JPH026757A - 糖尿病用アッセイ方法、それに用いるキットおよび単クローン性抗体、および検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、真性糖尿病に対する傾向、即ちそれに至るプ
ロセスの開始をヒトにおいて検出するだめの新規のアッ
セイに関するものである。さらに本発明は、多クローン
性または、好ましくは単クローン性の抗体薬剤、ヒトに
おけるベータ細胞破壊プロセスの診断を可能にし、イン
シュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）の初期の突然の
出現を予知できるこの種の抗体薬剤に基づいた血清と尿
素アッセイに関するものである。

（従来の技術と発明が解決しようとする課題）インシュ
リン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、膵臓の小島に在
るインシュリン生成ベータ細胞を破壊する自己免疫のプ
ロセスによって起こる。糖尿病は臨床的に多数のベータ
細胞が取り返しの付かない程に（多分９０％も）破壊さ
れた後にのみはっきり分かり、各人の命はインシュリン
の外来供給に依存することになる。換言すると、臨床診
断の際に、自己免疫のプロセスが既に元に戻らない位に
損傷を受けていても、その大部分は顕著な症状を示さな
い。

自己免疫のプロセスが終わり、病気のプロセスが停止さ
れ、同時に十分の分量の内因性インシュリンに供給する
十分な数のベータ細胞をなお患者が有する場合、病気が
なおり、外来性インシュリンに対する要求が無くなる。

従って、自己免疫プロセスの治療形態はどんなものでも
、人が危険な状態であることを見分けられ、同時に明白
な病気の徴候が無く、従ってその人自身の失ったインシ
ュリン生成能力のためにインシュリン置換が要求される
場合に、−層有効である。

インシュリンに免疫があるマウスまたは他の哺乳動物は
、一定期間の後（７〜１０日前後）、インシュリンが明
らかにインシュリン（ホルモン）受容体によって結合さ
れる部位でインシュリン分子に結合する特定のイディオ
タイプのインシュリンに抗体を発現する（シェヒクー・
ワイら、「インシュリンで免疫をつけたマウスにおりる
抗−イディオタイプを自然発生的に発現するインシュリ
ン受容体に対する自己抗体」、サイエンス、２１６．５
４２〜５４５．１９８２年４月３０日：シェヒクー・ワ
イら、抗−イディオタイプに自然発生的に発現するイン
シュリン受容体に対するマウス抗体；１．その抗体の特
性化Ｊ　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　６４１１
〜６４１５（１９８４；エリアス・デイら、「抗−イデ
ィオタイプを自然発生的に発現するインシュリン受容体
に対するマウス抗体；■、グルコースボメオスタシスの
効果およびインシュリン受容体」、Ｊ、旧０１Ｃｈｅｍ
、　　２５９　６４１６　（１９８４）　　；コーエン
・アイ・アールら、「抗体としてインシュリンホルモン
受容体に働き、真性糖尿病を引き起こす抗−イディオタ
イプを発生するインシュリンへの免疫化」、生物学と薬
学におけるイディオタイプにおいて、エイチ・コーラ−
ら編、アカデミツク・プレス、ニューヨーク、２０巻、
３８５頁（１９８４）　、シエヒクー・ワイら、抗イデ
イオタイプ、受容体および分子擬態において、リンチカ
ム・デイ・ニスら編、スプリンガーーヴエルラク、二ｊ
−−ヨーク、７３〜９１頁（１９８８））。これはＤＭ
−イディオタイプ抗体を操作的に決める。従って叶−イ
ディオタイプ抗体のインシュリン結合部位は、インシュ
リン受容体のインシュリン結合部位を擬態する。これら
同じマウスは、次にＤＭ−イディオタイプ抗体に対し抗
体を自然発生的に発生ずることが認られた。このような
聞−イディオタイプの抗−インシュリン抗体に対する抗
体は、以下に抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体と称せられ
る。従って、ＤＭ−イディオタイプを認める他に、また
抗−開−イデイオタイプ抗体は、インシュリンに対する
細胞質受容体と相互に作用する。このような抗−ＤＭ−
イディオタイプ抗体はインシュリンの機能部分の構造を
擬態し、インシュリン受容体に対し抗体として挙動する
。

（課題を解決するための手段） 本発明は、真性糖尿病に対する傾向をヒトにおいて決定
する方法に関する。さらに本発明は、多クローン性また
は、好ましくは単クローン性の抗体を使用することがら
成る前記方法に基づいたアッセイを行うための手段、お
よびこのようなアッセイのためのキットに関する。

本発明による一つのアッセイは、インシュリンの受容体
結合部位を認めるイディオタイプ抗体、ここでは０４−
イディオタイプ抗体と呼ぶ抗体の使用に基づくものであ
る。アッセイは、ＤＭ−イディオタイプ抗体、すなわち
、インシュリンの受容体結合部位を認めると同じ聞−イ
ディオタイプ抗体によって認められる抗−ＤＭ−イディ
オタイプ抗体に対し抗体の有無を決定するために使用さ
れる。

第１図は、ホルモン、受容体、イディオタイプ抗体およ
び抗−イディオタイプ抗体の間の関係を示す図である。

ＤＭ−イディオタイプ抗体は、インシュリン聞一エビト
ープ受容体部位を擬態し、同時に抗−ＤＭ−イディオタ
イプ抗体は、インシュリン分子自身の叶−エピトープ部
位を擬態する。インシュリンは多くの抗原エピトープを
有するが、インシュリンをインシュリンホルモン受容体
に結合する叶−エビ１−−ブのめが、本発明に関係する
ものである。

Ｉ　ＤＤＭを持つ患者の血液は、インシュリン受容体の
インシュリン結合部位を認める抗−開−イディオタイプ
抗体を含む。このような抗−聞−イディオタイプ抗体は
、多クローン性または単クローン性［ＩＭ−イディオタ
イプ抗体を認める。このような患者では、この抗ＤＭ−
イディオタイプ抗体は、インシュリン受容体を占め、従
って直接インシュリンの付加を防止し、および／または
インシュリン受容体自身の変化を引き起こし、従って、
間接的Ｑこホルモンとしてインシュリンの活性を妨げる
。

また、臨床ＩＤＤＭの症状に導く自己免疫プロセスの初
期の段階で、比較的大量、即ち、抗−ＤＭ−イディオタ
イプ抗体の分量よりも実質的に多い開イディオタイプ抗
体が血清中に現れる。このような分量の叶−イディオタ
イプ抗体は健康な患者には現れない。プロセスの後に、
血清中の叶−イディオタイプ抗体の分量は、非常に減少
し、抗−ＤＭイディオタイプ抗体の分量は、非常に増加
する。

従って、また本発明は、試験される患者の血清の中に聞
−イディオタイプ抗体の有無を決定するために抗−ＤＭ
−イディオタイプ抗体の使用を基本とするアッセイを含
む。抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体または検体の血清の
中のＤＭ−イディオタイプ抗体のいずれか又は両方が上
がる場合、これば初期の糖尿病のポジティブの指示であ
る。

さらに、抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体またはＤＭイデ
ィオタイプ抗体に結合する成分が、糖尿病患者の尿中に
現れるが、正常の尿には現れないことを見出した。抗−
ＤＭ−イディオタイプ抗体の使用に関して、これは、糖
尿病原がＤＭ−イディオタイプ抗体、インシュリン受容
体、および／または他のインシュリン結合分子を含むこ
とを意味し、これら全ては、新たに診断されたＩＤＤＭ
患者の尿に在ることが確立されると、ベータ細胞の破壊
中にＩＤＤＭの初期の段階で患者の尿に在ることも期待
される。同じことが糖尿病患者の尿中に見出されるが正
常の尿には見出されない成分に叶−イディオタイプ抗体
が結合することが期待される。通常、叶−イディオタイ
プ抗体の結合は、抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体のそれ
よりも弱いが、なお認められる。本発明は、さらにこの
ような尿アッセイを行う手段、さらにこのようなアッセ
イのためのキットに関する。

単りヱ二畳１Ｕ彊１悲饗遣 単クローン性抗−インシュリン抗体を発現するために標
準法を使用した。マウスの（Ｃ５７ＢＬ／６ｘ　ＢＡＬ
Ｂ／ｃ）　Ｆ　＋ハイブリッド株を、文献に記載された
ような完全フロイントアシュハン１〜中にウシインシュ
リン２５μｇで免疫化した（シエヒター・ワイら（１９
８２）、同上：シェヒター・ワイら（１９８４）、同上
；エリアス・デイら（１９８４）　、同上；コーエン・
アイ・アールら（１９８４）　、同上）。

５日後、２匹のマウスの肺臓を取り出し、肺臓細胞を、
ハイブリトーマを発現する標＜ＩＢ方法を用いてＨＡＴ
感性リンパ球腫瘍ライン５ｐ２１０を用いて融合さセた
（コーラ−・ジー　［ハイブリドーマ製造の技術Ｊ　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、門ｅｔｈｏｄｓ、　２．２８５〜９８　
（１９８１））。

試験した９６０穴の中、４個はインシュリンへの抗体に
対しポジティブであった。この４個のハイブリドーマを
再クローン化し、それらの抗体をＤＭ−イディオタイプ
に対し試験した。この聞−イディオタイプは、受容体結
合部位にてインシュリンに特異的に結合し、特異的抗−
イディオタイプ抗体の抗−受容体活性を阻害する能力に
よって検出した。

本来のインシュリンまたはアセチル−３−インシュリン
（これは修飾結合部位を持つ）への結合は、固相ラジオ
イムノアッセイ　（Ｒ１八）を用いてアッセイした。可
撓性ＰＶＣミクロタイタープレートを、ＰＢＳにとかし
た５０μｇ／−のインシュリンを、１個の穴に０，１ｍ
Ａ！の割合で１時間、室温で被覆した。腹水液をＰＢＳ
　＋〇、１χＢＳＡに１：１００で希釈し、１個の穴に
０．０２５　ｍＲの濃度で加えた。プレートを３回、Ｐ
ＢＳ　＋０．１χＢＳ八で洗浄し、＋２５１−ヤギ抗マ
ウスＩｇを１個の穴に１００．　ＯＯＯｃｐｍの割合で
２時間添加した。次にプレートを４回洗浄し、乾燥し、
穴をガンマカウンターでカウントした。本来のインシュ
リンを用いるｃｐｍと修飾インシュリンを用いるｃｐｍ
の比は、表１に示した。

抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体はインシュリンと同様の
挙動であるので、含脂肪細胞において脂質生成を引き起
こす。ＤＭ−イディオタイプ抗体の活性は、抗−叶一イ
ディオタイプ抗体によって誘導される脂質生成を阻害す
る能力によって測定される。脂質生成は、ラットの含脂
肪細胞の懸濁液でアッセイした。１：５００の希釈率で
抗−叶〜イディオタイプ血清は、脂質生成を誘導するよ
うに含脂肪細胞に添加した。抗−インシュリン単クロー
ン性腹水液をＩ：５０で添加し、＋ａＣＵ−グルコース
を脂質合成源として添加した。３７°Ｃで２時間後、ア
ッセイを停止し、脂質画分の放射活性をベータカウンタ
ーでカウントしたくシェヒター・ワイら（１９８２）、
同上；シェヒター・ワイら（１９８４）、同上；エリア
ス・デイら（１９８４）、同上）。

表１は、クローン１１１７と６１）６がＤＭ−イディオ
タイプに対しポジティブであることを示している。

反対に、クローン１４と１５は、このイディオタイプに
ネガティブであり、本来のインシュリンと、インシュリ
ン受容体に結合する能力を失った化学的に修飾したイン
シュリンとの間で区別がつかなかった。聞ポジティブイ
ディオタイプ抗体は、修飾インシュリンを認めることが
できない。クローン１４と１５はまた、抗−ｌ−イディ
オタイプ抗体の活性を示さない（表１）。従って、聞−
イディオクイプーポジティブ抗−インシュリン抗体（Ｄ
Ｍ−イディオタイプ抗体）は、叶−イディオタイプ（抗
叶−イディオタイプ抗体）への抗−イディオタイプ抗体
を検出する試薬として働く。

紅 単クローン性抗−インシュリン抗体の性質１４　　　　
　　　１．２　　　　　　　　　　　０１５　　　　　
　　１．２　　　　　　　　　　　５１０７　　　　　
　　３．８　　　　　　　　　　５６６Ｄ６　　　　　
　　３．１　　　　　　　　　　６９ハイブリドーマＩ
Ｄ７は、フランス国パリのアンスチテユ・パスツールの
寄託コレクンオンに寄託した。寄託番号１−７６６゜ 単クローン性抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体を得るため
に、マウスの株（Ｃ５７ＢＬ／６　ＸＣ３１１／ｅＢ）
Ｆ＋をウシインシュリンに免疫化した。２４日後に、抗
開イディオタイプ抗体が現れ始めたとき、マウスの肺臓
細胞を、開−イディオタイプ抗体の生産の為に上に述べ
たと同様の方法で標準骨髄腫パートナ−（Ｓｔ１２１０
）　と融合させた。聞゛　−イディオタイプ抗体に対し
単クローン性抗体を生成する５個のハイブリドーマを選
択した。これらの１個を、ＤＴ３１２と名付けた。

単クローン性抗体の製造の当業者はここに開示された方
法を繰り返して、ハイブリト−マクローンが得られ、ま
た受容体結合部位でインシュリンに特異的に結合する抗
体または叶−イディオタイプ抗体に特異的に結合する抗
体を生産するものを選択できるので、これらは本発明の
範囲内にある。

ここに開示した特異的１０７と６Ｔ１６クローンは、好
適例である。さらに、ハツカネズミの抗体を特定例とじ
てここに使用するが、また抗体生成細胞ラインが得られ
る限り、哺乳動物はいずれも免疫化のために選択でき、
このような哺乳動物のリンパ球は比較できる骨髄腫細胞
ラインと交雑できることも理解されるだろう。同様に、
いずれのインシュリンも、特にヒトインシュリンを、イ
ンシュリン受容体結合部位が特異的種であるように現れ
ないような、免疫化物質として使用できる。また、叶−
イディオタイプ抗体を抗−ｌ−イデイオタイプクローン
を得るためのインシュリンと同様に免疫化物質として使
用できる。さらに、抗体のイムノグロブリンタイプは重
要でない。ＤＭ−イディオタイプ抗体が特異的にその受
容体結合部位でインシュリンに結合する限り、本発明に
含まれるものである。また、抗−ＤＭ−イディオタイプ
抗体が特異的に叶−イディオタイプ抗体に結合する限り
、本発明に含まれるものである。

ハイブリドーマＤＴ３１２によって生成された抗体は、
本発明のプロセスにおいてバイブリド′−マを生成する
他の４個の抗−叶一イディオタイプ抗体のいずれかよっ
て生成された抗体よりも、若干良いか悪〈実施するとい
う証拠はない。従って、いずれの抗−ＩＢＭ−イディオ
タイプ抗体も、ＤＴ３１２からのものと同様に実施でき
、抗−叶−イディオタイプ抗体を使用する本発明のプロ
セスにおいてそのために置換されることができる。

ラットのＢＢ株は、ヒ目ＤＤＭの広く受は入れられてい
るモデルである。糖尿病傾向のＢＢラットは、約９０日
令のラットの約７０％が、臨床的糖尿病になるヘーク細
胞に対して、自己免疫攻撃を自然発生的に発生する。ラ
ットの残りの３０％は、臨床的糖尿病を発生しない。

ＢＢラノ１〜の糖尿病傾向株から、糖尿病耐性サプライ
ンを選択した。これらのラットは、糖尿病傾向ラインと
比較して、ＩＤＤＭを発現する機会が非常に僅かであり
、はんの数パーセントのラットが糖尿病になる。ラット
の血清中の抗ＤＭ−イディオタイプ抗体の存在が、臨床
的ＩＤ叶の将来の突然の発病を予知するかどうか試験す
るため、ラットのＢＨの糖尿病耐性ラインと糖尿病傾向
ラインの両者を使用した。

第２図は、ラットがＩＤＤＭを最後に発現するかどうか
について、日令のちがうラットの血清から得られた結果
を示している。血清は、６０．７０．８０．９０および
１００日令について各２０ないし３０匹のラットの群か
ら得られ、表１に示したような単クローン性ＤＭポジテ
ィブ抗体６Ｄ６に対し抗体のためのラジオイムノアッセ
イで試験した。目印は９０〜１００日でＩＤＤＭを発現
し続けたＢＢ糖糖尿病傾向クラット示す。黒い目印は、
ＩＤＤＭを発現し続けなかったＢＢ糖糖尿病傾向クラッ
ト示す。Δ印は、ＩＤＤＭを発現しなかったＢＢＢ尿病
耐性株ラットを示す。

最後に病気を発現した糖尿病傾向のＢＢプラット、年令
の増加と共に抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体の量を増加
したことが認られる。ＩＤＤＭの攻撃時に、全ラットが
ポジティブであった。これに対して、臨床的ＩＤＤＭを
発現しない糖尿病傾向および糖尿病耐性のラットは、抗
−叶−イディオタイプ抗体が認られなかった。実際にネ
Ｊと傾向を発現した糖尿病耐性株の１匹のラットは、試
験にポジティブであった。これは抗−ＤＭ−イディオタ
イプ抗体の存在がＢＢプラットおけるＩＤＤＭの発現を
特異的に予知していることを示している。ポジティブの
ラットは全部、糖尿病を発現し続け、ネガティブのまま
のラットは糖尿病を発現しなかった。日令の高いラット
は、血清中に存在する抗−叶−イディオタイプ抗体の分
量が多かった。

ＢＢラノ１−における叶−イディオタイプ日令によって
ＢＢ／ＩＥラットの血清におけるＤＭ−イディオタイプ
抗体と抗−インシュリン抗体（広く）の発現を、またＩ
ＤＤＭの発現を比較する実験をさらに行った。血清は、
日令の違った糖尿病傾向（ＤＰ）または糖尿病耐性（Ｄ
Ｒ）サプラインのＢＢ／Ｅラットから得られた。各群は
、それぞれ同相ラジオイムノアッセイによって、ＤＭ−
イディオタイプの特異性（抗原として単クローン性抗−
叶−イディオタイプ抗体ＤＴ３１２を使用）の抗体およ
びインシュリン（抗原としてウシインシュリンを使用）
に対する抗体を検出するために調べる約２５の血清を含
んでいた。ミクロタイター穴を終夜、４℃で５０μｇ　
／　ｍｌの抗原のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）　０．１　
ｍｌでインキュベートした。非特異的結合は、１時間２
６℃で、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳを
用いてプレートをインキュベートでブロックした。テス
ト血清を１％ＢＳＡで１：１００に希釈し、２５μｌを
二倍の穴に加え、２時間、２６℃でインキュベートシた
。

穴はＰＢＳで３回洗浄し、結合抗体をＩ２５■−ウサギ
抗−ラソトＩｇを用いて１６時間、４°Ｃでインキュベ
ートして検出した。結合しない抗体をＰＢＳで４回洗浄
した。穴を乾燥し、ガンマカウンターを用いてカウント
するためにカットした。第３図は、抗叶−イディオタイ
プ抗体を抗原として用いた結果を示している。第４図は
、インシュリンを抗原として用いた結果を示している。

数匹のラソＩ・は最後にはＩＤＤＭを発現し、または、
示したように穴に残った。反応性の分量は複数の段階に
て平均のｃｐｍ±ＳＤとして示す。第３図において、・
印は１０聞を発現しつづけたＢＢｗ尿病傾向ラットを示
し、○印はＩＤＤＭを発現しなかった糖尿病傾向ＢＢラ
ットを示した。第４図において、目印はＩＤＤＭを発現
し続けたＢＢ糖糖尿病傾向クラット示す。黒い目印はＩ
ＤＤＭを発現し続けなかったＢＢＢ尿病傾向ラットを示
す。Δ印はＩＤＤＭを発現しなかったＢＢ＄ｉ尿病耐性
病耐性株ラット。

第２図に示したように、血清中の抗−ｌ−イディオタイ
プ抗体の分量は糖尿病を発現する傾向を確かに表示する
ことが認られる。第３図は特に病気の発現の初期に、血
清中の叶−イディオタイプ抗体の分量が臨床的１１）Ｄ
？ｌのきたるべき発現の予知になることを示している。

しかし、第４図と以下の表２から認られるように、ＤＭ
−イディオタイプに特異的ではないインシュリン抗体は
、初期の糖尿病の正しい予知として使用できない。

表２は、８０日令の高台のＢＢ／Ｅラットの糖尿病傾向
または糖尿病耐性サプラインのそれぞれから得られた血
清アッセイで得た結果を示す。数匹のラットは、示され
たように最終的にＩＤＤＭを発現しまたは発現しなかっ
た。同相ラジオイムノアッセイを第２〜４図について上
に述べたように行った。

血清は平均Ｃρｍが２または正常の血清の平均Ｃ凹（７
００ｃｐｍ±１２０）より上の標準偏向である場合、ポ
ジティブとした。

紅 ８Ｂ／ＥラツトにおけるＩＩ）ＤＭの発現と関連した開
−イディオタイプと抗−聞一イデイオタイプ抗体をもつ
ラットの糖尿病 ｉｄ：イディオタイプ、 ＊　：　　ｐ＜０．０５１０ＤＭを発現しなかったラッ
トと比較パ有した声ｒ「の ストレプトゾ１〜シンは、２００ｍｇ／ｋｇの１回の投
与量でマウスに投与するとき、ヘータ細胞と糖尿病の急
性破壊を引き起こす毒物である。１日４０ｍｇ／ｋｇの
ス１〜レブＩ−ヅトシンを５日間、毎日、分けてＣ５７
ＢＬ／ＫＳＪ株の雄マウスに投与したところ、自己免疫
糖尿病のタイプを生じた（ロソシニ・エイ・エイら、「
インシュリン依存性真性糖尿病の免疫学」、Δｎｎ、　
Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　３　：　２８９　（１９
８５））。

毒物の低い量の投与は、自己免疫応答を引き起ごずよう
なヘーク細胞を明らかに部分的に損傷する。

自己免疫反応は、ストレプトシトシン自身ではなく　、
Ｃ５７ＢＬ／ＫＳＪマウスで発現する糖尿病状態に対し
応答できる。従って、ストレプトシトシンの低い投与量
で引き起こされる糖尿病は、ヘータ細胞の毒性の発作後
に若干のヒ１−に生じる自己免疫糖尿病のモデルである
。

ＢＢラットの自然発生的な糖尿病に似て、この自己免疫
糖尿病の形態は、また抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体の
発現と関連する。表３は、全部２．５月令の、２０匹の
雄のＣ５７ＢＬ／ＫＳＪマウスと２０匹の雄のＢＡＬＢ
／ｃ株のマウスを、低い投与量でストレプトシトシンを
（４０ｍｇ／ｋｇ　、１日１回、５日間）投与して処理
した実験結果を示している。糖尿病の発現は高血糖症の
検出によって処理の開始−ケガ後に評価した。血液を各
マウスの尻尾の静脈から収集し、血液グルコースの濃度
を測定した。糖尿病は４００ｍｇ％以上の濃度で診断し
た。マウスの血清を、また抗−イディオタイプ抗体の存
在に対して調べた。これは固相ラジオイムノアッセイに
おける抗体の、ＤＭ−イディオタイプにポジティブであ
ることが知られているモルモット抗−インシュリン抗体
への結合によって測定した（シェヒター・ワイら（１９
８４）、同上；エリアス・デイら（１９８４）、同上、
コーエン・アイ・アールら（１９８４）、同上）。表３
は、２０匹のＣ５７ＢＬ／ＫＳＪ全部が抗−開−イディ
オタイプ抗体と結合した糖尿病を発現したことを示して
いる。また、自己免疫糖尿病を発現しなかったＢＡＬＢ
／ｃマウスは抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体を発現しな
かった。

表１ 低投与量のストレプトシトシンで処理したＣ５７ＢＬ／
ＫＳＪマウスは抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体と結合し
た糖尿病を発現する。

ストレプトシトシンを用いて処理（４０ｍｇ／ｋｇ　Ｘ
　５　）Ｃ５７ＢＬ／ＫＳＪ　　　　　２０／２０　　
　　　　　　　２０／２０ＢＡＬＢ／ｃ　　　　　　　
Ｏ／２０　　　　　　　　　０／２０ＩＤＤＭをもつヒ
トが抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体に対しポジティブで
あるかどうかを決定するために、３０人の新たに診断さ
れた未治療のＩＤＤＭ患者と２０人の健康な対照者の血
清を調べた。ラジオイムノアッセイミクロタイタープレ
ートを、終夜、４℃で０．２５ｍｇ／ｙ＋ｌのＤＭＩｇ
Ｇ（ＩＤ７）　（商品名セファクリルＳ−２００カラム
で腹水液から精製した）で被覆した。プレートを洗浄し
、ＰＢＳ　＋０．１χｌ’ｌｓＡで１＝５０に希釈した
ヒト血清を一つの穴に２５ｐ１用い、２時間、室温でイ
ンキュベートした。プレートを３回洗浄し、＋２５１−
ウサギ抗−ヒ１−Ｆａｂを一つの穴に１００，０００ｃ
ｐｍ／２５　ｐｌ、２時間添加した。プレートを洗浄し
、乾燥し、穴をカントし、ガンマカウンターでカウント
シた。血清は、健康な対照者よりも少なくとも２倍、単
クローン性ＤＭ　ＩＤフイディオタイプに結合した場合
を、ポジティブと考えた。

表４は、新たに診断されたＩＤＤＭ患者は、抗−ＤＭイ
ディオタイプに対しポジティブであり、２０人の対照者
はネガティブであったことを示している。

ＩＤＤＭ患者と対照者の血清は、ＯＭ−イディオタイプ
ネガティブ抗−インシュリン単クローン性抗体１４また
は１５（示していない）と反応しなかった。

従って、ＢＢラットに似て、ＩＤＤＭを発現するヒトも
、ＤＨ−イディオタイプ単クローン性抗体を用いて検出
できる抗−叶−イディオタイプ抗体を発現する。

紅 新たに診断したＩＤＤＭ患者の血清中の抗−聞−イディ
オタイプ抗体 健康な対照者　　　２００ 血清は、それぞれ糖尿病患者の兄弟であり、タイプ１の
糖尿病を発現する危険があると考えられるグループから
得られた。患者は、１〜６年追跡し、数人は、臨床的糖
尿病を発現したが、他の者は発現しなかった。叶ポジテ
ィブ単クローン性抗体６Ｄ６およびＩＤ７、およびポリ
クローン性モルモット抗−インシュリン抗血清（コーエ
ン・アイ・アールら（１９８４）　、同上）は、固相ラ
ジオイムノアッセイで抗体として使用し、シェヒター・
ワイら（１９８２）、同上；シェヒター・ワイら（１９
８４）、同上：エリアス・デイら（１９８４）、同上、
コーエン・アイ・アールら（１９８４）、同上に記載さ
れたような抗−ＤＭ−イディオタイプヒト抗体の結合を
検出した。表５は、発病前のＩ　ＤＤＭの発現と抗−Ｄ
Ｍ−イディオタイプ抗体の存在との間の関連を示してい
る。

紅 危険な状態のヒトの抗ＤＭ−イディオタイプ抗体の存在
とＩＤＤＭの発現との間の関連 抗−イディオタイプ応答 ポジティブ 無 ネガティブ 抗体と１０ＤＭ間の一致 ３／２７　　　２／２０　　４／２９ ９／２７　　　６／２０　　６／２９ １６／２７　　　１３／２０　２５／２９（５９χ）　
　　（６５χ）（８６χ）１０７単クローン性抗体が二
次的ＩＤＤＭとの一致率８６％の効率で抗−開−イディ
オタイプを検出したことを認めることができる。不正確
なネガティブはない（ＩＤＤＭ患者は抗−ＤＭ−イディ
オタイプではなかった）。ＩＤＤＭなしでポジティブで
あった４／２９の患者はまだ発病していない。それぞれ
ＤＭ−イディオタイプではない（示していない）抗−イ
ンシュリン単クローン性抗体１４または１５に対し抗−
イディオタイプ抗体を検出できなかった。抗〜ＤＭ−イ
ディオタイプ抗体（ＤＭポジティブイプ１０７単ツクロ
ーン性抗体用いて検出した）は、ＩＤＤＭの発現と非常
に関連がある。

タイプＩ　　　　　　の　アッセイ 固相ラジオイムノアッセイを、１８人の新たニ病気にか
かったタイプＩの糖尿病患者と１０人の健康な対照者か
ら得られた尿で行った。ラジオイムノアッセイミクロミ
クロタイタープレートを４０μｇ／ｍ！の蛋白質濃度で
試験尿を４℃で終夜、インキュへ一トシて、尿蛋白をコ
ーティングした。非特異的結合物を、室温で３０分間１
％のウシ血清アルブミンでインキュへ−Ｉ〜してブロッ
クした。穴を洗浄し、単りＩ：Ｉ−ン性抗体（４５％硫
酸アンモニウムでハイブリドーマ培養培地から沈澱した
精製１ｇＧおよびＨＰＬＣの濾過による精製物）を、４
０μｇ　／　ｍｅの濃度で３時間、室温で添加した。穴
を洗浄し、アッセイは室温で２時間、″５Ｉ−標識ヤギ
抗−マウスｒｇ、１１０５ｃｐ／ｍｌを用いて発現した
。この試験でインキュベートシた抗体はＤＴ３１２抗−
叶−イディオタイプ抗体であり、対照としてＮ１３、こ
れはラットニーリンパ球に対する単クローン性抗体であ
る。結果を穴に対して結合したｃｐｍとして表６に示し
た。

表６からラットニーリンパ球に対する対照単クローン性
抗体は、糖尿病および正常の尿に結合するバンクグラウ
ンドを示していることが認められる。しかし抗−聞−イ
ディオタイプ抗体（ＤＴ３１２）は１８の糖尿病原全部
に結合したが、１０の対照尿には結合しなかった。糖尿
病の尿への結合の平均ｃｐｍは３６．７７３ｃｐｍであ
り、対照尿への結合の３．０９１ｃｐｍのみに比較され
る。

唐」− タイプＩ真性糖尿病の尿アッセイ 上記アッセイは、尿成分を用いて同相をコーティングし
、次に種々の単クローン性抗体とインキュへ一トシて行
ったことに注目しなければならない。洗浄後、ラジオラ
ベルしたヤギ抗−マウス抗体は、マウス抗体を結合した
尿成分を同定する。

従って、抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体（ＤＴ３１２）
が叶−イディオタイプ抗体とインシュリン受容体自身の
フラグメントの両方に結合するので、さらに結合の優勢
が抗体によるものか、他の尿成分によるものかを試験し
た。

この試験では、試験される単クローン性抗体または対照
としてのインシュリンのいずれかが固相と結合し、すな
わちミクロタイタープレートを抗体でコーティングし、
固相を尿でインキュベートし、洗浄した。尿抗体のコー
ティングへの結合は、ラジオラベルした抗−ヒトＩＧで
第二のインキュベートを行って検出する。同じ患者から
の血清も試験し、血液中で循環するものと尿中に漏れる
ものとの間の相関関係を認めた。結果を表７に示す。

表１ 新たに診断されたＩＤＤＭ患者の尿と血清中に検出され
た抗体 Ｔ３１２ ＤＭ”　　−１ｄ ６／２１ ５／２１ 試験において、表７に示した結果では、ｐｕｓ中でウシ
インシュリンを５０μｇ　／　ｍｌ用い室温で１時間、
プレートをコーティングして、インシュリンをプレート
にコーティングした。単クローン性抗体ＩＤ７　、ＤＴ
３１２および１４を、ＰＢＳ中で精製１ｇＧ　（７０〜
８０％の全蛋白質が５Ｏ３−ＰＡＧＥによるＴｇＧであ
る）１００μｇ／　ｍｌ、を用い終夜、４℃でコーティ
ングして、プレートにコーティングした。コーテイング
後、プレートを１回、ＰＢＳで洗浄し、非特異的結合物
は１時間、室温でＰＢＳ中で１％のＢＳＡでブロックし
た。

次に、血清をＰＢＳ中で０．１％ＢＳＡで１＝５０に希
釈し、一つの穴に２５μｌを使用した。尿素を希釈して
いないプレートに添加した。プレートを２時間、３７℃
でインキュへ一トシ、３回洗浄し、１′■−抗ヒトＩｇ
を一つの穴に１００．　ＯＯＯｃｐｍを添加し終夜４℃
でインキュベートした。非特異的ラベルを４回洗浄し、
乾燥した穴をカソトシ、カウントした。

ラジオラベルした抗−ヒＨｇは、それら自身が抗体では
ない単クローン性抗体に結合したどのフラグメントにも
結合しないので、この試験は尿中の抗体の存在を測定す
るのみて、種々の単クローン性抗体が結合する他のフラ
グメントの存在を度外視する。

尿アッセイの結果と血清アッセイの結果は近く、完全で
はないが、相関関係にある。さらに、このアッセイのた
めに抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体を使用できるだけで
なく、ＤＭ−イディオタイプ抗体も使用できることが認
られる。

ｒと血清アッセイの　　　１ 更に血清と尿が相関する試験は、プレートを尿でコーテ
ィングして固相ラジオイムノアッセイを使用して行った
。その結果を表８に示す。

同相ラジオイムノアッセイで抗−聞−イディオタイプ単
クローン性抗体を使用する新たに診断したＩＤＤＭ患者
の尿と血清に検出された抗体と剥離インシュリン受容体
（またはフラグメント）１４　　　抗−ＤＭ　”　−ｉ
ｄ、　　ＩＤＤＭ　　　尿　　　０／２０血清　　Ｏ／
２０ 試験において、表８に示す結果は、ＲＩＡプレートを、
ひとつの穴に５０μｌの尿の割合で、終夜、４℃で６回
、ＰＢＳをかえて透析した希釈していない尿試料でコー
ティングした。プレートを１回、ＰＢＳで洗浄し、非特
異的結合は表７のようにブロックした。マウス抗−ＤＭ
−イディオタイプ抗体（ＩＤ７）　と叶−イディオタイ
プ抗体（ＤＴ３１２）を、一つの穴に２５ｕｌ、１００
　ｐｇ　／　ｍＲの割合で、３７℃で２時間、添加した
。アッセイの残りを１２５■−抗一マウスｒｇを用いる
表７に関して迷べたと同様に行った。血清をプレートに
コーティングするとき、希釈せず、透析しなかった。

抗−ｌ−イディオタイプ抗体（ＤＴ３１２）は血清中よ
りも尿中でポジティブであることが認められる。

これは、多分剥離インシュリン受容体の濃度が非常に低
く、血液では検出されないが、尿では濃縮しており従っ
て検出できたと思われる。さらに、ＤＭ−イディオタイ
プ抗体は抗−聞−イディオタイプ抗体のように敏感では
ないが、尿を試験するために有用であることは注目され
る。聞−イディオタイプ抗体は他のフラグメントよりも
抗体に結合するので、単クローン性抗体が固相に結合す
る試験は、−層敏感である。また、抗−聞−イディオタ
イプ抗体は、尿中の抗体とだけでばなく、インシュリン
受容体やそのフラグメンＩ・とも反応する。

従って、尿が固相に結合するアッセイは、これらの抗体
を使用すると一層敏感である。

当業者は、アッセイ血清および／または尿に対する機構
を案出し、両者の抗体（抗−叶−イディオタイプとＤＭ
〜イディオタイプ）の使用を組み合わせた結果を得るこ
とができる。勿論、互いに反応するように遊離形態で使
用することはできない。

しかし、両者ともビーズのように分離した同相に固定化
したのち、血清または尿とインキュベートするために一
緒にすることができる。このようにすると、さらに効果
があり、従って糖尿病または糖尿病前期の尿または血清
に対しポジティブの数を改善し、同時に健康な対照者で
はポジティブがないようにする。

のタイプＩ　　　尿　に対する尿アッセイ新たに診断し
たタイプ■の糖尿病患者に対して記載したものとおなし
アッセイ方法で、糖尿病患者の兄弟のようなタイプＩの
糖尿病の危険があると考えられる各人の尿に行うことが
できる。ＤＴ３１２抗体を用い試験がポジティブである
ものは、恐らく次の１〜６年内に、臨床的糖尿病を発現
することになろう。

上記血清アッセイ実験において、叶−イディオタイプ抗
体は患者の血液血清において抗−ＤＭ−イディオタイプ
抗体を診断するために使用しく逆もまた同じ）、これに
よって、抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体とＤＭ−イディ
オタイプ抗体のいずれかまたは両方の存在と、危険な状
態にある人のＩ　ＤＤＭの発現との間に一定の関連性が
あるという事実を確認した。この抗−聞−イディオタイ
プ抗体の存在とＩＤＤＭの将来の発現との間の関連は、
自然発生的に病気のＢＢラットと、低いストレプトシト
シンの投与によって誘発されたＣ５７ＢＬ／６／ＫＳＪ
マウスでの試験でさらに確かめられた。この関連に対す
る合理性は、抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体がインシュ
リンに対する受容体と反応する事実に関連している。従
って、これらの抗体はインシュリン受容体を持つヘータ
細胞に直接攻撃するか、または体細胞のインシュリン受
容体と相互に作用することによって直接ヘータ細胞の破
壊を増大させ、間接的にインシュリンに耐性にして、こ
れによってインシュリンの過剰生産に導く。従って、ヘ
ータ細胞不足のプロセスを補強する。

新たに診断したＩＤＤＭ患者の尿中の物質が、抗ＤＭ−
イディオタイプ抗体と結合し、他のものがＤＭイディオ
タイプ抗体と結合するという発見は、上記血液血清に関
する所見および得られた理論と一致する。二種の物質の
みが抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体によって確認されて
いる。叶−イデイオタイプ抗−インシュリン抗体および
インシュリン受容体またはそのフラグメントである。こ
れは検出に使用される抗体を操作上明確にするのに固有
のものである。血清中の聞−イディオタイプ抗体と抗−
聞−イディオタイプは、糖尿病の発現と関連があり、こ
れらが生産され血液内を循環する結果、尿に漏れ出るこ
とになる。

インシュリン受容体または他のインシュリン結合分子の
フラグメントは、このような分子が認められ、血液中を
循環する抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体によって攻撃さ
れるので、尿中に現れることが期待される。インシュリ
ン結合分子は分解し、フラグメントが尿に漏れ出る。こ
れらのフラグメントは、また本発明の抗−聞−イディオ
タイプ抗体試薬によって検出できる。

上記物質のいずれかまたは両方が、尿中に存在し、抗−
ＤＭ−イディオタイプ抗体でアッセイの結果がポジティ
ブになる場合、これは初期のＩＤＤＭをもつ患者の尿が
、本発明の血清アッセイで新たに診断したＩＤＤＭ患者
において結果がポジティブになる本実施例で示したもの
と同じ物質を有する理由を説明するものである。同じ患
者のおける血清と尿の相関関係は、表７と表８に示した
。

本発明の尿アッセイが初期糖尿病、すなわち、症状が現
れる前の検出に適用できることを、更に証明するために
、糖尿病前期ＮＯＤマウスを使用し試験を行った。マウ
スのＮ００株は、ヒトＩＤＤＭの広く入手できるモデル
である（ロソシニ・エイ・エイら、「インシュリン依存
性真性糖尿病の免疫」、Ａｎｎ、　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ
　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　４巻、　２８９〜３２０頁
（１９８５）　；力１−一力・ニスら、「非肥満体糖尿
病（ＮＯＤ）マウスの免疫機構Ｊ　、Ｄｉａｂｅｔｅｓ
、　３２巻２４７頁（１９８３）　　；　トンテシリ・
オウら、「非肥満体糖尿病（ＮＯＤ）マウスの循環リン
パ球個体群と自抗体：長朋的研究Ｊ　、Ｃ１ｙｎ、　１
Ｅｘｐ、　Ｔｍｍｕｎｏｌ、、　７０巻、８４〜９３頁
（１９８７））。

尿を公然の糖尿病の自然発性的開始前の約１ケ月ないし
２ケ月に、４匹の４月令のＮＯＤマウスから収集した。

尿を固相ミクロクイタープレートにコーティングし、表
７に関連して上に記載したものと同し方法でアッセイを
行った。相関関係のために、同じマウスからの血清を、
単クローン性抗体をプレートにコーティングするアッセ
イを用いて、ＤＭ−イディオタイプ抗体と抗−叶一イデ
ィオタイプ抗体に対してアッセイした。これら試験の両
方の結果を表９に示す。

これら両方の試験の結果、開−イディオタイプ抗体と抗
−叶−イディオタイプ抗体の両方を使用する尿と血清の
アッセイの両方で、二次的糖尿病に対し４匹の試験した
各マウスはポジティブであり、同時に尿の試験をした対
照はネガティブであることを示している。また、試験し
たＤＭ−−イディオタイプ抗体はネガティブである。こ
れら４匹のマウスは、後に公然のＩＤＤＭを発現したこ
とが観察された。この実験は、本発明の尿アッセイが、
本発明の血清アッセイと共に、公然の糖尿病の発生の前
に初期の糖尿病を検出するように操作できることを確立
した。

ここに示すように、血液と尿のいずれかまたは両方での
抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体の存在および／または叶
−イディオタイプ抗体の存在は、自然発注的病気のＢＢ
ラット、低い投与量のストレプトシトシンによって誘発
されたＣ５７Ｒ１、／６／ＫＳＪマウス、糖尿病前期Ｎ
ＯＤマウスおよびヒトの患者での自己免疫タイプＩの発
現と関連していた。これらの観察は、血液または尿での
抗−叶−イディオタイプおよび／またはＤＭ−イディオ
タイプ抗体の検出は、初期の糖尿病の危険にある人を診
断するために使用できる事実に基づく。これらの抗体が
何故、インシュリンのプロデューサー、パンクレアチン
小島のパーク細胞の自己免疫破壊にあるとする糖尿病と
関連しているか。この関連は抗−聞イディオタイプ抗体
がインシュリンに対し受容体と反応する事実に関係して
いる（シェヒター・ワイら（１９８４）、同上；エリア
ス・デイら（１９８４）、同上、コーエン・アイ・アー
ルら（１９８４）、同上）。

従って、これらの抗体は直接インシュリン受容体を有す
るベータ細胞に攻撃する。しかし、体細胞のインシュリ
ン受容体と相互に作用することによって直接ベータ細胞
の破壊となる。上述のように、抗−受容体、抗−イディ
オタイプ抗体は、インシュリン受容体の制御を引き下げ
感度を減することによって、インシュリンに対し末梢抵
抗を引き起こす。インシュリンに対する末梢抵抗により
インシュリンの分量を増加することが必要となる。この
インシュリン増加の要求は、初期の自己免疫攻撃からベ
ータ細胞が受ける損傷を悪化させる。従って、ベータ細
胞の直接の自己免疫攻撃は、他の因子によって引き起こ
されるかもしれないが、ヘク細胞因子と糖尿病の代償不
全に導く抗−［３Ｍ−イディオタイプ抗体によって誘発
された末梢抵抗と結合する。このように、抗−ＤＭ−イ
ディオタイプ抗体は、ベータ細胞の破損プロセスを強め
るので、糖尿病の発生と関係する。

抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体の役割は次の通りである
。

ベータ細胞に対する初期の損傷は、ビールス性感染また
は潜在性の毒性発作によって生しる。損傷はベータ細胞
に対し直接自己免疫プロセスの引金となる。インシュリ
ンに対する自抗体は、損傷したベータ細胞が免疫原性イ
ンシュリン結晶またはプロインシュリンを溢れさすとき
に発現する。

抗−インシュリン抗体の若干は、インシュリン受容体を
擬態する、すなわち、回−イディオタイプに対しポジテ
ィブである。ＤＭ”　−イディオタイプ抗体は、抗−叶
−イディオタイプ抗体の生産を促す。後者は、インシュ
リン受容体を認め、これらと結合して、その制御を引き
下げ感度を減する。

これば、末梢インシュリン抵抗とインシュリン選択の引
き上げの要求となる。ベータ細胞は、大量のインシュリ
ンを生産することを強要されるとオーバーワークになり
、自己免疫破壊を一層受けやすくなる。従って、抗−受
容体（抗−１）Ｍ−イディオタイプ抗体）の存在は臨床
的糖尿病の切迫している攻撃を先ふれとなる。叶−イデ
ィオタイプ抗体は基本的には抗−ＤＭ−イディオタイプ
抗体の体生産の前駆体であり、この種の聞−イディオタ
イプ抗体の存在も期待される。

本実施例で使用した特異的イムノアッセイ技術はラジオ
イムノアッセイである。、しかし、当業者が、叶−イデ
ィオタイプ抗体を用いるアッセイによって測定された人
の血清中に抗−叶−イディオタイプ抗体の存在が、初期
、すなわち、ＩＤＤＭの存在を示すポジティブであると
いう事実に気付いたとき、使用できるイムノアッセイ技
術の複数のタイプに気付くであろう。ラジオイムノアッ
セイ（１’１ｌＡ）　、同相あるいは液相の他に、従来
のイムノアッセイ技術を使用でき、例えば、エンサイム
リンクドイムノソルベントアソセイ（ＥＬＩＳＡ）　、
エンザイムおよびラジオアイソトープとはべつの標識を
使用するヘテロジニアスイムノアソセイ　（両者は拮抗
的および非拮抗的）、蛍光消化およびエンザイムチャン
ネリングに基づくホモジニアスイムノアソセイ、免疫沈
降（放射免疫拡散を含む）および視覚半定量的検出また
は定量的比濁検出に基づく凝集アッセイである。アッセ
イは、従来の固相またはサンドイッチアッセイ技術をい
ずれも使用できる。血液または尿の中の囲−イディオタ
イプ抗体を使用する抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体の存
在に対しアッセイするために、または抗−聞イディオタ
イプ抗体を使用する叶−イディオタイプの存在をアッセ
イするために使用される特定の技１ホテは、それ自体は
本発明の一部ではないので、さらに詳細には記述しない
。

同様に、本発明を達成するために使用される種々のアッ
セイのいずれかを行うためにキットを用意することがで
きる。この種のキットは、単一アッセイまたは一定数の
アッセイを行うために必要な材料を全て含む。例えば、
このようなキットは、固相固定化非ヒ）ＤＭ−イディオ
タイプまたは抗ＤＭ−イディオタイプ抗体および、標識
抗−ヒ）Ｆａｂのような、アッセイの過程で固定化抗体
に結合するいずれかの抗体の非可変領域を認識すること
ができる標識抗−ヒト抗体を含むことができる。

あるいは、この種のキットは、血清または尿を固定する
のに適した固相、ガラス瓶またはアッセイで使用される
液相非ヒトＤＭ−イディオタイプまたは抗−ＤＭ−イデ
ィオタイプ抗体を用いた他の容器、および非ヒト抗体が
増える動物で増えた全抗体と結合する標識１ｇを含むこ
とができる。キ・７トは、またＤＭ−イディオタイプ抗
体と抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体の免疫複合物が形成
できる試薬を含むことができ、キットを使用するための
使用法、およびキットの材料を支持するだめのコンテナ
を含む。従来のタグまたはラベルを使用でき、例えば放
射性同位体、酵素、発色団または蛍光団がある。

代表的放射性同位体はヨウ素−１２５またはイオウ３５
である。代表的な酵素は、このためにセイヨウワサビパ
ーオキシダーゼ、α−ガラクトシダーゼおよびアルカリ
性ホスファターゼを含む。

（発明の効果） 以上、本発明によれば、初期の真性糖尿病をヒトにおい
て検出するための新規のアッセイを提供することができ
、さらに本発明は、多クローン性または、好ましくは単
クローン性の抗体薬剤、ヒトにおけるベータ細胞の破壊
プロセスの診断を可能にし、インシュリン依存性真性糖
尿病（ＩＤＤＭ）の初期の突然の出現を予知できるこの
種の抗体薬剤に基づいた血清と尿素アッセイを提供する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ホルモン（第１Ａ図）、その受容体（第１Ｂ
図）、イディオタイプ抗体（第１ｃ図）および抗−イデ
ィオタイプ抗体（第１Ｄ図）間の関係を示す概略図。 第２図は、ラットの日令による複数グループのラットの
血清中に見出される抗−ｌ−イディオタイプ抗体の分量
を示すグラフであり、血清中に存在する抗−ｌ−イディ
オタイプ抗体の分量はＤＭイディオタイプ抗体への結合
によって測定した。 第３図は、ラットの日令による複数グループのラットの
血清中に見出されるＤＭ−イディオタイプ抗体の分量を
示すグラフであり、血清中に存在する囲−イディオタイ
プ抗体の分量は抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体への結合
によって測定した。 第４図は、ラットの日令による複数グループのラットの
血清中に見出されるインシュリン抗体の分量を示すグラ
フであり、血清中に存在するインシュリン抗体の分量は
インシュリンへの結合によって測定した。 特許出願人　イエダ・リザーチ・アンド・デベロプメン
ト・カンパニー・リミテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、インシュリンの受容体部位に結合できるＤＭ−イデ
   ィオタイプ抗体に結合する物質、または抗−ＤＭ−イデ
   ィオタイプ抗体に結合する物質であって、初期のまたは
   現存するインシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）を
   表示するように存在する物質に対して、患者の血清また
   は尿をアッセイしてなる、ヒトがＩＤＤＭまたは発現す
   るＩＤＤＭに対する傾向を有するかどうかを測定するた
   めのアッセイ方法。 ２、ＤＭ−イディオタイプ抗体によって患者の血清中の
   抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体の有無を試験してなり、
   抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体の存在が初期のまたは現
   存するＩＤＤＭを表示する請求項１記載のアッセイ方法
   。 ３、ＤＨ−イディオタイプ抗体に結合する物質、または
   抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体に結合する物質に対して
   、患者の血清をアッセイしてなり、このような物質の存
   在が初期のまたは現存するＩＤＤＭを表示する請求項１
   記載のアッセイ方法。 ４、ＤＭ−イディオタイプ抗体に結合する物質、または
   抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体に結合する物質に対して
   、患者の尿をアッセイしてなり、このような物質の存在
   が初期のまたは現存するＩＤＤＭを表示する請求項１記
   載のアッセイ方法。 ５、抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体に結合する物質に対
   して、患者の血清をアッセイしてなり、このような物質
   の存在が初期のまたは現存するＩＤＤＭを表示する請求
   項１記載のアッセイ方法。 ６、ＤＭ−イディオタイプ抗体に結合する物質に対して
   、患者の尿をアッセイしてなり、このような物質の存在
   が初期のまたは現存するＩＤＤＭを表示する請求項１記
   載のアッセイ方法。 ７、抗−ＤＨ−イディオタイプ抗体に結合する物質に対
   して、患者の尿をアッセイしてなり、このような物質の
   存在が初期のまたは現存するＩＤＤＭを表示する請求項
   １記載のアッセイ方法。 ８、患者の血清または尿およびＤＭ−イディオタイプ抗
   体または抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体を接触させ、前
   記抗体と前記血清または尿中の物質との免疫共役の程度
   を測定してなる請求項１記載のアッセイ方法。 ９、ＤＭ−イディオタイプまたは抗−ＤＭ−イディオタ
   イプ抗体が単クローン性抗体である請求項８記載のアッ
   セイ方法。 １０、ＤＭ−イディオタイプまたは抗−ＤＭ−イディオ
   タイプ抗体、前記ＤＭ−イディオタイプまたは抗−ＤＭ
   −イディオタイプ抗体の変化しにくい領域を認めること
   ができる標識抗体、前記抗体の免疫錯化を行うことがで
   きる試薬、およびキットの材料を保持するコンテナから
   なる請求項１記載のアッセイを行うためのキット。 １１、検出されるべき物質が抗体であり、ＤＭ−イディ
   オタイプまたは抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体、検出さ
   れるべき抗体の変化しにくい領域を認めることができる
   標識抗体、前記抗体の免疫錯化を行うことができる試薬
   、およびキットの材料を保持するコンテナからなる請求
   項１記載のアッセイを行うためのキット。 １２、インシュリンの受容体部位に結合できる単クロー
   ン性ＤＭ−イディオタイプポジティブ抗−インシュリン
   抗体。 １３、鼠起源の請求項１２記載の単クローン性抗体。 １４、インシュリンの受容体部位に結合するＤＭ−イデ
   ィオタイプポジティブ抗−インシュリン抗体の部位に結
   合出来る単クローン性抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体。 １５、鼠起源の請求項１４記載の単クローン性抗体。 １６、液体試料を、インシュリンの受容体部位に結合で
   きる単クローン性ＤＭ−イディオタイプポジティブ抗−
   インシュリン抗体と接触させ、結合の程度を測定してな
   り、前記結合が抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体の存在の
   表示である、前記液体試料に存在することが推測される
   抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体を検出する方法。 １７、液体試料を、単クローン性抗−ＤＭ−イディオタ
   イプ抗体と接触させて、結合の程度を測定してなり、前
   記結合が抗−ＤＭ−イディオタイプ抗体の存在の表示で
   ある、前記液体試料に存在することが推測されるＤＭ−
   イディオタイプ抗体を検出する方法。