JPH0262823B2 - - Google Patents
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- JPH0262823B2 JPH0262823B2 JP56030019A JP3001981A JPH0262823B2 JP H0262823 B2 JPH0262823 B2 JP H0262823B2 JP 56030019 A JP56030019 A JP 56030019A JP 3001981 A JP3001981 A JP 3001981A JP H0262823 B2 JPH0262823 B2 JP H0262823B2
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- G—PHYSICS
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Description
本発明は、血漿又は血清からリポ蛋白質フラク
シヨンを選択的に分離することによる血液のβ−
リポ蛋白質の脂質含分を直接測定する方法に関
し、この際、血漿又は血清にポリカチオン（アニ
オン交換体とも称される）を添加し、このポリカ
チオンとリポ蛋白質とから形成される錯体を溶液
から分別除去する。 このような方法は、西ドイツ特許出願公開第
2600664号明細書から公知であり、この方法では、
血清に、溶液中の弱いポリカチオンを特に40％の
ポリエチレンイミン（PEI）−溶液の形で添加し
ており、この際は、可溶性のリポ蛋白質−PEI−
錯体が生じる。この可溶性のリポ蛋白質−PEI−
錯体は、予めポリエチレンイミンの加えられた血
清を弱酸性陽イオン交換体例えばＨ−型のメタク
リル酸−ジビニルベンゾール−コポリマーと一緒
に振り、上澄みをデカンテーシヨンすることによ
り溶液から選択的に除かれる。３種のリポ蛋白質
フラクシヨン即ち一方でβ−リポ蛋白質（低密度
のリポ蛋白質＝LDL）及び他方でプレ−β−リ
ポ蛋白質（非常に低密度のリポ蛋白質＝VLDL）
とα−リポ蛋白質（高密度のリポ蛋白質＝HDL）
の選択的分離は、β−リポ蛋白質とPEIとからの
可溶性錯体は、意外にも溶液中に自由に残存し、
プレ−β−リポ蛋白質とPEIとからの可溶性錯体
及びα−リポ蛋白質とPEIとからの可溶性錯体
は、弱酸性カチオン交換体に吸着されることによ
り、達成される。次いでデカンテーシヨンした上
澄みの脂質含分を公知方法で測定する；即ち血清
中のβ−コレステリンの含分に相当するデカンテ
ーシヨンした上澄み中に含有されるLDL−フラ
クシヨンのコレステリン含分を、リーベルマン−
ブルヒアルト（Liebermann−Burchard）の方法
で、又は酵素法で測定する。 これらの西ドイツ特許出願公開第2600664号明
細書に公知の方法は、誤差±10％の範囲で、再現
可能な測定結果を生じ、超遠心法の参考値（超遠
心による密度勾配による３リポ蛋白質フラクシヨ
ンの分離；Med.Labor.30巻12号294〜301頁
（1977年）参照）と一致するが、その臨床上の使
用性は限られ、熟練した専門家の使用を必要とす
る比較的時間のかかる方法に関する。更に、補助
的イオン交換体の添加（錯体形成に必要なポリカ
チオンと共に）は、汚染の危険性並びに上澄み中
に存在するLDL−フラクシヨンの１部分が必然
的なデカンテーシヨン、洗浄及び濾過の際に損失
する危険性を伴なう。これらの理由から、この公
知方法は、特別な実験上の経費を要しない標準的
方法として、かつ未熟練者によつても迅速かつ確
実に実施するためには適合性が低い。 西ドイツ特許出願公開第2708912号明細書から
は、血漿又は血清からリポ蛋白質を選択的に分離
するもう１つの方法が公知であり、ここでは、血
漿又は血清にまず２価のカチオン例えばMg2+−、
Ca2+−又はMn2+−イオンを加え、引続き固定イ
オンとしてスルフエートイオンをかつ反対イオン
として同様に２価のカチオン例えばMg2+−、
Ca2+−又はMn2+−イオンを有する陽イオン交換
体を加える。この陽イオン交換体の骨格物質は、
網状化された炭化水素、網状化された多糖類、又
は場合により低級ヒドロキシアルキル基で変性さ
れていてよい網状化されたセルロースよりなる。
この方法は、先に記載の方法とは反対に迅速に、
再現可能に、かつ経済的にカラム法で使用できる
が、LDL−及びVLDL−リポ蛋白質フラクシヨ
ンが常に一緒に陽イオン交換体に吸着されるが、
α−リポ蛋白質は第１カラムの溶離液中に残存す
る欠点を有する。従つてβ−リポ蛋白質即ち
LDL−フラクシヨン単独の脂質含分の測定は、
この方法を用いては不可能である。 本発明は、迅速に、再現可能で経済的にカラム
法で使用できるが前記の欠点を有しない、前記種
類の方法を得ること及びこの方法を実施する診断
用セツトを得ることを目的とする。 この課題は、本発明により、血漿又は血清から
のリポ蛋白質フラクシヨンの選択的分離による血
液のβ−リポ蛋白質の脂質を直接測定する方法で
（この際、血漿又は血清に固体アニオン交換体を
添加し、固体アニオン交換体及びリポ蛋白質から
形成される錯体を溶液から分別除去する）、次の
ようにして解決される、即ち、血漿又は血清に水
に不溶の固体アニオン交換体を添加することによ
りプレ−β−リポ蛋白質（VLDL）及びα−リポ
蛋白質（HDL）を分離し、溶液中に残存するβ
−リポ蛋白質（LDL）の脂質含分を公知方法で
測定する。 本発明の方法によれば、被検体液には水性試薬
溶液を添加する必要もなく、体液中に固体の、粉
状又は顆粒状の補助イオン交換体（即ち陽イオン
交換体）を導入する必要もなく、従来公知方法に
おける補助イオン交換体の分離又は被検液体への
異種溶液の添加と関連して現れるすべての困難は
さけられる。本発明方法では、予め水溶液の形で
添加されたポリエチレンイミンの機能、即ちリポ
蛋白質との錯体形成、予め別個に添加された補助
−イオン交換体の機能即ちリポ蛋白質−PEI−錯
体の選択的吸着を、一個の個有の工程にまとめる
ことができ、この際特定の試薬溶液を製造して浄
化又は分離する必要もなく、デカンテーシヨン、
濾過又は溶離液の浄化も必要ではない。本発明に
より使用される固体のアニオン交換体は、カラム
に充填する必要があるだけで、被検体液を慣用方
法でクロマトグラフイにかけると、この際LDL
−フラクシヨンは、支障なく流過し、VLDL又は
HDL−フラクシヨンは不溶の担体に吸着される。 即ち、弱酸性陽イオン交換体を共用しない本発
明の方法は、簡単であり、この方法により、分析
結果に誤差が入らず、困難なく酵素的にLDL−
コレステリン含分を再現性良く測定することがで
きる。 本発明方法の有利な態様は、実施例から明らか
である。 ４級アンモニウム基を固定イオンとして有する
塩基性アニオン交換体の使用、殊に、多孔性担体
上で網状化されたPEI又は４級アンモニウム基含
有デキストランの使用が有利である。更に、２官
能性のエポキシド化合物特にエピクロルヒドリン
又は炭素原子数３〜６のジカルボン酸から誘導さ
れるジアルデヒドで特にグルタールジアルデヒド
で網状化されたPEIの使用が特に有利である。こ
の場合、PEIの網状化は例えば米国特許第
3796634号、西ドイツ特許第1168078号又は西ドイ
ツ特許出願公告第1056825号明細書から公知の方
法で行なう。この場合エピクロルヒドリンは、50
％PEI−溶液各21.6ml（20g）の網状化のために
有利に、2.5〜3.5mlの量で使用するのが有利であ
る。 水に不溶の多孔性担体上で網状化されたPEIを
VLDL−及びHDL−フラクシヨンの分離のため
に使用する際に、被検試料の種類及び起源に応じ
て、血清もしくは血漿中のHDL−分の約５〜10
％が、LDL−フラクシヨンへの貫流中に達する。
しかしながら、この分は少ないので、電気泳動で
検出できるだけである。 ところで、多孔性セラミツク材料又は特定の孔
径を有する多孔性ガラスいわゆるコントロールド
−ポア−ガラス（controlled−pore−glasses）
の存在でPEIの網状化を実施する場合に、溶離液
中の５〜10％のHDL−分もさけることができる
ことが判明した。多孔性セラミツク材料として
は、このために焼成した粘土、シリカゲル及び珪
藻土並びにこれら物質をベースとして製造したが
種々のポリマーと混合した市販製品が好適であ
り、CPG−ガラスとしては、平均孔径175〜250
Åのものが最適であると立証された。 更に、セラミツク材料又は、CPG−ガラスの
存在で網状化されたPEIの使用は、事情によつて
現われる僅かに網状化されたPEI−ゲルの障害性
膨張を確実にさける利点を有する。 殊に濁つた血清では、本発明方法の使用時に
も、僅かなVLDL−フラクシヨンがLDLへの貫
流中に達することができる。しかしながら、この
ことは、使用される網状化された疎水性基でポリ
エチレンイミンを殊に疎水性アミンを、網状化時
に変性することによつてさけられることが判明し
た。この種の疎水性化基での変性によつて、
VLDL−リポ蛋白質への結合能力は著るしく高め
られる。好適な疎水性アミンは、炭素原子数３〜
12の直鎖又は分枝鎖の１級アルキルアミン例え
ば、プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｔ−ブ
チルアミン、ヘキシルアミン、ドデシルアミン、
Ｎ−ヒドロキシメチルエチレンイミン、３−アミ
ノ−２，２−ジメチルプロパン−１−オール、
Ｎ，Ｎ−２−テトラメチルプロパン−１，３−ジ
アミンである。これらのアミンは、PEIの網状化
の際のコモノマーとして２官能性エポキシド化合
物又はジアルデヒドと共に使用される。 まつたく一般的に、カラムによる個々のリポ蛋
白質フラクシヨンの分離度は、溶液のイオン濃
度、PEI−マトリツクスのPH値及び網状化度に依
り決まる。網状化度の増加に伴ないPEI−マトリ
ツクスのリポ蛋白質に対する結合性は低下する。 更に、血漿又は血清からのプレ−β−リポ蛋白
質及びα−リポ蛋白質の分離のために、そのポリ
マーマトリツクス中に、平均分子量20000〜
800000を有するデキストランが導入結合されてい
るようなアニオン交換体を使用するのが有利であ
る。この場合デキストランは、アニオン交換体殊
にポリエチレンイミンの網状化の間に２官能性エ
ポキシド化合物又はジアルデヒドと共に、なお網
状化されていないアニオン交換体の溶液に加え
て、デキストラン単位を網状化の間にポリマーマ
トリツクス中に導入結合させるのが有利である。 本発明の目的は、更に、本発明で使用されるア
ニオン交換体を含有する本発明方法を実施するた
めの診断用セツトである。有利にこの診断用セツ
トは、試験セツト又は試験組合せ物の形で、
各々、個々の測定のための又は一連の測定のため
に充分な量に分包されたすべての必要試薬を有す
る。このテストセツトは既に試験カラムを有して
いてもよい。例えば本発明による診断用セツトは
次のものよりなつてよい： (a) 透明の又は半透明の材料よりなる試験カラム (b) 試験カラムの充填に充分な量の前記の水に不
溶の固体アニオン交換体 (c) 別個に分包されたリポ蛋白質の溶離のための
PH6.5〜7.5の好適な緩衝液 (d) 同様に別個に分包された純粋な食塩溶液 次に、本発明により使用可能なアニオン交換体
の製造を例示する： アニオン交換体１：PEI−エピクロルヒドリン
−クロモソルブ 50％ポリエチレンイミン溶液（G35、BASF）
20gを0.5m−NaOH38ml中に溶かし、エピクロル
ヒドリン2.5mlで網状化させる。このバツチを激
しく15分間撹拌し、被覆のために約50gのクロモ
ソルブ （Johns−Manville International
Corporation New York社の登録商標、珪藻土
をベースとする市販の担持剤）中に撹拌導入し、
60℃で３時間後加熱する。このアニオン交換体を
篩（網目幅0.5mm）中で粉砕し、最微細分を除き、
充分に洗浄し、0.33mNaCl−0.05mイミダゾール
塩酸−（PH7.2）で予備平衡化させる。 アニオン交換体２：PEI−エピクロルヒドリン
−コモノマークロモソルブ アニオン交換体１の製造に記載と同様に、PEI
をエピクロルヒドリンで網状化するが、次に記載
のコモノマーの存在で、次のバツチを用いて行な
う： PEI（50％溶液） 10g 0.5mNaOH 20ml ジオキサン ５ml 並びに ブチルアミン 0.2g 又は プロピルアミン 0.2g 又は ヘキシルアミン 0.2g 又は ドデシルアミン 0.2g 又は Ｎ−ヒドロキシメチル−エチレンイミン
0.5g 又は ３−アミノ−２，２−ジメチルプロパン−
１−オール（BASF） 2g 又は Ｎ，Ｎ−２−テトラメチルプロパン−１，
３−ジオン 1.5g 後処理はアニオン交換体１の製造の際の記載と
同様に行なう。 アニオン交換体３：PEI−グルタールジアルデ
ヒド−CPG−ガラス又はスフエロジル
（Spherosil ） 平均孔径250ÅのCPG−ガラス（製造者：
Electro Nucleonics）5gをグルタールジアルデ
ヒド溶液で湿らせ、軽い撹拌下に10％PEI−溶液
（PH8.0）と反応させる。30分後にデカンテーシヨ
ンし、被覆されたガラス粒子を0.1N−HCl，
0.1N−NaOH及び水で充分に洗浄する。 アニオン交換体４：PEI−エピクロルヒドリン
−CPG−ガラス PEI−G35（50％、BASF）20g、0.5m−NaOH
45ml及びエピクロルヒドリン2.5mlよりなる混合
物を室温で２時間激しく撹拌する。平均孔径177
Åを有するCPG−ガラス（製造者：Elecro
Nucleonics）70gをこの溶液で湿らせ、70℃で２
時間保持する。この被覆されたガラス粒子をカラ
ム中に充填し、1mHCl2、0.5m−燐酸塩緩衝液
（PH7.4）５及び引続き同量の再蒸溜水で洗浄す
る。リポ蛋白質の分離のために、アニオン交換体
を0.25m−NaCl−0.05m−イミダゾール−HCl−
緩衝液（PH7.2）で又は0.42m−KClで予備平衡化
させる。 アニオン交換体５：PEI／デキストラン−エピ
クロルヒドリン−CPG−ガラス PGI−G35（50％；BASF）20g、0.5m−NaOH
45ml、デキストランT500（製造者：pharmacia；
平均分子量：500000）1g及びエピクロルヒドリ
ン2.5mlよりなる混合物を室温で２時間激しく撹
拌する。平均孔径200ÅのCPG−ガラス56gをこ
の溶液で湿らせ、70℃で２時間保持する。この被
覆されたガラスをアニオン交換体４の記載と同様
に洗浄しかつ、予備平衡化する。 アニオン交換体６：PEI／デキストラン−エピ
クロルヒドリン−CPG−ガラス PEI−G35（50％；BASF）20g、0.5m−NaOH
45ml、デキストランT70（平均分子量70000）1g及
びエピクロルヒドリン2.5mlよりなる混合物を室
温で２時間激しく撹拌する。平均孔径200Åの
CPG−ガラス56gをこの溶液で湿らせ、70℃で２
時間保持する。この被覆されたガラス粒子を前記
と同様に洗浄し、かつ予備平衡化する。 アニオン交換体７：PEI／デキストラン−エピ
クロルヒドリン−CPG−ガラス PEI−G35（50％；BASF）20g，0.5m−NaOH
45ml、デキストランT40（平均分子量40000）1g及
びエピクロルヒドリン2.5mlよりなる混合物を室
温で２時間激しく撹拌する。平均孔径200Åを有
するCPG−ガラス56gをこの溶液で湿らせ、70℃
で２時間保持する。この被覆されたガラス粒子を
再び前記と同様に洗浄し、予備平衡化する。 アニオン交換体８： ジエチル−２−ヒドロキシプロピル−アンモニ
ウム基を有するデキストランゲル（QAE−
Sephadex ：製造者：Pharmacia）を再蒸溜水
で予備膨潤させ、引続き0.11m−NaOHで充分に
平衡化し、引続きカラム中に充填する。 例 血液の脂質含分の測定： 被検ヒト血清0.05〜0.15mlをカラム（５×10
mm）（前記のアニオン交換体１〜８の１種２mlが
充填されていて、0.25m−NaCl−0.05m−イミダ
ゾール−塩酸−緩衝液（PH7.2）又は0.42m−KCl
−溶液で予備平衡化させた）に入れる。前記緩衝
液４ml又は0.11m−NaCl溶液で溶離させ、溶離
液中のLDL−コレステリン−含分を次の公知の
分析法の１種で測定する； １ リポ蛋白質−電気泳動（P.Mu¨ller等による
Lab.mad.1巻145〜148頁、（1977年）参照）。 ２ コレステリン測定、ベーリンガー、マンハイ
ムGmbH社の試験組成物（P.Ro¨schlau等によ
るZ.Klin.Chem.Klin.Biochem.12巻403頁
（1974年）参照）； ３ フリーデワルドによるLDL−コレステリン
（W.Friedewald等によるClin.Chem.18巻499頁
（1972年）参照） LDL−コレステリンの含分の評価は次式（フ
リーデワルド）に従がつて行なう： CLDL＝
C血清−（CHDL＋TG／５） ここでＣ＝コレステリン濃度（mg／100ml） TG＝トリグリセリド濃度（mg／100ml） アニオン交換体に吸着されるリポ蛋白質
（VLDL−及びHDL−フラクシヨン）をNaClで
溶離させ、燐タングステン酸又はヘパリンでの
VLDL−フラクシヨンの沈殿の後に、上澄み中の
HDL−コレステリンを公知法で測定する。 次の第１表に、血清中のそれぞれの総コレステ
リン含分の種々の試料に関して、フリーデワルド
の方法で測定したLDL−フラクシヨンのコレス
テリン含分及び本発明により測定したLDL−フ
ラクシヨンのコレステリン含分をそれぞれmg／
100mlで測定して対比させて示す。この場合、本
発明方法で測定した値は、フリーデワルド法で測
定した値と非常に良好に一致することが明らかで
ある。
シヨンを選択的に分離することによる血液のβ−
リポ蛋白質の脂質含分を直接測定する方法に関
し、この際、血漿又は血清にポリカチオン（アニ
オン交換体とも称される）を添加し、このポリカ
チオンとリポ蛋白質とから形成される錯体を溶液
から分別除去する。 このような方法は、西ドイツ特許出願公開第
2600664号明細書から公知であり、この方法では、
血清に、溶液中の弱いポリカチオンを特に40％の
ポリエチレンイミン（PEI）−溶液の形で添加し
ており、この際は、可溶性のリポ蛋白質−PEI−
錯体が生じる。この可溶性のリポ蛋白質−PEI−
錯体は、予めポリエチレンイミンの加えられた血
清を弱酸性陽イオン交換体例えばＨ−型のメタク
リル酸−ジビニルベンゾール−コポリマーと一緒
に振り、上澄みをデカンテーシヨンすることによ
り溶液から選択的に除かれる。３種のリポ蛋白質
フラクシヨン即ち一方でβ−リポ蛋白質（低密度
のリポ蛋白質＝LDL）及び他方でプレ−β−リ
ポ蛋白質（非常に低密度のリポ蛋白質＝VLDL）
とα−リポ蛋白質（高密度のリポ蛋白質＝HDL）
の選択的分離は、β−リポ蛋白質とPEIとからの
可溶性錯体は、意外にも溶液中に自由に残存し、
プレ−β−リポ蛋白質とPEIとからの可溶性錯体
及びα−リポ蛋白質とPEIとからの可溶性錯体
は、弱酸性カチオン交換体に吸着されることによ
り、達成される。次いでデカンテーシヨンした上
澄みの脂質含分を公知方法で測定する；即ち血清
中のβ−コレステリンの含分に相当するデカンテ
ーシヨンした上澄み中に含有されるLDL−フラ
クシヨンのコレステリン含分を、リーベルマン−
ブルヒアルト（Liebermann−Burchard）の方法
で、又は酵素法で測定する。 これらの西ドイツ特許出願公開第2600664号明
細書に公知の方法は、誤差±10％の範囲で、再現
可能な測定結果を生じ、超遠心法の参考値（超遠
心による密度勾配による３リポ蛋白質フラクシヨ
ンの分離；Med.Labor.30巻12号294〜301頁
（1977年）参照）と一致するが、その臨床上の使
用性は限られ、熟練した専門家の使用を必要とす
る比較的時間のかかる方法に関する。更に、補助
的イオン交換体の添加（錯体形成に必要なポリカ
チオンと共に）は、汚染の危険性並びに上澄み中
に存在するLDL−フラクシヨンの１部分が必然
的なデカンテーシヨン、洗浄及び濾過の際に損失
する危険性を伴なう。これらの理由から、この公
知方法は、特別な実験上の経費を要しない標準的
方法として、かつ未熟練者によつても迅速かつ確
実に実施するためには適合性が低い。 西ドイツ特許出願公開第2708912号明細書から
は、血漿又は血清からリポ蛋白質を選択的に分離
するもう１つの方法が公知であり、ここでは、血
漿又は血清にまず２価のカチオン例えばMg2+−、
Ca2+−又はMn2+−イオンを加え、引続き固定イ
オンとしてスルフエートイオンをかつ反対イオン
として同様に２価のカチオン例えばMg2+−、
Ca2+−又はMn2+−イオンを有する陽イオン交換
体を加える。この陽イオン交換体の骨格物質は、
網状化された炭化水素、網状化された多糖類、又
は場合により低級ヒドロキシアルキル基で変性さ
れていてよい網状化されたセルロースよりなる。
この方法は、先に記載の方法とは反対に迅速に、
再現可能に、かつ経済的にカラム法で使用できる
が、LDL−及びVLDL−リポ蛋白質フラクシヨ
ンが常に一緒に陽イオン交換体に吸着されるが、
α−リポ蛋白質は第１カラムの溶離液中に残存す
る欠点を有する。従つてβ−リポ蛋白質即ち
LDL−フラクシヨン単独の脂質含分の測定は、
この方法を用いては不可能である。 本発明は、迅速に、再現可能で経済的にカラム
法で使用できるが前記の欠点を有しない、前記種
類の方法を得ること及びこの方法を実施する診断
用セツトを得ることを目的とする。 この課題は、本発明により、血漿又は血清から
のリポ蛋白質フラクシヨンの選択的分離による血
液のβ−リポ蛋白質の脂質を直接測定する方法で
（この際、血漿又は血清に固体アニオン交換体を
添加し、固体アニオン交換体及びリポ蛋白質から
形成される錯体を溶液から分別除去する）、次の
ようにして解決される、即ち、血漿又は血清に水
に不溶の固体アニオン交換体を添加することによ
りプレ−β−リポ蛋白質（VLDL）及びα−リポ
蛋白質（HDL）を分離し、溶液中に残存するβ
−リポ蛋白質（LDL）の脂質含分を公知方法で
測定する。 本発明の方法によれば、被検体液には水性試薬
溶液を添加する必要もなく、体液中に固体の、粉
状又は顆粒状の補助イオン交換体（即ち陽イオン
交換体）を導入する必要もなく、従来公知方法に
おける補助イオン交換体の分離又は被検液体への
異種溶液の添加と関連して現れるすべての困難は
さけられる。本発明方法では、予め水溶液の形で
添加されたポリエチレンイミンの機能、即ちリポ
蛋白質との錯体形成、予め別個に添加された補助
−イオン交換体の機能即ちリポ蛋白質−PEI−錯
体の選択的吸着を、一個の個有の工程にまとめる
ことができ、この際特定の試薬溶液を製造して浄
化又は分離する必要もなく、デカンテーシヨン、
濾過又は溶離液の浄化も必要ではない。本発明に
より使用される固体のアニオン交換体は、カラム
に充填する必要があるだけで、被検体液を慣用方
法でクロマトグラフイにかけると、この際LDL
−フラクシヨンは、支障なく流過し、VLDL又は
HDL−フラクシヨンは不溶の担体に吸着される。 即ち、弱酸性陽イオン交換体を共用しない本発
明の方法は、簡単であり、この方法により、分析
結果に誤差が入らず、困難なく酵素的にLDL−
コレステリン含分を再現性良く測定することがで
きる。 本発明方法の有利な態様は、実施例から明らか
である。 ４級アンモニウム基を固定イオンとして有する
塩基性アニオン交換体の使用、殊に、多孔性担体
上で網状化されたPEI又は４級アンモニウム基含
有デキストランの使用が有利である。更に、２官
能性のエポキシド化合物特にエピクロルヒドリン
又は炭素原子数３〜６のジカルボン酸から誘導さ
れるジアルデヒドで特にグルタールジアルデヒド
で網状化されたPEIの使用が特に有利である。こ
の場合、PEIの網状化は例えば米国特許第
3796634号、西ドイツ特許第1168078号又は西ドイ
ツ特許出願公告第1056825号明細書から公知の方
法で行なう。この場合エピクロルヒドリンは、50
％PEI−溶液各21.6ml（20g）の網状化のために
有利に、2.5〜3.5mlの量で使用するのが有利であ
る。 水に不溶の多孔性担体上で網状化されたPEIを
VLDL−及びHDL−フラクシヨンの分離のため
に使用する際に、被検試料の種類及び起源に応じ
て、血清もしくは血漿中のHDL−分の約５〜10
％が、LDL−フラクシヨンへの貫流中に達する。
しかしながら、この分は少ないので、電気泳動で
検出できるだけである。 ところで、多孔性セラミツク材料又は特定の孔
径を有する多孔性ガラスいわゆるコントロールド
−ポア−ガラス（controlled−pore−glasses）
の存在でPEIの網状化を実施する場合に、溶離液
中の５〜10％のHDL−分もさけることができる
ことが判明した。多孔性セラミツク材料として
は、このために焼成した粘土、シリカゲル及び珪
藻土並びにこれら物質をベースとして製造したが
種々のポリマーと混合した市販製品が好適であ
り、CPG−ガラスとしては、平均孔径175〜250
Åのものが最適であると立証された。 更に、セラミツク材料又は、CPG−ガラスの
存在で網状化されたPEIの使用は、事情によつて
現われる僅かに網状化されたPEI−ゲルの障害性
膨張を確実にさける利点を有する。 殊に濁つた血清では、本発明方法の使用時に
も、僅かなVLDL−フラクシヨンがLDLへの貫
流中に達することができる。しかしながら、この
ことは、使用される網状化された疎水性基でポリ
エチレンイミンを殊に疎水性アミンを、網状化時
に変性することによつてさけられることが判明し
た。この種の疎水性化基での変性によつて、
VLDL−リポ蛋白質への結合能力は著るしく高め
られる。好適な疎水性アミンは、炭素原子数３〜
12の直鎖又は分枝鎖の１級アルキルアミン例え
ば、プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｔ−ブ
チルアミン、ヘキシルアミン、ドデシルアミン、
Ｎ−ヒドロキシメチルエチレンイミン、３−アミ
ノ−２，２−ジメチルプロパン−１−オール、
Ｎ，Ｎ−２−テトラメチルプロパン−１，３−ジ
アミンである。これらのアミンは、PEIの網状化
の際のコモノマーとして２官能性エポキシド化合
物又はジアルデヒドと共に使用される。 まつたく一般的に、カラムによる個々のリポ蛋
白質フラクシヨンの分離度は、溶液のイオン濃
度、PEI−マトリツクスのPH値及び網状化度に依
り決まる。網状化度の増加に伴ないPEI−マトリ
ツクスのリポ蛋白質に対する結合性は低下する。 更に、血漿又は血清からのプレ−β−リポ蛋白
質及びα−リポ蛋白質の分離のために、そのポリ
マーマトリツクス中に、平均分子量20000〜
800000を有するデキストランが導入結合されてい
るようなアニオン交換体を使用するのが有利であ
る。この場合デキストランは、アニオン交換体殊
にポリエチレンイミンの網状化の間に２官能性エ
ポキシド化合物又はジアルデヒドと共に、なお網
状化されていないアニオン交換体の溶液に加え
て、デキストラン単位を網状化の間にポリマーマ
トリツクス中に導入結合させるのが有利である。 本発明の目的は、更に、本発明で使用されるア
ニオン交換体を含有する本発明方法を実施するた
めの診断用セツトである。有利にこの診断用セツ
トは、試験セツト又は試験組合せ物の形で、
各々、個々の測定のための又は一連の測定のため
に充分な量に分包されたすべての必要試薬を有す
る。このテストセツトは既に試験カラムを有して
いてもよい。例えば本発明による診断用セツトは
次のものよりなつてよい： (a) 透明の又は半透明の材料よりなる試験カラム (b) 試験カラムの充填に充分な量の前記の水に不
溶の固体アニオン交換体 (c) 別個に分包されたリポ蛋白質の溶離のための
PH6.5〜7.5の好適な緩衝液 (d) 同様に別個に分包された純粋な食塩溶液 次に、本発明により使用可能なアニオン交換体
の製造を例示する： アニオン交換体１：PEI−エピクロルヒドリン
−クロモソルブ 50％ポリエチレンイミン溶液（G35、BASF）
20gを0.5m−NaOH38ml中に溶かし、エピクロル
ヒドリン2.5mlで網状化させる。このバツチを激
しく15分間撹拌し、被覆のために約50gのクロモ
ソルブ （Johns−Manville International
Corporation New York社の登録商標、珪藻土
をベースとする市販の担持剤）中に撹拌導入し、
60℃で３時間後加熱する。このアニオン交換体を
篩（網目幅0.5mm）中で粉砕し、最微細分を除き、
充分に洗浄し、0.33mNaCl−0.05mイミダゾール
塩酸−（PH7.2）で予備平衡化させる。 アニオン交換体２：PEI−エピクロルヒドリン
−コモノマークロモソルブ アニオン交換体１の製造に記載と同様に、PEI
をエピクロルヒドリンで網状化するが、次に記載
のコモノマーの存在で、次のバツチを用いて行な
う： PEI（50％溶液） 10g 0.5mNaOH 20ml ジオキサン ５ml 並びに ブチルアミン 0.2g 又は プロピルアミン 0.2g 又は ヘキシルアミン 0.2g 又は ドデシルアミン 0.2g 又は Ｎ−ヒドロキシメチル−エチレンイミン
0.5g 又は ３−アミノ−２，２−ジメチルプロパン−
１−オール（BASF） 2g 又は Ｎ，Ｎ−２−テトラメチルプロパン−１，
３−ジオン 1.5g 後処理はアニオン交換体１の製造の際の記載と
同様に行なう。 アニオン交換体３：PEI−グルタールジアルデ
ヒド−CPG−ガラス又はスフエロジル
（Spherosil ） 平均孔径250ÅのCPG−ガラス（製造者：
Electro Nucleonics）5gをグルタールジアルデ
ヒド溶液で湿らせ、軽い撹拌下に10％PEI−溶液
（PH8.0）と反応させる。30分後にデカンテーシヨ
ンし、被覆されたガラス粒子を0.1N−HCl，
0.1N−NaOH及び水で充分に洗浄する。 アニオン交換体４：PEI−エピクロルヒドリン
−CPG−ガラス PEI−G35（50％、BASF）20g、0.5m−NaOH
45ml及びエピクロルヒドリン2.5mlよりなる混合
物を室温で２時間激しく撹拌する。平均孔径177
Åを有するCPG−ガラス（製造者：Elecro
Nucleonics）70gをこの溶液で湿らせ、70℃で２
時間保持する。この被覆されたガラス粒子をカラ
ム中に充填し、1mHCl2、0.5m−燐酸塩緩衝液
（PH7.4）５及び引続き同量の再蒸溜水で洗浄す
る。リポ蛋白質の分離のために、アニオン交換体
を0.25m−NaCl−0.05m−イミダゾール−HCl−
緩衝液（PH7.2）で又は0.42m−KClで予備平衡化
させる。 アニオン交換体５：PEI／デキストラン−エピ
クロルヒドリン−CPG−ガラス PGI−G35（50％；BASF）20g、0.5m−NaOH
45ml、デキストランT500（製造者：pharmacia；
平均分子量：500000）1g及びエピクロルヒドリ
ン2.5mlよりなる混合物を室温で２時間激しく撹
拌する。平均孔径200ÅのCPG−ガラス56gをこ
の溶液で湿らせ、70℃で２時間保持する。この被
覆されたガラスをアニオン交換体４の記載と同様
に洗浄しかつ、予備平衡化する。 アニオン交換体６：PEI／デキストラン−エピ
クロルヒドリン−CPG−ガラス PEI−G35（50％；BASF）20g、0.5m−NaOH
45ml、デキストランT70（平均分子量70000）1g及
びエピクロルヒドリン2.5mlよりなる混合物を室
温で２時間激しく撹拌する。平均孔径200Åの
CPG−ガラス56gをこの溶液で湿らせ、70℃で２
時間保持する。この被覆されたガラス粒子を前記
と同様に洗浄し、かつ予備平衡化する。 アニオン交換体７：PEI／デキストラン−エピ
クロルヒドリン−CPG−ガラス PEI−G35（50％；BASF）20g，0.5m−NaOH
45ml、デキストランT40（平均分子量40000）1g及
びエピクロルヒドリン2.5mlよりなる混合物を室
温で２時間激しく撹拌する。平均孔径200Åを有
するCPG−ガラス56gをこの溶液で湿らせ、70℃
で２時間保持する。この被覆されたガラス粒子を
再び前記と同様に洗浄し、予備平衡化する。 アニオン交換体８： ジエチル−２−ヒドロキシプロピル−アンモニ
ウム基を有するデキストランゲル（QAE−
Sephadex ：製造者：Pharmacia）を再蒸溜水
で予備膨潤させ、引続き0.11m−NaOHで充分に
平衡化し、引続きカラム中に充填する。 例 血液の脂質含分の測定： 被検ヒト血清0.05〜0.15mlをカラム（５×10
mm）（前記のアニオン交換体１〜８の１種２mlが
充填されていて、0.25m−NaCl−0.05m−イミダ
ゾール−塩酸−緩衝液（PH7.2）又は0.42m−KCl
−溶液で予備平衡化させた）に入れる。前記緩衝
液４ml又は0.11m−NaCl溶液で溶離させ、溶離
液中のLDL−コレステリン−含分を次の公知の
分析法の１種で測定する； １ リポ蛋白質−電気泳動（P.Mu¨ller等による
Lab.mad.1巻145〜148頁、（1977年）参照）。 ２ コレステリン測定、ベーリンガー、マンハイ
ムGmbH社の試験組成物（P.Ro¨schlau等によ
るZ.Klin.Chem.Klin.Biochem.12巻403頁
（1974年）参照）； ３ フリーデワルドによるLDL−コレステリン
（W.Friedewald等によるClin.Chem.18巻499頁
（1972年）参照） LDL−コレステリンの含分の評価は次式（フ
リーデワルド）に従がつて行なう： CLDL＝
C血清−（CHDL＋TG／５） ここでＣ＝コレステリン濃度（mg／100ml） TG＝トリグリセリド濃度（mg／100ml） アニオン交換体に吸着されるリポ蛋白質
（VLDL−及びHDL−フラクシヨン）をNaClで
溶離させ、燐タングステン酸又はヘパリンでの
VLDL−フラクシヨンの沈殿の後に、上澄み中の
HDL−コレステリンを公知法で測定する。 次の第１表に、血清中のそれぞれの総コレステ
リン含分の種々の試料に関して、フリーデワルド
の方法で測定したLDL−フラクシヨンのコレス
テリン含分及び本発明により測定したLDL−フ
ラクシヨンのコレステリン含分をそれぞれmg／
100mlで測定して対比させて示す。この場合、本
発明方法で測定した値は、フリーデワルド法で測
定した値と非常に良好に一致することが明らかで
ある。
【表】
第２表で、変動係数と再現率（％）の記載によ
り本発明方法の精確度を示す。
り本発明方法の精確度を示す。
【表】
第３表では種々の血清に関して、それぞれ総コ
レステリン含分、HDL−フラクシヨンのコレス
テリン含分、トリグリセリドの含分、本発明によ
り測定した前記アニオン交換体４を用いるLDL
−フラクシヨンのコレステリン含分及びフリーデ
ワルド法で測定したLDL−フラクシヨンのコレ
ステリン含分を示す。
レステリン含分、HDL−フラクシヨンのコレス
テリン含分、トリグリセリドの含分、本発明によ
り測定した前記アニオン交換体４を用いるLDL
−フラクシヨンのコレステリン含分及びフリーデ
ワルド法で測定したLDL−フラクシヨンのコレ
ステリン含分を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 血漿又は血清からリポ蛋白質フラクシヨンの
選択的分離により血液のβ−リポ蛋白質の脂質含
分を陽イオン交換体の不存在下で、直接測定する
方法において、血漿又は血清に、水に不溶の固体
アニオン交換体として、多孔性担持物質上で網状
化されたポリエチレンイミン（PEI）又は固定イ
オンとしての４級アンモニウム基を有する固体デ
キストランを添加することによりプレ−β−リポ
蛋白質（VLDL）及びα−リポ蛋白質（HDL）
を分離し、溶液中に残つているβ−リポ蛋白質
（LDL））の脂質含分を公知方法で測定すること
を特徴とする、血液のβ−リポ蛋白質の脂質含分
を直接測定する方法。 ２ アニオン交換体として、固定イオンとしての
ジエチル−２−ヒドロキシプロピル−アンモニウ
ム基を有する固体デキストランを使用する、特許
請求の範囲第１項記載の方法。 ３ VLDL−フラクシヨン及びHDL−フラクシ
ヨンの分離のために、２官能性エポキシド化合物
で網状化されたPEIを使用する、特許請求の範囲
第１項に記載の方法。 ４ VLDL−フラクシヨン及びHDL−フラクシ
ヨンの分離のために、炭素原子数３〜６のジアル
デヒドで網状化されたPEIを使用する、特許請求
の範囲第１項に記載の方法。 ５ VLDL−フラクシヨン及びHDL−フラクシ
ヨンの分離のために、疎水性アミンの存在で２官
能性エポキシド化合物又はジアルデヒドで網状化
されたPEIを使用する、特許請求の範囲第２項又
は第３項記載の方法。 ６ 炭素原子数３〜12の直鎖又は分枝鎖の１級ア
ルキルアミンの存在で網状化されたPEIを使用す
る、特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７ VLDL−フラクシヨン及びHDL−フラクシ
ヨンの分離のために、水に不溶の固体アニオン交
換体で被覆されたか又は包囲された微細な多孔性
担持物質を使用する、特許請求の範囲第１項から
第６項までのいずれか１項に記載の方法。 ８ 微細な多孔性担持物質として、焼成粘土、シ
リカゲル、珪藻土、特定の孔寸法を有するガラス
（CPG−ガラス）又はこれら担持物質の混合物を
使用する、特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９ 微細多孔性担持物質として、平均孔径175〜
250ÅのCPG−ガラスを使用する、特許請求の範
囲第８項に記載の方法。 １０ ポリマーマトリツクス中にデキストランが
導入結合されている、網状化されたポリエチレン
イミンを使用する、特許請求の範囲第１項から第
９項までのいずれか１項に記載の方法。 １１ ポリマーマトリツクス中に平均分子量
20000〜800000のデキストランが導入結合されて
いる、網状化されたポリエチレンイミンを使用す
る、特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２ 血漿又は血清を、網状化された固体アニオ
ン交換体又はこれで被覆された微細多孔性担持物
質の充填されたカラム上に加え、PH6.5〜7.5の緩
衝液で、LDL、VLDL及びHDLを選択的に溶離
させる、特許請求の範囲第１項から第１１項まで
のいずれか１項に記載の方法。 １３ LDLの溶離のために緩衝液として塩化ナ
トリウム−イミダゾール−塩酸−緩衝液を使用す
る、特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４ LDLの溶離の後の緩衝液のNaCl−濃度
を、溶離液中にVLDLが検出できるまで段階的に
増大させ、次いで一定NaCl濃度でVLDLを完全
に溶離させ、その後純砕な食塩溶液でHDLを溶
離させる、特許請求の範囲第１３項記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19803009037 DE3009037A1 (de) | 1980-03-08 | 1980-03-08 | Verfahren zur direkten bestimmung des lipidgehaltes der (beta) -lipoproteine des blutes |
Publications (2)
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|---|---|
| JPS56137251A JPS56137251A (en) | 1981-10-27 |
| JPH0262823B2 true JPH0262823B2 (ja) | 1990-12-26 |
Family
ID=6096684
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| JP (1) | JPS56137251A (ja) |
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| DE (2) | DE3009037A1 (ja) |
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