JPH0269663A - 免疫分析方法 - Google Patents
免疫分析方法Info
- Publication number
- JPH0269663A JPH0269663A JP22050788A JP22050788A JPH0269663A JP H0269663 A JPH0269663 A JP H0269663A JP 22050788 A JP22050788 A JP 22050788A JP 22050788 A JP22050788 A JP 22050788A JP H0269663 A JPH0269663 A JP H0269663A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- measured
- sample
- calibration curve
- concn
- substance
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- Pending
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- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［発明の目的］
（産業上の利用分野）
本発明は、サンプル中に含まれる特定の抗原又は抗体又
は補体価を定量分析する免疫分析方法に関り゛る。
は補体価を定量分析する免疫分析方法に関り゛る。
（従来の技術）
近年医療分野においては病気の診断を行うに際し、血清
等の生体サンプル中に存在する抗原又は抗体を高度の信
頼性をもって簡易、迅速に定量分析することが極めて重
要な課題になってきている。このような定量分析を行う
方法としては、例えばラジオイムノアッセイ（以下ＲＩ
Ａと称する）が知られている。しかしこのＲＩＡでは放
射性元素を用いるため、専用の機器を設置すると共に資
格を有するオペレータが操作を行わなければならず、し
かも廃棄物の処理等にも注意を要覆るという問題がある
。他の方法として、例えばエンザイムノアッセイ（以下
ＥＩＡと称する）が知られている。しかしＥＩＡは感度
的には優れているものの、測定に長時間を要する上に手
間も煩雑でざらに測定のダイナミックレンジも狭いとい
う問題を有する。
等の生体サンプル中に存在する抗原又は抗体を高度の信
頼性をもって簡易、迅速に定量分析することが極めて重
要な課題になってきている。このような定量分析を行う
方法としては、例えばラジオイムノアッセイ（以下ＲＩ
Ａと称する）が知られている。しかしこのＲＩＡでは放
射性元素を用いるため、専用の機器を設置すると共に資
格を有するオペレータが操作を行わなければならず、し
かも廃棄物の処理等にも注意を要覆るという問題がある
。他の方法として、例えばエンザイムノアッセイ（以下
ＥＩＡと称する）が知られている。しかしＥＩＡは感度
的には優れているものの、測定に長時間を要する上に手
間も煩雑でざらに測定のダイナミックレンジも狭いとい
う問題を有する。
そこで、本出願人等は先に特開昭６０−１１７１５９号
において、内部に親水性の標識物質（例えば蛍光物質）
を封入したリポソーム試薬等のマイクロカプセルを用い
た方法を開示した。この方法はマイクロカプセルイムノ
アッセイ（ＭＣＩＡ）と称され、以下のように行われる
。すなわち、定量分析すべき抗原又は抗体（以下被測定
物質と称する）が含まれるサンプル中に前記リポソーム
と共に補体を加えて混合すると、抗原−抗体反応及びそ
れに伴う補体の作用によってリポソームが破壊され、封
入されていた標識物質が流出する。この流出した標識物
質の徂と、サンプル中の被測定物質の量との間には相関
関係がおるので、流出した標識物質例えば蛍光物質を蛍
光分析等の所定の分析方法によって定量することにより
、被測定物質を定量しようとするものである。このＭＣ
ＩＡではサンプルにリポソームを混合した後、一定時間
経過してから測定が行われる。
において、内部に親水性の標識物質（例えば蛍光物質）
を封入したリポソーム試薬等のマイクロカプセルを用い
た方法を開示した。この方法はマイクロカプセルイムノ
アッセイ（ＭＣＩＡ）と称され、以下のように行われる
。すなわち、定量分析すべき抗原又は抗体（以下被測定
物質と称する）が含まれるサンプル中に前記リポソーム
と共に補体を加えて混合すると、抗原−抗体反応及びそ
れに伴う補体の作用によってリポソームが破壊され、封
入されていた標識物質が流出する。この流出した標識物
質の徂と、サンプル中の被測定物質の量との間には相関
関係がおるので、流出した標識物質例えば蛍光物質を蛍
光分析等の所定の分析方法によって定量することにより
、被測定物質を定量しようとするものである。このＭＣ
ＩＡではサンプルにリポソームを混合した後、一定時間
経過してから測定が行われる。
（発明が解決しようとする課題）
ところでそのような従来の免疫分析方法では、感度が良
いという利点がある反面高濃度のサンプルでは値が飽和
してしまって測定できないので測定範囲が狭くなるとい
う問題がおる。このため高濃度のサンプルは希釈してか
ら再び測定を繰返さねばならず、時間を貸すと共に、コ
ストアップが避けられなくなる。
いという利点がある反面高濃度のサンプルでは値が飽和
してしまって測定できないので測定範囲が狭くなるとい
う問題がおる。このため高濃度のサンプルは希釈してか
ら再び測定を繰返さねばならず、時間を貸すと共に、コ
ストアップが避けられなくなる。
本発明は以上のような事情に対処してなされたもので、
測定範囲の広い免疫分析方法を提供することを目的とす
るものである。
測定範囲の広い免疫分析方法を提供することを目的とす
るものである。
［発明の構成］
（課題を解決するための手段）
上記目的を達成するために本発明は、被測定物質を高濃
度に含む場合には、値が飽和する前に測定を行うことに
よりサンプル中の被測定物質を定量分析するようにした
ものである。
度に含む場合には、値が飽和する前に測定を行うことに
よりサンプル中の被測定物質を定量分析するようにした
ものである。
（作 用）
予め標準サンプルと試薬とを混合した後、反応液の蛍光
強度を経時的に複数回例えば３回測定する。これを元に
３回目と１回目の蛍光強度の差と被測定物質の濃度との
関係を示す第１の検量線、及び２回目と１回目の蛍光強
度の差と舶記濃度との関係を示す第２の検量線を作成す
る。次に未知のサンプルについて同様に被測定物質を３
回測定する。この結果、２回目の値≧３回目の値ならば
、第２の検量線を参照し、また２回目の値〈３回目の値
ならば第１の検量線を参照して被測定物質の濃度を求め
る。これによって低濃度から高濃度の広い範囲にわたる
サンプルについての測定が可能となる。
強度を経時的に複数回例えば３回測定する。これを元に
３回目と１回目の蛍光強度の差と被測定物質の濃度との
関係を示す第１の検量線、及び２回目と１回目の蛍光強
度の差と舶記濃度との関係を示す第２の検量線を作成す
る。次に未知のサンプルについて同様に被測定物質を３
回測定する。この結果、２回目の値≧３回目の値ならば
、第２の検量線を参照し、また２回目の値〈３回目の値
ならば第１の検量線を参照して被測定物質の濃度を求め
る。これによって低濃度から高濃度の広い範囲にわたる
サンプルについての測定が可能となる。
（実施例）
先ず、本発明の免疫分析方法の原理について説明する。
表面に抗ＡＦＰ （αフェトプロティン〉モノクローナ
ル抗体を固定し、内部にＣＦ（カルボキシフルオレセイ
ン）蛍光物質を封入したリポソーム試薬を用い、被測定
物質として種々の濃度のＡＦＰを含む標準血清サンプル
と、第２抗体及び補体とを共に混合した後、３７℃で恒
温しつつ反応液のＡＦＰの蛍光強度を蛍光光度計を用い
て経時的に回測定することにより第１図のような特性が
１昇られた。縦軸は反応液の蛍光強度Ｖ、横軸は時間Ｔ
を示している。また、第１図の３０分経過後の蛍光強度
Ｖ３０から３０秒経過後の蛍光強度Ｖ Ｄ、５を引いた
値ＶＡ （蛍光強度差）と、サンプル中のＡＦＰ！度
Ｃとの関係を示すと第２図のような特性が得られた（以
下第１の検量線と称する）。この第１の検量線はＡＦＰ
の低濃度領域では感度良くＡＦＰを測定することができ
るが、高濃度領域はせいぜい１１００ｎ／ｍｌまでしか
測定できないことを示している。
ル抗体を固定し、内部にＣＦ（カルボキシフルオレセイ
ン）蛍光物質を封入したリポソーム試薬を用い、被測定
物質として種々の濃度のＡＦＰを含む標準血清サンプル
と、第２抗体及び補体とを共に混合した後、３７℃で恒
温しつつ反応液のＡＦＰの蛍光強度を蛍光光度計を用い
て経時的に回測定することにより第１図のような特性が
１昇られた。縦軸は反応液の蛍光強度Ｖ、横軸は時間Ｔ
を示している。また、第１図の３０分経過後の蛍光強度
Ｖ３０から３０秒経過後の蛍光強度Ｖ Ｄ、５を引いた
値ＶＡ （蛍光強度差）と、サンプル中のＡＦＰ！度
Ｃとの関係を示すと第２図のような特性が得られた（以
下第１の検量線と称する）。この第１の検量線はＡＦＰ
の低濃度領域では感度良くＡＦＰを測定することができ
るが、高濃度領域はせいぜい１１００ｎ／ｍｌまでしか
測定できないことを示している。
次に、第１図の特性のうち特に横軸Ｔを２分経過後まで
にとって示すと第３図のような特性が得られた。この特
性は１０． ＯＯＯｎｇ／ｍ１以上のＡＦＰの高濃度領
域では２分経過までに反応が終了していることを示して
いる。また第３図の２分経過後の反応液の蛍光強度ｖ２
から前記Ｖ ｏ、ｓを引いた値Ｖｅと、サンプル中のＡ
ＦＰ１度Ｃとの関係を示すと第４図のような特性が得ら
れた（以下第２の検ｍ線と称する〉。この第２の検量線
は第１の検量線と比較し低濃度領域はＡＦＰを測定でき
ないが、高ａ度領域は１０．０００ｎｇ／ｍｌまで測定
可能であることを示している。
にとって示すと第３図のような特性が得られた。この特
性は１０． ＯＯＯｎｇ／ｍ１以上のＡＦＰの高濃度領
域では２分経過までに反応が終了していることを示して
いる。また第３図の２分経過後の反応液の蛍光強度ｖ２
から前記Ｖ ｏ、ｓを引いた値Ｖｅと、サンプル中のＡ
ＦＰ１度Ｃとの関係を示すと第４図のような特性が得ら
れた（以下第２の検ｍ線と称する〉。この第２の検量線
は第１の検量線と比較し低濃度領域はＡＦＰを測定でき
ないが、高ａ度領域は１０．０００ｎｇ／ｍｌまで測定
可能であることを示している。
これらの事実は第１及び第２の検量線を組合わせること
により、低濃度領域から高濃度領域にわたって八ＦＰが
測定可能であることを示しており、本発明はこの事実を
利用してなされたものである。
により、低濃度領域から高濃度領域にわたって八ＦＰが
測定可能であることを示しており、本発明はこの事実を
利用してなされたものである。
以下、本発明実施例を説明する。
く第１の実施例〉
未知濃度のサンプルを用い前記のようなリポソーム試薬
等と混合した後、同様な方法によって３０秒経過後の蛍
光濃度Ｖｏ、ｓ、２分経過後の蛍光濃度Ｖ２，３０分経
過後の蛍光濃度Ｖ３０を各々測定した。次にこれら各測
定値間で比較を行い、Ｖ２≧Ｖ３０のときは第２図の第
１の検量線を参照することにより被測定物質の濃度を求
めた。またＶ２ ＜Ｖ２Ｏのときは第４図の第２の検量
線を参照することにより被測定物質の濃度を求めるよう
にした。
等と混合した後、同様な方法によって３０秒経過後の蛍
光濃度Ｖｏ、ｓ、２分経過後の蛍光濃度Ｖ２，３０分経
過後の蛍光濃度Ｖ３０を各々測定した。次にこれら各測
定値間で比較を行い、Ｖ２≧Ｖ３０のときは第２図の第
１の検量線を参照することにより被測定物質の濃度を求
めた。またＶ２ ＜Ｖ２Ｏのときは第４図の第２の検量
線を参照することにより被測定物質の濃度を求めるよう
にした。
このような方法によれば、第１の検量線によってカバー
される約１ｎｇ／ｍｌの低濃度領域から、第２の検量線
によってカバーされる約１０． ＯＯＯｎｇ／ｍまでの
高濃度領域にわたる広い濃度範囲にわたるＡＦＰＩ度に
ついての測定を行うことができる。
される約１ｎｇ／ｍｌの低濃度領域から、第２の検量線
によってカバーされる約１０． ＯＯＯｎｇ／ｍまでの
高濃度領域にわたる広い濃度範囲にわたるＡＦＰＩ度に
ついての測定を行うことができる。
従って従来のように高濃度のサンプルについても、希釈
してから再び測定を繰返すような方法は不要となるので
、コストアップを伴うことなく効率的に測定を行うこと
ができる。
してから再び測定を繰返すような方法は不要となるので
、コストアップを伴うことなく効率的に測定を行うこと
ができる。
く第２の実施例〉
標準血清サンプルを前記リポソーム試薬等と混合した後
、反応液の蛍光強度を３０秒間隔で３０分経過後まで測
定して各蛍光強度ＶＤ、５． Ｖｌ 。
、反応液の蛍光強度を３０秒間隔で３０分経過後まで測
定して各蛍光強度ＶＤ、５． Ｖｌ 。
Ｖｈｓ、・・・Ｖ２Ｏを得た。続いて各３０秒間の蛍光
強度の変化量の最大値を求めることにより、縦軸の蛍光
強度差Ｖｃと横軸のＡＦＰ′ａ度Ｃとの関係を示す第５
図のような特性が得られた（以下筒３の検量線と称する
）。この第５図の第３の検量線から明らかなように、本
実施例によっても１ｎｇ／ｍｌから１０． ＯＯＯｎｇ
／ｍｌまでの広い濃度範囲にわたるＡＦＰ！度について
の測定を行うことができる。
強度の変化量の最大値を求めることにより、縦軸の蛍光
強度差Ｖｃと横軸のＡＦＰ′ａ度Ｃとの関係を示す第５
図のような特性が得られた（以下筒３の検量線と称する
）。この第５図の第３の検量線から明らかなように、本
実施例によっても１ｎｇ／ｍｌから１０． ＯＯＯｎｇ
／ｍｌまでの広い濃度範囲にわたるＡＦＰ！度について
の測定を行うことができる。
従って前記実施例と同様な効果を得ることができる。
［発明の効果］
以上述べたように本発明によれば、被測定物質を高濃度
に含むサンプルについては、値が飽和する前に測定を行
うことができるので高濃度まで測定が可能となって測定
レンジを拡大することができる。またこれによってレン
ジオーバーのサンプルを希釈して再測定する手間を省け
ると共にコストアップを避けることができる。
に含むサンプルについては、値が飽和する前に測定を行
うことができるので高濃度まで測定が可能となって測定
レンジを拡大することができる。またこれによってレン
ジオーバーのサンプルを希釈して再測定する手間を省け
ると共にコストアップを避けることができる。
第１図及び第３図は本発明の免疫分析方法の原理を説明
するための蛍光強度の経時特性を示すグラフ、第２図、
第４図及び第５図は本発明の免疫分析方法の原理を説明
するための蛍光強度差とＡＦＰ濃度との関係を示すグラ
フである。 ■・・・蛍光強度、 ＶＡ 、 ＶＢ 、 Ｖｃ −蛍光強度差、Ｃ・・・Ａ
ＦＰ濃度。 閂−関丁Ｃガ） 第 ３ 図 第４図 ≧響 氷繁・四黛く
するための蛍光強度の経時特性を示すグラフ、第２図、
第４図及び第５図は本発明の免疫分析方法の原理を説明
するための蛍光強度差とＡＦＰ濃度との関係を示すグラ
フである。 ■・・・蛍光強度、 ＶＡ 、 ＶＢ 、 Ｖｃ −蛍光強度差、Ｃ・・・Ａ
ＦＰ濃度。 閂−関丁Ｃガ） 第 ３ 図 第４図 ≧響 氷繁・四黛く
Claims (2)
- （１）抗体又は抗原を表面に固定化し内部に標識物質を
封入したマイクロカプセルとサンプルとを混合し、抗原
−抗体反応により前記マイクロカプセルが破壊されて流
出した標識物質の量を検出することによりサンプル中の
抗原又は抗体又は補体価を定量分析する免疫分析方法に
おいて、サンプルと試薬の混合後２回以上の測定を行う
ことにより２種類以上の検量線を求め、測定した値によ
つて２種類以上の検量線のうち１種を用いてサンプル中
の被測定物質を定量分析することを特徴とする免疫分析
方法。 - （２）サンプルと試薬の混合後経時的に測定を行い、一
定時間内の最大反応速度からサンプル中の被測定物質を
定量分析することを特徴とする免疫分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22050788A JPH0269663A (ja) | 1988-09-05 | 1988-09-05 | 免疫分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22050788A JPH0269663A (ja) | 1988-09-05 | 1988-09-05 | 免疫分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0269663A true JPH0269663A (ja) | 1990-03-08 |
Family
ID=16752112
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22050788A Pending JPH0269663A (ja) | 1988-09-05 | 1988-09-05 | 免疫分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0269663A (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56150333A (en) * | 1980-04-23 | 1981-11-20 | Olympus Optical Co Ltd | Sample analysis method |
| JPS62278458A (ja) * | 1986-05-27 | 1987-12-03 | Toshiba Corp | 免疫分析方法 |
-
1988
- 1988-09-05 JP JP22050788A patent/JPH0269663A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56150333A (en) * | 1980-04-23 | 1981-11-20 | Olympus Optical Co Ltd | Sample analysis method |
| JPS62278458A (ja) * | 1986-05-27 | 1987-12-03 | Toshiba Corp | 免疫分析方法 |
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