JPH0276578A - 組換えマレック病ウイルスおよびその製法 - Google Patents
組換えマレック病ウイルスおよびその製法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ニワトリ細胞またはニワトリ体内において外
来遺伝子産物を発現させることが可能な新規なウィルス
ベクターに関するものである。さらには、これを用いた
ニワトリ用多価生ワクチンに関する。
来遺伝子産物を発現させることが可能な新規なウィルス
ベクターに関するものである。さらには、これを用いた
ニワトリ用多価生ワクチンに関する。
灸肌ム童上−Ｌ、ｌバＬ翌ｊＦ肢」せ
現在の養鶏分野においては種鶏、産卵鶏、及び肉用鶏の
別を問わず、ワクヂネーションによる疾病予防は重要な
衛生対策の柱である。しかしながら、そのワクチネーシ
ョンの実態は実に過密とも言えるはど頻回であり、した
がってこれに要する人件費の大きさは養鶏家にとって大
きな経済的負担となっている。この点の打開策として、
一つには既存の数種のワクチンを単純に混合することが
考えられる。しかしながら、生ワクチンの場合にはウィ
ルス相互の干渉という問題があり、又、不活化ワクチン
混合の場合においても容量的な限界がある。さらにこの
ような問題に加えて、生ワクチンと不活化ワクチンの混
合においては、ゲル（アジュバント）への生ワクチン抗
原の吸着による力価低下という問題があり、従来の技術
では現実的に問題が残されている。
別を問わず、ワクヂネーションによる疾病予防は重要な
衛生対策の柱である。しかしながら、そのワクチネーシ
ョンの実態は実に過密とも言えるはど頻回であり、した
がってこれに要する人件費の大きさは養鶏家にとって大
きな経済的負担となっている。この点の打開策として、
一つには既存の数種のワクチンを単純に混合することが
考えられる。しかしながら、生ワクチンの場合にはウィ
ルス相互の干渉という問題があり、又、不活化ワクチン
混合の場合においても容量的な限界がある。さらにこの
ような問題に加えて、生ワクチンと不活化ワクチンの混
合においては、ゲル（アジュバント）への生ワクチン抗
原の吸着による力価低下という問題があり、従来の技術
では現実的に問題が残されている。
最近ではこのような点を踏まえ、第二の打開策としてウ
ィルスベクターを使用することが試みられつつある。す
なわち、一つのウィルスに複数のワクチン抗原の遺伝子
を組み込むことで多価の生ワクチンを作製するという方
法である。この方法により、前述したようなウィルス相
互の干渉、あるいは不活化ワクチン混合時における接種
量の増大という問題を生じない多価ワクチンを作出する
ことが可能であると瀉えられる。
ィルスベクターを使用することが試みられつつある。す
なわち、一つのウィルスに複数のワクチン抗原の遺伝子
を組み込むことで多価の生ワクチンを作製するという方
法である。この方法により、前述したようなウィルス相
互の干渉、あるいは不活化ワクチン混合時における接種
量の増大という問題を生じない多価ワクチンを作出する
ことが可能であると瀉えられる。
これまでに、ウィルスをベクターとして使うことを目的
とした研究は、既にワクシニアウィルス、アデノウィル
ス、ヘルペスシンプレックスウィルス、し１−ロウイル
ス等で実施されており、いずれもインビトロの系におい
て、ＨＢ ｓ抗ｉ（Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原）あるい
は狂犬病ウィルスや帯状庖疹ウィルス等の糖蛋白抗原の
発現に成功している。しかしながら、ワクシニアウィル
スを除いては、いずれのウィルスも本来、腫瘍原性を有
するウィルス属に属することから、これらのウィルスを
ヒトまたは動物へ投与することは、安全性の面から問題
が多く現実的ではない。また、ワクシニアウィルスの場
合、ウィルス自体の安全性に問題はないものの、本発明
が目的とする鳥類へのウィルスベクターとして見た場合
には、接種の対象となる鳥類がワクシニアウィルス本来
の宿主ではないことから、仮に鳥類へのウィルスベクタ
ーとして使用されたとしても、その効果に多くは期待で
きない。同様に、前述の他のウィルスベクターを用いた
場合にも、鳥類がこれらのウィルス本来の宿主ではない
ことから高い効果は期待できない。
とした研究は、既にワクシニアウィルス、アデノウィル
ス、ヘルペスシンプレックスウィルス、し１−ロウイル
ス等で実施されており、いずれもインビトロの系におい
て、ＨＢ ｓ抗ｉ（Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原）あるい
は狂犬病ウィルスや帯状庖疹ウィルス等の糖蛋白抗原の
発現に成功している。しかしながら、ワクシニアウィル
スを除いては、いずれのウィルスも本来、腫瘍原性を有
するウィルス属に属することから、これらのウィルスを
ヒトまたは動物へ投与することは、安全性の面から問題
が多く現実的ではない。また、ワクシニアウィルスの場
合、ウィルス自体の安全性に問題はないものの、本発明
が目的とする鳥類へのウィルスベクターとして見た場合
には、接種の対象となる鳥類がワクシニアウィルス本来
の宿主ではないことから、仮に鳥類へのウィルスベクタ
ーとして使用されたとしても、その効果に多くは期待で
きない。同様に、前述の他のウィルスベクターを用いた
場合にも、鳥類がこれらのウィルス本来の宿主ではない
ことから高い効果は期待できない。
このような点から、鳥類のポックスウィルス（例えばニ
ワトリの鶏痘ウィルス）をベクターとして使うことが考
えられ、既にウィルスベクターとしての検討もなされて
おり、そのウィルスＤＮＡに外来遺伝子挿入の可能なこ
とが示されている［佐伯ら、第３５回日本ウィルス学会
Ｐ２１１９ （１９８７）］。
ワトリの鶏痘ウィルス）をベクターとして使うことが考
えられ、既にウィルスベクターとしての検討もなされて
おり、そのウィルスＤＮＡに外来遺伝子挿入の可能なこ
とが示されている［佐伯ら、第３５回日本ウィルス学会
Ｐ２１１９ （１９８７）］。
しかしながら、例えば、現在の養鶏分野においては、鶏
痘に対する免疫は、鶏痘ウィルスの免疫持続期間が短い
ことから、通常、ニワトリの飼育期間中に数回のワクチ
ンウィルス（弱毒鶏痘ウィルスまたは鳩痘ウィルス〉接
種が必要とされている。このようなことから、ポックス
ウィルスをウィルスベクターとして用いた場合には、仮
に複数の抗原を組み込んだウィルスベクターが作出され
ワクチンとして使用されたとしても、頻回のワクチネー
ションが必要になると男えられる。
痘に対する免疫は、鶏痘ウィルスの免疫持続期間が短い
ことから、通常、ニワトリの飼育期間中に数回のワクチ
ンウィルス（弱毒鶏痘ウィルスまたは鳩痘ウィルス〉接
種が必要とされている。このようなことから、ポックス
ウィルスをウィルスベクターとして用いた場合には、仮
に複数の抗原を組み込んだウィルスベクターが作出され
ワクチンとして使用されたとしても、頻回のワクチネー
ションが必要になると男えられる。
１肌す且１
このような状況下において、鳥類を宿主とする、免疫持
続期間の長いウィルスを利用した効果的なウィルスベク
ターの開発に鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、マ
レック病ウィルスに外来遺伝子を効率よく組み込むこと
に成功し、マレック病ウィルスをウィルスベクターとし
て用いることが可能なことを見いだし本発明を完成する
に至った。
続期間の長いウィルスを利用した効果的なウィルスベク
ターの開発に鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、マ
レック病ウィルスに外来遺伝子を効率よく組み込むこと
に成功し、マレック病ウィルスをウィルスベクターとし
て用いることが可能なことを見いだし本発明を完成する
に至った。
すなわち、本発明は、鳥類用のワクチンとして利用する
ことか可能な、新規な組換えマレック病ウィルスならひ
にその製法、さらにはこの組換えマレック病ウィルスを
用いた鳥類用多価生ワクチンを提供するものである。
ことか可能な、新規な組換えマレック病ウィルスならひ
にその製法、さらにはこの組換えマレック病ウィルスを
用いた鳥類用多価生ワクチンを提供するものである。
九旦圓藷、ｉ上」１働１
マレック病は人畜を含めて、唯一ワクチンによってその
発病が防がれる悪性腫瘍であるが、その防御メカニズム
としては、ワクチンウィルスが終生持続感染することに
より、鶏等鳥類体内においてマレック病ウィルスに対す
る液性及び細胞性免疫を惹起、終生持続せしめ、その結
果、強毒ウィルスによるＩｌｌ；化を抑えていると号゛
えられている。
発病が防がれる悪性腫瘍であるが、その防御メカニズム
としては、ワクチンウィルスが終生持続感染することに
より、鶏等鳥類体内においてマレック病ウィルスに対す
る液性及び細胞性免疫を惹起、終生持続せしめ、その結
果、強毒ウィルスによるＩｌｌ；化を抑えていると号゛
えられている。
すなわち、本発明に従い、池の疾病に対するワクチン抗
原をコードする外来遺伝子をマレック病ウィルスに組み
込み、これを鳥類に接種した場合においても、通常のマ
レック病ウィルスと同様な機序により木組換えウィルス
接種鶏において、長期又は終生に亘って外来遺伝子に由
来する抗原が発現され、該抗原に対する液性又は細胞性
免疫が誘導 保持されることが期待される。 すなわち
、本発明に従えば、鶏等の鳥類に対して初生時の一回投
与のみで多数の病原体に対して免疫を賦与しうる多価生
ワクチンを作出することが可能である。
原をコードする外来遺伝子をマレック病ウィルスに組み
込み、これを鳥類に接種した場合においても、通常のマ
レック病ウィルスと同様な機序により木組換えウィルス
接種鶏において、長期又は終生に亘って外来遺伝子に由
来する抗原が発現され、該抗原に対する液性又は細胞性
免疫が誘導 保持されることが期待される。 すなわち
、本発明に従えば、鶏等の鳥類に対して初生時の一回投
与のみで多数の病原体に対して免疫を賦与しうる多価生
ワクチンを作出することが可能である。
現在、マレック病に対するワクチンとしては、マレック
病■型ウィルス（ＭＤＶ−Ｔ型）を弱毒化したもの、七
面鳥ヘスベスウイルス（ＨＶＴ）からなるもの、または
マレック病■型ウィルスと七面鳥ヘルペスウィルスを混
合したものが存在する。
病■型ウィルス（ＭＤＶ−Ｔ型）を弱毒化したもの、七
面鳥ヘスベスウイルス（ＨＶＴ）からなるもの、または
マレック病■型ウィルスと七面鳥ヘルペスウィルスを混
合したものが存在する。
マレック病自体はＩ型ウィルスの感染により引き起こさ
れることがわかっており、したがって、その発症防御に
は、血清学的に同じ型に属するマレック病Ｉ型ウィルス
弱毒株をワクチンとして用いることが最も効果的である
と尤えられる。すなわち、本発明において、マレック病
ワクチンも含めた多価ワクチンとして本発明の組換えマ
レック病ウィルスを使用する場合には、マレック病Ｉ型
ウィルスを使用することが好まＬい。
れることがわかっており、したがって、その発症防御に
は、血清学的に同じ型に属するマレック病Ｉ型ウィルス
弱毒株をワクチンとして用いることが最も効果的である
と尤えられる。すなわち、本発明において、マレック病
ワクチンも含めた多価ワクチンとして本発明の組換えマ
レック病ウィルスを使用する場合には、マレック病Ｉ型
ウィルスを使用することが好まＬい。
本発明のような、池のウィルスベクターをはるかに凌駕
する特質をもつマレック病ウィルスをベクターとする多
価生ワクチン作製のためには、まず、マレック病ウィル
スＤＮ月−において、外来遺伝子を挿入することが用能
な部位、または削除可能な部位を９い出すことか必須で
ある。
する特質をもつマレック病ウィルスをベクターとする多
価生ワクチン作製のためには、まず、マレック病ウィル
スＤＮ月−において、外来遺伝子を挿入することが用能
な部位、または削除可能な部位を９い出すことか必須で
ある。
しかしながら、マレック病ウィルスＤＮＡについては、
ボンクスウイルス、アデノウィルスのようには解析が進
んでおらず、わずかに、二・二の制限酵素によるマツピ
ンクが示されているのみであり［福地邦彦ら、 、１．
Ｖｉｒｏｌ、 、 ５１．１１１０２（＋９８４）コ
、また、特定の蛋白質をコードすることが明かな部分は
ｇＡをコートする、マレック病ウィルス遺伝子を制限酵
素Ｂａｍ１ｌ Ｉて切断し得らノするＲａｍ１ｌｌ−Ｂ
断片１箇所のみであり、 ［Ｒ，Ｊ、 ｌ５Ｆ（ＩＲＴ
ら、 Ｊ、 ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、 、 ６］。
ボンクスウイルス、アデノウィルスのようには解析が進
んでおらず、わずかに、二・二の制限酵素によるマツピ
ンクが示されているのみであり［福地邦彦ら、 、１．
Ｖｉｒｏｌ、 、 ５１．１１１０２（＋９８４）コ
、また、特定の蛋白質をコードすることが明かな部分は
ｇＡをコートする、マレック病ウィルス遺伝子を制限酵
素Ｂａｍ１ｌ Ｉて切断し得らノするＲａｍ１ｌｌ−Ｂ
断片１箇所のみであり、 ［Ｒ，Ｊ、 ｌ５Ｆ（ＩＲＴ
ら、 Ｊ、 ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、 、 ６］。
ｐ２６１４ （１９８７） ］他の領域の遺伝子に関し
てはほとんど解析かなされていない。
てはほとんど解析かなされていない。
ところで、ｇＡは２．ｑ ＋３と共にウィルスの産生ず
る主要な糖蛋白質てあり、動物体内に接種された場合に
ｇＢのような中和抗体の産生は今のところ認められてい
ないものの、ｇＡが細胞性免疫を惹起することは十分推
定される。したがって、マレック病ウィルスにベクター
とワクチンとしての両方の機能を持なぜることを考えた
場合に、このｇＡ遺伝子に外来遺伝子を挿入しｇＡを変
異化させることはワクチン効果の低下につながると予想
された。
る主要な糖蛋白質てあり、動物体内に接種された場合に
ｇＢのような中和抗体の産生は今のところ認められてい
ないものの、ｇＡが細胞性免疫を惹起することは十分推
定される。したがって、マレック病ウィルスにベクター
とワクチンとしての両方の機能を持なぜることを考えた
場合に、このｇＡ遺伝子に外来遺伝子を挿入しｇＡを変
異化させることはワクチン効果の低下につながると予想
された。
このような状況において、本発明者らは、まだあまり解
析の進んでいない遺伝子についても効果的な組換えマレ
ック病ウィルスの作出に関して研究を進めた結果、マレ
ック病■型つィルス道伝子のＢａｍ）Ｈ−Ｈ断片（マレ
ック病ウィルス遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩで切断して
生じる８番１］に大きな遺伝子断片）を用いることによ
り組換えマレック病ウィルスを作出することが可能であ
ることを見いだした。
析の進んでいない遺伝子についても効果的な組換えマレ
ック病ウィルスの作出に関して研究を進めた結果、マレ
ック病■型つィルス道伝子のＢａｍ）Ｈ−Ｈ断片（マレ
ック病ウィルス遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩで切断して
生じる８番１］に大きな遺伝子断片）を用いることによ
り組換えマレック病ウィルスを作出することが可能であ
ることを見いだした。
マレック病ウィルス遺伝子Ｂａｍ１ｌ Ｉ −Ｈ断片に
は、マレック病ウィルスを構成するｇＡまたはｇＢのよ
うな主要な蛋白質はコードされていないと省えられてい
ることから、本発明におけるマレック病つィルス遺伝子
のＢａｍ１ｌ Ｉ−Ｈ断片を用いて外来遺伝子断片をウ
ィルスゲノムに組み込んだ組換えマレック病ウィルスは
、マレック病ワクチンとしての効果を落とすことなく、
目的の外来遺伝子を効率よく発現する非常に優れた多価
生ワクチンとなりうる。
は、マレック病ウィルスを構成するｇＡまたはｇＢのよ
うな主要な蛋白質はコードされていないと省えられてい
ることから、本発明におけるマレック病つィルス遺伝子
のＢａｍ１ｌ Ｉ−Ｈ断片を用いて外来遺伝子断片をウ
ィルスゲノムに組み込んだ組換えマレック病ウィルスは
、マレック病ワクチンとしての効果を落とすことなく、
目的の外来遺伝子を効率よく発現する非常に優れた多価
生ワクチンとなりうる。
本発明で開示されるように、これまでに組換えウィルス
へフタ−として知られていないマレック病ウィルスを用
い、このウィルスＤＮＡにおいて外来遺伝子組み込みの
可能な部位かあり、しかも、当該部位に外来遺伝子を挿
入したとき膝組換えウィルスが増殖し、外来遺伝子を発
現することが出来ることを見いだしたことは、本発明に
おいて最も特筆すべきことである。
へフタ−として知られていないマレック病ウィルスを用
い、このウィルスＤＮＡにおいて外来遺伝子組み込みの
可能な部位かあり、しかも、当該部位に外来遺伝子を挿
入したとき膝組換えウィルスが増殖し、外来遺伝子を発
現することが出来ることを見いだしたことは、本発明に
おいて最も特筆すべきことである。
以下、本発明の組換えマレック病ウィルスの作出法につ
いてさらに記述する。
いてさらに記述する。
一般に、本発明のような組換えウィルスを作出するため
には以下のような手順が必要となる、（１）ウィルスＤ
ＮＡの一部とベクターにクローニングする。
には以下のような手順が必要となる、（１）ウィルスＤ
ＮＡの一部とベクターにクローニングする。
（２）ウィルスＤＮＡ断片がクローニングされたベクタ
ーに、目的とする外来遺伝子の発現が可能な遺伝子断片
を挿入したプラスミドを構築する。
ーに、目的とする外来遺伝子の発現が可能な遺伝子断片
を挿入したプラスミドを構築する。
（３）該プラスミドをウィルス感染細胞に形質導入する
。
。
（４）適当な方法で外来遺伝子を保持する組換えウィル
スを選択する。
スを選択する。
本発明においては、マレック病Ｉ型ウィルスの遺伝子か
ら各種遺伝子のクローニングをおこなった。しかしなが
ら、外来遺伝子をマレック病ウィルスゲノムに組み込む
際に使用するウィルス由来遺伝子断片としては、１１ａ
ｍＩ目−１４断片が最も好ましいことが見いだされた。
ら各種遺伝子のクローニングをおこなった。しかしなが
ら、外来遺伝子をマレック病ウィルスゲノムに組み込む
際に使用するウィルス由来遺伝子断片としては、１１ａ
ｍＩ目−１４断片が最も好ましいことが見いだされた。
ウィルスに外来遺伝子を組み込む際に用いる遺伝子断片
（プラスミド）の基本構造としては、マレック病ウィル
ス由来の遺伝子を有し、さらに動物細胞もしくは動物ウ
ィルス由来のプロモーターの下流に目的の外来構造遺伝
子を接続した構造を有する。このようなプラスミドを用
いることにより、ウィルス由来遺伝子断片に相同性のあ
るライ−１２〜 ルスゲノムの中に該プラスミドが組み込まれる。
（プラスミド）の基本構造としては、マレック病ウィル
ス由来の遺伝子を有し、さらに動物細胞もしくは動物ウ
ィルス由来のプロモーターの下流に目的の外来構造遺伝
子を接続した構造を有する。このようなプラスミドを用
いることにより、ウィルス由来遺伝子断片に相同性のあ
るライ−１２〜 ルスゲノムの中に該プラスミドが組み込まれる。
また、該プラスミドをウィルスに形質導入する際には、
予めプラスミドを適当な制限酵素で切断し線状化し、こ
れを形質導入することも可能である。
予めプラスミドを適当な制限酵素で切断し線状化し、こ
れを形質導入することも可能である。
本発明では、まず、（１）として、ウィルスＤＮＡを制
限酵素て切断し、アガロースゲル電気泳動により、各断
片を分離したのちゲルより回収し、各断片をプラスミ１
ごにクローニングする方法を行った。 この際に使用す
るクローニングベクターとしては、コスミド、ファージ
等のいずれも利用することができる。
限酵素て切断し、アガロースゲル電気泳動により、各断
片を分離したのちゲルより回収し、各断片をプラスミ１
ごにクローニングする方法を行った。 この際に使用す
るクローニングベクターとしては、コスミド、ファージ
等のいずれも利用することができる。
次に、（２）としては、プラスミドにクローニングされ
た各ウィルス断片を任意な制限酵素で一箇所切断または
三箇所切断して一部欠損させたものへ動物細胞内で機能
するプロモーターを発現されるべき構造遺伝子の上流に
もつ外来遺伝子を挿入する。
た各ウィルス断片を任意な制限酵素で一箇所切断または
三箇所切断して一部欠損させたものへ動物細胞内で機能
するプロモーターを発現されるべき構造遺伝子の上流に
もつ外来遺伝子を挿入する。
この際に用いる外来遺伝子発現の為のプロモーターとし
ては、動物細胞もしくは動物ウィルス由来のプロモータ
ーが使用されるが、特に好ましくはニワトリのβ−アク
チン遺伝子プロモーターが使用される（第１図参照）、
このニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーターは、従
来よく知られているＳＶ４０初期遺伝子プロモーター等
と比較して、極めて高いプロモーター活性を有している
。さらに、ニワトリのβ−アクチン遺遺伝子フロロモー
ターＳＶ４０初期遺伝子プロモーターのハイブリッドプ
ロモーターを使用すればβ−アクチン遺伝子プロモータ
ーのみの場合に較べて、さらに高い外来遺伝子の発現が
可能となる（第２図参照）。
ては、動物細胞もしくは動物ウィルス由来のプロモータ
ーが使用されるが、特に好ましくはニワトリのβ−アク
チン遺伝子プロモーターが使用される（第１図参照）、
このニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーターは、従
来よく知られているＳＶ４０初期遺伝子プロモーター等
と比較して、極めて高いプロモーター活性を有している
。さらに、ニワトリのβ−アクチン遺遺伝子フロロモー
ターＳＶ４０初期遺伝子プロモーターのハイブリッドプ
ロモーターを使用すればβ−アクチン遺伝子プロモータ
ーのみの場合に較べて、さらに高い外来遺伝子の発現が
可能となる（第２図参照）。
（３）のウィルスＤＮＡへの外来遺伝子を含むウィルス
断片の相同組換えであるが、例えば、カイコを宿主とす
るバキュロウィルスのようにウィルスＤＮＡが比較的短
いものでは、ウィルスＤＮＡと該プラスミドを同時に細
胞に形質導入する方法がとられるが、マレック病ウィル
スの場合、そのＩ）ＨＡは１６０Ｋｈｐ−１８０Ｋｂｐ
と長い為に、このような方法での相同組換えは困難であ
り、従って本発明では、ワクシニアウィルスの例を参省
に該プラスミドを導入する方法［Ｍ、 ＭＡＣＫＥＴＴ
ら、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、 ７
９゜Ｐ７４１５（１９８２） ］つまり、培養細胞にウ
ィルスを感染させｆＳ後に、該プラスミドを導入すると
いう方法が用いられる。
断片の相同組換えであるが、例えば、カイコを宿主とす
るバキュロウィルスのようにウィルスＤＮＡが比較的短
いものでは、ウィルスＤＮＡと該プラスミドを同時に細
胞に形質導入する方法がとられるが、マレック病ウィル
スの場合、そのＩ）ＨＡは１６０Ｋｈｐ−１８０Ｋｂｐ
と長い為に、このような方法での相同組換えは困難であ
り、従って本発明では、ワクシニアウィルスの例を参省
に該プラスミドを導入する方法［Ｍ、 ＭＡＣＫＥＴＴ
ら、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、 ７
９゜Ｐ７４１５（１９８２） ］つまり、培養細胞にウ
ィルスを感染させｆＳ後に、該プラスミドを導入すると
いう方法が用いられる。
この際、形質導入の方法はリン酸カルシウム法、ＤＩｉ
Ａ［１−Ｄｅｘ ｔｒａｎ法、エレク１へロボーレーシ
ョン法のいずれても行うことかてきる。
Ａ［１−Ｄｅｘ ｔｒａｎ法、エレク１へロボーレーシ
ョン法のいずれても行うことかてきる。
（４）の組換えウィルスの選択方法に関しては、発現さ
せるｌ＼くウィルスに組み込まれた外来遺伝子に応じた
Ｊｌ！ｌ定系か使用される。例えは、その−例として、
本実施例に示すようにβ−カラクトシダーゼ（β−蝕ａ
ｌ）をコードする遺伝子（Ｌａｃ−Ｚ遺伝子）をマレッ
ク病ウィルスに組み込み、β−ガラク１ヘシダーゼを発
現している組換えウィルスを選択する場合には、β−ガ
ラク）ヘシダーゼに対する基質［例えはＸ−ＧａＨ５−
７１フモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−カラク
トピラノシド）コを細胞シートに重層する寒天液中に添
加することで、β−ガラク１−シダーゼ括性をもつウィ
ルスのプラークを色別することが可能である。［Ｓ、
ＣＨＡＸＲＡＢＢＡＲＴＩら、Ｍｏｌ、Ｃｅ１１． Ｉ
ｄｉｏｍ、、 ５．１１３４０３（＋９８５）；佐伯ら
、第３５回日本ウィルス学会 （１９８７）］。
せるｌ＼くウィルスに組み込まれた外来遺伝子に応じた
Ｊｌ！ｌ定系か使用される。例えは、その−例として、
本実施例に示すようにβ−カラクトシダーゼ（β−蝕ａ
ｌ）をコードする遺伝子（Ｌａｃ−Ｚ遺伝子）をマレッ
ク病ウィルスに組み込み、β−ガラク１ヘシダーゼを発
現している組換えウィルスを選択する場合には、β−ガ
ラク）ヘシダーゼに対する基質［例えはＸ−ＧａＨ５−
７１フモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−カラク
トピラノシド）コを細胞シートに重層する寒天液中に添
加することで、β−ガラク１−シダーゼ括性をもつウィ
ルスのプラークを色別することが可能である。［Ｓ、
ＣＨＡＸＲＡＢＢＡＲＴＩら、Ｍｏｌ、Ｃｅ１１． Ｉ
ｄｉｏｍ、、 ５．１１３４０３（＋９８５）；佐伯ら
、第３５回日本ウィルス学会 （１９８７）］。
このようにして得られる５ 本発明の組換えマレック病
ウィルスは、鳥類、特にニワトリ用の多価生ワクチンと
して非常に有効である。すなわち、ニワトリの他の感染
症に対するワクチン抗原を発現可能な外来遺伝子を組み
込まれた組換えマレック病ウィルスは、本来のマレック
病ウィルスが持つ非常に優れた免疫持続効果を有する、
極めて利用価値の高い多価生ワクチンとなる。
ウィルスは、鳥類、特にニワトリ用の多価生ワクチンと
して非常に有効である。すなわち、ニワトリの他の感染
症に対するワクチン抗原を発現可能な外来遺伝子を組み
込まれた組換えマレック病ウィルスは、本来のマレック
病ウィルスが持つ非常に優れた免疫持続効果を有する、
極めて利用価値の高い多価生ワクチンとなる。
以下、実施例にしたがい、本発明をさらに詳細に説明す
るが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
るが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
マレック病■型ウィルスを鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）に
接種後、細胞変性効果（ＣＰＵ ）を強く呈した時点で
ウィルス感染細胞をへ−ベストし、平井らの方法［Ｊ、
ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、 、 ４５． ｐＨ９（１９
７９） ］に従って、ウィルスＤＮＡを精製した。
接種後、細胞変性効果（ＣＰＵ ）を強く呈した時点で
ウィルス感染細胞をへ−ベストし、平井らの方法［Ｊ、
ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、 、 ４５． ｐＨ９（１９
７９） ］に従って、ウィルスＤＮＡを精製した。
すなわち、まず遠心により集めたウィルス感染細胞に２
倍量の１％−ＮＰ４０溶液（０，旧Ｍ−Ｔｒｉｓ−ＩＣ
Ｉ、 ｐＨ７，４，０，０］Ｍ−ＮａＣＩ、 ０．００
１５Ｍ−ＭｇＣｈ）を加えて３０分間水冷した後、ピペ
ッティングした。この溶液を２５００回転て１０分間遠
心分離し、その上清を４０％−６０Ｘ（ｗ／ｗ）のショ
糖溶？’＆ （０，０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐＨ
７，４゜０．１５Ｍ ＮａＣ１）に重層、１７５ＫＧで
２時間遠心後、４０％ショ糖溶液と６ｆ）％ショ糖溶液
の中間に形成されたマレック病ウィルスに由来するカプ
シドの層を分取した。さらに、この中間層を再度０．０
２Ｍ Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ。
倍量の１％−ＮＰ４０溶液（０，旧Ｍ−Ｔｒｉｓ−ＩＣ
Ｉ、 ｐＨ７，４，０，０］Ｍ−ＮａＣＩ、 ０．００
１５Ｍ−ＭｇＣｈ）を加えて３０分間水冷した後、ピペ
ッティングした。この溶液を２５００回転て１０分間遠
心分離し、その上清を４０％−６０Ｘ（ｗ／ｗ）のショ
糖溶？’＆ （０，０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐＨ
７，４゜０．１５Ｍ ＮａＣ１）に重層、１７５ＫＧで
２時間遠心後、４０％ショ糖溶液と６ｆ）％ショ糖溶液
の中間に形成されたマレック病ウィルスに由来するカプ
シドの層を分取した。さらに、この中間層を再度０．０
２Ｍ Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ。
ｐＨ７，４，Ｏ，］５５ＭＮａＣｌ溶液に懸濁し、１６
０ＫＧで１時間遠心してベレッティングさせた。このペ
レットを、プロテイネースＫ（ベーリンガー マンハイ
ム）を０．１ｚに含む１％−３ＤＳ溶液（０，ＩＪ Ｔ
ｒｉｓ−１−１ｃＩ、 ｐＨ７，４゜０、０１１４−Ｅ
ＤＴＡ、 ］％−３ａｒｃｏｃｉｎａｔｅ；半井化学）
に浮遊させ、３７°Ｃ半一化学置した。その後、フェノ
ール処理、エタノール沈澱によりＨＮＡを回収し、ＴＥ
［衝液（１０ｎ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ、 ｐｌ＋７
．４．１ｍＭ−ＥＤＴＡ ）に溶解し、１０％−３０％
のグリセロールグラデイエン＋−＞８液に重層後、１７
５ＫＧで４時間遠心した。次に管底より溶液を分画し、
ウィルスＤＮＡを含む分画をとり、１０χ−トリクロル
酢酸を等量加えて、ＤＮＡを沈澱させ回収した。
０ＫＧで１時間遠心してベレッティングさせた。このペ
レットを、プロテイネースＫ（ベーリンガー マンハイ
ム）を０．１ｚに含む１％−３ＤＳ溶液（０，ＩＪ Ｔ
ｒｉｓ−１−１ｃＩ、 ｐＨ７，４゜０、０１１４−Ｅ
ＤＴＡ、 ］％−３ａｒｃｏｃｉｎａｔｅ；半井化学）
に浮遊させ、３７°Ｃ半一化学置した。その後、フェノ
ール処理、エタノール沈澱によりＨＮＡを回収し、ＴＥ
［衝液（１０ｎ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ、 ｐｌ＋７
．４．１ｍＭ−ＥＤＴＡ ）に溶解し、１０％−３０％
のグリセロールグラデイエン＋−＞８液に重層後、１７
５ＫＧで４時間遠心した。次に管底より溶液を分画し、
ウィルスＤＮＡを含む分画をとり、１０χ−トリクロル
酢酸を等量加えて、ＤＮＡを沈澱させ回収した。
次に、この精製ＤＮＡ １０ｕｑを制限酵素ＢａＨＩＨ
Ｉ （宝酒造；以下、本実施例で示した試薬は、特に記
載のない限り宝酒造製あるいは東洋紡製を使用した。）
で切断し、０．５χ−アガロースゲル電気泳動で各断片
を分離後、Ｈ断片をエレクトロエリューション法により
ゲルから浴出し、フェノール処理、エタノール沈澱によ
り回収した。このようにして得た断片的４０ｎｇをｐＵ
ｃ１９２０ｎｇとＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させ、
大腸菌コンピテントセル（ＪＭＩ０９）に形質導入し、
アンピシリン及びＸ−Ｇａ１を含む寒天平板上に広げた
。形質転換によってβ−ｇａｌを産生じなくなった白色
のコロニーを採取し、１００１１ｇ／ｍｌにアンピシリ
ンを含むＬＢ培地で培養した後、常法であるアルカリ法
によって菌体内のプラスミドを回収し、これをＢａｍＨ
Ｉで切断することにより、ＢａｌｌＨＩ −ＨＵＩ片の
挿入されたプラスミドを保有する形質転換体を選出した
。
Ｉ （宝酒造；以下、本実施例で示した試薬は、特に記
載のない限り宝酒造製あるいは東洋紡製を使用した。）
で切断し、０．５χ−アガロースゲル電気泳動で各断片
を分離後、Ｈ断片をエレクトロエリューション法により
ゲルから浴出し、フェノール処理、エタノール沈澱によ
り回収した。このようにして得た断片的４０ｎｇをｐＵ
ｃ１９２０ｎｇとＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させ、
大腸菌コンピテントセル（ＪＭＩ０９）に形質導入し、
アンピシリン及びＸ−Ｇａ１を含む寒天平板上に広げた
。形質転換によってβ−ｇａｌを産生じなくなった白色
のコロニーを採取し、１００１１ｇ／ｍｌにアンピシリ
ンを含むＬＢ培地で培養した後、常法であるアルカリ法
によって菌体内のプラスミドを回収し、これをＢａｍＨ
Ｉで切断することにより、ＢａｌｌＨＩ −ＨＵＩ片の
挿入されたプラスミドを保有する形質転換体を選出した
。
このようにして得られたプラスミドをｐＭＢＨと命名し
た（第３図参照）。
た（第３図参照）。
ｆＪｊ ： ＬａｃＺ −−’ ｒｌ＋”一つｐＭＢ
）ＩをＢｇｌｌｌで切断し、大腸菌由来のアルカリフォ
スファターゼ（ＢＡＩ’）により５°末端の脱リン酸化
を行っノご。
）ＩをＢｇｌｌｌで切断し、大腸菌由来のアルカリフォ
スファターゼ（ＢＡＩ’）により５°末端の脱リン酸化
を行っノご。
一方、上流に：ユワトリ由来β−アクチン遺伝子のプロ
モーターを持つ大腸菌由来のＬａｃＺ遺（天子をｐＡｃ
−ＬａｃＺよりＢａｍ１ｌｌ及びＸｈｏｒで切り出し、
０．８％ゲルで分離後、５．２Ｋｂｐｆｌ断片を回収し
、平滑末端（ヒしたのち、その４０ ｎ ｇを上記の直
線化したｐＭｌ’ｌｌ（２０ｎｇとＴ４リガーゼによっ
て連結しＨＢＩＯＩに導入した。
モーターを持つ大腸菌由来のＬａｃＺ遺（天子をｐＡｃ
−ＬａｃＺよりＢａｍ１ｌｌ及びＸｈｏｒで切り出し、
０．８％ゲルで分離後、５．２Ｋｂｐｆｌ断片を回収し
、平滑末端（ヒしたのち、その４０ ｎ ｇを上記の直
線化したｐＭｌ’ｌｌ（２０ｎｇとＴ４リガーゼによっ
て連結しＨＢＩＯＩに導入した。
このものをアンピシリン ＜］、ＯＯ＋１９／ｍｌ）を
含む寒天平板に広げ３７°Ｃて培養した後、アンピシリ
ンに耐性な６個の形質転換コロニーを選択し、１００刈
／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地て培養し、プラス
ミドを単離した後、ＢａｍＨＩ及び旧ｎｄｍによる切断
パターンを分析した。０８％アガロースゲル電気泳動で
予想されたパターンを示した−・−ンのプラスミドをｐ
ＭＲ１１１＋、と命名した（第３図参照）。
含む寒天平板に広げ３７°Ｃて培養した後、アンピシリ
ンに耐性な６個の形質転換コロニーを選択し、１００刈
／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地て培養し、プラス
ミドを単離した後、ＢａｍＨＩ及び旧ｎｄｍによる切断
パターンを分析した。０８％アガロースゲル電気泳動で
予想されたパターンを示した−・−ンのプラスミドをｐ
ＭＲ１１１＋、と命名した（第３図参照）。
実ＪＬＳ ３−レぽＩ庭弘ｊ−をｊごλヌ」こ１−子５
肩了り工」仁スの」「出 ３７℃で一晩培養した初代ＣＥＦを１ｉＤＴＡ−１−リ
プシン溶液でハーベスト、洗浄後、５ｘ牛血清（ＢＳ）
添加イーグル−ＭＨＭ （Ｅ−ＭＥＭ、 日永）培地
に２０万個／ｍＨ７）細胞濃度で浮遊し、その４０ｍ１
をファルコン社製組織培養フラスコ（Ｎｏ、 ３０２８
＞に入れ、３７℃で１６時間培養した。このときの細胞
のシート率は約５０χであった。これにマレック病■型
ウィルス感染ＣＥＦを約８０万個接種し、３７℃で４時
間培養後、再びＥＤＴＡ−１−リプシン溶液で細胞をハ
ーベストし、５Ｘ−ＢＳ添加Ｅ−ＭＨＭで一度洗浄した
後、ショ糖添加リン酸バッファー（ショ糖２７２ＨＩＭ
、リン酸カリウム７ｍＭ、ＭｇＣＩ ２１ｍＭ、 ｐ
Ｉ＋７．４） テ２度細胞を洗浄し、最終的ニ０．７ｍ
ｌのショ糖添加リン酸バッファーに懸濁し、エレクトロ
ボーレーション用キュベツトくバイオラット、 ＮＯ，
１６５−２０８５＞に入れ、ｐｌｉｌＢＨＩＬ４０μ９
を添加し１０分間水冷した。次に、バイオラッド社製ジ
ーンパルザーに添付されたマニュアルに従って、エレク
トロボーレーションを行った。エレクトロボーレーショ
ンの条件は、２００Ｖ−２５μＦ、１回パルスで行った
。
肩了り工」仁スの」「出 ３７℃で一晩培養した初代ＣＥＦを１ｉＤＴＡ−１−リ
プシン溶液でハーベスト、洗浄後、５ｘ牛血清（ＢＳ）
添加イーグル−ＭＨＭ （Ｅ−ＭＥＭ、 日永）培地
に２０万個／ｍＨ７）細胞濃度で浮遊し、その４０ｍ１
をファルコン社製組織培養フラスコ（Ｎｏ、 ３０２８
＞に入れ、３７℃で１６時間培養した。このときの細胞
のシート率は約５０χであった。これにマレック病■型
ウィルス感染ＣＥＦを約８０万個接種し、３７℃で４時
間培養後、再びＥＤＴＡ−１−リプシン溶液で細胞をハ
ーベストし、５Ｘ−ＢＳ添加Ｅ−ＭＨＭで一度洗浄した
後、ショ糖添加リン酸バッファー（ショ糖２７２ＨＩＭ
、リン酸カリウム７ｍＭ、ＭｇＣＩ ２１ｍＭ、 ｐ
Ｉ＋７．４） テ２度細胞を洗浄し、最終的ニ０．７ｍ
ｌのショ糖添加リン酸バッファーに懸濁し、エレクトロ
ボーレーション用キュベツトくバイオラット、 ＮＯ，
１６５−２０８５＞に入れ、ｐｌｉｌＢＨＩＬ４０μ９
を添加し１０分間水冷した。次に、バイオラッド社製ジ
ーンパルザーに添付されたマニュアルに従って、エレク
トロボーレーションを行った。エレクトロボーレーショ
ンの条件は、２００Ｖ−２５μＦ、１回パルスで行った
。
その後、さらに１０分間水冷しな後、前日培養した初代
ＣＥＦをハーベストしたものと混合し、最終的に２００
万個／ｍｌの濃度になるよう５％ＢＳ添加Ｅ−ＭＥＭ（
日永〉に浮遊させ、径ｌＱｃｍのシャーレ（ファルコン
社製、Ｎｏ、 ３００３ ＞に１３ｍＩず９１０枚に分
注し、３７℃で培養した。翌日、培地を除去、１χ−Ｂ
Ｓを添加したフェノールレッド不含Ｅ−ＭＥＭにアガロ
ースをＩＸ濃度に添加した液を重層し、さらに３７°Ｃ
で５日間培養した。次に、クロロフェノールレッドβ−
Ｄ−ガラクトピラノシド（生化学工業）を１００μｇ／
ｍｌの濃度で含む１ｘ−アガロース／Ｉｉ−ＭＥＭ液（
フェノールレッド不合）を重層し、３７℃で数時間おい
た。
ＣＥＦをハーベストしたものと混合し、最終的に２００
万個／ｍｌの濃度になるよう５％ＢＳ添加Ｅ−ＭＥＭ（
日永〉に浮遊させ、径ｌＱｃｍのシャーレ（ファルコン
社製、Ｎｏ、 ３００３ ＞に１３ｍＩず９１０枚に分
注し、３７℃で培養した。翌日、培地を除去、１χ−Ｂ
Ｓを添加したフェノールレッド不含Ｅ−ＭＥＭにアガロ
ースをＩＸ濃度に添加した液を重層し、さらに３７°Ｃ
で５日間培養した。次に、クロロフェノールレッドβ−
Ｄ−ガラクトピラノシド（生化学工業）を１００μｇ／
ｍｌの濃度で含む１ｘ−アガロース／Ｉｉ−ＭＥＭ液（
フェノールレッド不合）を重層し、３７℃で数時間おい
た。
この結果、シャーレ当り１０ｇから３０個の頻度で、β
〜ｇａｌ活性を示す赤色のウィルスのプラークが認めら
れた。このとき、赤色のプラークは、ｐＭＢＨ−ＬＬの
みをエレクトロボーレーションにより導入したもの、又
はウィルスのみに同様な処置をした場合には認められな
かった。又、この赤色プラークをクローニングし前日培
養した２伏目ＣＥＦに接種したところ、このプラークは
継代され、前述した方法によって再びβ−ｇａｌに由来
する赤色プラーク分示し、安定してウィルスに組み込ま
れていることが示された。
〜ｇａｌ活性を示す赤色のウィルスのプラークが認めら
れた。このとき、赤色のプラークは、ｐＭＢＨ−ＬＬの
みをエレクトロボーレーションにより導入したもの、又
はウィルスのみに同様な処置をした場合には認められな
かった。又、この赤色プラークをクローニングし前日培
養した２伏目ＣＥＦに接種したところ、このプラークは
継代され、前述した方法によって再びβ−ｇａｌに由来
する赤色プラーク分示し、安定してウィルスに組み込ま
れていることが示された。
第１図は、ニワトリβ−アクチン遺伝子プロモーター下
流にＬａｃ−Ｚ３１１伝子を組み込んだプラスミドｐＡ
ｃ−ＬａｃＺの構造を示す。 第２図は、ニワトリβ−アクチン遺伝子プロモーターと
ＳＶ４０初期遺伝子プロモーターのハイブリッドプロモ
ーターの下流にＬａｃ−Ｚ遺伝子を組み込んだプラスミ
ドｐＡｓ−ＬａｃＺの構造を示す。 第３図は、マレック病■型ウィルスＤＮＡ Ｂａｍｔｌ
Ｉ−Ｈ断片が組み込まれたプラスミドｐＭＢｌｌなら
びにプラスミドｐＭＢ）Ｉ−ＩＬの構築図を示す。 手続補正書く自制
流にＬａｃ−Ｚ３１１伝子を組み込んだプラスミドｐＡ
ｃ−ＬａｃＺの構造を示す。 第２図は、ニワトリβ−アクチン遺伝子プロモーターと
ＳＶ４０初期遺伝子プロモーターのハイブリッドプロモ
ーターの下流にＬａｃ−Ｚ遺伝子を組み込んだプラスミ
ドｐＡｓ−ＬａｃＺの構造を示す。 第３図は、マレック病■型ウィルスＤＮＡ Ｂａｍｔｌ
Ｉ−Ｈ断片が組み込まれたプラスミドｐＭＢｌｌなら
びにプラスミドｐＭＢ）Ｉ−ＩＬの構築図を示す。 手続補正書く自制
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）マレック病ウィルス由来の遺伝子断片を有し、さ
らに動物細胞もしくは動物ウィルス由来のプロモーター
下流に外来遺伝子を組み込んだプラスミドによって変異
された組換えマレック病ウィルス。 （２）マレック病ウィルスがＩ型である前記第（１）項
記載の組換えマレック病ウィルス、 （３）マレック病ウィルス由来の遺伝子断片が、マレッ
ク病ウィルス遺伝子ＢａｍＨＩ−Ｈ断片である前記第（
２）項記載の組換えマレック病ウィルス。 （４）外来遺伝子発現用プロモーターが、ニワトリ由来
のβ−アクチン遺伝子プロモーターである前記第（２）
項記載の組換えマレック病ウィルス。 （５）外来遺伝子発現用プロモーターが、ニワトリのβ
−アクチン遺伝子プロモーターとＳＶ４０初期遺伝子プ
ロモーターとのハイブリッドプロモーターである前記第
（２）項記載の組換えマレック病ウィルス。 （６）動物細胞もしくは動物ウィルス由来のプロモータ
ー下流に外来遺伝子を接続した遺伝子断片をマレック病
Ｉ型ウィルス遺伝子ＢａｍＨＩ−Ｈ断片に組み込み、こ
れをマレック病Ｉ型ウイルスゲノムに組み込むことを特
徴とする組換えマレック病ウィルスの製法。（７）マレ
ック病ウィルス由来の遺伝子断片を有し、さらに動物細
胞もしくは動物ウィルス由来のプロモーター下流に外来
遺伝子を組み込んだプラスミドによって変異された組換
えマレック病ウィルスからなる鳥類用多価生ワクチン。 （８）鳥類がニワトリである前記第（７）項の多価生ワ
クチン。 （９）マレック病ウィルスがＩ型である前記第（８）項
記載の多価生ワクチン。 （１０）マレック病ウィルス由来の遺伝子断片が、マレ
ック病ウィルス遺伝子ＢａｍＨＩ−Ｈ断片である前記第
（９）項記載の多価生ワクチン。 （１１）外来遺伝子発現用プロモーターが、ニワトリ由
来のβ−アクチン遺伝子プロモーターである前記第（９
）項記載の多価生ワクチン。 （１２）外来遺伝子発現用プロモーターが、ニワトリの
β−アクチン遺伝子プロモーターとＳＶ４０初期遺伝子
プロモーターのハイブリッドプロモーターである前記第
（９）項記載の多価生ワクチン。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63226960A JP2583115B2 (ja) | 1988-09-10 | 1988-09-10 | 組換えマレック病ウイルスおよびその製法 |
| CA000610801A CA1339774C (en) | 1988-09-10 | 1989-09-08 | Recombinant marek's disease virus, process for preparing the same and vaccine containing the same |
| ES89116679T ES2061850T3 (es) | 1988-09-10 | 1989-09-08 | Virus recombinante de la enfermedad de marek, su procedimiento de preparacion y vacuna. |
| DE89116679T DE68912478T2 (de) | 1988-09-10 | 1989-09-08 | Rekombinantes Marek-Krankheitsvirus, Verfahren zu seiner Herstellung, und Vakzine. |
| US07/404,500 US5171677A (en) | 1988-09-10 | 1989-09-08 | Recombinant marek's disease virus and process for preparing the same |
| AT89116679T ATE100495T1 (de) | 1988-09-10 | 1989-09-08 | Rekombinantes marek-krankheitsvirus, verfahren zu seiner herstellung, und vakzine. |
| EP89116679A EP0361182B1 (en) | 1988-09-10 | 1989-09-08 | Recombinant Marek's disease virus, process for preparing the same and vaccine containing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63226960A JP2583115B2 (ja) | 1988-09-10 | 1988-09-10 | 組換えマレック病ウイルスおよびその製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0276578A true JPH0276578A (ja) | 1990-03-15 |
| JP2583115B2 JP2583115B2 (ja) | 1997-02-19 |
Family
ID=16853319
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63226960A Expired - Fee Related JP2583115B2 (ja) | 1988-09-10 | 1988-09-10 | 組換えマレック病ウイルスおよびその製法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5171677A (ja) |
| EP (1) | EP0361182B1 (ja) |
| JP (1) | JP2583115B2 (ja) |
| AT (1) | ATE100495T1 (ja) |
| CA (1) | CA1339774C (ja) |
| DE (1) | DE68912478T2 (ja) |
| ES (1) | ES2061850T3 (ja) |
Cited By (1)
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