JPH0262943A - 細胞内の物質測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ、産業上の利用分野 本発明は、体細胞や菌体内に存在する物質を測定する方
法に関するものである。

Ｂ２発明の概要 本発明は、細胞膜を破壊して細胞内の被測定物質を抽出
し、その後この物質を例えば光学的手法超音波を照射し
、細胞膜を破壊することによりて、 測定に要するる時間が短く、かつ簡単な操作で済むよう
にしたちのである。

Ｃ１従来の技術 細胞内や菌体内に存在する物質を定性的あるいは定型的
に測定することにより何効な知見を得ることができる。

例えば生体細胞中には、生体のリン酸代謝及びエネルギ
ー代謝の役割を果たしているアデノンン三リン酸（ＡＴ
Ｐ）が必ず存在し、死細胞中にはＡＴＰが存在しないこ
とが知られている。また１個の細胞中に存在するＡＴＰ
ｆｆｉは、同一細胞では同一濃度のＡＴＰが存在する。

従ってＡ　Ｔ　Ｐが定量できれば、細胞の数及び生細胞
が死細胞かの判定や細胞の活性度が測定できることにな
る。

また水道原水中や大気浮遊粉塵中には、種々の発癌関連
物質が含まれており、これらのモニタリングや検出法に
Ａ　ｍｅｓ法またはその変法を用いた復帰突然変異試験
が広く使用されている。これらの短期間テストは方法が
簡便で、定量性も比較的高い。最近になって、化学物質
のＤＮＡ傷害を短時間に検出する有効な短期テストがい
くつか提出されている。これらの短期テストは、特定の
菌と化学物質を反応させた時に、菌体内で化学物質がＤ
ＮＡ傷害を誘起し、それに伴って生ずるＳＯ８反応をβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性から求められる方法である
。従って菌体内に発生したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活
性を測定することができれば、化学物質が発癌関連物質
であるか否かの判定ができることになる。

このように細胞内に存在する物質または生成した物質を
測定するためには、多くの場合細胞に何らかの処理を施
し、細胞膜を破壊し、細胞外にその物質を放出させるこ
と、いわゆる抽出操作を行う必要がある。そこで細胞膜
を破壊する方法として、界面活性剤、有機酸、無機酸あ
るいは有機溶媒等の抽出剤を用いる方法を検討している
。例えば有機溶剤を用いる方法を簡単に説明すると、先
ず試料１ｍ（２に有機溶剤であるエタノール（９９゜５
％）５ｘＱを混合し、この混合液を沸騰（７８℃）させ
ながら１分間振盪して目的物質を抽出する。

次いで有機溶剤を除去するために１０分間送風乾燥処理
を行い、５ｚＣの蒸留水に溶解して抽出液を希釈し、試
料中の目的物質を測定する。

Ｄ１発明が解決しようとする課題 しかしながら抽出剤を用いる方法は、試薬処理を伴うた
め次のような問題点がある。

■これらの試薬が最終検出系に影響を及ぼし、検出感度
を低下させるために、その阻害を避ける方法として、処
理工程の中に中和、抽出、遠心分離、希釈などの操作が
必要であり、分析に時間がかかる。

■使用する試薬濃度により膜破壊効率が大きく左右され
るので、試薬の調整作業が必要となり、労力と時間がか
かる。

■分析工程に中和、抽出、遠心分離、希釈などのうちい
くつかの操作が必要であるため、その−連の操作を自動
化する場合に複雑な機構が必要となる。

本発明の目的は、処理工程が簡単であり、分析に要する
時間が短く、しかも目的物質についての分析精度の高い
測定方法を提供することにある。

Ｅ１課題を解決するための手段 超音波は従来から高分子の化学結合の切断などいろいろ
な応用面があることが知られている。ここに細胞などの
膜は主に蛋白質や脂質から構成されているので、高分子
の高次構造から成る膜の破壊にも適用できると考えた。

具体的には本発明は、細胞を含む溶液に超音波を照射す
ることにより細胞膜を破壊して細胞内の被測定物質を抽
出し、次いでこの被測定物質を測定することを特徴とす
る。

Ｆ、実施例 （実施例１） 凍結保存された大腸菌を含む試料液を解凍し、試料液０
　、６　ｍＱを試験管にピペット等の手動式分注器を用
いて分取する。次いでこの試験管に０゜１ｉ＋！＃！の
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を５’　、　７　ｍＱ添加
した後３０Ｗの超音波を１〜２分間照射し、これにより
大腸菌の細胞膜を破壊してＡＴＰを抽出する。続いてこ
の溶液０　、５　ｍＱをピペットで測定装置専用のバイ
ヤルビンに分取し、発光試薬を含む反応試薬を０　、５
　ｍＱ自動的に分注して、分注直後から３０秒間の発光
量を計測する。

以上において上記の発光法は、生物発光法と呼ばれ、以
下に示すようにＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼ
との反応により発生する光の量にもとずいてＡＴＰの量
を知る方法であり、簡便で高感度な測定法である。なお
ホタルの光はこれに相当する。

アデニルルシフェリン＋Ｏ＊　　　　　　　　　　　　
＞　　　７デニルオＮシルシフエリン＋先このようにし
て種々の大腸菌濃度におけるＡＴＰｆｆｉを測定し、そ
れらの関係を表す検量線を第１図に示す。大腸菌濃度が
未知な試料液については、ＡＴＰｆｆｌを測定し、その
値と検量線とにもとすいて大腸菌濃度を知ることができ
る。

（実施例２） サルモネラ菌をＬＢ倍倍地各種の栄養分を備えた信地）
で−夜培養し、その培養液を波長６００ｎｍにおける吸
光度０．１になるようにＬＢ倍倍地希釈調製する。こう
して得られた試験液３．０．ｖρにＤＮＡ損傷を引き起
こす化学物質（４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシド（４
ＮＯＱ））０．０５１を加え、３７℃で２時間培養する
。これにより大腸菌中にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼが生
成する。

次いで培養した試験液０゜６ｍＱにＯ、ｌ　ｍＱ／Ｑの
リン酸緩衝液（ｐＨ７、０）を５．７１添加した後３０
Ｗの超音波を１〜２分間照射する。しかる後にこの反応
液０．２５ｚ１２に０．１ｍＱ／ＱのＮａ−ＰＢＳ（リ
ン酸緩衝液）　２．２５ｍｆ２．０　、　ｌ肩Ｑ／Ｑの
Ｎ　ａ　Ｎ３０．５ｍＱ、０．２５ｉｏｆ２／１２のラ
クトースｌ。

ＯｍＱ及び６Ｕ／ｘＱ（Ｕとは酵素活性を表す単位であ
る。）のグルコースオキシダーゼｌＩＮ、Ｑを加え、３
７℃で２時間酵素反応させた。なおＮａ−ＰＢＳ２．２
５ｍＱを加えた理由は、ラクトースとクシレコースオキ
ンダーゼと反応液との比率を一定にするためである。そ
の後この酵素反応液０　、２　ｍ（１を化学発光測定装
置（明電舎製ルミノメータＵＰＤ−８０００）専用バイ
ヤルビンに分取し、これに２　Ｘ　Ｉ　Ｏ−７ｎｏ（１
／Ｑのルミノール０　、５　ｍ（ｌと６×１０−３ｎｏ
　（１／Ｑのフェリシアン化カリウム０５１を加え、１
秒後から３０秒間の発光量を計測した。

ここで上記のプロセス中の酵素反応と化学発光反応とは
次の通りである。

〈酵素反応〉 β−Ｄ−カラクトゾダーゼ ラクトース十ＨｚＯ＞　　ａ−Ｄ−グルコ−人−十β−
Ｄ−力ンクトースａ−Ｄ−グルコース　〈□〉　　β−
Ｄ−グルコースグルコづオキシダーゼ β−Ｄ−グルコー人十〇ｔ＋ＨｔＯ−＞　　Ｄ−ゲルコ
ント１１２０２く化学発光反応〉 ７エリゾアン化カリウム Ｎ２０．＋ルミノール　□〉　アミノフタル１Ｎ２＋Ｎ
２０＋老第２図は既知量のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活
性と発光量との関係を示す検量線であり、この検量線を
利用して４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシトの定量を行
った結果を第３図に示す。なおβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ活性濃度と４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシド濃度は
比例関係にあり、その定数は酵素反応の種類及び反応時
間等により定まる。

（実施例３） 超音波を照射する工程までは実施例２と全く同槌の操作
を行い、その後は反応液２　、１７１（ｌに０ニトロフ
ェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＣ）０．
２ｍＮを加え、３７℃で１０分間培養する。培養後反応
停止液として１λ０ρ／ＱのＮａ。

ＣＯ３をｌπｇ加え、４２０ｎｍにおいて吸光度を計測
する。測定結果は第４図に示す通りであり、この図に示
す検量線と吸光度とを調べることにより４ＮＱＯの量が
求まる。

（実施例４） サルモネラ閑をＬ　Ｂ借地（各種の栄養分を備えた信地
）で−夜培養し、その培養液を波長６００ｎｍにおける
吸光度が０．１になるようにＬＢ倍倍地希釈調製する。

こうして得られた試験液３゜０ｔｔｔＱにＤＮＡ損傷を
引き起こす化学物質（４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシ
ド（４ＮＱＯ））００５１１（！を加え、３７℃で２時
間培養する。これにより菌中にβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼが生成する。

次いで培養した試験液０．６１をバイヤルビンに分取し
、これに０．Ｉｍｏ（１／Ｑのリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）を１．９ｍｇ添加する。このようにして得られる試
料液の入ったバイヤルビンを１２個用意し、そのうち６
個についてはＩＯＷの超音波を照射すると共に残りの６
個については３０Ｗの超音波を照射し、分ｔＪられた６
個についての照射時間を０゜１．２，３．５．１０分間
とした。次いで各バイヤルビンに０ＮＰＣ０，２ｄを加
え、３７℃で２０分間培養する。その後反応停止液とし
てｌｌ／１２のＮ　ａ　２　ＣＯ３を１ｍ（ｉ加え、４
２０ｎｍにおいて吸光度を計測する。測定結果は第５図
に示す通りである。図中黒丸は超音波の出力が３０Ｗの
場合であり、白丸はＩＯＷの場合である。この図かられ
かるように超音波の出力が３０Ｗであってかつその照射
時間が１〜２分間のときに吸光度が最も大きい。

以上において、本発明の対象となる細胞は、微生物ある
いは体細胞のいずれであってもよく、微生物としては大
腸菌やサルモネラ菌等の細菌、糸状菌、酵母、変形菌、
単細胞の藻類あるいは原生動物等が挙げられる。

抽出すべき物質としては、元から細胞内に存在する物質
及び外部からの刺激により生成する物質のいずれをも含
む。前者の元から細胞内に存在する物質とは、代謝物質
、蛋白質、核酸あるいは脂質等であり、このうち代謝物
質とは、アデノシン三リン酸等のヌクレオチド、ヌクレ
オシド、アミノ酸あるいはホルモン等である。後者の物
質とは、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素である。

目的とする物質を定性あるいは定量するためには、吸光
光度法、蛍光光度法、生物発光法または化学発光法等を
利用することができる。

Ｉ−Ｉ　、発明の効果 本発明によれば、超音波の照射により細胞膜を破壊して
細胞内の物質を抽出しているため、処理工程が簡単であ
り、従って自動化が容易であると共に複雑な処理機構を
必要としない。また試薬の調製や取り扱い等に要する時
間が短縮でき、しかも高い精度で目的とする物質を測定
することかできる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＡＴＰ濃度と菌体濃度との関係を示すグラフ、
第２図は発光量とβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性との関
係を示すグラフ、第３図は発光量と４ＮＱＯｉｔとの関
係を示すグラフ、第４図は吸光度と４ＮＱＯとの関係を
示すグラフ、第５図は吸光度と超音波照射時間との関係
を示すグラフである。 第１図 ＡＴＰａ度と菌体濃度との関係図 菌体濃度（ｃｅｌｌｓ／ｌｕｂｅ） 発光量と４　Ｎ　Ｑ　Ｏ備との関係図 ４　Ｎ　Ｑ　ｏ　ｍ　（ｒ＋ｇ／　ｔｕｂｅ）第４図 吸光量と４ＮＱＯ量との関係図 ４ＮＱＯ量（ｎｇ／ｃｅｌｌ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）細胞を含む溶液に超音波を照射することにより細
   胞膜を破壊して細胞内の被測定物質を抽出し、次いでこ
   の被測定物質を測定することを特徴とする細胞内の物質
   測定方法。