアントクレジルブルー（C.I.51010） 架橋剤 (i) 一般式 Ｏ＝Ｃ＝Ｎ―Ｒ―Ｎ＝Ｃ＝Ｏ （ここでＲは置換または未置換のアルキレン
基、アリーレン基、アルキルアリーレン基また
はアリールアルキレン基である）で表わされる
ジイソシアネート (ii) 一般式 Ｒ―Ｎ＝Ｃ＝Ｎ―R′ （ここでＲおよびR′は同一または異なる置換
または未置換のアルキル基、アリール基、アル
キルアリール基またはアリールアルキル基であ
る）で表わされるカルボジイミド (iii) 一般式 CHO―Ｒ―CHO （ここでＲは置換または未置換のアルキレン
基、アリーレン基、アルキルアリーレン基また
はアリールアルキレン基である）で表わされる
ジアルデヒド (iv) 構造式 で表わされるエチレン―無水マレイン酸共重合
体（EMA） (v) 式 を有するジニトロベンゼン これら３つの化合物の間の反応は、これら化合
物を単独で使用して行なうことができ、またこれ
ら化合物用の溶媒、たとえば水、少なくとも１種
類の塩の水溶液または緩衝剤混合物の存在下でも
行なうことができる。溶媒のPHは4.5ないし9.5
で、染料の溶解度を高めるために少量の有機溶媒
を添加してもよい。反応温度はほぼ室温（４〜５
℃ないし蛋白質変性温度）である。
（Staphylococcous aureus）からのProtein Ａ (ii) ホルモン蛋白質 (iii) 各種のγ―免疫グロブリン（Ig）（たとえば
IgG、IgM、IgA、IgD、IgE） 染 料 (i) ナイルブルー（C.I.51180） (ii) クレジルバイオレツト（Cresyl violet） (iii) トルイジンブルー（C.I.52040） (iv) ブリリアントクレジルブルー（C.I.51010） 架橋剤 (i) 一般式 Ｏ＝Ｃ＝Ｎ―Ｒ―Ｎ＝Ｃ＝Ｏ （ここでＲは置換または未置換のアルキレン
基、アリーレン基、アルキルアリーレン基また
はアリールアルキレン基である）で表わされる
ジイソシアネート (ii) 一般式 Ｒ―Ｎ＝Ｃ＝Ｎ―R′ （ここでＲおよびR′は同一または異なる置換
または未置換のアルキル基、アリール基、アル
キルアリール基またはアリールアルキル基であ
る）で表わされるカルボジイミド (iii) 一般式 CHO―Ｒ―CHO （ここでＲは置換または未置換のアルキレン
基、アリーレン基、アルキルアリーレン基また
はアリールアルキレン基である）で表わされる
ジアルデヒド (iv) 構造式 で表わされるエチレン―無水マレイン酸共重合
体（EMA） (v) 式 を有するジニトロベンゼン これら３つの化合物の間の反応は、これら化合
物を単独で使用して行なうことができ、またこれ
ら化合物用の溶媒、たとえば水、少なくとも１種
類の塩の水溶液または緩衝剤混合物の存在下でも
行なうことができる。溶媒のPHは4.5ないし9.5
で、染料の溶解度を高めるために少量の有機溶媒
を添加してもよい。反応温度はほぼ室温（４〜５
℃ないし蛋白質変性温度）である。
蛋白質―蛋白質間の反応を防止するため、蛋白
質に対して大過剰量（４ないし50倍のモル濃度）
の染料を使用して反応を行なう。
質に対して大過剰量（４ないし50倍のモル濃度）
の染料を使用して反応を行なう。
また、蛋白質と染料との総量に対して大過剰量
の架橋剤を使用して反応を行なう。
の架橋剤を使用して反応を行なう。
操作上の詳細については以下の実施例により明
らかになるであろう。しかしながら、これらの実
施例は本発明を限定するものではなく、いかなる
種類の物質についても有利に適用できる。
らかになるであろう。しかしながら、これらの実
施例は本発明を限定するものではなく、いかなる
種類の物質についても有利に適用できる。
実施例 １
抗ヒト免疫グロブリンＧ家兎血清（抗ヒト
IgG）の免疫グロブリンフラクシヨンを、二官能
性物質としてグルタルアルデヒドを使用して、ナ
イルブルー（Ｃ・I.51180）およびトルイジンブ
ルー（C.I.52040）でマークした。
IgG）の免疫グロブリンフラクシヨンを、二官能
性物質としてグルタルアルデヒドを使用して、ナ
イルブルー（Ｃ・I.51180）およびトルイジンブ
ルー（C.I.52040）でマークした。
まず、リン酸カリウム緩衝剤（0.01M，PH7.1）
１ml中に抗ヒトIgG2mgおよびナイルブルー1.3×
10-4ミリモルを含有する溶液に、最終のグルタル
アルデヒド濃度が0.05％となるまでグルタルアル
デヒドを添加した。室温において撹拌しながら反
応を30分間行ない、ついで遊離のアルデヒド基を
亜硫酸水素ナトリウムにより捕集することにより
反応を停止した。Sephadex G25のクロマトグラ
フイーにより未反応の染料を除去した。
１ml中に抗ヒトIgG2mgおよびナイルブルー1.3×
10-4ミリモルを含有する溶液に、最終のグルタル
アルデヒド濃度が0.05％となるまでグルタルアル
デヒドを添加した。室温において撹拌しながら反
応を30分間行ない、ついで遊離のアルデヒド基を
亜硫酸水素ナトリウムにより捕集することにより
反応を停止した。Sephadex G25のクロマトグラ
フイーにより未反応の染料を除去した。
代表的な実験例では、蛋白質：染料のモル比が
１：1.8の螢光抗ヒトIgG―ナイルブルー複合体、
あるいは１：1.2の抗ヒトIgG―トルイジンブルー
複合体が得られた。
１：1.8の螢光抗ヒトIgG―ナイルブルー複合体、
あるいは１：1.2の抗ヒトIgG―トルイジンブルー
複合体が得られた。
染料の濃度を、ナイルブルーについてはモル吸
収係数5.8×104を使用してλ＝635nmにおいて、
トルイジンブルーについてはモル吸収係数3.1×
104を使用してλ＝620nmにおいて測定した。
収係数5.8×104を使用してλ＝635nmにおいて、
トルイジンブルーについてはモル吸収係数3.1×
104を使用してλ＝620nmにおいて測定した。
蛋白質濃度については、ε（％）＝14、λ＝
280nmを使用し、紫外域での染料の吸収を補正す
ることにより、あるいはケルダールミクロ法によ
り窒素を測定することにより算定した。
280nmを使用し、紫外域での染料の吸収を補正す
ることにより、あるいはケルダールミクロ法によ
り窒素を測定することにより算定した。
両複合体とも、結合ヒト免疫グロブリンの抗体
特性を明確に維持していた。
特性を明確に維持していた。
実施例 ２
二官能性物質としてグルタルアルデヒドを使用
し、ヒト絨毛膜性ソマトマモトロピン（HCS）
とオキサジン系染料、すなわちブリリアントクレ
ジルブルー（C.I.51010）との間の複合体を調製
した。
し、ヒト絨毛膜性ソマトマモトロピン（HCS）
とオキサジン系染料、すなわちブリリアントクレ
ジルブルー（C.I.51010）との間の複合体を調製
した。
HCS2.5mgおよび染料５×10-4ミリモルを含有
するリン酸ナトリウム緩衝剤（0.05M、PH7.8）
１mlに、最終グルタルアルデヒド濃度が0.1％と
なるまで、グルタルアルデヒドを添加した。室温
で１時間反応を行なつたのち、実施例11の倍く反
応溶液を処理してHCS：ブリリアントクレジル
ブルーのモル比が１：１の複合体を得た。
するリン酸ナトリウム緩衝剤（0.05M、PH7.8）
１mlに、最終グルタルアルデヒド濃度が0.1％と
なるまで、グルタルアルデヒドを添加した。室温
で１時間反応を行なつたのち、実施例11の倍く反
応溶液を処理してHCS：ブリリアントクレジル
ブルーのモル比が１：１の複合体を得た。
染料の割合についてはモル吸収係数16500を使
用してλ＝633において、HCSについてはε（％）
＝8.3を使用してλ＝278において測定した。
用してλ＝633において、HCSについてはε（％）
＝8.3を使用してλ＝278において測定した。
実施例 ３
架橋剤としてグルタルアルデヒドを使用し、実
施例１と同じ条件下で、ナイルブルーとスタフイ
ロコツカス アウレウスからのProtein Ａとの間
の複合体を調製した。
施例１と同じ条件下で、ナイルブルーとスタフイ
ロコツカス アウレウスからのProtein Ａとの間
の複合体を調製した。
この複合体の蛋白質：染料のモル比は１：1.5
であつた。
であつた。
この場合、Protein Ａの測定にあたり、ケルダ
ールミクロ法を使用しない場合には、ε（％）＝
1.65、λ＝275を使用する。
ールミクロ法を使用しない場合には、ε（％）＝
1.65、λ＝275を使用する。
実施例 ４
構造式
を有するトルイレン―２，４―ジイソシアネート
（TDIC）を二官能性物質として使用し、抗ヒト
免疫グロブリン（抗ヒトIgG）をナイルブルー
（C.I.51180）でマークした。
（TDIC）を二官能性物質として使用し、抗ヒト
免疫グロブリン（抗ヒトIgG）をナイルブルー
（C.I.51180）でマークした。
反応を２段階で行なつた。第１段階では、４位
のイソシアネート基を抗ヒトIgGのNH2と反応さ
せる。第２段階では、遊離のTDICを含有しない
抗ヒトIgG―TDIC複合体に37℃でナイルブルー
を添加し、第２のイソシアネート基を染料のアミ
ノ基と反応させる。
のイソシアネート基を抗ヒトIgGのNH2と反応さ
せる。第２段階では、遊離のTDICを含有しない
抗ヒトIgG―TDIC複合体に37℃でナイルブルー
を添加し、第２のイソシアネート基を染料のアミ
ノ基と反応させる。
工程１
リン酸カリウム緩衝剤（PH4.5、0.05M）中に
γ―免疫グロブリン５mgを含む溶液（０℃に冷却
したもの）にTDIC0.05mlを添加した。激しく撹
拌しながら０℃で約30分間反応を行ない、混合物
を遠心分離して０℃において水溶液中で沈殿する
未反応のジイソシアネートを除去した。溶解した
TDICを反応させるため、上清液を０℃でさらに
１時間反応させた。
γ―免疫グロブリン５mgを含む溶液（０℃に冷却
したもの）にTDIC0.05mlを添加した。激しく撹
拌しながら０℃で約30分間反応を行ない、混合物
を遠心分離して０℃において水溶液中で沈殿する
未反応のジイソシアネートを除去した。溶解した
TDICを反応させるため、上清液を０℃でさらに
１時間反応させた。
工程２
工程１の溶液に、ナイルブルー10-4ミリモルを
含有するリン酸塩緩衝剤0.1mlを添加した。反応
溶液を37℃で１時間撹拌し、ついで未反応イソシ
アネート基を分解するために0.1M炭酸アンモニ
ウムに対して透析した。遊離の染料については、
蒸留水または中性の緩衝剤に対する透析および
Sephadex G25のクロマトグラフイーにより除去
した。
含有するリン酸塩緩衝剤0.1mlを添加した。反応
溶液を37℃で１時間撹拌し、ついで未反応イソシ
アネート基を分解するために0.1M炭酸アンモニ
ウムに対して透析した。遊離の染料については、
蒸留水または中性の緩衝剤に対する透析および
Sephadex G25のクロマトグラフイーにより除去
した。
得られた複合体における蛋白質：ナイルブルー
のモル比は１：2.4であつた。なお、これらの算
定にあたつては、実施例１で蛋白質および染料に
ついて示した方法およびモル吸収係数を使用し
た。
のモル比は１：2.4であつた。なお、これらの算
定にあたつては、実施例１で蛋白質および染料に
ついて示した方法およびモル吸収係数を使用し
た。
この複合体の螢光強度は、同じ濃度で遊離の発
色団を励起する際に得られるものよりもかなり高
いものであつた。
色団を励起する際に得られるものよりもかなり高
いものであつた。
実施例 ５
構造式
CH3―CH2―Ｎ＝Ｃ＝Ｎ―CH2
―CH2―CH（NH―CH3）2
を有する１―エチル―３―（３―ジメチルアミノ
プロピル）―カルボジイミド（ECDI）を使用し
て、ナイルブルー（C.I.51180）をスタフイロコ
ツカス アウレウスからのProtein Ａと結合させ
た。
プロピル）―カルボジイミド（ECDI）を使用し
て、ナイルブルー（C.I.51180）をスタフイロコ
ツカス アウレウスからのProtein Ａと結合させ
た。
蒸留水1.2ml中にProtein A5mgおよび大過剰量
（約10倍モル）のナイルブルーを含有する溶液に
ECDI50mgを添加した。撹拌しながら室温で７時
間反応を続け、その間、希HClを添加することに
よりPHを６ないし6.8に維持した。その後、水を
４または５回交換しながら生成物を48時間透析し
た。透析膜内で形成されたコロイド状懸濁液を遠
心分離により除去し、溶液中になお存在する遊離
の染料をSephadex G25のクロマトグラフイーに
より除去した。
（約10倍モル）のナイルブルーを含有する溶液に
ECDI50mgを添加した。撹拌しながら室温で７時
間反応を続け、その間、希HClを添加することに
よりPHを６ないし6.8に維持した。その後、水を
４または５回交換しながら生成物を48時間透析し
た。透析膜内で形成されたコロイド状懸濁液を遠
心分離により除去し、溶液中になお存在する遊離
の染料をSephadex G25のクロマトグラフイーに
より除去した。
複合体中におけるナイルブルーの濃度について
は、水中におけるモル吸収係数5.8×104を使用
し、λ＝635で測定した。蛋白質の濃度について
は、ε（％）＝1.65を使用してλ＝275nmで測定
し、紫外部における染料の吸収を補正することに
より算定した。また、より正確には、ケルダール
ミクロ法により窒素を測定することにより算定す
る。
は、水中におけるモル吸収係数5.8×104を使用
し、λ＝635で測定した。蛋白質の濃度について
は、ε（％）＝1.65を使用してλ＝275nmで測定
し、紫外部における染料の吸収を補正することに
より算定した。また、より正確には、ケルダール
ミクロ法により窒素を測定することにより算定す
る。
代表的な反応により、Protein Ａ：ナイルブル
ーのモル比が１：１ないし1.5（このモル比は反応
時間および反応温度を変えることにより変えられ
る）であり、λ＝680nmにおける螢光強度が同じ
濃度で遊離の発色団を励起することによつて得ら
れるものよりも大きい複合体が得られた。この方
法でマークしたProteni Ａは、家兎Ｇ免疫グロブ
リンで感作した羊赤血球のProtein Ａ−ナイルブ
ルーによる凝集反応でなる受動血球凝集テストに
より示される如く、結合免疫グロブリンの特性を
維持していた。
ーのモル比が１：１ないし1.5（このモル比は反応
時間および反応温度を変えることにより変えられ
る）であり、λ＝680nmにおける螢光強度が同じ
濃度で遊離の発色団を励起することによつて得ら
れるものよりも大きい複合体が得られた。この方
法でマークしたProteni Ａは、家兎Ｇ免疫グロブ
リンで感作した羊赤血球のProtein Ａ−ナイルブ
ルーによる凝集反応でなる受動血球凝集テストに
より示される如く、結合免疫グロブリンの特性を
維持していた。
実施例 ６
実施例５の方法に従つて、ECDIの存在下、ホ
ルモン蛋白質、すなわちヒト絨毛膜性ソマトマモ
トロピン（HCS）をナイルブルーでマークした。
ルモン蛋白質、すなわちヒト絨毛膜性ソマトマモ
トロピン（HCS）をナイルブルーでマークした。
各試薬の量については、HCS2.5mg、メタノー
ル0.05mlに溶解したナイルブルー10-3ミリモルお
よびECDI45mgであり、反応を水２ml中で行なつ
た。
ル0.05mlに溶解したナイルブルー10-3ミリモルお
よびECDI45mgであり、反応を水２ml中で行なつ
た。
蛋白質の濃度はε（％）＝8.3を使用し、λ＝278
で測定した。
で測定した。
得られた螢光複合体はモル比HCG：染料＝
１：１を有しており、ホルモンは抗HCG抗血清
と反応させる際、その抗原特性を維持していた。
１：１を有しており、ホルモンは抗HCG抗血清
と反応させる際、その抗原特性を維持していた。
実施例 ７
ECDIの存在下で家兎γ―免疫グロブリンをマ
ークするためにトルイジンブルー（C.I.52040）
を使用した。
ークするためにトルイジンブルー（C.I.52040）
を使用した。
反応の詳細は次のとおりである。
水２ml中にγ―免疫グロブリン３mgおよびトル
イジンブルー２×10-4ミリモルを含有する反応混
合物を、希HClでPH5.6に調整した。ECDI25mgを
加え、撹拌しながら室温で反応を行なつた。約２
時間後、さらにECDI25mg加え、さらに２時間反
応を続けた。最後に、水またはイオン強度の低い
中性緩衝剤に対して48ないし72時間透析した。
イジンブルー２×10-4ミリモルを含有する反応混
合物を、希HClでPH5.6に調整した。ECDI25mgを
加え、撹拌しながら室温で反応を行なつた。約２
時間後、さらにECDI25mg加え、さらに２時間反
応を続けた。最後に、水またはイオン強度の低い
中性緩衝剤に対して48ないし72時間透析した。
染料についてはモル吸収係数＝3.1×104、λ＝
620nm、蛋白質についてはε（％）＝14、ε＝
280nmにより測定して、調製された複合体のモル
比蛋白質：トルイジンブルーを算定したところ、
１：1.1あつた。
620nm、蛋白質についてはε（％）＝14、ε＝
280nmにより測定して、調製された複合体のモル
比蛋白質：トルイジンブルーを算定したところ、
１：1.1あつた。
このようにしてマークしたγ―免疫グロブリン
は抗γ―免疫グロブリンの存在下で、その免疫特
性を維持していた。
は抗γ―免疫グロブリンの存在下で、その免疫特
性を維持していた。
第１図および第２図は、本発明による調製され
た各種の複合体および対照の発光スペクトルを示
すグラフである。
た各種の複合体および対照の発光スペクトルを示
すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 一般式 （式中、ｎは１ないし４の整数であり、ｍは前記
ｎに等しい整数または０であり、Ｐは抗原または
抗体から選ばれる蛋白質であり、Ｌは架橋剤の残
基であり、Ｘは酸素原子またはイオウ原子であ
り、ＹはNH、NH2、NR′およびNR′R″（ここで
R′およびR″は同一または異なる置換または未置
換のアルキル基、アリール基、アリールアルキル
基またはアルキルアリール基である）および
OCOR′（ここでR′は前記と同意義を有する）の中
から選ばれる基であり、R1、R2、R3、R4、R5、
R7およびR8は同一または異なる水素原子、アミ
ノ基または置換または未置換のアルキル基、アリ
ール基、アルキルアリール基またはアリールアル
キル基であり、R1およびR2および／またはR7お
よびR8は互いに結合して芳香環との縮合環を形
成する２価の基であつてもよく、R1、R2、R3、
R4、R5、R7およびR8のうち少なくとも１つは架
橋剤との反応の際―NH―Ｌまたは―Ｎ＝Ｌ基を
形成するアミノ基でなければならない）を有す
る、免疫蛍光試薬。 ２ 一般式 （式中、ｎは１ないし４の整数であり、ｍは前記
ｎに等しい整数または０であり、Ｐは抗原または
抗体から選ばれる蛋白質であり、Ｌは架橋剤の残
基であり、Ｘは酸素原子またはイオウ原子であ
り、ＹはNH、NH2、NR′およびNR′R″（ここで
R′およびR″は同一または異なる置換または未置
換のアルキル基、アリール基、アリールアルキル
基またはアルキルアリール基である）および
OCOR′（ここでR′は前記と同意義を有する）の中
から選ばれる基であり、R1、R2、R3、R4、R5、
R7およびR8は同一または異なる水素原子、アミ
ノ基または置換または未置換のアルキル基、アリ
ール基、アルキルアリール基またはアリールアル
キル基であり、R1およびR2および／またはR7お
よびR8は互いに結合して芳香環との縮合環を形
成する２価の基であつてもよく、R1、R2、R3、
R4、R5、R7およびR8のうち少なくとも１つは架
橋剤との反応の際―NH―Ｌまたは―Ｎ＝Ｌ基を
形成するアミノ基でなければならない）を有する
免疫蛍光試薬の製法において、以下の群(a)、(b)お
よび(c)から選ばれる各々少なくとも１種類の化合
物を互いに反応させることを特徴とする、免疫蛍
光試薬の製法。 (a) 抗原または抗体から選ばれる蛋白質、 (b) 一般式 （式中、R1、R2、R3、R4、R5、R7、R8、Ｘお
よびＹは前記と同意義である）で表される可視
域に吸収（λmaxは550ないし800nmにある）
を有するオキサジンまたはチアジンから選ばれ
る染料、および (c) 一般に前記染料(b)のアミノ基と反応しうる基
を有する二官能性物質の形の架橋剤。 ３ 特許請求の範囲第２項記載の製法において、
前記３つの化合物の間の反応を、これら化合物の
みを使用して、またはこれら化合物用の溶媒の存
在下で行う、免疫蛍光試薬の製法。 ４ 特許請求の範囲第２項または第３項記載の製
法において、好ましくは水、少なくとも１種類の
塩の水溶液または緩衝剤混合物の存在下で反応を
行う、免疫蛍光試薬の製法。 ５ 特許請求の範囲第２項ないし第４項のいずれ
か１項に記載の製法において、PH4.5ないし9.5に
おいて反応を行う、免疫蛍光試薬の製法。 ６ 特許請求の範囲第２項ないし第５項のいずれ
か１項に記載の製法において、ほぼ室温において
反応を行う、免疫蛍光試薬の製法。 ７ 特許請求の範囲第２項ないし第６項のいずれ
か１項に記載の製法において、反応温度が好まし
くは４℃ないし前記蛋白質の変性温度の範囲から
選ばれる、免疫蛍光試薬の製法。 ８ 特許請求の範囲第２項ないし第７項のいずれ
か１項に記載の製法において、前記蛋白質に対し
て大過剰量の染料を使用して反応を行う、免疫蛍
光試薬の製法。 ９ 特許請求の範囲第２項ないし第８項のいずれ
か１項に記載の製法において、前記蛋白質に対し
て４ないし50倍（モル濃度）の大過剰量で染料を
使用して反応を行う、免疫蛍光試薬の製法。 １０ 特許請求の範囲第２項ないし第９項のいず
れか１項に記載の製法において、蛋白質および染
料の総量に対して大過剰量の二官能性物質を使用
して反応を行う、免疫蛍光試薬の製法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT24161/81A IT1140209B (it) | 1981-09-25 | 1981-09-25 | Reagenti per immunoluorescenza e metodo per la loro preparazione |
| IT24161A/81 | 1981-09-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5866851A JPS5866851A (ja) | 1983-04-21 |
| JPH0261707B2 true JPH0261707B2 (ja) | 1990-12-20 |
Family
ID=11212303
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57165174A Granted JPS5866851A (ja) | 1981-09-25 | 1982-09-24 | 免疫螢光試薬およびその製法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4463099A (ja) |
| EP (1) | EP0075982B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5866851A (ja) |
| AT (1) | ATE16643T1 (ja) |
| DE (1) | DE3267616D1 (ja) |
| IT (1) | IT1140209B (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4582791A (en) * | 1983-10-07 | 1986-04-15 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Reducing non-specific background in immunofluorescence techniques |
| US4918200A (en) * | 1984-07-16 | 1990-04-17 | Huls America Inc. | Chromogenic and fluorogenic silanes and using the same |
| US4666862A (en) * | 1984-08-14 | 1987-05-19 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Fluorescent energy transfer with phycobiliproteins |
| DE3526565A1 (de) * | 1985-07-25 | 1987-02-05 | Boehringer Mannheim Gmbh | Resorufin-derivate, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung in fluoreszenzimmunoassays |
| US4900686A (en) * | 1987-04-02 | 1990-02-13 | Polaroid Corporation | Fluorescent conjugates and biological diagnostic assay |
| US4882284A (en) * | 1987-04-13 | 1989-11-21 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Method for quantitating and differentiating white blood cells |
| US5360739A (en) * | 1991-12-05 | 1994-11-01 | Miles Inc. | Methods for the identification and characterization of reticulocytes in whole blood |
| US5350695A (en) * | 1991-12-05 | 1994-09-27 | Miles Inc. | Methods for the identification and characterization of reticulocytes in whole blood |
| US7322927B2 (en) | 1993-09-24 | 2008-01-29 | Biosite, Inc. | Hybrid phthalocyanine derivatives and their uses |
| US6238931B1 (en) * | 1993-09-24 | 2001-05-29 | Biosite Diagnostics, Inc. | Fluorescence energy transfer in particles |
| US5824799A (en) * | 1993-09-24 | 1998-10-20 | Biosite Diagnostics Incorporated | Hybrid phthalocyanine derivatives and their uses |
| US6251687B1 (en) | 1993-09-24 | 2001-06-26 | Biosite Diagnostics, Inc. | Fluorescence energy transfer and intramolecular energy transfer in particles using novel compounds |
| US7083984B2 (en) | 1993-09-24 | 2006-08-01 | Biosite, Inc. | Hybrid phthalocyanine derivatives and their uses |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2937186A (en) * | 1958-04-29 | 1960-05-17 | Univ Kansas Res Foundation | Isothiocyanate compounds and means of producing the same |
| US3028397A (en) * | 1959-03-24 | 1962-04-03 | Borden Co | Isothiocyanates of phthaleins |
| GB1533410A (en) * | 1974-12-20 | 1978-11-22 | Block Engineering | Antigen detecting reagents |
| US4181650A (en) * | 1975-08-25 | 1980-01-01 | Maier Charles L Jr | Procedure for the assay of pharmacologically immunologically and biochemically active compounds in biological fluids |
| CA1070612A (en) * | 1975-10-09 | 1980-01-29 | Robert V. Dahlstrom | Solid phase immunofluorescent assay method |
| DE2824917A1 (de) * | 1977-07-13 | 1979-02-01 | Corning Glass Works | Biologisch aktive konjugate |
| US4141688A (en) * | 1977-08-11 | 1979-02-27 | Miles Laboratories, Inc. | Composition, device and method for determining reducing agents |
| US4363759A (en) * | 1978-04-10 | 1982-12-14 | Miles Laboratories, Inc. | Chemiluminescent-labeled haptens and antigens |
| US4193983A (en) * | 1978-05-16 | 1980-03-18 | Syva Company | Labeled liposome particle compositions and immunoassays therewith |
| US4238395A (en) * | 1978-07-24 | 1980-12-09 | Miles Laboratories, Inc. | Dimethyl 7-[ω-N-(phthalimido)alkyl]aminonaphthalene-1,2-dicarboxylates |
| US4225485A (en) * | 1978-07-24 | 1980-09-30 | Miles Laboratories, Inc. | Chemiluminescent naphthalene-1,2-dicarboxylic acid hydrazide-labeled polypeptides and proteins |
| US4297273A (en) * | 1978-07-24 | 1981-10-27 | Miles Laboratories, Inc. | Chemiluminescent phthalhydrazide-labeled protein and polypeptide conjugates |
| DE2912845A1 (de) * | 1979-03-30 | 1980-10-09 | Frenzel Bernd | Verfahren zum nachweis und zur quantitativen bestimmung von antigenen, antikoerpern, oder komplexen aus antigenen und antikoerpern |
| US4351760A (en) * | 1979-09-07 | 1982-09-28 | Syva Company | Novel alkyl substituted fluorescent compounds and polyamino acid conjugates |
-
1981
- 1981-09-25 IT IT24161/81A patent/IT1140209B/it active
-
1982
- 1982-09-15 AT AT82201143T patent/ATE16643T1/de not_active IP Right Cessation
- 1982-09-15 DE DE8282201143T patent/DE3267616D1/de not_active Expired
- 1982-09-15 EP EP82201143A patent/EP0075982B1/en not_active Expired
- 1982-09-16 US US06/419,053 patent/US4463099A/en not_active Expired - Fee Related
- 1982-09-24 JP JP57165174A patent/JPS5866851A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT8124161A0 (it) | 1981-09-25 |
| US4463099A (en) | 1984-07-31 |
| IT1140209B (it) | 1986-09-24 |
| JPS5866851A (ja) | 1983-04-21 |
| EP0075982B1 (en) | 1985-11-21 |
| DE3267616D1 (en) | 1986-01-02 |
| ATE16643T1 (de) | 1985-12-15 |
| EP0075982A1 (en) | 1983-04-06 |
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