JPH02286096A - 菌体濃度推定方法 - Google Patents
菌体濃度推定方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
Ａ、産業上の利用分野
本発明は細菌内の物質を抽出して測定することにより菌
体濃度（菌体数）を推定する方法に関するものである。
体濃度（菌体数）を推定する方法に関するものである。
Ｂ１発明の概要 。
本発明はグラム陰性菌またはグラム陽性菌の細胞膜を界
面活性剤により破壊して細胞内の被測定物質を抽出し、
その後この物質を光学的手法により測定して菌体濃度を
推定する方法において、界面活性剤の他にクロロポルム
を添加することによって、 抽出効率を高めると共に、室温においてら十分な抽出が
できるようにしたものである。
面活性剤により破壊して細胞内の被測定物質を抽出し、
その後この物質を光学的手法により測定して菌体濃度を
推定する方法において、界面活性剤の他にクロロポルム
を添加することによって、 抽出効率を高めると共に、室温においてら十分な抽出が
できるようにしたものである。
Ｃ１従来の技術
グラム染色法と呼ばれる細菌の染色法は、細菌を大きく
２群に分類することのできる方法として古くから利用さ
れている。この方法は、熱固定した細菌をまず塩基性の
色素で染めた後、Ｉｔ Ｋ■混合溶液で処理し、次い
でアセトンまたはアルコールで脱色した後異なった色素
で後染色する方法であり、最初に染めた色素で染まるも
のをグラム陽性菌といい、後染色で染まるものをグラム
陰性菌という。グラム陰性菌は細胞膜が薄く、その外側
にリボ多糖を持つものが多いが、グラム陽性菌は細胞膜
が厚く、その外側にリボ多糖を欠くものが多い。
２群に分類することのできる方法として古くから利用さ
れている。この方法は、熱固定した細菌をまず塩基性の
色素で染めた後、Ｉｔ Ｋ■混合溶液で処理し、次い
でアセトンまたはアルコールで脱色した後異なった色素
で後染色する方法であり、最初に染めた色素で染まるも
のをグラム陽性菌といい、後染色で染まるものをグラム
陰性菌という。グラム陰性菌は細胞膜が薄く、その外側
にリボ多糖を持つものが多いが、グラム陽性菌は細胞膜
が厚く、その外側にリボ多糖を欠くものが多い。
このように分類される菌群について夫々その菌体濃度を
測定することにより有効な知見を得ろことができ、その
測定方法として、菌体内に存在する物質を測定すること
により菌体濃度を推定する方法がある。
測定することにより有効な知見を得ろことができ、その
測定方法として、菌体内に存在する物質を測定すること
により菌体濃度を推定する方法がある。
例えば生体細胞中には、生体のリン酸代謝及びエネルギ
ー代謝の役割を果たしているアデノシン三リン酸（ＡＴ
Ｐ）が必ず存在し、死細胞中にはＡＴＰが存在しないこ
とが知られている。また１個の細胞中に存在するＡＴＰ
量は、同一細胞では同一濃度のＡ ’ｌ’ Ｉ）が存在
する。従ってＡ ’ｒ Ｐが定量できれば、菌体の数か
測定できることになる。
ー代謝の役割を果たしているアデノシン三リン酸（ＡＴ
Ｐ）が必ず存在し、死細胞中にはＡＴＰが存在しないこ
とが知られている。また１個の細胞中に存在するＡＴＰ
量は、同一細胞では同一濃度のＡ ’ｌ’ Ｉ）が存在
する。従ってＡ ’ｒ Ｐが定量できれば、菌体の数か
測定できることになる。
このように細胞内に存在する物質を測定するためには、
多くの場合細胞に何らかの処理を施し、細胞膜を破壊し
、細胞外にその物質を放出させること、いわゆる抽出操
作を行う必要がある。
多くの場合細胞に何らかの処理を施し、細胞膜を破壊し
、細胞外にその物質を放出させること、いわゆる抽出操
作を行う必要がある。
一方最近において、可溶化することが困難な非常に疎水
性の強い蛋白質を比較的温和な条件で可溶化できる界面
活性剤の種類が増えてきた。
性の強い蛋白質を比較的温和な条件で可溶化できる界面
活性剤の種類が増えてきた。
界面活性剤はその電気的な性質に基づいて、陰イオン性
界面活性剤、陽イオン性界面活性剤９両性界面活性剤及
び非イオン性界面活性剤に分類される。また電気的な性
質とは無関係にコール酸。
界面活性剤、陽イオン性界面活性剤９両性界面活性剤及
び非イオン性界面活性剤に分類される。また電気的な性
質とは無関係にコール酸。
デオキシコール酸−どのようなステロイド骨格を持つ界
面活性剤も存在する。この中で膜蛋白質の可溶化には、
陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤及び胆汁
酸（コール酸、デオキシコール酸）がよく利用されてい
る。
面活性剤も存在する。この中で膜蛋白質の可溶化には、
陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤及び胆汁
酸（コール酸、デオキシコール酸）がよく利用されてい
る。
こうしたことから界面活性剤を用いて細胞内の物質を抽
出することが試みられている。
出することが試みられている。
Ｄ１発明が解決しようとする課題
ところが、界面活性剤は表面張力を著しく低下させる作
用を有し、細胞の膜破壊にも実際にいくつかの界面活性
剤が使用されているらのの、従来の界面活性剤を用いた
方法では、体細胞のような比較的Ｉｌ！破壊の容易な細
胞を対象とした場合には、良好な抽出を行うことかでき
るが、微生物細胞の場合には、膜破壊作用が弱く、抽出
効率が低下する欠点があった。さらに界面活性剤を用い
た抽出方法は、一般に時間がかかることも問題点となっ
ていた。
用を有し、細胞の膜破壊にも実際にいくつかの界面活性
剤が使用されているらのの、従来の界面活性剤を用いた
方法では、体細胞のような比較的Ｉｌ！破壊の容易な細
胞を対象とした場合には、良好な抽出を行うことかでき
るが、微生物細胞の場合には、膜破壊作用が弱く、抽出
効率が低下する欠点があった。さらに界面活性剤を用い
た抽出方法は、一般に時間がかかることも問題点となっ
ていた。
本発明の目的は、グラム陰性菌またはグラム陽性菌の菌
体敢を推定するにあたって細胞内の被測定物質の抽出効
率が高く、しかも操作が簡単で、短時間で分析を行うこ
とのできる方法を提供することにある。
体敢を推定するにあたって細胞内の被測定物質の抽出効
率が高く、しかも操作が簡単で、短時間で分析を行うこ
とのできる方法を提供することにある。
Ｅ、課題を解決するための手段
本発明は、グラム陰性菌群またはグラム陽性菌群と界面
活性剤及びクロロホルムとを混合し、その混合液を振盪
することにより菌の細胞膜を破壊して細胞内の被測定物
質を抽出し、次いでこの被測定物質を光学的手法により
測定し、その測定値と予め作成した検量線とにもとづい
て菌体濃度を推定することを特徴とする。
活性剤及びクロロホルムとを混合し、その混合液を振盪
することにより菌の細胞膜を破壊して細胞内の被測定物
質を抽出し、次いでこの被測定物質を光学的手法により
測定し、その測定値と予め作成した検量線とにもとづい
て菌体濃度を推定することを特徴とする。
Ｆ、実施例
（実施例！；陰イオン性界面活性剤の１つであるドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）によるＰｓｅ−ｎｄｏ＠ｏ
ｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ （グラム陰性菌の代
表種）中のＡＴＰの測定） 上記の菌群を含む懸濁菌液１１Ｑを試験管に分取してク
ロロホルム０．２村を加え、更に界面活性剤である１％
のドデシル硫酸すトリウム（ＳＤＳ）溶液を０ 、２
ｍＱ加える。なおＳＤＳの濃度単位の「％」については
、１％が０．０１９ＩＲＱの意味である。次いでこの試
験管をポルテックスミキサー等の振盪器を用いて２０秒
間撹拌振盪し、これにより細胞膜を破壊する。次にＡＴ
Ｐと他の細胞成分を分離するために遠心分離機により３
゜００ ｒｐｍの回転数で５分間遠心分離し、その後上
澄成分をピペットで静かに別の試験管に分取し、これを
０．１ｍｏＣ／１２ ）リス／Ｅ Ｄ Ｔ Ａ緩衝液
（ｐＨ７，７５）で１０倍に希釈する。そしてこの反応
液０ 、５ ｍＱをピペットで測定装置専用のバイヤル
ビンに分取し、発光試薬を含む反応試薬を０．５ｍＱ自
動的に分注して、分注直後から３０秒間の発光型を計測
する。
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）によるＰｓｅ−ｎｄｏ＠ｏ
ｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ （グラム陰性菌の代
表種）中のＡＴＰの測定） 上記の菌群を含む懸濁菌液１１Ｑを試験管に分取してク
ロロホルム０．２村を加え、更に界面活性剤である１％
のドデシル硫酸すトリウム（ＳＤＳ）溶液を０ 、２
ｍＱ加える。なおＳＤＳの濃度単位の「％」については
、１％が０．０１９ＩＲＱの意味である。次いでこの試
験管をポルテックスミキサー等の振盪器を用いて２０秒
間撹拌振盪し、これにより細胞膜を破壊する。次にＡＴ
Ｐと他の細胞成分を分離するために遠心分離機により３
゜００ ｒｐｍの回転数で５分間遠心分離し、その後上
澄成分をピペットで静かに別の試験管に分取し、これを
０．１ｍｏＣ／１２ ）リス／Ｅ Ｄ Ｔ Ａ緩衝液
（ｐＨ７，７５）で１０倍に希釈する。そしてこの反応
液０ 、５ ｍＱをピペットで測定装置専用のバイヤル
ビンに分取し、発光試薬を含む反応試薬を０．５ｍＱ自
動的に分注して、分注直後から３０秒間の発光型を計測
する。
以上において上記の発光法は、生物発光法と呼ばれ、以
下に示すようにＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼ
との反応により発生する光の儀にもとづいてＡＴＰの量
を知る方法であり、簡便で高感度な測定法である。なお
ホタルの光はこれに相当する。
下に示すようにＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼ
との反応により発生する光の儀にもとづいてＡＴＰの量
を知る方法であり、簡便で高感度な測定法である。なお
ホタルの光はこれに相当する。
ルシフエラーゼ
ＡＴＰ ＋ ルシフェリン
→ γｆニルルシ７五リす１ｆニルルンフ１リン＋
Ｏｔ ７７’
ニルオキジルシフ工リン＋光種々の菌体濃度において、
本実施例に従ってＡＴＰを抽出した結果を第１図に示す
。
→ γｆニルルシ７五リす１ｆニルルンフ１リン＋
Ｏｔ ７７’
ニルオキジルシフ工リン＋光種々の菌体濃度において、
本実施例に従ってＡＴＰを抽出した結果を第１図に示す
。
（実施例２；陰イオン性界面活性剤の１つであるドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）によるＢａｃ−ｉｌｌｕｓ
ｍｅｇａｔｅｒｉｕ＠（グラム陽性菌の代表＆）中の
ＡＴＰの測定） 上記の菌群を含む閑懸蜀液０ 、５ ｍＱを試験管に分
取して実施例１と同様の試験を行ったところ、第２図の
結果が得られた。
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）によるＢａｃ−ｉｌｌｕｓ
ｍｅｇａｔｅｒｉｕ＠（グラム陽性菌の代表＆）中の
ＡＴＰの測定） 上記の菌群を含む閑懸蜀液０ 、５ ｍＱを試験管に分
取して実施例１と同様の試験を行ったところ、第２図の
結果が得られた。
第１図及び第２図のグラフから、本実施例による測定に
よれば、ＡＴ Ｐｉ１１度と菌体濃度とは直線関係にあ
り、良好な抽出が行われていることがわかる。従ってこ
れらのグラフを検量線として用い、ＡＴＰｉｌｌＩ度を
測定することによって、菌体濃度を正確に推定できる。
よれば、ＡＴ Ｐｉ１１度と菌体濃度とは直線関係にあ
り、良好な抽出が行われていることがわかる。従ってこ
れらのグラフを検量線として用い、ＡＴＰｉｌｌＩ度を
測定することによって、菌体濃度を正確に推定できる。
抽出すべき物質としては、元から細胞内に存在する物質
及び外部からの刺激により生成する物質のいずれをも含
む。前者の元から細胞内に存在する物質とは、代謝物質
、蛋白質、核酸あるいは脂質等であり、このうち代謝物
質とは、アデノシン三リン酸等のヌクレオチド、ヌクレ
オシド、アミノ酸あるいはホルモン等である。後者の物
質とは、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素である。
及び外部からの刺激により生成する物質のいずれをも含
む。前者の元から細胞内に存在する物質とは、代謝物質
、蛋白質、核酸あるいは脂質等であり、このうち代謝物
質とは、アデノシン三リン酸等のヌクレオチド、ヌクレ
オシド、アミノ酸あるいはホルモン等である。後者の物
質とは、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素である。
界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン
性界面活性剤あるいはステロイド骨格をもつ界面活性剤
等を用いることができる。
性界面活性剤あるいはステロイド骨格をもつ界面活性剤
等を用いることができる。
陰イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウ
ム、テトラデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸
ナトリウム、テトラデシルスルホン酸ナトリウム、ドデ
シルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシル−Ｎ−サ
ルコシン酸ナトリウム等が挙げられる。
ム、テトラデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸
ナトリウム、テトラデシルスルホン酸ナトリウム、ドデ
シルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシル−Ｎ−サ
ルコシン酸ナトリウム等が挙げられる。
非イオン性界面活性剤としては、デシルエーテル、ドデ
シルエーテル、トリデシルエーテル、テトラデシルエー
テル、セチルエーテル、ステアリルエーテル、オレイル
エーテル、セチル−ステアリルエーテル、ｐ−ｔ−オク
チルフェニルエーテル、ｐ−オクチルフェニルエーテル
、ｐ−ノニルフェニルエーテル、モノラウリン酸ソルビ
タン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸
ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノラウリン
酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステ
アリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、ラウ
リルジメヂルアミンアキシド等を挙げることができる。
シルエーテル、トリデシルエーテル、テトラデシルエー
テル、セチルエーテル、ステアリルエーテル、オレイル
エーテル、セチル−ステアリルエーテル、ｐ−ｔ−オク
チルフェニルエーテル、ｐ−オクチルフェニルエーテル
、ｐ−ノニルフェニルエーテル、モノラウリン酸ソルビ
タン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸
ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノラウリン
酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステ
アリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、ラウ
リルジメヂルアミンアキシド等を挙げることができる。
ステロイド骨格をもつ界面活性剤としては、コール酸ナ
トリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシ
コール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウ
ロデオキシコール酸ナトリウム、ジギトニン等を挙げる
ことができる。
トリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシ
コール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウ
ロデオキシコール酸ナトリウム、ジギトニン等を挙げる
ことができる。
抽出した物質については、生物発光法や化学発光法を利
用して、その発光量を吸光光度法や蛍光光度法により測
定することができる。
用して、その発光量を吸光光度法や蛍光光度法により測
定することができる。
Ｇ１発明の効果
本発明によれば、界面活性剤とクロロホルムとを組み合
わせて菌体の細胞膜を破壊し、細胞内の被測定物質を抽
出するようにしているため、実施例からも明らかなよう
に抽出効率が高くて精度の高い測定を行うことができ、
従ってグラム陰性菌群あるいはグラム陽性菌群の菌体濃
度を正確に推定できる。また陰イオン性界面活性剤や非
イオン性界面活性剤等種々のものを使用することができ
、界面活性剤に制約がない。しかも室温で抽出すること
ができ、その操作も簡単なため、自動化が容易である。
わせて菌体の細胞膜を破壊し、細胞内の被測定物質を抽
出するようにしているため、実施例からも明らかなよう
に抽出効率が高くて精度の高い測定を行うことができ、
従ってグラム陰性菌群あるいはグラム陽性菌群の菌体濃
度を正確に推定できる。また陰イオン性界面活性剤や非
イオン性界面活性剤等種々のものを使用することができ
、界面活性剤に制約がない。しかも室温で抽出すること
ができ、その操作も簡単なため、自動化が容易である。
その上抽出時間が短いため作業上有利である。
第１図及び第２図は、各々菌体濃度とＡＴＰ濃度との関
係を示すグラフである。 外２名 手続補上書（１） ６．補正の内容 平成−１年９月８ 日 明細書第１ ３頁第１行および第２行を「光
係を示すグラフである。 外２名 手続補上書（１） ６．補正の内容 平成−１年９月８ 日 明細書第１ ３頁第１行および第２行を「光
Claims (2)
- （１）グラム陰性菌群と界面活性剤及びクロロホルムと
を混合し、その混合液を振盪することによりグラム陰性
菌の細胞膜を破壊して細胞内の被測定物質を抽出し、次
いでこの被測定物質を光学的手法により測定し、その測
定値と予め作成した検量線とにもとづいてグラム陰性菌
の菌体濃度を推定することを特徴とする菌体濃度推定方
法。 - （２）グラム陽性菌群と界面活性剤及びクロロホルムと
を混合し、その混合液を振盪することによりグラム陽性
菌の細胞膜を破壊して細胞内の被測定物質を抽出し、次
いでこの被測定物質を光学的手法により測定し、その測
定値と予め作成した検量線とにもとづいてグラム陽性菌
の菌体濃度を推定することを特徴とする菌体濃度推定方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10948389A JPH02286096A (ja) | 1989-04-28 | 1989-04-28 | 菌体濃度推定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10948389A JPH02286096A (ja) | 1989-04-28 | 1989-04-28 | 菌体濃度推定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02286096A true JPH02286096A (ja) | 1990-11-26 |
Family
ID=14511386
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10948389A Pending JPH02286096A (ja) | 1989-04-28 | 1989-04-28 | 菌体濃度推定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02286096A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007502967A (ja) * | 2003-08-20 | 2007-02-15 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | 疎水性液体マトリクス中に拡散または分散した親水性化合物の抽出および濃縮の方法 |
| JP2009112199A (ja) * | 2007-11-02 | 2009-05-28 | Toyobo Co Ltd | 多色ルシフェラーゼの検出方法 |
| WO2014061785A1 (ja) * | 2012-10-19 | 2014-04-24 | 株式会社日立製作所 | 生体物質回収方法及び生体物質回収装置 |
-
1989
- 1989-04-28 JP JP10948389A patent/JPH02286096A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007502967A (ja) * | 2003-08-20 | 2007-02-15 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | 疎水性液体マトリクス中に拡散または分散した親水性化合物の抽出および濃縮の方法 |
| JP2009112199A (ja) * | 2007-11-02 | 2009-05-28 | Toyobo Co Ltd | 多色ルシフェラーゼの検出方法 |
| WO2014061785A1 (ja) * | 2012-10-19 | 2014-04-24 | 株式会社日立製作所 | 生体物質回収方法及び生体物質回収装置 |
| JP2014082946A (ja) * | 2012-10-19 | 2014-05-12 | Hitachi Ltd | 生体物質回収方法及び生体物質回収装置 |
| US9988663B2 (en) | 2012-10-19 | 2018-06-05 | Hitachi, Ltd. | Method for collecting biological material and device for collecting biological material |
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