JPH0262942A - 細胞内の物質測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ、産業上の利用分野 本発明は、体細胞や菌体内に存在する物質を測定する方
法に関するものである。

Ｂ　発明の概要 本発明は、細胞膜を界面活性剤により破壊して細胞内の
被測定物質を抽出し、その後この物質を例えば光学的手
法により測定する方法において、界面活性剤の他にクロ
ロホルムを添加することによって、 抽出効率を高めると共に、室温においても十分な抽出が
できるようにしたものである。

Ｃ１従来の技術 細胞内や菌体内に存在する物質を定性的あるいは定量的
に測定することにより有効な知見を得ることができる。

例えば生体細胞中には、生体のリン酸代謝及びエネル＋
−代謝の役割を果たしているアデノンン三リン酸（ＡＴ
Ｐ）が必ず存在し、死細胞中にはＡＴＰが存在しないこ
とが知られている。また１個の細胞中に存在するＡＴＰ
［は、同一細胞では同−濃度のＡＴＰが存在する。従っ
てＡＴＰが定量できれば、細胞の数及び生細胞か死細胞
かの判定や細胞の活性度が測定できることになる。

また水道原水中や大気浮遊粉塵中には、種々の発癌関連
物質が含まれており、これらのモニタリングや検出法に
Ａｍｅｓ法またはその変法を用いた復帰突然変異試験が
広く使用されている。これらの短期テストは方法が簡便
で、定量性も比較的高い。最近になって、化学物質のＤ
ＮＡ傷害を短時間に検出する有効な短期テストがいくつ
か提出されている。これらの短期テストは、特定の閑と
化学物質を反応させた時に、菌体内で化学物質がＤＮＡ
傷害を誘起し、それに伴って生じるＳＯ８反応をβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼ活性から求める方法である。従って
菌体内に発生したβ−Ｄ−ガラクトンダーゼ活性を測定
することができれば、化学物質が発癌関連物質であるか
否かの判定ができることになる。

このように細胞内に存在する物質または生成した物質を
測定するためには、多くの場合細胞に何らかの処理を施
し、細胞膜を破壊し、細胞外にその物質を放出させるこ
と、いわゆる抽出操作を行う必要がある。

一方最近において、可溶化することが困難な非常に疎水
性の強い蛋白質を比較的温和な条件で可溶化できる界面
活性剤の種類が増えてきた。

界面活性剤はその電気的な性質に基づいて、陰イオン性
界面活性剤、陽イオン性界面活性剤２両性界面活性剤及
び非イオン性界面活性剤に分類される。また電気的な性
質とは無関係にコール酸。

デオキシコール酸などのようなステロイド骨格を持つ界
面活性剤も存在する。この中で膜蛋白質の可溶化には、
陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤及び胆汁
酸（コール酸、デオキシコール酸）がよく利用されてい
る。

こうしたことから界面活性剤を用いて細胞内の物質を抽
出することが試みられている。

Ｄ１発明が解決しようとする課題 ところが、界面活性剤は表面張力を著しく低下させる作
用を有し、細胞の膜破壊にも実際にいくつかの界面活性
剤が使用されているものの、従来の界面活性剤を用いた
方法では、体細胞のような比較的膜破壊の容易な細胞を
対象とした場合には、良好な抽出を行うことができるが
、微生物細胞の場合には、膜破壊作用が弱く、抽出効率
が低下する欠点があった。さらに界面活性剤を用いた抽
出方法は、一般に時間がかかることも問題点となってい
た。

本発明の目的は、細胞内の被測定物質の抽出効率が高く
、しかも操作が簡単で、短時間で分析を行うことのでき
る測定方法を提供することにある。

Ｅ１課題を解決するための手段 本発明は細胞と界面活性剤及びクロロホルムとを混合し
、その混合液を振盪することにより細胞膜を破壊して細
胞内の被測定物質を抽出し、次いてこの被測定物質を測
定することを特徴とする。

Ｆ、実施例 （実施例１） 凍結保存された大腸菌の菌液を解凍し、菌液１ｍＱを試
験管に分取してクロロホルム０．２ｍＱを加え、更に界
面活性剤である１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ
）溶液を０．２ｍＣ加える。なおｓＤｓの濃度単位の「
％」については、１％が０．０１９／ｍ＋２の意味であ
る。次いでこの試験管をポルテックスミキサー等の振盪
器を用いて２０秒間撹拌振盪し、これにより細胞膜を破
壊する。

次にＡＴＰと他の細胞成分を分離するために遠心分離器
により３０００ｒｐｍの回転数で５分間遠心分離し、そ
の後上澄成分をピペットで静かに別の試験管に分取し、
これを蒸留水で１０倍に希釈する。そしてこの反応液０
．５ｍＱを測定装置専用のバイヤルビンに分取し、発光
試薬を含む反応試薬を０．５ｍＱ自動的に分注して、分
注直後から３０秒間の発光量を計測する。

以上において上記の発光法は、生物発光法と呼ばれ、以
下に示すようにＡＴＰとルシフェリンとルンフェラーゼ
との反応により発生する光の量にもとづいてＡＴＰの績
を知る方法であり、簡便で高感度な測定法である。なお
ホタルの光はこれに相当する。

ルンフェラーゼ ＡＴＰ＋ルシフェリン　　　　　　　　　　７デニルル
ゾ７エリンアデールルン７１リン十〇、−７デニルオ竹
ルシフ工リン＋光第１図は、試料としてＡＴＰ標準液を
用い、当該実施例の方法によりＡＴＰの量を測定した場
合の検量線の一例である。また発光量から検量線を介し
てＡＴＰ抽出量（濃度）を求め、このＡＴＰ抽出量と菌
体濃度との関係を調べたところ、第２図に示すような直
線性が得られた。従って抽出が良好に行われていること
が裏付けられている。

ここで上記の測定プロセスの中でＳＤＳの濃度を変えて
、抽出したＡＴＰ濃度を調べたところ第３図に示す結果
が得られた。この結果からＳＤＳの最適濃度は約１％が
最適であることがわかる。

更に上記の測定プロセスの中で振盪時間を変えて、抽出
したＡＴＰ濃度を調べたところ第４図に示す結果が得ら
れた。この結果から振盪時間はＡＴＰ抽出量に対して影
響を及ぼさないことがわかる。

（実施例２） ＳＤＳ溶液の代わりに１％モノラウリル酸ソルビタン溶
液を用いる他は実施例１と同様にして、菌体濃度と抽出
したＡＴＰ濃度との関係を調べたところ、第５図に示す
結果が得られた。この結果から良好な抽出が行われてい
ることが理解される。

（実施例３） ＳＤＳｆ８Ｍの代わりに１％コール酸ナトリウム溶液を
用いる他は実施例１と同様にして、菌体濃度と抽出した
ＡＴＰ濃度との関係を調べたところ、第６図に示す結果
が得られた。この結果から良好な抽出が行われているこ
とが理解される。

（実施例４） 大腸菌をＬＢ培地（各種の栄養分を備えた培地）で−夜
培養し、その培養液を波長６００ｎｍにおける吸光度が
０．１　になるようにＬＢ培地で希釈調製する。こうし
て得られた試験液３．ＯｒｌにＤＮＡ損傷を引き起こす
化学物質０．０５ｍｅを加え、３７℃で２時間培養する
。これにより大腸菌中にβ−Ｄ−ガラクトシダーセか生
成する。次いで培養した試験液１．０ｍｆｆに０．１ｍ
ｏｆ２／ＣのＮａＰＢＳｌ、０ｍＱ、　りｏｏホルム０
．１ｒｌ及び１％の５ｌ）ＳＯ，１ｍ１２を加え、１０
秒間振借した後５分間静１位した。しかる後にこの反応
ｔｇＬ０．２５ｍ１！に０．１ｍｏＣ／ＣのＮａ　　Ｐ
Ｉ３５（リン酸緩衝液）２．２５ｍＱ、、０．１ｍＱ、
／ＱのＮ　ａ　Ｎ３０．５　ｍ１２１０．２５ｍｏＬ’
ｉ２のラクトース１．Ｏｍｇ及びＧＵ／ｍｌ！（ｔ、’
とは酵素活性を表す単位である。）のタルコースオギノ
ダーゼ１ｍ９を加え、３７℃で２時間酵素反応さＵた。

なおＮａ−ＰＩ３５２．２５＋ｔｌを加えた理由は、ラ
クトースとクルコースオキンダーゼと反応液との比率を
一定にするためである。

その後この酵素反応液Ｑ、２ｍＱに２ＸｌＯ−７ｍ。

Ｑ／！２のルミノール０．５ｍ＆と６　Ｘ　Ｉ　Ｏ−３
ｍｏ（１／Ｑ、のフエリノアノ化カリウム０．５ｍ（２
を加え、１秒後から３０秒間の発光量を計測した。

ここで上記のプロセス中の酵素反応と化学発光反応とは
次の通りである。

く酵素反応〉 α−Ｄ−グル］−ス β−Ｄ−グル］−ス く化学発光反応〉 第７図は既知ｊｉｔのβ−Ｄ−ガラクトンダーゼ活性と
発光量との関係を示ケ検ｍ線であり、この検ｆｉｔ線を
利用して４−二ト〔Ｊキノリン−Ｎ−オキノド（１）　
Ｎ　Ａ損傷を引き起こす化学物質（４，Ｎ　Ｑ　Ｏ））
の定量を行った結果を第８図に示Ｗ０β−［）−カラク
トシダーゼ活性濃度と４−ニトロキノリンＮ−オキノド
濃度は比例関係にあり、その定数は酵素反応の種類及び
反応時間等により定まる。

以上において、本発明の対象となる細胞は、微生物ある
いは体細胞のいずれであってもよく、微生物としては大
腸菌等の細菌、糸状菌、酵母、変形菌、単細胞の藻類あ
るいは原生動物等が挙げられる。

抽出すべき物質としては、元から細胞内に存在する物質
及び外部からの刺激により生成する物質のいずれをも含
む。前者の元から細胞内に存在する物質とは、代謝物質
、蛋白質、核酸あるいは脂質等であり、このうち代謝物
質とは、アゾ／ノンすリン酸等のヌクレオチド、ヌクレ
オシド、アミノ酸あるいはホルモン等である。後者の物
質とは、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素である。

界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン
性界面活性剤あるいはステロイド骨格をもつ界面活性剤
等を用いることができる。

陰イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウ
ム、テトラデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸
ナトリウム、テトラデシルスルホン酸ナトリウム、ドデ
シルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシル−Ｎ−サ
ルコシン酸ナトリウム等が挙げられる。

非イオン性界面活性剤としては、デシルエーテル、ドデ
シルエーテル、トリデシルエーテル、テトラデシルエー
テル、セチルエーテル、ステアリルエーテル、オレイル
エーテル、セチル−ステアリルエーテル、ｐ−ｔ−オク
チルフェニルエーテル、ｐ−オクチルフェニルエーテル
、ｐ−／ニルフェニルエーテル、モノラウリン酸ソルビ
タン、モノバルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸
ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノラウリン
酸ソルビタン、モノバルミチン酸ソルビタン、モノステ
アリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、ラウ
リルジメチルアミンアキシト等を挙げることができる。

ステロイド骨格をもつ界面活性剤としては、コール酸ナ
トリウム、デオキンコール酸ナトリウム、ケノデオキシ
コール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウ
ロデオキシコール酸ナトリウム、ジギトニン等を挙げる
ことができる。

抽出した物質については、生物発光法や化学発光法を利
用して、その発光量を吸光光度法や蛍光光度法により測
定することができる。

Ｇ０発明の効果 本発明によれば、界面活性剤とクロロホルムとを組み合
わせて細胞膜を破壊し、細胞内の被測定物質を抽出する
ようにしているため、実施例からも明らかなように抽出
効率が高くて精度の高い測定を行うことができる。また
陰イオン性界面活性剤や非イオン性界面活性剤等種々の
ものを使用することができ、界面活性剤に制約がない。

しかも室温で抽出することができ、その操作も簡単なた
め、自動化が容易である。その上抽出時間が短いため作
業上有利である。

【図面の簡単な説明】

第１図はＡＴＰの検量線を示すグラフ、第２図、第５図
及び第６図は、各々菌体濃度とＡＴＰ濃度との関係を示
すグラフ、第３図はＳＤＳ濃度とＡＴＰ濃度との関係を
示すグラフ、第４図はＡＴＰ濃度と振盪時間との関係を
示すグラフ、第７図はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の
検量線を示すグラフ、第８図は４ＮＱＯと発光量との関
係を示すグラフである。 第１図 ＡＴＰの検量線のグラフ ＝８−７ Ａ　Ｔ　Ｐ　ｔＫ（ｍｏｌ／　ｌ） 第２図 菌体４文とＡＴＰａ変との関係図 菌体ｆｉ！ｆ（ｃｅｌｌｓ／１ｕｂｅ）第４図 ＡＴＰｎ文と種湯時間との関係図 圓 振ｌ最時間（Ｓ） 第５図 菌体ａｔとＡＴＰ濃度との関係図 菌体濃度（ｃｅｌｌｓ／＋ｕｂｅ） 第６図 菌体濃度とＡＴＰ＠度との関係図 １体１度（ｃｅｌｌｓ／＋Ｌｂｅ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）細胞と界面活性剤及びクロロホルムとを混合し、
   その混合液を振盪することにより細胞膜を破壊して細胞
   内の被測定物質を抽出し、次いでこの被測定物質を測定
   することを特徴とする細胞内の物質測定方法。