JPH02671B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、水性媒質中では加水分解し易く有機
媒質中では安定な不安定性有機試薬を安定化する
ための新規且つ有用な方法に関するものである。
有機試薬は生物体から取つたものも、あるいは合
成したものも含まれる。

米国で１年間に行われる試験管による診断試験
の全体の25％は信頼できないと言われている。信
頼性のない試験は不要の医療の原因ともなり、ま
た必要な医療を差控えさせて所得の損失を招く。
特異性が高いため、酵素定量の使用はここ２〜３
年大幅に増えており、この傾向は今後も続きそう
である。しかし、成果に正確さと一貫性を持たせ
るためには、厳しい品質管理対策が必要である。
この必要性は、酵素の正確な性質並びにその作用
のメカニズムが大部分未知のまゝである。という
事実に基づいている。

現在では、試験管内診断試験の信頼性のなさの
最も重要な理由は、使用する有機試薬の水溶液が
不安定であることである。現行の方法論では、
種々な不安定性試薬を使用する必要があり、この
ため、試験管内診断キツトの製造の際厳重な品質
管理が必要である。当然、この品質管理のコスト
は高いものになる。更に、当該方法のいかなる段
階においても管理を高精度の管理基準内に維持し
ておかないと、最終製品の品質は大幅に低下する
可能性がある。

有機試薬の反応能力を安定化するのに使用され
ている現在の技術水準の商業ベースに乗つた方法
としては、(a)凍結乾燥、(b)製薬業界で乾燥粉末の
錠剤化に使用しているような乾式混合によつて試
薬を固着して固形マトリクスにするか、あるいは
(c)試薬の化学的不動化によつて固形化する方法が
ある。これらは言葉上では洗練された内容を意味
しているのに対し、その為のアプローチは実用的
でなく高価である。即ち、製造業者は水分を取除
く作業をしなければならないと同時に不完全な製
品の供給を余儀なくされており、従つて品質管理
サイクルの一部を使用者に委譲しており、使用者
側で最終製品の希釈を行わなければならない。研
究所側は凍結乾燥及び乾式混合の高コストの負担
を余儀なくされており、十分訓練されていない研
究所員による希釈技術の拙劣さのため、多量の試
薬が浪費されている。その上、包装上の様式及び
サイズも限られたものしか利用できない。

このようなわけで、液状媒質内で不安定性、加
水分解性のある有機試薬を安定化し、該試薬を単
一容器に容れて長期間保存でき、該容器を繰返し
開けて使用しても中の有機試薬が大幅に劣化しな
いような方法に対する要望が生れて来た。不安定
性有機試薬を液状媒質内で安定化する方法は、比
較的コストの安い、一般市場で入手可能な安定化
成分で実施できるものでなければならず、またそ
の他の不安定性試薬の存在下においても試薬を効
果的に安定化できるものでなければならない。

発明の要約 本出願人は上記の諸特徴を有する方法を発明し
た。本発明の方法を使用すると、水性媒質中で不
安定で非水性媒質内で安定な不安定性試薬を安定
化することができる。この方法では、このような
有機試薬の最低１つを、当該有機試薬と非劣化式
に反応し且つ室温で、望ましくは冷凍温度で液状
である水混和性有機溶剤に溶解する。即ち、この
ようにして、有機溶剤に有機試薬を加えた溶液を
生成するわけである。最低１重量％の不活性で、
表面領域の大きい粒状乾燥剤を上記溶液に添加し
て水分を吸収させ、溶液の残留含水量を約0.5重
量％以下、望ましくは約0.1重量％以下にする。

乾燥剤を溶剤に添加するのは、試薬を溶剤に溶
解する前でも後でもよい。溶液はその中に乾燥剤
を入れた状態で包装することができ、あるいは乾
燥剤は包装に先立つて溶液から取除くこともでき
る。望ましくは、乾燥剤を溶液中に残留させ、溶
液を容れた容器を、実用の際、繰返し開閉する場
合有機試薬の加水分解を回避するようにするのが
よい。

溶剤には１つ以上の有機試薬を加えることがで
き、また、所望の際は、試薬用可溶化剤を使用す
ることができる。例えば、ガンマ−グルタミルパ
ラニトロアニリド（GGP）、即ち極性有機試薬
を、無水ジメチルスルホキシドで、または無水ジ
メチルスルホキシド（70％Ｖ／Ｖ）と無水アセト
ン（30％Ｖ／Ｖ）の望ましい溶剤混合液で安定化
する。望ましくは試薬を溶剤混合液に添加する前
に、固形硼酸を添加して溶剤混合液内の試薬の溶
解度を増し、最後に分子ふるい〔ユニオンカーバ
イド社のリンデ事業部製マツシユ4A（Mash4A）〕
を該溶液に加え不活性乾燥剤の働きをさせる。次
に、この溶液を使用して、人間の血清または血漿
のような生物体に於ける流動体の生理学的に重要
な酵素であるガンマ−グルタミルトランスペプチ
ダーゼの診断定量を行う。当該試薬の冷凍温度
（２乃至８℃）における有効安定化期間は、水溶
液内における同一保存条件下での該試薬の最長安
定化期間が数日間にすぎないのに対して、数年間
と長い。

本発明では、加水分解性不安定試薬を、試薬の
加水分解と分解を防止することにより有機溶剤溶
液内で効果的に「安定化」した。この安定化法に
よつて液状媒質内で長期安定化が得られた。更
に、製造に際し精密許容差管理を達成できる。結
果として作り出される製品が高品質であるため、
従来製品に特有な剛性容器サイズの不便さ、並び
に包装、凍結乾燥、及び試薬浪費による高コスト
の問題が解決された。

本発明の以上の並びにその他の特徴、諸局面、
及び利点は、以下の本発明の詳細な説明並びに付
属の特許請求の範囲を参照すれば更によく理解で
きるであろう。

詳細な説明 水性媒質内で不安定で非水性媒質内で安定な有
機試薬の長期間に亘る安定を得るには、これらを
水混和性有機溶剤に溶解し、且つ該溶剤に表面領
域の大きい不活性粒状乾燥剤を添加して、溶液の
残留含水量を約0.5重量％以下、望ましくは0.1重
量％以下にまで減少させるとよい。この方法で長
期安定が得られるのは、有機試薬を劣化させる主
な要因が取除かれるためである。

生物学的定量に使用される有機試薬には、不安
定で水溶液中で急速に劣化するものが多い。この
劣化の主な原因は次の３つの要因である。即ち、
(1)加水分解、(2)微生物作用、及び(3)分解である。
水分を取り去ると、これらの要因によつて生ずる
劣化は大幅に減少するか、あるいは完全に無くな
る。

既述のように、現在、臨床診断用製品では媒質
調製品の脱水は、凍結乾燥と言われる方法で行わ
れている。凍結乾燥は、問題の製品を水性媒質内
で調製し、真空下で該媒質の水を凍結・蒸発さ
せ、次に容器を密閉することによつて達成され
る。別の従来技術では、乾燥成分を直接使用し、
不活性成分を添加し、この混合物を乾式混合す
る。使用の際は、乾燥材は、凍結乾燥であれ乾式
混合であれ、水に溶解し而も数日以内に使用しな
いと効果が無くなる。

対照的に、本発明では、不安定な有機試薬は、
水性劣化を無くしたため有機溶剤内での保存が可
能である。

この方法は、広範囲の有機試薬の安定化に有用
である。

この方法を使用できる有機試薬には次のものが
含まれる。即ち、コレステロール、マグネシウム
チモールフタレインモノフオスフエート、ジチオ
エリトリトール、ジチオトレイトール、Ｎ−アセ
チルシスチン、グルタチオン、メルカプトエタノ
ール、ｏ−クレゾールフタレイン錯体、Ｎ−アセ
チルシステイン、及びアデノシントリフオスフエ
ートである。有機試薬の混合剤をも使用すること
ができる。

臨床診断分野に於て、本発明は例えば次のよう
に商業的に適用される。即ち、酵素活量、例えば
生物流動体等におけるガンマ−グルタミルトラン
スペプチダーゼ（ガンマ−GT）活量の測定に使
用される診断試薬の形態で実施される。しかしこ
れは代表例であつてこれに限定されるものではな
い。本発明に基づいて調製された組成物はその他
の酵素の活量を測定並びに定量するには使用する
ことができる。つまり、該組成物は定量の基準材
料として使用することができる。使用例の幾つか
を以下に列挙する。

１ 酵素ガンマ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ（ガンマ−GT）活性の定量用基質として使
用するためのガンマ−グルタミル−ｐ−ニトロ
アニリド（ガンマ−GPNA）の安定化。

２ アルカリ性フオスフアターゼ（ALP）及び
酸性フオスフアターゼ（ACP）の活性の定量
基質として使用するためのパラニトロフエニー
ルフオスフエート（PNP）の安定化。

３ アルカリ性フオスフアターゼ活量を定量する
ためのフエノールフタレインモノフオスフエー
ト（PMP）の安定化。

４ ALP定量用グリセロールフオスフエートの
安定化。

５ 上記１及び２の定量を標準化するためのｐ−
ニトロアニリド及びｐ−ニトロフエノールの安
定化。

６ 生物流動体のアスコルビン酸の定量の際基準
材料として使用するためのアスコルビン酸の安
定化。

７ 生物流動体のカリウムの定量に使用されるテ
トラフエノールボロンの安定化。

８ 還元溶液として使用するためのアスコルビン
酸の安定化。

９ 生物流動体のビリルビン定量用基準容液とし
て使用するためのビリルビン（胆じゆう酸の一
種）の安定化。

10 酵素フオスフオキナーゼ用基質として使用す
るためのフオスフオエノールピルヴエートの安
定化。

一般に、有機試薬は、概ね無水ではあるが水混
和性の有機溶剤に溶解して、高濃縮均質溶液を生
成する。溶剤は溶質に対するそのソルボリテイツ
クな特性に基づいて選択する。例えば、アスコル
ビン酸のような極性化合物は、ジメチルスルホキ
シドのような極性水混和性有機溶剤に溶解する。
これに対し、エタノールは、比較的非極性で幾つ
かの水酸基を含有するグリセロールフオスフエー
トの保存用として使用する。有機試薬を溶解する
には、例えばアルコール、特に２乃至４個の水酸
基と２乃至10個の炭素原子を有する液状ポリオー
ルのような中性またはアルカリ性PHの比較的不活
性な有機溶剤が望ましい。具体例として、グリセ
ロール、エチレングリコール、プロピレングリコ
ール、またはブタンジオールがある。有機溶剤の
PHは、溶剤を水に混ぜ、該混合物のPHを測定して
決める。

どの不安定化合物であつてもその安定「液体」
溶液を調製する場合は、好適有機溶剤が一大関心
事である。本明細書中で使用する場合には、用語
「溶剤」は１つの溶剤、あるいは２つまたは３つ
以上の溶剤から成る１つの混合物のことを指す。
適正な有機溶剤または溶剤混合物には少なくとも
下記の特性が必要である。

１ 問題の試薬を溶解すること。

２ 該試薬と非劣化式に反応すること。（ソルボ
リシスの自由エネルギーが低い、即ち、通常の
共鳴が達成される。） ３ 少なくとも室温で、また望ましくは冷凍室温
度で液体であること。

４ 該試薬の使用目的に干渉しないか、あるいは
無視し得る程度にしか干渉しないこと。

本明細書中で使用する場合には、用語「非劣化
式に反応する」は、溶剤、あるいは乾燥剤、ある
いは可溶化剤が、有機試薬の効力を損なうような
状態では該試薬と反応したり、あるいはこれに影
響を及ぼさないということを意味する。

次の重大関心事は好適乾燥剤である。適正な乾
燥剤とは、少なくとも下記の特性を備えたものの
ことである。

１ 溶剤混合物から脱水を行うこと。

２ 使用する１つまたは２つ以上の試薬と非劣化
式に反応すること。

３ 容器の開閉を繰返すなどの方法で水が導入さ
れる際溶液からの脱水を続けること。

４ 試薬の使用目的に干渉しないこと。

乾燥剤は含水量を所望の低率、即ち0.5％以下、
望ましくは0.1％以下に維持する。乾燥剤は、有
機試薬に対し殆んど反応しない有効吸水体でなけ
ればならない。乾燥剤は、粒子サイズが２乃至16
メツシユである天然または合成の分子ふるいのよ
うな表面領域の大きい吸湿剤であるのが望まし
く、これが少なくとも１％Ｖ／Ｖ、典型的には５
〜20％Ｖ／Ｖ存在するのが望ましい。吸湿剤は水
をその孔内に吸収するように働くから、表面領域
量は重要な要素である。

分子ふるいはゼオライトまたは類似の物質であ
つて、その原子は、多数の小空洞部と完全均一サ
イズのより小さい開口部即ち孔とが相互連結する
状態で結晶格子の形に配列されている。通常、こ
の空洞部には水の分子が含まれているが、真空下
で加熱すると、この水は脱水され、而も残留結晶
格子には何の変化も生じない。空洞部と孔の網目
は結晶体の全容積の50％を占める。分子ふるいに
は水その他の小分子量液体を再吸収しようとする
強い性向がある。

天然のゼオライトには一定限度の分子ふるい特
性しか示さないものも幾つかある。合成ゼオライ
トは数種類のサイズ（直径が３、４、５及び10オ
ングストローム単位）のものがあり、これらはた
とえ高温使用時でも吸収及び再生に関する容量が
大きい。

本発明の方法では、組成物を有機溶剤並びに不
活性粒状乾燥剤の存在下で安定化した後、乾燥剤
を取除いても他の方法の場合のように組成物の安
定に大きな影響を及ぼすことがないことが判明し
た。一般に、組成物は乾燥剤の存在下の室温では
約24時間に亘つて保存するのがよいことが判つ
た。この時間内では、どんな微量の水も乾燥剤で
吸収されてしまい、従つて乾燥剤を除去した際、
組成物には水が存在している可能性は殆んどな
い。組成物はまたある限られた基礎上に開放する
こともできる。つまり、たとえ容器の上端に空気
中の水分が入つたとしても、その水分の量は比較
的少量であるから、組成物内の不安定成分を大幅
に分解することはない。

一般に、乾燥剤は安定化溶液とある期間接触さ
せておくのがよい。この期間は調製時溶液内に始
めにあつた水量によつて決まる。大抵の場合、乾
燥剤は約３日乃至４日間溶液と接触させておくの
がよいことが知られている。この時間は、組成物
を少なくとも不安定成分の分解が生じない点まで
加熱すると短縮することができる。このようなわ
けで、組成物は約60℃の温度までなら加熱しても
不安定成分に影響を及ぼさないで済むことが判つ
た。重要なことは、乾燥剤は水がわずか約0.5％
Ｖ／Ｖになるまで溶液中に残して置くのがよいと
いうことである。

既述の1976年３月17日付米国特許出願第667857
号では、安定化を維持するには乾燥剤を有機溶剤
と共に組成物内に滞留させる必要があるとされて
いる。これに対し、この例は本発明の望ましい実
施例ではあるが、結果として、安定化の第１段階
達成後は乾燥剤を取除いても組成物の安定化は大
幅に低下することはないことが判明した。

安定化溶液から乾燥剤を取除く利点は溶液の調
剤精度が向上することである。なぜなら、取除か
なかつた場合乾燥剤は溶剤自体をある程度吸収す
るか、あるいは少なくとも溶剤の一部を乾燥剤の
表面上に表面張力によつて付着させるであろうか
らである。乾燥剤を除去することによつて、溶液
の量子化が決定的且つ重要な要因である場合、溶
液量を正確に調剤することができる。

例えば、ある種の溶剤（例えばプロピレングリ
コール）の膨張係数は温度依存形であることが観
測される。この場合容器内に調剤注入できる溶液
量は製造現場では極めて注意深く調整できるが、
実際の使用現場での調整は容易ではない。

３つ目の重大関心事は使用する可溶化剤で、こ
れは問題の試薬の溶解度を所望のレベルまで高め
る必要のある場合に考慮の対象となる。可溶化剤
の最低必要条件は次の通りである。

１ 問題の試薬の溶解度を高める（普通、有機溶
剤と溶媒和複合体（solvated complex）を生
成して行う、つまりこの複合体となると試薬に
対しより優れた溶剤となる）こと。

２ 試薬と反応しないか、あるいは非劣化式に反
応すること。

３ 有機試薬の使用目的に干渉しないか、あるい
は無視できる程度にしか干渉しないこと。

多数の有機試薬に適した可溶化剤の例として
は、硼酸、イミダソール、サリチル酸塩、アスコ
ルビン酸、及びこれらの組合せが挙げられる。

溶剤、試薬、可溶化剤の添加順序は、一般的に
は重要ではないが、実用上は、始めに可溶化剤を
溶剤に添加・溶解し、次に水性不安性有機試薬を
添加するのが好ましい。次に、試薬を必要に応じ
て撹拌か加熱のいずれか一方または双方によつて
溶解する。但し、普通は、溶剤混合物の温度が50
℃、またはどんなに低くとも溶液の沸点を越えな
いようにして行わなければならない。この後で、
溶液を濾過してくずや非溶解物を除去し、この濾
過済み溶液に乾燥剤を加え、キヤツプ密閉式防水
容器に収納して保存する。

使用の際は、この溶液を１つまたは２つ以上の
その他の反応成分を含む水性緩衝剤と混合し、そ
の結果生成された溶液を、乾式混合されたまたは
再構成式凍結乾燥された調製品を使用する場合と
同じ方法で使用する。この方法を使用すると、不
安定試薬を水性反応混合物から凍結乾燥させ、次
いで使用直前に該試薬を再構成するのに要する高
い費用をかけないで済む。これによつて、本方法
では包装及び実施に自在性があり、同時に水をベ
ースにした反応混合物を安定化された不安定性溶
液と共に生成することによつて製品の品質が保証
されるから、問題の臨床診断定量用製品の成分は
総て良質なものとなる。

不安定性有機試薬の安定化の例としては、ガン
マ−グルタミル−ｐ−ニトロアナリド（ガンマ−
GPNA）がある。これは、ガンマ−GPNAを
Ｖ／Ｖに基づいて水分を0.5％しか含有しない有
機溶剤、例えばジメチルスルホキシドに溶解して
得られる。この後、固状乾燥剤を添加して水分を
完全に取除く（0.01％Ｖ／Ｖ以下）。必要とあれ
ば、可溶化剤、例えば硼酸、イミダソール、サリ
チル酸塩、その他のものも使用することができ
る。可溶化剤は、可溶化剤のみならず安定化剤の
機能をも果す。望ましくは、まず可溶化剤を溶剤
に添加し、その後で有機試薬を溶剤に添加するの
がよい。次いで、該溶液を濾過し、乾燥剤と共に
不活性容器に収納し、これを密閉して保存する。

本発明では、１つ以上の試薬をこの溶液内で安
定化させることができる。この場合、その他の試
薬の添加は、ガンマ−GPNAの添加の前でも後
でも可能である。例えば、本発明の実施例の１つ
では、パラニトロフエノールフオスフエート
（PNPP）をもう１つの化合物として添加できる。

化合物溶解後、もう１つの無水溶剤、例えばア
セトンをも添加できる。これによつて、溶液を２
乃至８℃で保存しても凝固することはなくなる
（ジメチルスルホキシド溶液は10乃至18℃で凝固
する）。低温で保存すると、保存寿命が大幅に伸
びる。

液状安定化溶液は、調製後、分子ふるいを含有
し気密式に密閉されたガラス製または高密度ポリ
エチレン製のびんに分配する。これらのびんは、
普通、冷凍下で保存する。このような安定化有機
試薬の予定保存寿命はこの条件下では最低４年で
あるが、劣化は殆んど認められない。

本発明に基づいて処理された不安定性有機試薬
には利点が多数ある。例えば、長期間に亘る安定
化が、酵素反応性や光度吸収率に影響を全く与え
ることなく、得られる。本発明による試薬は、そ
の品質が製造、包装、保存、及び使用を通して確
実に維持されるようになつている。従来の試薬で
は包装サイズが限定されて不便であつたが、この
問題も解消されている。同様に、包装、凍結乾燥
及び試薬浪費の高コストの問題も解消された。液
状試薬システムでは使用に自在性がある。なぜな
ら、成分の分離が容易に行えるからである。この
液状システムでは、凍結乾燥式のまたは乾式媒質
式調製品に比べて、試薬の均質性、包装性、並び
に使用上の自在性がより高いものになつている。

本発明の安定化有機試薬を調製したばかりの水
性有機試薬と比較してみた。研究の結果、本発明
の経年安定化試薬は正確さ、感度、及び精度の点
で、調製したばかりの試薬に匹敵することが判つ
た。

診断酵素学に於て、有機試薬を随時使用可能な
液状媒質の形で安定化することは、臨床実験室の
要求並びに取締り当局の信頼性に関する要望に十
分に応える新規且つ刺激的な方法である。液状有
機試薬システムに融通性を持たせたため、自動操
作使用が確実になり、同時に手動による実験の便
利さも得られる。

更に、本発明で使用される溶剤システムでは、
同一の液状有機媒質内で１つ以上の試薬を安定化
することができる。本発明の別の利点としては、
有機試薬が水性緩衝剤に対して高溶解度を呈する
（即ち、混和できる）ことがある。

本発明の更に別の利点は、１つ以上の試薬を同
一溶液で安定化できるということである。本発明
の上記の及びその他の利点は、以下の実験例を参
照すればより完全に理解できるであろう。

実験例 １ 10グラムの硼酸をガラス製ビーカー内の100ミ
リリツトル（ml）の乾燥ジメチルスルホキシドに
加えた。直ちにこのビーカーをパラフイルム
（parafilm）で覆い、硼酸を室温で撹拌して溶解
した。次に、4.3グラムのガンマ−グルタミル−
ｐ−ニトロアナリドを該混合液に添加し、このガ
ンマ−GPNを再び撹拌して溶解した。このよう
にして生成した溶液を濾紙で濾過し、該濾過液を
乾燥分子ふるい（ユニオン・カーバイド社、リン
デ事業部（Linde Division）製のゼオライト）上
に保存した。該溶液の10ml毎に、サイズがマツシ
ユ4A（Mash 4A：直径４乃至８mm）のビーズ状
分子ふるいを約30個加えた。この溶液をキヤツプ
密閉形こはく色のガラスびんに入れ、分子ふるい
上に保存した。この溶液は、溶液の10ml当り約30
ビーズのマツシユ4A分子ふるいを含むものであ
れば如何なる容量であれ、より小形の色ガラスび
んに分配することができる。もちろん、この場合
も、びんはキヤツプで密閉される。該試料は室温
で１年間保存したが余り劣化しなかつた。

実験例 ２ 30％（Ｖ／Ｖ）のアセトンと70％（Ｖ／Ｖ）の
ジメチルスルホキシドの混合物を実験例１のジメ
チルスルホキシドの代りに使用した。試料は冷凍
下で２乃至８℃の温度で保存した。保存安定性
は、大幅な劣化を生じない範囲で最長４年間と考
えられる。アセトンを添加したことにより、該混
合物は冷凍温度下でも凍結しないようになつてい
る。

実験例 ３ 実験例１または２の方法で調製した30マイクロ
リツトル（μ）の溶液を、160ｍMolのグリシ
リグリシンを含有する0.4モル水性トリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン緩衝液（PH8.2±
0.15）の各１ミリリツトル（ml）に加えた。その
結果生成された溶液を生物流動体におけるガンマ
−GT活量の定量に使用した。ガンマ−GT活量
の定量用手順は次の通りである。2.9mlの上記溶
液は100μの人体血清試料を添加・混合し、一
定の温度、例えば37℃に於ける405nｍの吸光度
を測定する事によつてパラニトロアニリド
（PNA）の生成率を追跡する。パラニトロアナリ
ドの生成率は、診断上重要な肝臓酵素であるガン
マ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ガンマ−
GT）の活性（濃度）に正比例する。関連の反応
図式は次の通りである。

ガンマ−GPNA＋ グリシルグリシンガンマーGT ―――――→ ←――――― PH8.2PNA −GLU−GLYGLY PNAは405nｍの光を強く
吸収するが、ガンマ−GPNAは吸収しない。

以下の実験例の各々では、有機試薬を溶剤に溶
解する。このようにして生成された各溶液は、本
発明の原理に基づき乾燥剤を添加すると、長期間
保存しても安定化させることができる。

実験例 ４ （コレステロール基準−300mg％） 600mgのコレステロール（C₂₇H₄₅OH：融点148
〜149℃）を20mlの無水テトラヒドロフラン〔沸
点66〜67℃、H₂O0.01％（ニユージヤージー
08865、フイリツプスバーグにあるジエイ・テイ
ー・ベーカー・ケミカル・カンパニイ社製）〕に
溶解した。この溶液を無水（0.01％）ジメチル
スルホキシド〔（CH₃）₂SO（大きな化学製品販売
業者であればどこからでも入手可能）〕で100mlま
で希釈した。

次に、0.5乃至2.5mlの表面活性剤、例えばトリ
トンＸ−100（ジエイ・テイー・ベーカー・ケミカ
ル・カンパニイ社製LSC非イオン性表面活性剤の
商品名）を加え、生成溶液をイソプロパノールで
200.0mlまで希釈した。

溶液を完全に混合し、生物流動体のコレステロ
ール定量に普通使用される方法、即ちリーベルマ
ン−ブルシール反応（Lieberman−Burchard
reaction）に基づいた方法論またはアカデミツ
ク・プレス発行の「酵素分析法（Methods of
Enzaymatic Analysis）」、第２版、巻４、ペー
ジ1890乃至1893にペルグマイヤー（Bergmeyer）
が記載してあるような現在の技術水準では最新の
酵素学的方法のいずれかを標準化する為に使用し
た。

上記の方法を使用することによつて、如何なる
所望の濃度レベルの標準溶液をも調製することが
できるし、あるいは種々な量の単一標準溶液を分
析用試料として使用する事によつて標準化を達成
することができる。

実験例 ５ 基質溶液 4.0ｇの固状マグネシウムチモールフタレイン
モノフオスフエートを30mlの液化フエノール（ジ
エイ・テイー・ベーカー・ケミカル・カンパニイ
社製）に溶解し、この溶液をメタノールで100ml
まで希釈した。溶液を60℃まで加熱し、固体が溶
解し易いようにした。この溶液は、乾燥剤と共に
包装すれば、温度25℃では18ケ月乃至２年間に亘
つて安定であり大きな加水分解を生じないものと
考えられる。

該溶液を使用すれば、アルカリ性フオスフアタ
ーゼの定量は次のようにして達成できる。

2.5mlの0.2M（PH10.0）、２−アミノ−２−メチ
ル−１−プロパノール緩衝液に、該溶液を２滴
（75μ）添加・混合する。この溶液を水浴また
は加熱ブロツク内で37℃まで予熱した後、100μ
の生物流動体試料を添加する。この混合液を37
℃で10分間温置し、0.5N水酸化ナトリウム−22
％炭酸ナトリウム溶液を１mlを添加混合する。生
成される色は595nｍの光で読取られる。酵素活
量は、好ましい酵素活量単位定義に従い純チモー
ルフタレインから得られる標準曲線から読取る。

実験例 ６ 4.0ｇのマグネシウムチモールフタレインモノ
フオスフエートを100mlの無水ジメチルスルホキ
シドに溶解した。この溶液は実験例５に従つて使
用することができる。

実験例 ７ （スルフヒドリル化合物） ＜Ａ＞；ジチオトレイトールを無水１，２−プロ
パンジオールに所望の濃度レベルで溶解した。
この溶液はスルフヒドリル基の酸化を防止する
（安定化期間は４乃至８℃で２年）。該溶液をび
ん詰めし、キヤツプで封をして保存した。

使用法：この溶液は、ギオケミストリー ジヤ
ーナル（Giochem.J.）61116（1955）に掲載
のオリバー ジエイ テイー（oliver.J.T.）
の方法に従つて、生物流動体内の酵素クレア
チンフオスフオキナーゼの診断定量に使用す
ることができる。但し、この方法に限定され
るわけではない。スルフヒドリル溶液を分析
に先立ちクレマチンフオスフオキナーゼ試薬
混合液に、最終グリコール濃度がCPK試薬
混合液の10％Ｖ／Ｖを越えないようにして、
添加する。

＜Ｂ＞；実験例7Aの方法のジチオトレイトール
の代りにジチオエリトリトールを使用すること
ができる。

＜Ｃ＞；7Aの方法のジチオトレイトールの代り
にＮ−アセチルシステインを使用することがで
きる。

＜Ｄ＞；7Aの方法のジチオトレイトールの代り
にグルタチオンを使用できる。

＜Ｅ＞；7Aの方法のジチオトレイトールの代り
にメルカプトエタノールを使用できる。

＜Ｆ＞；7Aの方法の１，２−プロパンジオール
に代えて無水グリセロールを使用できる。

＜Ｇ＞；7Aの方法の１，２−プロパンジオール
の代りに無水メタノールを使用できる。

＜Ｈ＞；7Aの方法の１，２−プロパンジオール
の代りに無水エタノールを使用できる。

実験例 ８ （ビリルビン標準…20mg％） 20.0mgビリルビン〔ニユーヨーク、ブレインヴ
ユーのICN・ケイ・アンド・ケイ研究所（Ｋ＆Ｋ
Laboratories）製〕を100mlの無水ジメチルス
ルホキシドに溶解した。該溶液はこはく色の密封
式ガラスびんに容れて暗所に４乃至８℃で保存し
た。この溶液は、本発明に従つて保存並びに調製
した場合、12乃至18ケ月の間安定であると考えら
れる。この溶液は、マロイ−イヴリンの方法〔エ
イチ・テイ・マロイ（Malloy、H.T.）、ケイ・
エイ・イヴリン（Evelyn、K.A.）共著のジヤー
ナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J.
Biological chemistry：1937年119：481）〕など
で、生物流動体内のビリルビン分析の標準化の一
次標準として使用できる。本例によれば、如何な
る所望の濃度レベルのビリルビン標準物をも調製
でき、また種々なアリコート（aliquots）の単一
標準物を使つて所望の標準化を達成することがで
きる。

実験例 ９ 実験例８の方法のジメチルスルホキシドの代り
に30％液化フエノール−70％メタノールの有機溶
剤混合液を使用した。

実験例 10 （カルシウム指示薬…0.167％Ｗ／Ｖ） 167mgのｏ−クレゾールフタレイン・コンプレ
クソン〔ICN・ケイ・アンド・ケイ研究所のカタ
ログ＃1367に記載のメタールフタリン１
（Metalphtalein1）〕を100mlの無水ジメチルスル
ホキシドに溶解した。約400ビーズの分子ふるい
（ユニオン・カーバイド・コーポレーシヨン社、
リンデ事業部のマツシユ4A）を加え、キヤツプ
で密閉したこはく色のガラスびんに容れて保存し
た。この溶液は、本発明の通り調製した場合は、
25℃で12乃至18ケ月間安定状態にあると考えられ
る。

使用法：緩衝試薬（0.2％の８−ヒドロキシキ
ノリンを含有する３％Ｗ／Ｖの水性の２−エ
チルアミノエタノール）の各１mlに対し、当
該カルシウム指示薬溶液の１滴（約30ml）を
添加する。混合後、該混合液を使用して生物
流動体内のカルシウムのレベル分析を行う。
該混合液は調製後60分以内に使用するのがよ
く、50mlの試料を４ml混合アリコートに添加
し、５分後に565nｍの波長において目盛の
正確な分光光度計で最終吸光度を読取る。

実験例 11 実験例10のジメチルスルホキシドの代りに、30
％Ｖ／Ｖの液化フエノールと70％Ｖ／Ｖののメタ
ノールの溶剤混合液を使用した。

実験例 12 〔加燐酸化剤（Phosphorylating agent）〕 ＜Ａ＞；フオスフオエノールビルヴエート（その
モノシクロヘキシルアンモニウム塩）を無水ジ
メチルスルホキシドに所望の濃度レベルで溶解
した。20乃至40ビーズの分子ふるい（ユニオ
ン・カーバイド・コーポレーシヨン、リンデ事
業部のマツシユ4A）を溶液の10ml毎に加えた。
該溶液はキヤツプ密閉式こはく色のガラスびん
に容れ４乃至８℃で保存した。該溶液の安定期
間は12乃至18ケ月間と考えられる。

この溶液は、タンザーとギルヴアーグの方法
〔エム・エル・タンザー（Tanzer、M.L.）と
シイ・ギルヴアーグ（Gilvarg、C.）共著のジ
ヤーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー（J.Biological Chemistry）（1959年、234；
3201）〕の場合と同じように、加燐酸化処理剤
として使用できる。タンザーとギルヴアーグの
最終反応混合液内に存在するジメチルスルホキ
シドのレベルが５％Ｖ／Ｖより低い場合には、
これによつて生じる酵素阻害は無視できる程度
のものである。

＜Ｂ＞；12Aのジメチルスルホキシドの代りに、
30％Ｖ／Ｖのアセトンと70％Ｖ／Ｖのジメチル
スルホキシドの溶剤混合液を使用することがで
きる。

＜Ｃ＞；12Aのジメチルスルホキシドの代りに、
50％Ｖ／Ｖメタノールと50％Ｖ／Ｖの液化フエ
ノールの溶剤混合液を使用することができる。

以上、本発明を幾つかの方法について相当詳細
に説明してあるが、当然、その他の方法も可能で
ある。従つて、付属の特許請求の範囲の精神並び
に範囲は、本明細書に記載した望ましい方法に限
定されるものではない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ガンマ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを
   含む安定な有機試薬の製法であつて、 Ａ ガンマ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドの
   ための少なくとも１つの可溶化剤を、室温では
   液体であり且つガンマ−グルタミル−ｐ−ニト
   ロアニリドと非劣化式に反応する水混和性有機
   溶剤に溶解する段階と、 Ｂ ガンマ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを
   上記有機溶剤に添加する段階と Ｃ 最低１重量％の不活性で表面領域の大きい粒
   状乾燥剤を、上記試薬を上記溶剤に溶解する前
   か後に、上記溶剤に添加して、上記溶液の残留
   含水量が約0.5％以下となるように該乾燥剤で
   水分を吸収する段階と、 Ｄ 上記溶液を密封する段階と、 から成る安定化有機試薬の製法。 ２ 前記可溶化剤が、硼酸、イミダゾール、サリ
   チル酸塩、アスコルビン酸、及びこれらの組合せ
   から成る群から選択される特許請求の範囲第１項
   に記載の製法。 ３ 前記水混和性有機溶剤が、ジメチルスルホキ
   シド、アセトン、及びこれらの組合せから成る群
   から選択される特許請求の範囲第２項に記載の製
   法。 ４ 前記試薬溶解段階がパラニトロフエニールフ
   オスフエートをジメチルスルホキシドに溶解する
   ことを含む特許請求の範囲第１項乃至第３項のい
   ずれかに記載の製法。