JPH0267370A - アニリン色素を供給する還元可能な化合物ならびにその分析組成物、要素および使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、臨床化学に関する。より詳細には、有用な色
素を放出する新規還元可能な化合物およびそれらの生物
学的流体のような液体のアッセイへの使用に関する。こ
れらの化合物は、微生物の検出分野で特に有用である。

〔従来の技術〕

液体、例えば水、乳汁および生物学的流体の化学分析は
、健康維持および診療にとってしばしば強い要求または
必要性がある。このような分析を促進するための各種組
成物および要素が知られている。かかる組成物および要
素は、分析対象物質（木明細書では「被分析物」という
）を測定するための試薬組成物を含む。被分析物は生物
または非生物的化学物質であってよい。試薬組成物は、
被分析物と相互作用し、検出可能な変性物（例えば、色
素生成物）を供給する。

近年、多大な労力が全血、血清、血漿および尿などの生
物学的流体の迅速かつ高い定量性のある診断または臨床
分析に向けられてきた。

例えば、感染症の迅速かつ効果的な診断および処置にと
って、できるだけ速やかに疾病を引き起こす細菌を検出
し得ることが望まれる。尿路感染症は、気管の感染頻度
より低いものの最も一般的な細菌性疾病である。事実、
多くの病院では、尿路感染症が留置カテーテルの使用お
よび外科的手術後の最も一般的な院内感染形態としてし
ばしば存在する。殆んどの尿路感染症は、尿道から導入
された微生物による上行性の感染からもたらされ、予期
できない感染から重い全身系の疾病へと悪化する。この
ような感染症は、一般に尿１＋ｎ／当たり１００．００
０（１０’）個以上の細菌を随伴し、主に細菌尿症と称
される状態になる。正常状態では、外性器由来の汚染物
は適正に採取し輸送しな験体１１当たり１．０００（１
０３）個未満の生物体を与える可能性があるが、尿は無
菌である。

主要な細菌尿症は、いずれかの尿路組織への微生物の侵
入に伴う各種の病理学的症状を呈するものであるか、ま
たは組織侵入を伴わない尿中での単なる細菌の増殖に寄
因するものであり得る。感染は、尿道、前立腺、膀胱ま
たは腎臓などの単一部位で起こるが、しばしば−の部位
以上で起こり得る。感染を尿に限定すると、それ自体無
症候性細菌尿、すなわち感染の明らかな徴候または症状
を全く示さない状態で存在してよい。この状態の早期処
置は、より重い状態、例えば腎孟腎炎（腎および腎孟の
炎症）への進行を防ぐことができる。

従って、信頼できる方法による細菌の迅速な検出は、初
期および特定の診断を促進するであろう。

さらに、実際的に処方抗生物質が感染処置に際して有効
であるためには、療法期間を通じて繰り返し試験するこ
とが必要である。従って、簡単で迅速な細菌尿試験が必
要なことは明白である。さらに子供、妊婦、糖尿病患者
および老人の間の尿路感染の発生が無症候性でしばしば
予期できないとの観点から、数験体の蒐集および試験が
必要とされる診断である細菌尿の試験は、ルーチンで作
業ができるように可能な限り単純で経済的でなければな
らない。このことは、重ねて迅速で安価な細菌尿の検出
方法の必要性を立証するものである。

現在の微生物培養による実験室的方法、例えばループ・
ダイレクト・ストリーク（ｌｏｏｐ−ｄｉｒｅｃｔｓｔ
ｒｅａｋ）法は、かなりのインキュベーション期間（１
８〜２４時間）を経過した後、結果を測定することがで
きる。これらの実験室的方法は、また、実施するのに時
間がかかり、相当な臨床上の訓練および設備をも必要と
する。

細菌をかなり迅速に測定するための既知の市販方法は、
重大な欠点を有する。それらは、時間がかかり、信顆性
に乏しく、複雑な試薬もしくは器具使用が必要であり、
そして特定の微生物に対して感度が限定され、薬剤もし
くは他の防害物に影響を受けやすい。そのため、公知法
の有用性はひどく限定される。

無色材料、例えばテトラゾリウム塩は、微生物により還
元されて発色ホルマザン色素を生成することが知られて
いる。しかしながら、微生物の検出にホルマザン色素を
使用することは、幾つかの欠点を有する。ホルマザン色
素は、一般に低い吸光係数を有するので低濃度の微生物
の検出に使用することができない。テトラゾリウム塩は
、ホルマザン色素の吸光係数を高めるための変性が容易
でない構造を有する。幾つかのホルマザン色素は、水に
不溶でありそして微生物に対して毒性を有する場合もあ
る。

液体分析用の多層要素もまた、既知である。これらの要
素は、被分析物と相互作用して酸化または還元により固
定化キャリア核から前もって形成した検出可能な部分を
放出する相互作用性組成物を含む。−殻内に、かかる放
出には高アルカリ媒体（すなわち、ｐＨが１３を越える
）の存在が必要である。前もって形成した検出可能な部
分の特性吸収帯は、放出の前陵で同一であり、非放出検
出可能な部分に由来する不要な吸収を遮断するために要
素中で輻射線ブロッキング層がアッセイ期間を通じて使
用される。

〔発明が解決しようとする課題〕

特開昭６２−５０１６４８号公報は、還元されたとき検
出可能な成分、例えば色素を放出する還元可能な化合物
を記載する。これらの還元可能な化合物は、微生物また
は生理学的ｐＨ（一般に、ｐＨ４〜９）でその化合物を
還元し得る他の被分析物を検出するために使用すること
ができる。かかる物質を測定するための従来技術を進歩
させてはいるが、その化ご物から放出される色素は、放
出された色素の一部となるカルボニルまたはチオカルボ
ニル結合基を介してキノンまなは芳香核に結合されてい
る。

このことが、還元可能な化合物に組み込むことができ、
かつ分析方法に使用できる色素の数および多様性を制限
する。例えば、アニリン色素は前記還元可能な化合物か
ら放出することができない。

被分析物の存在下でアニリン色素を放出する手段さえあ
れば、分析方法で利用できる可能性がある多くのアニリ
ン色素が存在する。

〔課題を解決するための手段〕

還元されて多種多様なアニリン色素を放出し得る新規で
有用な還元可能化合物は、次式％式％ で示される構造を有するものであって、上式中、ＣＡＲ
−は次式 で示されるキノン構造を有しており、 Ｒ−は次式 で示される基であり、これらの式中 Ｒ２およびＲ４は独立して水素原子、アルキル基、アリ
ール基もしくは電子吸引性基を表し、Ｒ５はメチレン基
を表し、 Ｒ３は式−Ｒ５ｌ：：ｌと同一であるかまたは水素原子
、アルキル基、アリール基もしくは電子求引性基を表わ
しており、あるいはＲ３とＲ４は一緒になって縮合炭素
環を完成するのに必要な原子を表しており、 Ｒ６はアルキル基、アリール基、シクロアルキル基もし
くは複素環式基を表しており、そしてＲ７は窒素原子と
一緒になって、キノン核からＲ１の放出および脱炭酸に
よりアニリン色素を生成する基であり、あるいはＲ６と
Ｒ７は一緒になって、キノン核からＲ１の放出および脱
炭酸によりアニリン色素を生成するアニリン色素部分の
一部を生成する炭素環を形成する基を表す、化合物であ
る。

前述の還元可能な化合物は、１種以上の適当なＭ街剤で
ｐＨ９以下に緩衝化した水性組成物中で使用することが
できる。またさらに、本化合物は被分析物を測定するた
めの乾式分析要素に組み込むことができる。

被分析物の測定方法は： Ａ、被分析物を含むことが予測されるリガンド試料を、
ｐ１１９以下で、前述の還元可能な化合物と接触させて
アニリン色素を供給する工程、およびＢ、キノン核から
Ｒ１の放出を引き起こす被分析物が存在する結果として
供給されるアニリン色素を検出する工程を含んでなる。

本発明の還元可能な化合物は、被分析物が存在する結果
として還元され、好ましくは生理学的ｐｌ＋（例えば、
６〜９）にてアニリン色素を放出することができる化合
物として広く定義できる。色素の存在は、試験験体中の
被分析物量を決定するのに適する波長で測定することが
できる。

より具体的には、本発明の化合物は、次式％式％ で示される構造により特定され、ここで、ＣＡＲ−は、
次式 で示されるキノン構造を表しており、 Ｒ１は、次式 前記のキノン核において、Ｒ２およびＲ４は、独立して
（すなわち、同一または相違する）水素原子、炭素原子
１〜４０個の置換もしくは未置換アルキル基（例えば、
メチル基、エチル基、ヒドロキシメチル基、メトキシメ
チル基、ベンジル基および当業者に自明の他の基）、置
換もしくは未置換アリール基（例えば、フェニル基、ナ
フチル基、メチルナフチル基、ｐ−ニトロフェニル基、
…−メトキシフェニル基、フェニルスルホンアミド基お
よび当業者に自明の池の基）または一般にハメット（Ｈ
ａｍ＋５ｅｔｔ）σ値が正の、好ましくは０．０６より
大きいσ値を有する電子吸引性基を表す。ハメットσ値
は、例えば、「有機化学における立体効果（Ｓｔｅｒｉ
ｃ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｉｎ　Ｏｒ　ａｎｉｃ　Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒ　）　Ｊ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎ
ｓ、　Ｉｎｃ、、１９５６．５７０〜５７４ページおよ
び「物理有機化学における進歩（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉ
　ｎ１’ｌ＋　５ｉｃａｌ　Ｏｒ　ａｎｉｃ　Ｃ１＋ｅ
ｍｉｓｔｒ　）　　Ｊ　、Ｖｏｌ、　２゜Ｉｎｔｅｒｓ
ｃｉｅｎｃｅ　ｌ’ｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　１９６４．
３３３〜３３９ページに記載の標準的方法により計算さ
れる値である。

正のハメットσ値を有する代表的電子吸引性基としては
、シアノ基、カルボキシル基、ニトロ基、ハロゲン原子
（フッ素、臭素、塩素またはヨウ素）、トリへロメチル
基（例えば、トリフルオロ、メチル基またはトリクロロ
メチル基）、トリアルキルアンモニウム基、カルボニル
基、カルバモイル基、スルホニル基、スルファモイル基
、エステルおよび当業者に極めて明白な他の基、あるい
はこれらの電子吸引性基の１以上が置換したアルキル基
またはアリール基（前記に定義）が挙げられる。好まし
い電子吸引性基としては、ｐ−ニトロフェニル基、翰−
ニトロフェニル基、Ｉ）−シアノフェニル基および２．
５−ジクロロフェニル基が挙げられる。メタ位にメトキ
シル基またはアセトアミド基を有するアリール基もまた
有用である。

Ｒ３は、式−Ｒ５Ｒ１で示される基と同一であるか、あ
るいは水素原子、前記Ｒ２およびＲ４に−）いて定義し
たような置換もしくは未置換アルキル基、置換もしくは
未置換アリール基または電子吸引性基を表す。また一方
、Ｒ３およびＲ４は一緒になって、キノン核に結合した
置換もしくは未置換炭素縮き環を完成するのに必要な原
子を表す。

例えば、このような環（単環式または二環式）は、骨核
中に炭素原子４〜８個を有することができる。

Ｒ５は、メチル基もしくはメトキシル基で置換されてい
るかまたは置換されていなくてもよいメチレン基を表す
。

Ｒ６は、炭素原子１〜２０１Ｉ！！Ｉの置換もしくは未
置換アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、イソプ
ロピル基、ヘキシル基、−ＣＨ２ＣＨ２−０ＣＯ−ｔ　
−ブチル基および当該技術分野で既知の他の基）、核中
の炭素原子６〜１４個の置換もしくは未置換アリール基
（例えば、フェニル基、ナフチル基、Ｉ）−クロロフェ
ニル基および当該技術分野で既知の他の基）、炭素原子
とヘキロ原子（酸素、イオウ、窒素、セレン、テレル）
を会わせて５〜１０個有する置換もしくは未置換複素環
式基（例えば、ピリジル基、オキサシリル基、チアゾー
リル基および当該技術分野で既知の他の基）または炭素
原子５〜１０個の置換もしくは未置換シクロアルキル基
（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルおよび当該
技術分野で既知の他の基）を表す。

Ｒ７は、キノン核からＲ１が放出され、次いで脱炭酸が
なされる場合に、それが結きする窒素原子と一緒になっ
てアニリン色素となるアニリン色素部分を形成する基を
表す、限定されるものでないが、有用なアニリン色素部
分の代表例としては、次の各式： ３個の〉、アルコキシル基（炭素原子１〜３個の）、ハ
ロゲン原子および当該技術分野で既知の他の基から選ば
れ、そしてＲＩｓは、置換もしくは未置換アルキル基（
炭素原子１〜１５個の〉または置換もしくは未置換アリ
ール基（前記に定義したような）を表す〕で示される部
分が挙げられる。

また一方、Ｒ６とＲ７は結合した窒素源と一緒になって
、アニリン色素部分の一部となる５〜７員の炭素環を形
成する基を表す。限定されるものでないが、このような
基の例としては、次式で示されるものが挙げられる： 〔上式中、Ｒ１、ＲＳ　、　ＲＩＯ、Ｒ１１、Ｒ１、Ｒ
＋３オよびＲ”は、ニトロ基、スルホアルキル基（炭素
原子１〜３個の）、第三級アミン基（炭素原子１〜前記
の還元可能な化合物が還元されたとき、Ｒ１部分を放出
する。それは、自動的に脱炭酸してアニリン色素を生成
する不安定なカルバミン酸結６を含む。好ましい態様で
は、放出されたアニリン色素は、キノン核に結合したま
まの色素部分の極大吸収と相違するものを有する。しか
しながら、ある態様では、放出されたアニリン色素が結
きしたままのアニリン部分の極大吸収と同一のものを有
する。これらの化合物は、放出されたアニリン色素が検
出用のもう一つの層に拡散するのに通過する輻射線ブロ
ッキング層を有する分析要素と一緒に使用することがで
きる。

本発明の好ましい還元可能な化合物は、前述したように
Ｒ２，ｐ、、３およびＲ４として少なくとも２個の電子
吸引性基を有するか、あるいはＲ３とＲ４が一緒になっ
て、前述したような置換もしくは未置換の縮合した５〜
７員の炭素環を表す。

より好ましくは、Ｒ４が未置換メチレン基であり、モし
てＲ３とＲ４が前述したような５〜７員の炭素環を表す
。

限定されるものでないが、本発明の代表的な還元可能な
化合物としては、以下の式で示される化金物が挙げられ
る： 本発明の新規還元可能な化合物は、一連の個別には既知
の反応を使用して製造される。−殻内に、この一連の反
応には次の工程が含まれる：（１）アニリン染料の製造
、（２）アニリン染料の塩化カルバミルの製造、次いで
（３）塩化カルバミルとヒドロキシメチルＣＡＲ−核と
の反応。代表的な装造は、下記例１および例２に示す。

一般に、本明細書で記載する還元可能な化合物は、限定
された水溶性を有する。従って、水性環境下でそれらを
使用する場合には、使用前にその化合物の分散体を調製
することが最もよい。かかる分散体は、一般に還元可能
な化合物、該化合物のための水性緩衝液および水可溶性
界面活性剤かまたは水混和性有機溶媒あるいはその両者
とを含んでなる。

本発明を実施する際に利用できる界面活性剤としては、
化合物の還元を妨げない全ての界面活性剤が挙げられる
。一般に生細胞を検出するために有用な界面活性剤とし
ては、非イオン性界面活性剤（例えば、アルキルアリー
ルポリエトキシアルコール、ｐ−アルキルアリールオキ
シポリグリシドールおよび当業者に既知の他のものを含
む）が挙げられる。

限定されるものでないが、有用な水混和性有機溶媒とし
ては、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、
プロパツールおよび当該技術分野で既知のもの）、Ｎ、
Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ア
セトニトリルまたはへキサメチレンホスホラミドが挙げ
られる。特定の還元可能な化合物について使用され得る
特定の溶媒は、日常的試験により容易に決定することが
できる。

分散物は、後述の例３に示される調製品の具体的な説明
を含む一般的な方法により調製することができる。還元
可能な化合物は、その分子量に応じた濃度で水混和性溶
媒に溶解されるが、一般に溶媒１ｍｌ当たりｌ　〜１０
０ｍｇ、好ましくは５〜８０ｍＨの濃度とされる。次に
、得られた溶液は分散物１繭！当たり、一般に０．１〜
２４ｍｇ、好ましくは０．５〜．１０ｍｇ量の適当な界
面活性剤と混合される。この調製は、−ｍに室温で実施
することができる。

これらの分散物は、一般に生理学的ｐＨ（一般に４〜９
）を持続するための有効量でＭｍ剤を含む。

分散物中の緩衝剤濃度は、広範に変えることができるが
、一般に０，０１〜０．１モル濃度である。代表的なｉ
ｌｆ剤としては、ＧｏｏｄらによりＢｉｏｃｌ＋ｅｍｉ
ｓｔｒ５、４６７（１９６６）および＾ｎａ１．　Ｂｉ
ｏｃｌ＋ｅｍ、、１０４．３００（１９８０）に報告さ
れているリン酸塩、ホウ酸塩およびその他の緩衝剤が挙
げられる。

本明細書に記載される還元可能な化合物は、水性溶液お
よび非水性溶液、例えば生物学的流体、製造加工品、排
水または食品素材の分析測定（すなわち、定量的または
定性的検出）用の組成物として有用である。この化合物
の還元をもたらし、アニリン色素を放出する単一反応ま
たは一連の反応を使用して多様な被分析物の測定を行う
ことが可能である。多様な被分析物には、生細胞（例え
ば、細菌、白血球細Ｒ２！、ｌ、酵母またはカビ）、酵
素（例えば、リパーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸
オキシダーゼ、クレアチンキナーゼ、α−グリセロリン
酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン
酸アミノトランスフェラーゼおよび池のＮＡＤＩＩ起因
性、Ｆ　Ａ　Ｄ　Ｈ起因性またはオキシダーゼ起因性の
アッセイ）、本発明の還元可能な化合物を還元し得る生
細胞以外の生物学的または化学的還元体く例えば、アス
コルビン酸塩、システィン、グルタチオンまたはチオレ
ドキシン）、代謝可能な物質（例えば、グルコース、乳
酸、トリグリセライドまたはコレステロール）および免
疫反応体く例えば、抗原、抗体またはハプテン）が含ま
れる。

本発明の組成物を使用して、酵素還元系反応ならびにフ
ラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤＦＡＤＨ）に起
因する反応、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（
ＮＡＤ　−ＮＡＤＩＩ）に起因する反応および（ＮＡＤ
Ｐ−ＮＡＤＰＨ）に起因する反応をモニターすることが
できる。これらの例で、本発明の還元可能な化合物を使
用するとＮＡＤＨの代わりに色素を供給することができ
る。

本発明の還元可能な化合物は、生物学的試料中の生細胞
を検出または定量する上で特に有用である。本発明によ
れば、生細胞を有することが予測される全ての生物学的
試料が細菌、白血球細胞、酵母またはカビについて分析
可能であるが、本発明は、ヒトと動物の流体のような生
物学的流体（例えば、尿、脳髄液、血液ならびに便通分
泌液）およびヒトや動物の組織懸濁液中の細菌の検出に
ついて特に有用である０本発明の実施は、尿（希釈また
は未希釈の）で尿路感染症を検出するのに特に重要であ
る。

還元可能な化合物を使用して生細胞を測定する場合、そ
の生細胞を電子移動剤（以下ｒ　ＥＴＡ　。

という）と相互作用させることが好ましい。ＥＴＡの存
在は、また、非生物被分析物の分析的測定についてより
効果的な色素放出をももたらすであろう。ＥＴＡは、測
定される物質（例えば、生細胞）と還元可能な化合物と
の間を媒介するように作用する可動性化合物である。

−ｉに、ＥＴＡのポテンシャルは、測定される物質のボ
テンシャルよりかなり陽性であり、本発明の還元可能な
化合物に比べより小さな陽性を有していなければならな
い。すなわち、ＥＴＡは被分析物より容易に還元され、
該還元可能な化合物より還元され難いものでなければな
らない。これらは、一般に被分析物の濃度に応じた濃度
で、好ましくはｔｘｔｏ−’モル濃度からｌＸｌ０−’
モル濃度までで存在する。

本発明の実施に際して有用なＥＴＡ化り物は、フェナジ
ンメトスルフェート、フェナジンエトスルフェートおよ
び当業者に既知の類似の化合物である。場合により、種
々のＥＴＡ化合物の組み会わせ物も使用することができ
る。本発明の実施上有用なＥＴＡ化合物は、米国特許第
４，７４６，６０７号明細書に記載されている。

生細胞、特に細菌細胞の検出は、しばしばそれらの細胞
の栄養源の存在下で実施されるが、必ずしもその存在が
必要とされるものではない。資化され得る炭素源および
ｔ％合によって窒素源を含むいずれかの栄養培地を使用
することができる。適切な組成およびｐＨを有する適当
な栄養培地は、当該技術分野でよく知られている。

本発明は、溶液アッセイかまたは乾式アッセイのいずれ
かに適用可能である。溶液アッセイでは、還元可能な化
合物、好ましくはＥＴＡをも含む溶液（または分散液）
が調製され、次いで測定される生細胞または被分析物を
含有する溶液試験試料と混合することにより接触される
。ＥＴＡは、また、還元可能な化合物と混きする前に試
験試料と混合しておいてもよい。−殻内に、還元可能な
化合物は、適当な容器中の試験試料と混合される。得ら
れた溶液（または懸濁液）を静かに混合した後、４０℃
未満の温度で比較的に短時間インキュベーションする。

次に、適当な波長で色素を測定することにより試験試料
を評価する。このような評価は、適当な検出装置を用い
て行ってもよい。

溶液アッセイは、また、試験試料を含有する多孔質吸収
材、例えば紙製ストリップを還元可能な化合物分散液と
接触させることにより実施することもできる。試験試料
中の被分析物は、多孔質材から分散液中に浸透し、測定
に必要な分析用反応を開始する。溶液アッセイでは、還
元可能な化合物の存在量は、最低０．００１ミリモル濃
度、好ましくは０．０１〜１．０ミリモル濃度である。

当業者により容易に決定される量で他の試薬を存在せし
めてもよい。

また一方、本発明の方法は、乾燥分析要素を有する乾式
アッセイとして実施することができる。

このような要素は、吸収キャリア材、すなわち、それ自
体吸着材または吸収材を担持する薄いシートまたはスト
リップであって、還元可能な化合物またはそれを含んで
なる乾燥された分散物残渣を含む支持体であってもよい
。このような要素は、当該技術分野で試験ストリップ、
診断要素、浸漬スティックおよび診断試薬などとして知
られている。

乾式分析要素として使用される場きには、本明細書に記
載される還元可能な化合物は、吸収または浸透すること
により適当な吸収性キャリア材に組み込むか、または適
当な吸収性キャリア材上に塗布することができる。別法
として、それらをアッセイ期間を通じて要素に添加して
もよい。利用し得るキャリア材は、水または尿もしくは
血清のような生物学的流体にさらしたとき、不溶性でか
つそれらの完全な状態の構造を持続するものである。利
用し得るキャリア材は、紙、多孔質粒状物、セルロース
、多孔質ポリマーフィルム、木材片、ガラス繊維、織布
および不織布（き成および非合成）などであってよい。

このような要素を調製するために有用な材料および方法
は、米国特許第３．０９２，４６５号、同３，８０２゜
８４２号、同３，９１５，６４７号、同３，９１７，４
５３号、同３，９３６，３５７号、同４，２４８，８２
９号、同４，２５５，３８４号および同４，２７０，９
２０号明細書ならびに英国特許第２，０５２，０５７号
明細書により例示されるように当該技術分野てよく知ら
れている。

乾式アッセイは、非孔質支持体上に吸収性キャリア材と
して少なくとも１種の展開領域を有する該支持体を含ん
でなる分析要素を用いて特に有利に実施することができ
る。

３マ元可能な化合物は、展開領域中に存在させるか、ま
たは別の領域（例えば、試薬領域、位置合せ領域もしく
は親水性領域）に存在させてもよい。

展開領域は、いずれかの適当な１１維材もしくは非繊維
材または両方の混合物のいずれかから調製することがで
きる。この領域の空隙体積および平均細孔サイズは使用
目的に応じて変えることができる。例えば、全血または
細胞もしくは高分子物質を含有する他の液体試料がアッ
セイされる場合には、血清または尿がアッセイされると
きより空隙体積および平均細孔サイズを一般により大き
くする。

展開領域は、米国特許第４，２９２，２７２号明細書に
記載されるように適当なバインダー剤もしくは織布と混
合される繊維材料を使用して調製するか、あるいは米国
特許第３，９９２，１５８号、同４，２５８，００１号
および同４，４３０．４３６号明細書ならびに特開昭５
７−１０１７６０号公報に記載されるようなバインダー
性接着剤を有するかもしくは有しないポリマー組成物（
例えば、ブラッシングポリマー）または粒子からｍＷす
ることができる。

本発明の要素では、還元可能な化合物量は広範囲に変え
ることができるが、一般に最低０．０１ｇ／ｍ２、好ま
しくは０．０５〜０．２ｇ／ｍ２塗布量で存在する。任
意の試薬類を次の塗布量で存在させてもよい：ＥＴＡ　
　　　一般に最低　０．００１ｇ／ｍ”栄養源　　　一
般に最低　０．０５ｇ／ｍ２ＭＩ術剤　　　一般に最低
　０．１ｇ／ｍ２および界面活性剤　一般に最低　０．
１ｇ／＋＋＋２゜前記領域の１以上が、場合により、当
該技術分野で知られているような活性剤、バインダー（
−般に親水性のもの）、抗酸化剤またはカプラー溶媒、
ならびに特殊な被分析物のアッセイに必要ないずれかの
試薬類を包含する他の必要な各種成分を含んでいてもよ
い。

本発明の一態様では、水性液体中の微生物を検出するた
めの要素は、いずれも前述した電子移動剤および還元可
能な化合物を含んでなる。これらの要素はまた、生細胞
に対する栄養源およびアッセイ期間を通じて生理学的な
ｐＨを持続する緩衝剤を含むことが好ましい。このよう
な要素を使用して、例えば、尿試料（例えば還元性妨害
物質を除去する前処理がなされたもの）中の細菌を、適
当な方法で該試料と要素を物理的に接触させ、次いで細
菌の存在に起因して還元可能な化合物から放出される検
出可能種を適当な波長で検出することにより検出するこ
とができる。

本発明のもう一つ態様では、水性液体中の無生物的また
は化学的被分析物の測定のために要素が使用される。１
種以上の試薬を含有する相互作用性組成物を要素に組み
込むか、またはアッセイ時に添加することができる。こ
の組成物は、還元可能な化合物の還元をもたらし、その
結果生ずる色素生成物をもたらす被分析物と接触するの
に必要な試薬を含む。このような被分析物の例は前述し
ている。検出される色素量は、液体試料における被分析
物の存在量に相関させることができる。

本発明の要素はまた、他の還元体、例えばアスコルビン
酸塩（アスコルビン酸と当量のアルカリ金属塩）、シス
ティン、グルタチンおよびチオレトキシンなどの測定用
としても有用である。

本発明のアッセイは、手動式または自動式であってもよ
い、−殻内に、軟式要素を使用するに際しては、供給ロ
ール、チップ束または他の供給源。

から本発明の要素を取り出し、それを試験される液体試
料（例えば、１〜２００μｌ）と接触させ、ＸＡ＄１を
要素中の試薬と混合することによって数分析１！１また
は生細胞の測定がなされる。いずれかの適当な方法、例
えば試ｆ’ｌ中に本発明の要素を軽く浸すかもしくは浸
漬し、または好ましくは適当な分配手段で試Ｆｌの１以
上の）α滴を手動もしくは機械により要素をスポットす
ることによりこのような接触を行うことができる。

被分析物または生細胞の検出は、還元可能な化合物が還
元され適当な手段で検出し得るアニリン色素を放出した
ときに達成される。スペクトル測定は一色素の極大波長
または極大波長以外の波長のいずれかで行うことができ
る。

以下の例は、本発明の詳細な説明するために示す。

例１：゛量−０ｆｆ！なｆ合物１の製゛貴前記で特定さ
れる還元可能な化合物Ｉを次のように製造した。

（塩化カルバミル中間体の製造） アゾアニリン色素は、公知の方法（例えば、Ｍａｒｃｌ
＋、＾ｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃ１＋ｅ＋ｎ
１ｓｔｒｙ、第３版、Ｊｏｂｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏ
ｎｓ、　４７１ページ、１９８５、におけるジアゾニウ
ムカプリング、を参照）で製造することができる。

アゾアニリン色素（５４０ｍｇ、２ミリモル）を、２゜
６−ルチジン（２１４ｍｇ）含有ジクロロメチン（５０
ｍｌ）に溶解した。ホスゲン溶液（トルエン中１モル濃
度溶液２ｍ１）を撹拌しながら添加した。薄層クロマト
グラフィー〔シリカ；ヘプタン、／ジエチル（１／１）
）上で新たな生成物の生成を観察したところ、約５分内
に反応が完結した。次に、反応混合物を希塩酸水（１０
０社）に流し込み、有機層を分離し、乾燥次いで濃縮し
て固体生成物を得た。この塩化カルバミルをジエチルエ
ーテル／酢酸エチル溶液中に懸濁することで精製し、そ
のまま直接次の工程に使用した。

（ヒドロキシメチルキノン中間体の製造）次の一連の反
応式に従いこの中間体を製造した。

化合物Ａ（前記で特定される）は、特開昭６２−５０１
６４８号公報く前述）の実施例２１および実施例１（工
程２ａ、２ｂおよび３）に記載される方法により製造し
た。

化合物Ａ　（２５，２ｇ、８６．４ミリモル）、ヨウ化
メタン（４９ｇ、３４６ミリモル）と炭酸カリウム（３
５，８ｇ、２５９ミリモル）をアセトン（１５０＋ｎ／
）生還流下で２４時間加熱した。反応混合物を冷却し、
次いで希塩酸氷／水（２００ｍｌ）中に流し込んだ。沈
澱した固体を枦取し、水で洗浄し、空気乾燥次いて脱色
性炭素を含むエタノールから再結晶化して化合物Ｂ（＋
＊、ｐ。

１８６〜１８７℃）１６．７５ｇ（収率６０．６％）を
得た。構造（前記に同定）をＮＭＲで確認した。

ジクロロ、メタン（７５０ｍ／）中止り物Ｂ　（３２ｇ
、０．１モル）水冷溶液に塩化チタン（Ｉ　Ｖ）　（３
８ｇ、０．２モル）を加え、窒素雰囲気下で撹拌した。

この溶液にα。

α−ジクロロメチルメチルエーテル（１８，９ｇ、０．
１６５モル）を滴下し、次いで反応温き物を室温で約１
５時間加温した。この混合物を再度冷却し、氷水（１１
）を注意深く滴下した。得られた複数の層を分離し、水
層をジクロロメタンで洗浄した。会わせた有機層を乾燥
し、次いで溶媒を留去した。＄１１生成物をクロマトグ
ラフィー（シリカ：ジクロロメタン）により精製し、得
られた固体を冷ジエチルエーテル中ですりつぶし、濾過
し次いで冷ジエチルエーテルで洗浄し、白色固体（＋ａ
　、　ｐ　、　２０８〜２１０℃）として化合物Ｃ（１
６，１，、収率４６．５？ｇ＞を得た。

この構造（前記に固定）をＮＭＲで確認した。

水素１ヒホウ素ナトリウム（アルミナ上に１０％、２７
．９ｇ、７３．５ミリモル）を酢酸エチル（４００ｍＮ
＞中止き物Ｃ（１５ｇ、４３．２ミリモル）懸濁液に添
加した。

室温て１時間撹拌した後、反応混合物を濾過し、アルミ
ナを酢酸エチルで洗浄した。濾過物を溶媒除去して１■
化合物Ｄ　Ｉａｇを得た。この構造（前記に同定）をＮ
　Ｍ　Ｒで確認しな。

アセトニトリル（２６５ｍｌ）と水（１５ｍ／）中の化
合物Ｄ（１６ｇ、４５．８ミリモル）懸濁液に水（１５
０ｍｌ）中硝酸アンモニウノ、セリウム（７５，３ｇ、
１３７ミリモル）を速やかに滴下しな。室温で２時間撹
拌した後、反応混合物を氷／水（５００社）中に流し込
み、沈澱した生成物を集め、水で洗浄し次いで空気乾燥
しな。

１■生成物をクロマトグラフィー（シリカ；ジクロロメ
タン、′ジエチルエーテル）で精製し、次いで濾過して
化合物Ｅ（輸、ｐ、２１９〜２２１℃）９．４ｇ　（収
率６４％）を得た。構造（前述に固定）をＮＭＲで確認
した。

（還元可能な化合物１　ｆ）製造〉 前記ヒドロキシメチルキノン（３１９ｍｇ、１ミリモル
）と前記塩化カルバミル（３３２ｍｇ、１ミリモル〉を
、０℃で乾煉ジクロロメタン（５ｍｆｆｉ）に溶解した
。次に、撹拌しなから４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリ
ジン（１２２＋＊ｇ、１ミリモル）および１．８−ジア
ザビシクロウンデン−７−エン（１５２ｍｇ、１ミリモ
ル）を添加した。１０分後、反応混合物を希塩酸水（１
０ｎ＋１）中に流し込み、有機層を分離した。薄層クロ
マトグラフィー（シリカ；ジクロロメタン／１％トリフ
ルオロ酢酸）は、出発原料の他に新規な化合物を示した
。分収用シリカ薄層クロマトグラフィー板を使用してそ
の化合物を精製した。この板を塩酸／メタノール／ジエ
チルエーテル（１：１：１０）溶液に浸して乾燥した後
、粗生成物のジクロロメタン溶液をスポットした。この
板を、ジクロロメタンと１％ジエチルエーテルを使用し
て４８時間展開した。生成物は、イエロー吸収帯として
板上で分離された。この吸収帯を板からかき取り、ジク
ロロメタンに溶解し、溶媒としてジクロロメタンと１％
ジエチルエーテルを使用するシリカ（１％トリフルオロ
酢酸処理）を通して濾過した。

溶媒を除去した後、生成物をジエチルエーテルから再結
晶しなく収量１２０ｍｇ＞、　ｔｉ造はＮＭＲで確認さ
れた。

例２：還元日箭なイ人物■の、１造 ハイドロキシメチルキノン、アニリン色素および塩化カ
ルバミルを、例１に記載の方法で製造した。ハイドロキ
シメチルキノンと塩化カルバミルアニリン色素との間の
反応は、例１に記載するように実施した。薄層クロマト
グラフィー（シリカ；１％トリフルオロ酢酸処理）およ
び溶Ｍ液として１％ジエチルエーテルおよびヘプタン／
′酢酸エチル（３：１）を用いて測定したところ、約１
時間で反応は完了した。ジクロロメタンおよび１％ジエ
チルエーテルを用いて展開する分収用薄層クロマトグラ
フィーを使用して粗生成物を精製した。イエロー吸収帯
として分ｇｔされた還元可能な化合物■を、油状物とし
て得た。構造をＮＭＲにより確認した。

例３：　ム　Ｉを　用　るＥ、コリー（Ｅ、ｃｏｌｉ）
の１肚 本例は、本発明の還元可能な化合物の一つを使用する溶
液アッセイによる微生物（Ｅ、コリー）を測定するため
の本発明の実施例を示す。

社−１− Ｅ、コリー細胞は、振盪することなくプレイン・ハート
・インフュージョン培地で３７℃、−夜培養した。遠心
で細胞４０社を採取し、ペレットを０．０５モル濃度の
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）２５社に再懸濁し
、次いで得られた懸濁液を遠心した。この二次ベレット
を洗浄し、緩衝液２５ｍ１中に再懸濁した。この懸濁液
のアリコートをＭ衝液で希釈して、５Ｘ１０”個Ｅ、コ
リー細胞／社の貯蔵液（ＯＤ６２゜＝０．８３３）を得
な。

還元可能な化合物Ｉの分散液は、次のようにして調製し
た： ０．１％濃度の硫酸で酸性にしたＮ、Ｎ−ジメチルホル
ムアミド（５００ｍＮ）中に前記化合物を溶解した。こ
の溶液試料（２５０ｍｌ）を、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ
”）Ｘ−１００非イオン性界面活性剤（５００社）に添
加して十分に混きし、次いて０．０５Ｎのリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７，５）２５ｍｌに加えた。

電子移動剤としてトリメチルベンゾキノンを使用し、メ
タノールにより０．０１モル濃度溶液（１，５＋＊ｇ／
社）を調製した。

グルコースを滅菌水に溶解して１０（ｖ／ｖ）％溶液を
得た。

アッセイ 試験液は、緩衝液１，３９社、ｌＸｌ０’個Ｅ、コリー
／ｍ１緩ｍ液、グルコース溶液２５ｍＺ、還元可能な化
合物■懸濁液１．５ｍｌおよびＥＴＡ溶液２５社から調
製した。

バックグランド用対照液は、細胞を除去し、緩衝液容量
が１．４５ｍＮである以外は同一の試薬を含めた。

試験および対照液を、３７℃で３０分間インキュベーシ
ョンし、次いで４３８ｎｍで光学濃度を測定した。

３０分後にバックグランドを補正した光学濃度は０．４
７７であった。このことは、還元可能な化合物■が微生
物を検出するなめに利用できることを示す。

〔発明の効果〕

本発明の新規還元可能な化合物は、分析方法において各
種のアニリン色素を使用するための手段を提供する利益
を与える。色素成分がカルボニルまたはチオカルボニル
結き基を介して結きされている特開昭６２−５０１６４
８号公報（前述）に記載の化合物に比し、本発明の化合
物は、キノン核にカルボキシアミド結合基を介して結合
されているアニリン色素を有する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次式 ＣＡＲ−Ｒ＾１ で示される構造の還元可能な化合物であって、上式中、
   ＣＡＲ−は次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるキノン構造を有しており、 Ｒ＾１は次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される基であり、これらの式中 Ｒ＾２およびＲ＾４は独立して水素原子、アルキル基、
   アリール基もしくは電子吸引性基を表し、Ｒ＾５はメチ
   レン基を表し、 Ｒ＾３は式−Ｒ＾５−Ｒ＾１と同一であるかまたは水素
   原子、アルキル基、アリール基もしくは電子吸引性基を
   表わしており、あるいはＲ＾３とＲ＾４は一緒になって
   縮合炭素環を完成するのに必要な原子を表しており、 Ｒ＾６はアルキル基、アリール基、シクロアルキル基も
   しくは複素環式基を表しており、そしてＲ＾７は窒素原
   子と一緒になって、キノン核からＲ＾１の放出および脱
   炭酸によりアニリン色素を生成する基であり、あるいは
   Ｒ＾６とＲ＾７は一緒になつて、キノン核からＲ＾１の
   放出および脱炭酸によりアニリン色素を生成するアニリ
   ン色素部分の一部を生成する炭素環を形成する基を表す
   、化合物。 ２、ｐＨ９以下で緩衝化され、かつ次式 ＣＡＲ−Ｒ＾１ で示される構造の還元可能な化合物であって、上式中、
   ＣＡＲ−は次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるキノン構造を有しており、 Ｒ＾１は次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される基であり、これらの式中 Ｒ＾２およびＲ＾４は独立して水素原子、アルキル基、
   アリール基もしくは電子吸引性基を表し、Ｒ＾５はメチ
   レン基を表し、 Ｒ＾３は式−Ｒ＾５−Ｒ＾１と同一であるかまたは水素
   原子、アルキル基、アリール基もしくは電子求引性基を
   表わしており、あるいはＲ＾３とＲ＾４は一緒になって
   縮合炭素環を完成するのに必要な原子を表しており、 Ｒ＾６はアルキル基、アリール基、シクロアルキル基も
   しくは複素環式基を表しており、そしてＲ＾７は窒素原
   子と一緒になつて、キノン核からＲ＾１の放出および脱
   炭酸によりアニリン色素を生成する基であり、あるいは
   Ｒ＾６とＲ＾７は一緒になって、キノン核からＲ＾１の
   放出および脱炭酸によりアニリン色素を生成するアニリ
   ン色素部分の一部を生成する炭素環を形成する基を表す
   、化合物を含んでなる水性組成物。 ３、次式 ＣＡＲ−Ｒ＾１ で示される構造の還元可能な化合物であって、上式中、
   ＣＡＲ−は次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるキノン構造を有しており、 Ｒ＾１は次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される基であり、これらの式中 Ｒ＾２およびＲ＾４は独立して水素原子、アルキル基、
   アリール基もしくは電子吸引性基を表し、Ｒ＾５はメチ
   レン基を表し、 Ｒ＾３は式−Ｒ＾５−Ｒ＾１と同一であるかまたは水素
   原子、アルキル基、アリール基もしくは電子求引性基を
   表わしており、あるいはＲ＾３とＲ＾４は一緒になつて
   縮合炭素環を完成するのに必要な原子を表しており、 Ｒ＾６はアルキル基、アリール基、シクロアルキル基も
   しくは複素環式基を表しており、そしてＲ＾７は窒素原
   子と一緒になって、キノン核からＲ＾１の放出および脱
   炭酸によりアニリン色素を生成する基であり、あるいは
   Ｒ＾６とＲ＾７は一緒になつて、キノン核からＲ＾１の
   放出および脱炭酸によりアニリン色素を生成するアニリ
   ン色素部分の一部を生成する炭素環を形成する基を表す
   、化合物を含んでなる被分析物測定のための乾式分析要
   素。 ４、Ａ、被分析物を含むことが予測される液体試料を、
   ｐＨ９以下で次式 ＣＡＲ−Ｒ＾１ で示される構造の還元可能な化合物であって、上式中、
   ＣＡＲ−は次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるキノン構造を有しており、 Ｒ＾１は次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される基であり、これらの式中 Ｒ＾２およびＲ＾４は独立して水素原子、アルキル基、
   アリール基もしくは電子吸引性基を表し、Ｒ＾５はメチ
   レン基を表し、 Ｒ＾３は式−Ｒ＾５−Ｒ＾１と同一であるかまたは水素
   原子、アルキル基、アリール基もしくは電子求引性基を
   表わしており、あるいはＲ＾３とＲ＾４は一緒になって
   縮合炭素環を完成するのに必要な原子を表しており、 Ｒ＾６はアルキル基、アリール基、シクロアルキル基も
   しくは複素環式基を表しており、そしてＲ＾７は窒素原
   子と一緒になって、キノン核からＲ＾１の放出および脱
   炭酸によりアニリン色素を生成する基であり、あるいは
   Ｒ＾６とＲ＾７は一緒になって、キノン核からＲ＾１の
   放出および脱炭酸によりアニリン色素を生成するアニリ
   ン色素部分の一部を生成する炭素環を形成する基を表す
   、化合物と接触する工程、ならびに Ｂ、キノン核からＲ＾１の放出を引き起す被分析物が存
   在する結果として供給されるアニリン色素を検出する工
   程、を含んでなる被分析物の測定方法。