JPH026761B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は多糖類及びその製造法に関するもので
あり、更に詳しくは担子菌類であるフクロタケ由
来の多糖類及びフクロタケからこの多糖類を抽出
採取するその製造法に関するものである。 〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題
点〕 自己を復製し修復しうる生体はその機能維持の
ためアミノ酸、脂質などの多種類の低分子物質と
ともに蛋白質、核酸、多糖類などの高分子物質か
ら成り立つている。 従つて多糖類は天然に広く存在する。そして食
品、医薬品等として広く用いられている。これら
の多糖類のうち、担子菌類由来の多糖類が近年抗
コレステロール薬、免疫賦活剤などとして注目さ
れている。 この様な多糖類としてはシイタケよりのレンチ
ナン及びスエヒロタケよりのシゾフイランが特に
よく知られている。 これらはいずれもβ―１，３―グルカンを主鎖
とし、α―１，６―結合でグルコースが分岐して
いると云われている。 担子菌，ブクリヨウよりのパキマン，スクレロ
チウム属の微生物よりのスクレログルカン等も同
様の構造を持つと云われている。またペスタロチ
ア属に属する微生物の産生する多糖はβ―１，３
―グルカンの主鎖にβ―１，６―結合でＤ―グル
コピラノシル基及びＤ―グルコピラノシル―Ｄ―
グルコピラノシル基の側鎖の付いた構造であると
されているが、その側鎖の数は極めて多く、主鎖
100個当り約55ないし約75個であるとされている
（特開昭56―34702号公報）。 フクロタケ属に属する担子菌、キヌオオフクロ
タケ、及びシロフクロタケからは水、低級アルコ
ール、低級ケトン又はエートル等の溶媒による抽
出で抗腫瘍性の多糖が得られることが知られてい
る（特開昭57―38723号公報）。しかしその構造、
物性等は全く知られていない。 またフクロタケの菌糸体を希アルカリ溶液で抽
出することにより、サンタニン２と呼ばれる血圧
降下性物質を調製することが知られている（特開
昭57―47483号公報）。しかしこの物質は多糖のみ
から成る物質ではない。 〔問題点を解決する手段〕 本発明は本質的に式 〔→３）β−Ｄ−Glu（１〕→…… （） で表わされる第１のくり返し単位、式 で表わされる第２のくり返し単位及び式 で表わされる第３のくり返し単位（各式中Gluは
グルコピラノシル基を、数字は結合位置を表わ
す）からなり、第１（式（））、第２（式（））
及び式３（））のくり返し単位の個数の和100当
り、平均で第３（式（））のくり返し単位の個数
が約４ないし約12個で、第２（式（））及び第３
（式（））のくり返し単位の個数の和が同じく約
16ないし約33個である多糖類を提供するものであ
る。 〔作 用〕 本発明の多糖類の物理的、科学的性質は以下の
通りである。 (1) 溶解性 アルカリ水溶液及びジメチルスルホキシドに
可溶で、メタノール、エタノール、ｎ―ブタノ
ール、アセトン、ベンゼン、トルエン、酢酸エ
チル、プロピレングルコール、ピリジン等に実
質的に不溶である。乾燥した本発明の多糖類は
水に難溶性であるが、超音波処理などの操作を
加えることにより、水に可溶化できる。また塩
類水溶液にはわずかに溶ける。低濃度でアルカ
リ水溶液に溶解したのち中和すると溶解したま
まで残る。 (2) 旋光度 本発明の多糖類の0.5規定水酸化ナトリウム
水溶液（0.5％）中での比旋光度は 〔α〕^D ₂₅：約−12゜ である。 (3) 元素分析値 注意深く充分に乾燥するとCnH₂nOnから計
算される値に近い値を与えるが、通常少量の水
分を含有し、 Ｃ：43〜45％ Ｈ：5.6〜6.4％ Ｎ：定量限界以下 程度の値を与える。ハロゲン及び硫黄は検出さ
れない。 (4) 赤外線吸収分析 KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルを
第１図に示す。896cm^-1における吸収はＤ―グ
ルコース残基のβ―結合に特有なものである。 (5) C¹³−NMR分析 δ値：103.6，86.8，76.9，75.2，74.2，
（ppm）73.3，70.7，69.0及び61.4にピークを示
す。 (6) 発色反応 アンスロン反応 ：陽性 ニンヒドリン反応 ：陰性 デイシユのカルバゾール反応 ：陰性 (7) 分子量 濃度0.1モル／、PH8.6のトリス塩酸塩緩衝
液を移動相とするゲル過高速液体クロマトグ
ラフイにおいて分子量約30万ないし約280万を
中心に溶出する。 (8) 塩化セチルピリジニウムとの反応 水溶液中塩化セチルピリジニウムと沈澱を生
成しない。 (9) 構成糖類 本発明の多糖類を１規定硫酸水溶液中、100
℃で加水分解した後、ペーパークロマトグラフ
イにより、及びアルジトールアセテートに誘導
後、ガスクロマトグラフイにより同定するとグ
ルコースのみが検出される。 (10) 結合構式 メチル化分析により、モル比で ２，３，４，６―テトラ―Ｏ―メチルグルコ
ース １ ２，４，６―トリ―Ｏ―メチルグルコース 約2.7ないし約5.0 ２，３，４―トリ―Ｏ―メチルグルコース 約0.10ないし約0.35 及び ２，４―ジ―Ｏ―メチルグルコース 約0.7ないし約1.3 を与える。 エキソ型のβ―１，３―グルカナーゼを用いて
酵素分解すると、グルコースとゲンチオビオーズ
を生成する。 またメタ過ヨウ素ナトリウムで充分に酸化し、
水素化ホウ素ナトリウムで還元後、緩和な条件、
例えば0.1ないし0.2規定硫酸で、80ないし100℃、
１〜２時間程度加水分解すると側鎖に相当するグ
ルコース基の除去された直鎖状β―１，３―グル
カンが得られる。このものはメチル化分析で２，
４，６―トリ―Ｏ―メチルグルコースと痕跡量の
２，３，４，６―テトラ―Ｏ―メチルグルコース
を与える。この直鎖状β―１，３―グルカンをエ
キソ型β―１，３―グルカナーゼで酵素分解する
とグルコースのみが生成する。 従つて本発明の多糖類の主鎖は実質上β―１，
３―結合のグルコース残基のみから成る。 このことから本発明の多糖類は連続したβ―
１，３―グルコシド結合の主鎖よりなり、概略β
―１，３―結合のグルコース残基３〜６個の１個
の割合で、その６位にβ―結合で主として単独の
グルコース残基よりなる側鎖を有するが、側鎖約
３個のうち１個はβ―１，６―結合した２個のグ
ルコース残基からなるものと認められる。それ
故、本発明の多糖類の基本構造は前述の一般式の
くり返し単位からなるということができる。 これらのことから本発明の多糖は公知のスクレ
ログルカン、シゾフイラン及びキクラゲ子実体か
ら得られる分枝型β―１，３―グルカンよりも枝
分れの頻度が少なくかつ分枝中にわずかのβ―
１，６―結合で２ケ以上連続したグルコース残基
からなる分枝をもつ多糖類である。 またペスタロチア属の微生物の産生する多糖類
と比べると枝分れの頻度が著しく小さい。 本発明の多糖類は水で抽出されないから特開昭
57―38723号公報で開示された多糖とは別の物質
である。同様に本発明の多糖類は前述したサンタ
ニン２とは後者が多量の窒素を含み、ニンビトリ
ン反応陽性（従つてこのものは糖蛋白質であると
推定される）であることから明らかに別異の物質
である。 本発明の多糖類は免疫賦活作用及び抗腫瘍作用
を有し、抗ウイルス作用なども期待できる。 本発明の多糖類はフクロタケ属に属する担子
菌、特にフクロタケ（Volvariella volcacea）を
アルカリ水溶液で抽出することにより容易に調製
することができる。すなわち本発明はまたフクロ
タケをアルカリ水溶液で抽出して、本発明の多糖
類を製造する方法を提供するものである。 本発明の方法で原料として用いるフクロタケは
その子実体及び菌糸体のいずれであつてもよい。
そしてこれらは生の状態であつても乾燥品であつ
てもよい。抽出にあたり原料をあらかじめ細断す
ること抽出効率をあげるために有効である。 抽出に用いるアルカリ水溶液としては、例えば
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ
金属水酸化物を用いることができる。特に水酸化
ナトリウム水溶液が便利である。 用いるアルカリの濃度は特に限定的ではない
が、約0.1規定ないし約３規定の範囲内で用いる
のが好ましい。 抽出に用いるアルカリ水溶液の量は通常１回の
抽出あたり、原料乾燥重量の約５ないし約100倍
量程度である。この量は少なすぎれば抽出効率が
悪く、多すぎれば後処理が面倒である。 この抽出工程においては多糖の分解又は過酸化
等の変性を防ぐため、窒素等の不活性ガスの雰囲
気下で抽出を行うことが好ましい。またさらに水
素化ホウ素ナトリウム等の還元剤の存在下で行つ
てもよい。 抽出温度には格別の限定はないが、約30℃以下
が望ましい。さらに高温、例えば通常の熱アルカ
リ抽出の温度条件である60ないし80℃程度で抽出
すると、さらに多くの分岐を有する多糖類が抽出
されるからである。抽出操作はくり返し行つても
よい。 本発明に用いるフクロタケも自己の生命を維持
するための多くの成分をその菌体内に含んでい
る。従つてアルカリ水溶液でそのまま抽出すれば
種々の夾雑物が目的の多糖類中に含まれてしま
う。この抽出液から目的の多糖類を精製すること
は可能であるが煩雑な工程を必要とする。本発明
の多糖類は水、アルコール等の溶媒では抽出され
ないので、アルカリ水溶液で抽出する工程に先だ
ち、水、熱水、緩衝水溶液、アルコール又はこれ
らを組合せた溶媒により、これらの夾雑物を除去
しておくことが好ましい。なおこの様な操作によ
りアルカリ水溶液抽出の際夾雑物となる蛋白質、
マンガノラクトン、グリコーゲン様多糖等をあら
かじめ除去することができる。 本発明の方法に従つて抽出を行つたアルカリ水
溶液は塩酸、酢酸等の酸で中和する。通常この状
態では目的の多糖は塩溶液中に溶解している。多
少の沈澱を生ずる場合もある。所望によりこの中
和液に塩化セチルピリジニウムなどの第４級アン
モニウム塩を加えて夾雑する加能性のある物質を
不溶性沈澱として析出させる操作を行つてもよ
い。この沈澱は過、遠心分離等の通常の分離手
段により除去する。こうして得た中和液をそのま
ま又は濃縮後水で透析し、透析液を乾燥すること
により目的の多糖類を得ることができる。中和液
をそのまま又は濃縮した後、これにアルコール、
アセトンなどの沈澱剤を加え、得られた沈澱を所
望により水に対して透析し、乾燥して目的の多糖
類を固体として得てもよい。その際の乾燥方法と
しては、減圧乾燥、凍結乾燥、墳霧乾燥等の適当
な乾燥手段を用いることができる。 〔実施例〕 以下本発明を実施例により更に詳細に説明す
る。 実施例 １ 風乾したフクロタケ子実体100ｇを0.9％の食塩
を含むPH7.0の0.1Mリン酸塩緩衝液１に一夜浸
した後、ミキサーおよびホモジナイザーで破砕し
た。さらにこれに同じリン酸塩緩衝液２を加え
て４時間かくはんし遠心分離した。得られた固形
分を同じリン酸塩緩衝液３に入れホモジナイザ
ーで分散させた後、４時間かくはん、遠心分離し
沈澱を得た。この沈澱を３の水に分散させ、オ
ートクレープ中、120℃で30分間加熱した。冷却
後遠心分離して沈澱を得た。この熱水抽出処理を
さらに４回くり返し、水溶性画分をほぼ完全に抽
出除去した。 こうして得られた水不溶性画分を、水素化ホウ
素ナトリウム５ｇを溶解させた１規定水酸化ナト
リウム水溶液３に分散させた。窒素気流下に25
℃で４時間かくはんした後遠心分離した。この沈
澱に対して１規定水酸化ナトリウム水溶液による
抽出操作をくり返した。両水酸化ナトリウム抽出
液を合併し、これを濃塩酸で中和し、PH6.5に調
整した。 こうして得た抽出液に塩化セチルピリジニウム
水溶液（10％）をかくはん下に、その添加によつ
てあらたに沈澱が生じなくなるまで滴下し、つい
で10.000Gで30分間遠心分離を行い、生じた沈澱
を除去した。この上清に等容のメタノールを加え
てかくはんし、多糖類を沈澱させた。この沈澱を
１のメタノーで洗浄した後、蒸溜水500mlに加
えホモミキサーで分散後流水中に５日間透析し
た。 透析内液を凍結乾燥し、目的物13.0ｇを得た。 元素分析値 Ｃ：44.03％ Ｈ：6.05％ Ｎ：定量限界以下 比旋光度 〔α〕²⁵ _D：−12゜（濃度0.5〜、0.5規定水酸化ナト
リウム溶液中） 赤外吸収スペクトル 第１図にKBr錠剤法による、フーリエ変換赤
外吸収スペクトルを示す。 分子量 0.1M、PH8.6のトリス塩酸塩緩衝液を移動相と
して、東洋曹達工業(株)製G5000PWカラムを用い
たゲル過高速液体クロマトグラフイで分子量約
68万のリテンシヨンタイムの位置に溶出した。 C¹³―NMR分析、発色反応及び塩化セチルピ
リジニウムとの反応 前述した物理的、化学的性質と同じであつた。 構成糖及び結合様式 得られた多糖をメチル化し、さらに加水分解し
た。得られたメチル化糖をアルジトールアセテー
トに誘導した。これをガスクロマトグラフイで分
析した。得られたメチル化糖のモル比は ２，３，４，６―テトラ―Ｏ―メチルグルコース
１ ２，４，６―トリ―Ｏ―メチルグルコース 3.76 ２，３，４―トリ―Ｏ―メチルグルコース 0.33 ２，４―ジ―Ｏ―メチルグルコース 1.01 別にこの多糖をエキソ型β―１，３―グルカナ
ーゼで酵素分解した。グルコースとゲンチオビオ
ースが得られた。そのモル比は前者１モルに対し
て後者0.177モルであつた。 さらにまたこの多糖をメタ過ヨウ素酸ナトリウ
ムで充分に酸化し、水素化ホウ素ナトリウムで還
元した。これを更に0.1期定の硫酸中、100℃で２
時間加水分解したところ、側鎖に相当するグルコ
ース基の除去された直鎖状のグルカンの沈澱が得
られた。この沈澱を同様にしてメチル化分析を行
つたところ２，４，６―トリ―Ｏ―メチルグルコ
ースと痕跡量の２，３，４，６―テトラ―Ｏ―メ
チルグルコースを与えた。 またこの沈澱をエキソ型β―１，３―グルカナ
ーゼで酵素分解したところグルコースのみが生成
した。 従つて得られた多糖は前述した式（），（）
及び（）のくり返し単位からなりその個数の比
がこれらのくり返し単位の合計の個数100個当り、
式（）のくり返し単位７個、式（）のくり返
し単位と式（）のくり返しし単位との個数の和
は21個であつた。 実施例 ２ アルカリ水溶液抽出の前の工程を実施例１と同
様にして行つた後、抽出温度を20℃に変えた以外
は実施例１と同様にしてアルカリ水溶液抽出を行
つた。得られた抽出液を塩酸でPH6.5に調整した
後、実施例１と同様にして塩化セチルピリジニウ
ム水溶液（10％）を加え生ずる沈澱を遠心分離に
より除去した。上清を２日間流水中に透析した
後、透析内液を３にまで40℃で減圧下に濃縮し
た。これに等容のメタノールを加え生じた沈澱を
10000Gで30分間遠心分離した。この沈澱を300ml
のメタノールに加え約１時間かくはん遠心分離し
沈澱を得た。このメタノールによる洗浄をさらに
２度くり返したのち、沈澱を減圧乾燥し目的物
10.5ｇを得た。 こうして得た多糖について実施例１と同様にし
て分析を行なつた。 元素分析値 Ｃ：44.31％ Ｈ：6.10％ Ｎ：定量限界以下 分子量 分子量約55万の位置に溶出した。 メチル比糖のモル比 ２，３，４，６―テトラ―Ｏ―メチルグルコー
ス １ 2.4，６―トリ―Ｏ―メチルグルコース 4.26 ２，３，４―トリ―Ｏ―メチルグルコース 0.32 ２，４―ジ―Ｏ―メチルグルコース 1.01 エキソ型β―１，３―グルカナーゼ消化で得ら
れたグルコースとゲンチオビオースとのモル比 １：0.160 くり返し単位の割合 合計個数100個当り式（）のくり返し単位６
個で、式（）のくり返し単位と式（）のくり
返し単位の個数の和は19個であつた。 その他の結果は実施例１の場合と実質的に同一
であつた。 〔発明の効果〕 本発明の多糖類の抗腫瘍剤としての使用例 ICRマウス群で、本発明の多糖類のザルコーマ
180個型腫瘍に対する効果を試験した。 ICRマウス１匹につきザルコーマ180腹水癌細
胞５×16⁶個をそけい部皮下に接種した。実験群
は６匹あてとした。癌細胞移植後、翌日より10日
間、１日１回薬剤を腹腔内に0.1mlずつ投与した。
試験群には本発明の多糖類（実施例１で得たも
の）を第１表に示した投与量になる様、生理食塩
水に溶解して用い、対照群には生理食塩水のみを
投与した。腫瘍移植後35日目に癌を摘出してその
重量を測定した。各群の腫瘍抑制率は次式により
算出した。 抑制率(%)＝（１−試験群の平均腫瘍重量／対象群の平
均腫瘍重量） ×100 結果を第１表に示す。 【表】

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の多糖類の赤外吸収スペクトル
を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 本質的に式 〔→３）β−Ｄ−Glu（１〕→ で表わされる第１のくり返し単位、式 で表わされる第２のくり返し単位及び式 で表わされる第３のくり返し単位（各式中、Glu
   はグルコピラノシル基を、また数字は結合位置を
   表わす）からなり、第１、第２及び第３の各くり
   返し単位の和100個当り、平均で第３のくり返し
   単位の個数が約４ないし約12個で、第２のくり返
   し単位と第３のくり返し単位の個数の和が同じく
   約16ないし約33個である多糖類。 ２ フクロタケ由来の多糖類である特許請求の範
   囲第１項記載の多糖類。 ３ 濃度0.1モル／、PH8.6のトリス塩酸塩緩衝
   液を移動相とするゲル過高速液体クロマトグラ
   フイにおいて分子量約30万ないし約280万円与え
   る特許請求の範囲第１項または第２項記載の多糖
   類。 ４ メチル化分析により、２，３，４，６―テト
   ラ―Ｏ―メチルグルコース、２，４，６―トリ―
   Ｏ―メチルグルコース、２，３，４―トリ―Ｏ―
   メチルグルコース及び２，４―ジ―Ｏ―メチルグ
   ルコースを、３，３，４，６―テトラ―Ｏ―メチ
   ルグルコースを１としたときモル比で２，４，６
   ―トリ―Ｏ―メチルグルコース約2.7ないし約
   5.0、２，３，４―トリ―Ｏ―メチルグルコース
   約0.1ないし約0.35及び２，４―ジ―Ｏ―メチル
   グルコース約0.7ないし約1.3の割合で与える特許
   請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかの項記
   載の多糖類。 ５ アルカリ水溶液及びジメチルスルホキシドに
   可溶で、メタノール、エタノール、ｎ―ブタノー
   ル、アセトン、プロピレングリコール、ベンゼ
   ン、トルエン、ピリジン及び酢酸エチルに実質的
   に不溶である特許請求の範囲第１項ないし第４項
   記載の多糖類。 ６ フクロタケをアルカリ水溶液で抽出して得た
   ものである特許請求の範囲第１項ないし第５項の
   いずれか１項記載の多糖類。 ７ フタロタケをアルカリ水溶液で抽出して、本
   質的に式 〔→３）β−Ｄ−Glu（１〕→ で表わされる第１のくり返し単位、式 で表わされる第２のくり返し単位及び式 で表わされる第３のくり返し単位（各式中、Glu
   はグルコピラノシル基を、数字は結合位置を表わ
   す）からなり、第１、第２及び第３の各くり返し
   単位の個数の和100個当り、平均で第３のくり返
   し単位の個数が約４ないし約12個で、第２及び第
   ３のくり返し単位の個数の和が同じく約16ないし
   約33個である多糖類を採取することを特徴とする
   多糖類の製造法。 ８ 多糖類が濃度0.1モル／、PH8.6のトリス塩
   酸緩衝液を移動相とするゲル過高速液体クロマ
   トグラフイにおいて分子量約30万ないし約280万
   を与えるものである特許請求の範囲第７項記載の
   製造方法。 ９ 多糖類がそのメチル化分析により、２，３，
   ４，６―テトラ―Ｏ―メチルグルコース、２，
   ４，６―トリ―Ｏ―メチルグルコース、２，３，
   ４―トリ―Ｏ―メチルグルコース及び２，４―ジ
   ―Ｏ―メチルグルコースを、２，３，４，６―テ
   トラ―Ｏ―メチルグルコースを１としたときモル
   比で２，４，６―トリ―Ｏ―メチルグルコース約
   2.7ないし約5.0、２，３，４―トリ―Ｏ―メチル
   グルコース約0.1ないし約0.35及び２，４―ジ―
   Ｏ―メチルグルコース約0.7ないし約1.3の割合で
   与えるものである特許請求の範囲第７項または第
   ８項記載の製造法。 １０ 多糖類がアルカリ水溶液及びジメチルスル
   ホキシドに可溶で、メタノール、ｎ―ブタノー
   ル、アセトン、プロピレングリコール、ベンゼ
   ン、トルエン及び酢酸エチルに実質的に不溶なも
   のである特許請求の範囲第７項ないし第９項のい
   ずれか１項記載の製造法。 １１ アルカリ水溶液がアルカリ金属水酸化物の
   水溶液である特許請求の範囲第７項ないし第１０
   項のいずれか１項記載の製造法。 １２ アルカリ水溶液の濃度が約0.1規定ないし
   約５規定である特許請求の範囲第７項ないし第１
   １項のいずれか１項記載の製造法。 １３ 抽出を還元剤の存在下で行なう特許請求の
   範囲第７項ないし第１２項のいずれか１項記載の
   製造法。 １４ 抽出を温度約30℃以下で行なう特許請求の
   範囲第７項ないし第１３項のいずれか１項記載の
   製造法。