JPH06505392A - 弱毒化され、遺伝子的に加工されたシュードラビーウイルスｓ−ｐｒｖ−１５５およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この出願においては、括弧内のアラビア数字によって幾つかの刊行物が引用され る。これらの参照文献の完全な引用は、請求の範囲の直前、即ち本明細書末尾に 記載しである。本発明が属する技術の状態をより完全に記述するために、これら 引用文献の開示内容は、その全体が参照として本出願に組み込まれる。

〔発明の分野〕

本発明はジュードラビー（Ｐｓｅｕｄｏｒｘｂｉｅｓ）から豚を守るための生ウ イルスワクチンに有用な、弱毒化されたジュードラビーウィルス（ｐｓｅｕｄｏ ｒａｂｉｅｓ　ｖｉｒｕｓ）を包含する。本発明はまた、該ウィルスでワクチン 接種された動物と野生型ジュードラビーウィルスに感染した動物とを区別するた めの、このようなウィルスの使用を包含する。

〔発明の背景〕

ウィルスのＤＮＡを単離し、単離されたＤＮＡを細菌性プラスミドにクローン化 できることによって、ウィルスワクチンの作製に利用できる方法は大幅に拡大さ れてきて０る。本発明を完成するために用いられる方法には、クローン化された ウィルスＤＮＡ配列を、挿入、欠失、および、−個ある０は複数個の塩基変換に よって改変することが含まれる。改変されたＤＮＡは、次いでウィルスのゲノム に再挿入され、ウィルスを非病原性にする。この得られた生ウィルスは、ホスト 動物中で免疫応答を誘発し、病気に対して動物を保護するためにワクチンに利用 される。

動物ウィルスの一部であるヘルペスウィルスまたはへルペトビリダエ（１１ｅｒ ｐｅｊｏｖｉｒｉ＋１ａｅ）は、このアプローチが適用できるウィルス群の一例 である。これらのウィルスは、遺伝子物質として１０（１，０００ないし２００ ．０００塩基対のＤＮＡを含んでいる。重要なことに、ゲノムの幾つかの領域は 、細胞培養におけるｉｎ　ｖｉｊｒｏでのウィルス複製に必要不可欠では無いこ とが分かっている。該ＤＮＡのこれら領域を改変することによって、ウィルスの 病原性を低くすること、即ちウィルスを弱毒化することができる。例えば、チミ ジンキナーゼ遺伝子を不活性化すると、ヒト単純ヘルペスウィルス（ｈｕｍａｎ 　ｂｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ）は非病原性になり（１３）、豚の ジュードラビーウィルスも非病原性になる（１４）。

繰り返し領域部分を除去すると、ヒト単純ヘルペスウィルスは非病原性になる（ １６，１７）。繰り返し領域は、ウィルス性発癌に関連したマレック病ウィルス （Ｍｘｒｅｋ’ｓ　ｄｉｓｕｓｅｖｉｒｕｓ）で同定されている（１８）。ヘル ペスウィルスサイミリ（ｈｅｒｐｅｓｖｉｔｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ）にも同様に 、発癌性と相関する部分がある（１９）。繰り返し領域部分を除去すると、ジュ ードラビーウィルスは非病原性になる（米国特許４．８７７、７３７号、１９８ ９年１０月３１日発行）。天然に存在するジュードラビーウィルスのワクチン菌 株には欠失している部分があり（７゜１５）、これらの欠失は、少なくともこれ ら菌株の病原性の欠如に一部関係していることがわかっている。

ヘルペスウィルスはゲノムの様々な部分にＤＮＡの非必須領域を含んでおり、こ の領域の改変によって該ウィルスが非病原性になり、ワクチンを誘導できる非病 原性株の作製が可能であることについては一般に認められている。ウィルスの弱 毒化の程度は、ワクチンとしてのウィルス利用性にとって重要である。欠失はウ ィルスの過度の弱毒化を引き起こし、ワクチンが適度な免疫応答を誘発できない 結果となる。欠失による弱毒化の幾つかの例が知られているが、欠失の適切な組 み合わせについては明らかでない。

ジュードラビーウィルスの天然のホストは豚であり、その感染は通常は明瞭では ないが、発熱、痙掌および麻痺によって特徴付けられ得る。ジュードラビーウィ ルスは家畜、山羊、犬、猫、狐、ミンクにも感染し、これらに感染するとホスト は通常は死に至る。ジュードラビーウィルス感染の目にみえる顕著な特徴は激し いかゆみであり、ホストの感染部分領域の損傷を招く。臨床的徴候が現われてか ら通常は２．３日以内に、過度の興奮、発作、麻痺、脳を髄炎の全症状が現われ 、死に至る。

豚におけるジュードラビーウィルス病は、政府機関の世界規模での重大関心事で ある。合州国では、感染した家畜の群れからの豚は畜殺場へ回す以外、売買でき ない。合州国農業省は、ジュードラビーを排除するために撲滅計画を制定した。

特定の特異的ワクチン（ｄｉｆｆｅｒ！ｎｔｉａｌ　ｖａｃｃｉｎｅ）や診断テ スト手引が開発される以前には、ジュードラビーウィルスについてワクチン接種 された動物は、それが感染したものとして扱われ、同様の規制の下に置かれた。

特異的ワクチンの出現に伴って、州一連邦共同のジュードラビーウィルス撲滅計 画（Ｆｅｄｃｒａｌ　Ｒｅｇｉｓｔｅｒ、　Ｍｏ１．　５５．　Ｎｏ、９０．ｐ ｐ、１９２４５−１９２５３（Ｍａｙ９．　１９９０＞）で使用が認可されてい る特異的ワクチン／診断テストを施したワクチン接種済の非感染豚については、 周間で出荷ができるように規制が改変されてきた。

特異的ワクチンの構築に際しては、ＰＲＶの糖蛋白質の一つを欠失させることに 関心が集められてきた。理論的には、診断標識として選定される糖蛋白は次のよ うな特徴をもつべきとされる。（１）当該糖蛋白およびその遺伝子は、伝染性の ウィルスの産生に非必須のものでなければならない。（２）当該糖蛋白は、動物 内で強力且つ持続した反応を誘発しなければならない。（３）当該糖蛋白は、防 御的免疫反応に寄与してはならないｏ　ｇ　Ｄ＝　ｇ　ＨおよびｇＢ　（ＩＩ） 　（２５）の三種の糖蛋白は、第一の基準に当てはまらない。これらは夫々、必 須であることが証明されている、単純ヘルペスウィルス（ＨＳ　Ｖ）中のカウン ターパートを有している（２０）。また、ｇ６３は希少な糖蛋白であり、主要な 血清反応を誘発するとは思わない（８）。ｇ　ＩＩ＋は中和抗体のターゲットと して（１０）、また細胞媒介性免疫のターゲットとして（２１）防御免疫に寄与 することが分かっている。ｇｌもまた中和抗体のターゲットであり（２２）、防 御的免疫において役割を果たすと思われる。ｇｐＸだけが、上記三つの理論的基 準金てに適合する（２５）。

現在のところ、ＵＳＤＡ認可を受けた五つの改良型特異的ＰＲＶ生ワクチンが入 手可能である。それらはＰＲＶ／マーカー（Ｓｙｎ＋ｒｏＶｅｊ　Ｉｎｃｏｒｐ ｏｔａｊｃｄ）　、）ルビド（Ｔｏｌｖｉｄ）　ＣＵＰ！’）ｈｎ）　、ＰＲＶ ワクチン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ＜ｒ　ＩＩｇｅｌｈｅｉｍ）　、ＰＲＶａｃ　（Ｓ ｍｉｊｈＫｌｉｎ！Ｂｅｅｃｈａｍ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｅａｌｔｈ）およびオム ニマーク（ＯｍｎｉＭａｒｋ）　（Ｆｅｒｍｅｎｊａ　Ａｎｉｍａｌ　１ｌｅａ ｌｊｈ）である。これらワクチンの夫々のための診断テスト手引は、三つのＰＲ Ｖ糖蛋白（ｇｐＸ、ｇＩまたはｇｌｒｌ）の一つに対して向けられている。各々 の場合、診断用の糖蛋白をコードする遺伝子は、遺伝子工学によって改変されて いるか、或いは天然に存在するウィルス中において欠失しているかのいずれかで ある。ＰＲＶ／マーカー及びトルビドで欠失している診断マーカーはｇｐＸで、 これは遺伝子工学技術で改変されている。ＰＲＶワクチンおよびＰＲＶａｃは、 天然に存在するウィルスからｇＩが自然に欠失したウィルスを含んでいる。オム ニマークでは、遺伝子工学の結果ｇ　ＩＩ＋が欠失している。

ジュードラビーの撲滅計画が進むに従い、確認診断テストが重要となろう。各々 の診断抗原の抗原性が異なるため、また個々の動物の免疫応答の性質に起因して 、診断抗原に対する抗体の量は広範囲に亘って変化し得る。確認テストに用いら れ得る第二の診断マーカーを含むワクチンが、重要な価値を有するであろう。血 清学的差別化をはかるために、二つの糖蛋白の欠失を伴う二つのウィルス株が提 唱されてきた。−つはキット（Ｘ目）らにより記載されているもので（Ｕ、Ｓ、 特許４．７１１．８５０号）、遺伝子工学によるＧ１１ｌの欠失と、自然に発生 するｇｌの欠失とを有している。前述したように、これら二つの糖蛋白は中和抗 体のターゲットであり、またｇ　ＩＩＩは細胞媒介性免疫のターゲットでもある 。これらの重要な抗原の両方が欠失していると、ワクチンの有効性が妨げられる と予想される。ポスト（Ｐｏｓｔ）らによって記載された第二のウィルス（２５ ）は、ｇｐＸおよびｇＩの両遺伝子における欠失を含めるために、遺伝子的に加 工されている。著者等は、これらのウィルスが、ｇｐＸのみを欠失させたウィル スに比較して効果が著しく劣ると結論した。要するに、当該技術の現状は、ｇｐ ＸおよびｇＩの両者を欠失したウィルスはワクチンとしては有効ではないであろ うことを示している。

現在利用されているワクチンより優れたワクチンは、次のような特徴を持つと思 われる。（１）生後３−４日の小膝において臨床的徴候は現われない；（２）全 年齢の豚に対して、９５％の防御率を与える；（３）野生型に感染した動物との 血清学的差別を可能にする；（４）確認診断テストができる。本発明は、ｇｐＸ およびｇｌの両者における特定の領域を欠失させることによって、思いがけなく も、この様な優れたワクチンを提供するものである。

〔発明の概要〕

本発明は特に、５−ＰＲＶ−１５５と命名された、遺伝的に加工され且つ弱毒化 されたジュードラビーウィルス（ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ）を提供する。本発明は また、有効な免疫量の遺伝子的に加工され且つ弱毒化されたジュードラビーウィ ルス（Ｓ−ＰＲＶ−１５５と命名されたもの）と、適切なキャリアーとを含有す るワクチンを提供する。本発明は更に、ジュードラビーウィルスによって惹起さ れる疾患に対して動物を免疫化する方法であって、本発明のワクチンのを有効免 疫量を前記動物に投与することを具備した方法を提供する。最後に本発明は、本 発明のワクチンを接種された動物を、天然に存在する野生型ジュードラビーウィ ルスに感染した動物から区別する方法を提供する。

〔図面の簡単な説明〕

図１： ＰＲＶ株ＩＳＵ　Ｓ６２／２６の詳細。特有の長い内部繰り返し領域、特有の短 い領域、および末端リピート領域を示すＰＲＶゲノムＤＮＡ図。酵素ＢａｍＢＩ 、　Ｘｂａｌ、　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩの制限酵素地図が示されている。サイズを縮 小するために、断片を番号化あるいは記号化しである。特異的な短い領域は、詳 細を示すため拡大しである。幾つかの遺伝子の位置が示されている：これら遺伝 子は、糖蛋白ＩＩ　（ｇｌｌ）　（２４）　、糖蛋白ＩＩＩ（ｇｌｌｌ　＞　（ ２３）　、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、即時的初期遺伝子（ｉｎ＋ｍｅｄｉａｊ ｅ　ｅａｒ１７　ｇｅｎ；　Ｉ　Ｅ）　、プロティンキナーゼ（ＰＫ）（３）、 糖蛋白Ｘ　（ｇｐＸ）（４）、糖蛋白５０（ｇ５０）　（５）　、糖蛋白６３　 （ｇ６３）　（６）　、糖蛋白Ｉ（ｇＩ）（６）である。

図２： 相同ベクター２６３−５８．１８におけるＤＮＡの挿入の詳細。

プラスミド２６３−５８．１８を組み立てるＤＮＡ断片の方向性を示す図。各々 の断片の起源が表に示されている。断片間の接合部に位置する配列も示しである 。各々の断片を生成するために使用する制限酵素切断部位、並びに該断片を接合 するために使用する合成リンカ−配列が、各々の接合部について記載されている 。合成リンカ−配列には太線で下線が引いである。

また、幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置が示されている。次のよ うな簡略化が用いられている。０の中の数字は、図１に示した参照に対応するア ミノ酸を示す。

［］中の制限酵素切断部位は、構築の間に破壊される残余部位を示す。下記の略 号が用いられるニブロチインキナーゼ（ＰＫ）、糖蛋白Ｘは（ｇｐｘ）、糖蛋白 ５０は（ｇ５０）、糖蛋白６３　（ｇ６３）　、ジュードラビーウィルス（ＰＲ Ｖ）、ポリアゾニレ−ジョン信号（ｐＡ）。

図３： 相同ベクター４１６−０９．２ＢへのＤＮＡ挿入の詳細。プラスミド４１６−０ ９．２Ｍを組み立てるＤＮＡ断片の方向性を示す図。

各々の断片の起源を表に示す。断片間の夫々の接合部に位置する配列も示しであ る。各々の断片を生成するために使用する制限酵素切断部位、並びに該断片を接 合するために使用する合成リンカ−配列が、各々の接合部について記載されてい る。合成リンカ−配列には太線で下線をり匹）である。幾つかの遺伝子コード領 域および調節要素の位置が示されている。

次のような簡略化が用いられている。０の中の数字は図１に示した参照に対応す るアミノ酸を示す。［］中の制限酵素切断部位は、構築の間に破壊される残余部 位を示す。下記の略号が用いられるニブロチインキナーゼ（ＰＫ）、糖蛋白Ｘ（ ｇｐＸ）、糖蛋白５０は（ｇ５０）、糖蛋白６３（ｇ６３）。

ジュードラビーウィルス（ＰＲＶ）、ポリアゾニレ−ジョン信号（ｐＡ）。

図４＝ 相同ベクター４３６−８６．３２ｘへのＤＮＡ挿入の詳細。プラスミド４３６− ８６．３Ｋを組み立てるＤＮＡ断片の方向性を示す図。

表には各々の断片の起源が示されている。断片間の夫々の接合部に位置する配列 も示しである。各々の断片を生成するために使用する制限酵素切断部位、並びに 断片を接合するために使用する合成リンカ−配列が、各々の接合部について記載 されている。合成リンカ−配列には太線で下線を引いである。

幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置が示されている。次の簡略化が 用いられている。０の中の数字は、図１に示した参照に対応するアミノ酸を示す 。［］中の制限酵素切断部位は、構築の間に破壊される残余部位を示す。下記の 略号が用いられているニブロチインキナーゼ（ＰＫ）、糖蛋白Ｘは（ｇｐＸ）、 糖蛋白５０　（ｇ５０）　、糖蛋白１（ｇＩ）。

ジュードラビーウィルス（ＰＲＶ）、ヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）、 ポリアゾニレ−ジョン信号（ｐＡ）。

〔発明の詳細な説明〕

本発明は５−ＰＲＶ−１５５と命名された、遺伝的に加工され且つ弱毒化された ジュードラビーウィルス（ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ）を提供する。５−ＰＲＶ−１ ５５ジユードラビーウイルスは、特許手続上の微生物の国際的寄託に関するブタ ベスト条約に準じ、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲの下に、アメリカ合衆国メリーランド 州ロックウィルパークローンドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｙｅ、　Ｒｏ ｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｓｒ７１ｉｎｄ　２０８５２゜Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）のアメ リカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている。本発明はまた、有効な 免疫量の遺伝子的に加工され且つ弱毒化されたジュードラビーウィルス（Ｓ−Ｐ ＲＶ−１５５と命名されたもの）と、適切なキャリアーとを含有するワクチンを 提供する。該ワクチンは、不活性化された又は生のジュードラビーウィルス５− ＰＲＶ−１５５の何れかを含む。

ジュードラビーウィルスの適切なキャリアは当該技術において周知であり、蛋白 、糖等を含む。この様な適切なキャリアの一例は、安定化され加水分解された蛋 白、ラクトース等のような一以上安定化剤を含有する生理学的に均衡のとれた培 地である。

一般に、本発明のワクチンは有効免疫量（１０３〜１０９ＰＦＵ　／ｄｏｓｅ） の５−ＰＲＶ−１５５ウイルスを含む。好ましくは、生ワクチンの有効免疫量は 約１０’〜１０’　ＰＦＵ／ｄｏｓｅ、不活性化ワクチンの有効免疫量は約１０ ７〜１０９ＰＦＵ　／ｄｏｓｅである。生ワクチンは、好ましくは組織培養液を 採取し、安定化され加水分解された蛋白等の安定化剤を配合することによって製 造される。不活性化ワクチンは、ウィルスを不活性化した直後の組織培養液を直 接使用するのが好ましい。

本発明はまた、ジュードラビーウィルスによって惹起される病気に対して動物、 特に豚を免疫化する方法であって、本発明のワクチンの有効免疫量を前記動物に 投与することを具備した方法を提供する。ワクチンは、当業者に周知の方法、例 えば筋肉注射、皮下注射、腹腔内注射、静脈注射等の何れの方法によっても投与 できる。或いは、ワクチンは鼻孔内投与または経口投与され得る。

本発明はまた、本発明のワクチンを接種した動物と天然に存在する野生型ジュー ドラビーウィルスに感染した動物とを区別する方法を提供する。この方法は、ｇ ｌ）Ｘの存在および天然に存在する野生型ジュードラビーウィルスに感染した動 物中に通常発現する少なくとも一つの他の抗原の存在について、動物からの採取 した体液のサンプルを分析することと、該体液中に前記抗原およびｇｐｘが存在 するか否かを決定することとを具備する。体液中に前記抗原が存在し且つｇｐｘ が存在しないことは、その動物がワクチン接種されたものであり、天然に存在す る野生型ジュードラビーウィルスには感染していないことを示す。体液中におけ る前記抗原およびｇｐＸの存在は、例えば、体液中において、前記抗原およびｇ ｐＸに特異的な抗体を検出することを含む様々な方法で決定され得る。本発明の ワクチンを接種した動物と、天然に存在する野生型ジュードラビーウィルスに感 染した動物とを区別する方法は、更に、ｇｌの存在についてサンプルを分析する ことを具備し得る。体液中に前記抗原が存在し且つｇｌが存在しないことは、そ の動物がワクチン接種されたものであり、天然に存在する野生型ジュードラビー ウィルスには感染していないことを示す。この出願において、天然に存在するジ ュードラビーウィルスとは、遺伝子工学的操作のされていないジュードラビーウ ィルスを意味し、その中には野生型シロニードラビーウィルスと、天然に存在し 且つ自然の欠失をもったジュードラビーウィルスから選ばれるジュードラビーウ ィルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。この出願において、非 必須の遺伝子とは、ウィルスの複製に必要でない遺伝子を意味する。

本発明はまた、本発明のワクチンを接種した動物と天然に存在する野生型ジュー ドラビーウィルスに感染した動物とを区別するもうひとつの方法を提供する。こ の方法は、ｇＩの存在および天然に存在する野生型ジュードラビーウィルスに感 染した動物中に通常発現する少なくとも一つの他の抗原の存在について、動物か らの採取した体液のサンプルを分析することと、該体液中に前記抗原およびｇＩ が存在するか否かを決定することとを具備する。体液中に前記抗原が存在し、ｇ ｌが存在しないことは、前記動物がワクチン接種したものであり、天然に存在す る野生型ジュードラビーウィルスに感染していないことを示す。

５−ＰＲＶ−１５５を含むジュードラビーウィルスを構築し、選別し、精製する 方法は、次に述べる「材料および方法」の項で詳述する。

〔材料および方法〕

ジュードラビーウィルスのストックサンプルは、２　ｍＭのグルタミン、１００ 単位／１のペニシリン及び１００単位／ｍｌのストレプトマイシン（これらの成 分はＩｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社または同様の供給業者から入手でき る）を含有するダルベツコ改良イーグル（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　−ｓ　Ｍｏｄｉｆ ｉｅｄ　Ｅａｇｌ＊　（ＤＭＥ））培地（以後、完全ＤＭＥ培地と呼ぶ）に牛胎 児の血清を１％加えた培地中において、細胞あたり０．０１プラ一ク形成単位（ ＰＦＵ）の感染多重度でベロ（Ｖｅｒｏ）細胞に感染させることにより調製され る。細胞変性効果が現れた後、培地および細胞を回収し、細胞を５分間、３００ Ｏｒｐｍの臨床遠心分離機で遠心してペレット状にした。元の体積の１／１０の 培地中に細胞を再懸濁させ、二重オートクレーブ処理したスキムミルク（水中の ９％（ｗｇｊ＃ｏｌ）スキムミルク）を等量加えた。ウィルスサンプルを二重凍 結および解凍し、小分わけし、−７０℃で凍結貯蔵した。力価は、通常１０’　 ＰＦＵ／ｍｌであった。

ＰＲＶのタイター測定 ＰＲＶのタイター測定のために、ベロ細胞を６０ｍｍのペトリ皿に５　Ｉ　１０ ’細胞／ｍｌ濃度でブレーティングした。次の日に、成育培地（完全培地ＤＭＥ ＋１０％牛脂児血清）を３．０ｍｌ／皿の維持培地（完全培地ＤＭＥ＋　１％牛 脂児血清）と置換した。

ウィルスストックを維持培地で１：１０’、１０’、１０６゜１０７，１０８に 希釈した。これらの希釈液の１．０１を多血に添加した。皿は３７℃、二酸化炭 素５％の湿式インキュベーター中に４時間置かれた。次いで培地を吸引し、夫々 の皿に対して、２１１１Ｍのグルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１０ ０単位／　ｍ　Ｉのストレプトマイシン、および２％牛脂児血清を含有する２× の最低必須培地（ＭＥＭ）中において、最終濃度０．７５％の低温溶融アガロー ス５．Ｏｍｌをオーバーレイした。

アガロースを定着させるために皿を３０分室温に放置し、次いで二酸化炭素５％ の湿式インキュベーター中に３日間静置した。プラークをカウントし、ＰＦＩＩ ／ｍｌを計算した。

ＰＲＶ−ＤＮＡ（７）ｇ製 ＰＲＶ−ＤＮＡを調製するために、２５ｃｍ’フラスコまたは６０　ｍｍｍペリ 皿内におけるベロ細胞の集密細胞単層に対して、培地１ｍｌ中のウィルスサンプ ル１００　ｕｌを感染させた。二酸化炭素５％の湿式インキュベーター中に、３ ７℃で１〜２時間放置して吸着を促進させた。吸着後、４ｍｌの完全ＤＭＥ培地 ＋１％牛脂児血清を加えた。−晩インキユベーションした後、または細胞が１０ ０％の細胞変性効果を示したときに、細胞スクレーパー（コースタ−ｆｃｏｉｓ ｊ！ｒ）ブランド）を用いて細胞を培地中に擦り入れた。細胞および培地を５分 間、３００Ｏｒｐｍの臨床遠心分離機で遠心した。培地を捨て、細胞ペレットを ０、　ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５，ＩｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．５％Ｎｏａｉ ｄｅｊ　Ｐ−４０（ＮＰ４１））を含む０．５ｍｌ溶液中にゆっくり再懸濁した 。サンプルを室温で１０分インキュベーションした。次いで、ＲＮａｓｅ　Ａ（ シグマ）のストック溶液１０ｕ１を添加した（ストックは１０　ａ＋ｇ／ｍｌで 、ＤＮｉｓｅを失活させるために１０分煮沸した）。サンプルを５分間、３００ Ｏｒｐｍの臨床遠心分離機で遠心し、核をペレット化した。パスツールピペット または木製の棒で、ＤＮＡペレットを除去して捨てた。上澄液を、２０％ドデシ ル硫酸ナトリウム（シグマ社）２５ｕｌ及び２５ｕ１のプロテナーゼーＫ　（Ｌ ｏｎｇ／ｍｌ。

ベーリンガーマンハイム社）を含む１．５ｍｌのエペンド６ルフ管に注いだ。サ ンプルを掻き混ぜ、３７℃で３０〜６ｏ分インキュベーションした。同量の水飽 和フェノールを加え、サンプルをポルテックス攪拌機上で攪拌した。サンプルを エペンドルフ・ミニ遠沈管に入れ、最高速度で５分間遠心した。上部の水層を新 しいエベンドルフ管に採取し、２倍量の−２０’Ｃの無水エタノールを添加し、 該エベンドルフ管を−２０’Ｃで３０分間静置し、核酸を沈殿させた。エペンド ルフ遠心機内において、サンプルを４℃で５分間遠心した。上澄液を捨て、ペレ ットヲ８０％冷エタノールで一回洗浄した。１７ｕ１の水でペレットを再水和し た。大量のＤＮＡを調製するために、手順のスケールアップをはかり、８５０ｃ ｍ２のローラーボトルのベロ細胞から始めた。得られたＤＮＡを、水または０． 　ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７、５、１ｍＭ　ＥＤＴＡ中に４℃で貯蔵した。

フェノール抽出 ＤＮＡサンプルのフェノール抽出は任意の量で行われるが、典型的には、１００ 　ｕｌから１１のＤＮＡサンプルで行われる。

ＤＮＡサンプルを０．　ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７、５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ中に 希釈し、同量の水飽和フェノールを添加した。サンプルをポルテックス攪拌機上 で手順に攪拌し、水上に３分間静置した。マイクロ遠心機で３分間遠心した後、 水層を新しい管に採取し、エタノールで沈殿させた。

エタノール沈殿 サンプル中のＤＮＡをエタノール沈殿によって濃縮した。

該ＤＮＡサンプルに、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７，５）および３ 倍量の冷エタノールを添加した。ＤＮＡを一７０’Ｃで３０分間、あるいは〜２ ０℃で一晩で沈殿させ、４℃で１５分間マイクロ遠沈機で遠心してペレット化し た。このペレットを２００　ｕｌの８０％冷エタノールで洗浄し、４℃で１０分 間、再度ペレット化した。空気乾燥または凍結乾燥した後、適切な緩衝液または 水の中にペレットを再懸濁させた。

制限酵素消化分解 製造業者（ｉＢＩ、　ＢＲＬ、　Ｎｅｗ　ＥｎｇＩａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｇ等） が推薦する緩衝液を使用して、ＤＮＡを制限酵素で切断した。ＤＮＡの濃度をで きるだけｌ　ｕｇ１５０　ｕｌ以下に保った。インキュベーションを３７℃で１ 〜４時間行った。

ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動 ＤＮＡの制限酵素パターンを可視化するために、５ｕｌのローディング緩衝液（ ５Ｘ電気泳動緩衝液、０．０１％のブロムフェノールブルー、５０ｍＭ　ＥＤＴ Ａ、５０％グリセロール）を添加した。サンプルを、０．６％〜３．０％のアガ ロースゲルを含む水平潜水型電気泳動ユニットのレーンにかけた。電気泳動緩衝 液は、４０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡを酢酸でｐＨ７，８に調整 し、且−）０．５ｕｇ／ｍｌの臭化エチジウムを添加し又は添加しなかったもの である。ゲルを４０〜５０ボルトで１８時間泳動し、０．５　ｕｇ／ｍｌの臭化 エチジウムで３０分間染色し、長波長ＵＶトランスイルミネーターでＤＮＡバン ドを可視化した。

連結 ＤＮＡを、酵素Ｔ４・ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ　）の作用で連結した。連結反応 物には、０．２〜２０　ｕｇの様々な量のＤＮＡと、２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐ Ｈ７，５と、１０　ｍＭ　ＭｇＣｈと、１０　ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ ）と、２００　ｕＭ　ＡＴＰと、２ｏ単位のＴ４　−ＤＮＡリガーゼとが、１０ 〜２０ｕｌの最終反応容積中に含まれている。

連結は、１５℃で３〜１６時間行なわれた。

ＤＮＡのサザンブロテインング サザンプロテイングでは、非放射性のＤＮＡラベリングと検出キット（ベーリン ガーマンハイム社）を用い、製造業者が推薦する方法に従った。

グラハム（Ｇｒａｈａｍ）およびファンφデル・ニブ（Ｖ口ｄｅｒＥｂ）のリン 酸カルシウム法（１）を基礎として、次の改変が加えられた。ウィルスＤＮＡお よび／またはプラスミドＤＮＡを、０．　ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５，Ｉｍ Ｍ　ＥＤＴＡ中で２９８　ｕｌに希釈した。

２ＭのＣａＣｌ２４０　ｕｌを加え、続いて同量の２　Ｘ　ＩＩＩＥＰＥＳ食塩 緩衝液（１０ｇのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジンＮ−−２−エタンスルホ ン酸（ＨＥＰＥＳ）ト、食塩１６ｇと、０．７４ｇノ塩化カリウムと、０．２５ ｇのリン酸水素二ナトリウムと、２ｇのデキストランとを水１リットルに加え、 水酸化ナトリウムでｐＨを７．４に緩衝したもの）を加えた。混合物を氷上で１ ０分間インキュベーションし、６０　＋１１０１ベトリ皿内の５１の培地（ＤＭ Ｅ　＋２％牛脂児血清）下において増殖しているベロ細胞の８０％集密的単層に 滴下した。二酸化炭素５％の湿式インキュベーター中で、細胞を３７℃で４時間 インキュベーションした。次いで、細胞を１ｘＰＢｓ（水１リットル当り、１． １５ｇのリン酸水素二ナトリウム、０．２ｇのリン酸二水素カリウム、０．８ｇ の塩化ナトリウム、０．２ｇの塩化カリウム）のアリコート５ｍ１で三回洗浄し 、５ａ＋１の培地（ＤＭＥプラス２％の牛胎児血清）を供給した。ウィルスから の細胞変性効果が５０〜１００％になるまで、細胞を上記のように３７℃で３〜 ７日間インキュベーションした。ウィルスストックの調製のために、上記のよう にしてウィルスを回収した。このストックはトランスフェクションストックと呼 ばれ、続いて「組換ＰＲＶのプルオガルスクリーン（ＢＬｔｌＯＧＡＬ　５ＣＲ ＥＥＮ）Ｊによって組換ウィルスのスクリーニングを行った。

組換ＰＲＶを創製するための相同組換法この方法は、ＰＲＶ−ＤＮＡとプラスミ ド相同ベクターＤＮＡとをベロ細胞に同時トランスフェクトしたときに、両者の 間に起こる相同組換に基いている。適当なＰＲＶクローン化配列配列側面に配置 された外来ＤＮＡを含んだ０．１−１．ＯｕｇのプラスミドＤＮＡ　（相同ベク ター）を、約０．３１ｇの完全なＰＲＶφＤＮＡと混合した。このＤＮＡは０． 　ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７、５，１ｍＭ　ＥＤＴＡで２９８　ｕｌに希釈され 、「遺伝子組換ウィルスを創製するためのＤＮＡトランスフェクション」　（上 記参照）に準じてベロ細胞にトランスフェクションされる。

遺伝子組換ＰＲＶを創製するための直接連結技術々は、相同ベクターを用いて相 同的組換により組換ウィルスを創製するのではなく、直接連結によりＰＲＶを製 造する技術を開発した。この方法では、クローンされた外来ＤＮＡは、その両側 面にＰＲＶ−ＤＮＡが配置される必要はなく、プラスミドベクターから外来遺伝 子断片を切り出すために用いる制限酵素消化部位を有することだけが必要とされ る。ＰＲＶ−ＤＮＡを切り出すために、適合した制限酵素が使用された。この技 術で必要とされるのは、ＰＲＶ−ＤＮＡの消化分解に使用される酵素が限られた 切断部位を有し、少なくとも一箇所の非必須切断部位を有することである。我々 は、ＰＲＶ−ＤＮＡを二箇所で切断するＩｂａｌを使用した。また、我々はＰＲ Ｖ・ＤＮＡを四箇所で切断するＢｉｎｄ　ＩＩＩを使用した。

他の方法で予めＰＲＶに導入された制限酵素部位も使用できる。ＰＲＶφＤＮＡ を３０倍モルの過剰プラスミドＤＮＡと混合しく通常、プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　 １０ｕｇに対して５ｕｇのウィルスＤＮＡ）、混合物を適切な制限酵素で切断し た。ＤＮＡ混合物は、制限酵素を除くためにフェノールで抽出され、エタノール で沈殿され、上記に詳述した連結方法で結合された。次いで、連結されたＤＮＡ 混合物は、２９８　ｕｌの０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７、５，１ｍＭ　ＥＤＴ Ａ中に再懸濁され、「遺伝子組換ウィルスを創製するためのＤＮＡトランスフェ クション」　（上記参照）に準拠してベロ細胞にトランスフェクションされた。

直接連結法は、ＰＲＶからＤＮＡを欠失させるためにも使用され得る。適当な制 限酵素部位が両側に配置された非必須ＤＮＡは、このような酵素でＰＲＶを消化 し、再連結するこによって欠失され得る。直接連結法による組換ウィルスの生成 頻度が十分に高いので、スクリーニングは、トランスフェクションストックから ランダムに選んだプラークを制限酵素分析することによって達成され得る。

組換ＰＲＶのプロガル（Ｂｌｕｏｇａｌ）スクリーンニング大腸菌βガラクトシ ダーゼマーカー遺伝子が組換ウィルスに取り込まれた場合、組換体を含んでいる プラークは簡単な分析によって可視化される。プラーク分析の間に、化学物質Ｂ ｌｕｏｇａｌ”　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１ａｂｓ）がアガロ ースオーバーレイゲルに取り込まれ（２００ｕｇ／ｍｌ　）　、活性βガラクト シダーゼを発現したプラークは青色に変わった。この青色プラークを新鮮なベロ 細胞に入れ、再び青色プラークを単離することで精製した。大腸菌βガラクトシ ダーゼマーカー遺伝子を除去する組換ウィルス戦略において、分析には、バック グラウンド青色プラークから白色プラークを精製することが含まれる。何れの場 合も、典型的には三回のプラーク精製でウィルスは精製される。

欠失ウィルスの構築 欠失ウィルスの構築に使用される戦略には、相同組換および直接連結技術の両方 が含まれる。最初に、相同組換（ここでは欠失されるべき遺伝子が大腸菌βガラ クトシダーゼマーカー遺伝子で置換される）を経てウィルスが構築された。次に 、マーカー遺伝子を欠失させる直接連結によって、第二のウィルスが構築された 。この戦略においては、「組換ＰＲＶを創製するための直接連結方法」で述べた ように、最初のウィルスに導入されたマーカー遺伝子の両側に、制限酵素部位が 配置されていなければならない。この戦略の利点は、両ウィルスがｒ組換ＰＲＶ のためのプロガル（Ｂｌａｏｇａｌ）スクリーン」によって精製され得ることで ある。最初のウィルスは、白色のバックグラウンドから青色プラークを選別する ことで精製される。第二のウィルスは、青色のバックグラウンドから白色プラー クを選別することで精製される。ｇｐＸおよびｇｐｌ遺伝子コード領域を欠失さ せるために、三つの異なった相同ベクターが構築された。これら相同ベクターの 詳細を次に述べる。

相同ベクター２６３−５８．１８ プラスミド２６３−５８．１８は、ジュードラビーウィルスからｇｐＸ遺伝子コ ード領域を欠失させる目的で構築された。それは、両側にＰＲＶ−ＤＮＡが配置 された大腸菌βガラクトシダーゼマーカー遺伝子を含んでいる。該マーカー遺伝 子の上流は、ｇｐｘ初期転写生成物の最初の７アミノ酸（４）をコードする配列 で終端する約１３３０塩基対のＰＲＶ−ＤＮＡ断片である。前記マーカー遺伝子 の下流は、ｇｐＸ初期転写生成物の最後の１９のアミノ酸（４）をコードする配 列で始まる約１８００塩基対（７）ＰＲＶ−ＤＮＡ断片である。「組換ＰＲＶを 創製するための相同組換法」に準拠してこのプラスミドを使用すると、ｇｐｘ初 期転写生成物のアミノ酸８〜４７９をコードするＤＮＡが、マーカー遺伝子をコ ードするＤＮＡに置換される。なお、βガラクトシダーゼ（Ｉａｃｘ）マーカー 遺伝子は、内因性ｇｐＸプロモータの制御下にくることに留意されたい。該プラ スミドの詳細を図２に示す。該プラスミドは、標準組換ＤＮＡテクニック（２） を利用して、示されたＤＮＡ源から構築された。該プラスミドは、図２にあげた 合成りＮＡ配列と下記供給源からの制限酵素断片とを接合することによって構築 され得る。このプラスミドベクターは、ｐＳＰ６５（プロメガ社）のＳｍａ　ｌ からＰｖｕ　ＩＩまでの制限酵素断片（約２７９２塩基対）に由来する。断片１ は、Ｐ　ＲＶ　Ｂａｍ１ｌｌ制限酵素断片＃１０（１５）のＥｃｏＲＶからＳａ ｌ　Ｉまでの制限酵素断片（約９２２塩基対）である。断片２は、Ｐ　ＲＶ　Ｂ ａｍＨ１制限酵素断片＄１０（１５）のＳａｌ　ＩからＢａｎ　Ｈまでの制限酵 素断片（約４１２塩基対）である。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（１１） のＢａｍＢ１からＢａｌ　Ｉまでの制限酵素断片（約３３４７塩基対）である。

断片４は、Ｐ　Ｖ　ＲＢｌ！ＩＨＩ制限酵素断片＃７（１５）に由来するＮｄｅ 　Ｉから５ｔｕｌまでの制限酵素断片（約１８０３塩基対）である。接合部Ｂお よび接合部りに位置するＸｂｘ　１部位は該プラスミドの唯一のＸｂａ１部位で あり、マーカー遺伝子をＸｔｕ　Ｉ制限酵素断片として切り出すことができるこ とに注意されたい。

相同ベクター４１６−０９．２１１ プラスミド４１６−０９．２Ｂは、ジュードラビーウィルスからｇＩ遺伝子コー ド領域を欠失させる目的で構築された。それは両側にＰＲＶ−ＤＮＡが配置され た大腸菌βガラクトシダーゼマーカー遺伝子を含んでいる。そのマーカー遺伝子 の上流は、ｇＩ初期転写生成物の最初のアミノ酸（６）の約４６塩基対上流に位 置する配列で終端する、約１８８４塩基対のＰＲＶ・ＤＮＡ断片である。そのマ ーカー遺伝子の下流は、ｇｌ初期転写生成物の最後の１０５のアミノ酸（６）を コードする配列で始まる、約１３０９塩基対のＰＲＶ−ＤＮＡ断片である。「組 換ＰＲＶを創製するための相同組換方法」に準拠してこのプラスミドを使用する と、ｇＩ初期転写生成物のアミノ酸１〜４７２をコードするＤＮＡが、マーカー 遺伝子をコードするＤＮＡに置換される。βガラクトシダーゼ（１ＩＣ２）マー カー遺伝子は、ｇｐＸプロモータの制御下にくることに注意されたい。該プラス ミドの詳細を図３に示す。該プラスミドは、標準組換ＤＮＡ技術（２）を利用し て、示されたＤＮＡ源から構築された。該プラスミドは、図３に示した合成りＮ Ａ配列と下記供給源からの制限酵素断片とを接合することによって構築され得る 。このプラスミドベクターは、ｐｓＰ１９（プロメガ社）のＳｍａ　ｌからＢａ ｍＨＩまでの制限酵素断片（約３００９塩基対）に由来する。断片１は、ＰＲＶ ８ａｍＨｆ制限酵素断片＃７　（１５）の旧ｎｃｌｌからＤｒａｌまでの制限酵 素断片（約１８８４塩基対）である。断片２は、ＰＲＶＢａｍＨ２１１限酵素断 片＃１０（１５）のＳ！１１からＢａｔｎ　Ｅｌまでの制限酵素断片（約４１２ 塩基対）である。また断片３は、プラスミドｐＪＦ　７５１　（１１）のＢａｌ 旧からＢａｌ　Ｉまでの制限酵素断片（約３３４７塩基対）である。断片４は、 ＰＶＲＢａｍｌｌｌｌ制限酵素断片＃７（１５）に由来する５ｐｈｌからＢａｍ ＨＩまでの制限酵素断片（約１３０９塩基対）である。接合部Ｂおよび接合部り に位置するＸｂａ１部位は該プラスミドの唯一のＸｂａ　１部位であり、マーカ ー遺伝子をＸｂａｌ制限酵素断片として切り出すことができることに注意された い。

相同ベクター４３６−８６．３２に プラスミド４３６−８６．３２には、ジュードラビーウィルスからｇｐＸ遺伝子 コード領域を欠失させる目的で構築された。それは、ＰＲＶ−ＤＮＡが両側に配 置された、ＨＣＭＣで即時的初期促進された大腸菌βガラクトシダーゼマーカー 遺伝子を含んでいる。そのマーカー遺伝子の上流は、ｇｐｘ初期転写生成物の最 初の７アミノ酸（４）をコードする配列で終わる約１３３０塩基対のＰＲＶ−Ｄ ＮＡ断片である。そのマーカー遺伝子の下流は、ｇｐｘ初期転写物の最後の１９ のアミノ酸（４）をコードする配列で始ま約１８ｏＯ塩基対のＰＲＶ−ＤＮＡ断 片である。「組換ＰＲＶを創製するための相同組換法」に準拠してこのプラスミ ドを使用用すると、ｇｐＸ初期転写生成物のアミノ酸８〜４７９をコードするＤ ＮＡが、マーカー遺伝子をコードすＤＮＡで置換される。該プラスミドの詳細を 図４に示す。該プラスミドは、標準組換ＤＮＡ技術（２）を利用して、示された ＤＮＡ源から構築された。該プラスミドは、図４に示した合成りＮＡ配列と下記 供給源からの制限酵素断片とを接合することによって構築され得る。プラスミド ベクターは、ｐＳＰ６５（プロメガ社）の５ａｌｔ　ＩからＰｖｕ　Ｈまでの制 限酵素断片（約２７９２塩基対）に由来する。断片１は、Ｐ　ＲＶ　ＢａｍＨＩ 制限酵素断片＃１０（１５）のＥｃｏＲＶからＢａｍ　Ｂｌまでの制限酵素断片 （約１３３６塩基対）である。断片２は、ＨＣＭＶＸｂａｌ制限酵素断片Ｅ（１ ２）のＰｓ目からＡｖａｉｌまでの制限酵素断片（約１１９１塩基対）である。

断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１　（１１）のＢａｎ　１１ＩからＰｖｕｌｌ までの制限酵素断片（約３００２塩基対）である。なお、該断片は二つの内部Ｐ ｖｕ１１部位を含み、部分的なＰｖｕｌ［消化を必要とする。或いは、この断片 は部分的な消化を必要とせずに、二つの断片として得てもよい。これらの二つの 断片は、Ｂａｌ　２１１からＮｄｅｌまでの断片（約２９５０塩基対）と、Ｎｄ ｅｌからＰｙｕｌｌまでの断片（約５５塩基対）である。特有のＮｄｅ１部位で 接合されたこれら二つの断片は、断片３と置換可能である。断片４は、Ｐ　Ｖ　 ＲＢ！＋１１１１１制限酵素断片＃７（１５）から得たＮｄｅｌから５ｔｕｌま での制限酵素断片（約１８０３塩基対）である。接合部Ｂおよび接合部位Ｄに位 置するＸｂａ１部位は該プラスミドの唯一のＸｂｘ１部位であり、マーカー遺伝 子をＸｂａｌ制限酵素断片として切り出すことができることに注意されたい。

豚におけるワクチン接種の研究 ジュードラビーウィルスに感染していない瓶群の雌に生まれた日齢３日の豚を使 用して、弱毒化された生ウィルスの有効性をテストした。１０３〜１０５プラー ク形成ユニツト（ＰＦＵ　）を含むウィルス液１ｍｌを子豚に筋肉内注射した。

Ｐ　ＲＶ−１５５ウイルスもまた、不活性化ワクチンとしてテストした。該ウィ ルスは、二成分系エチレンイミンに３７℃で少なくとも４０時間さらして不活性 化された。不活性化ウィルス液をオイルベースアジュバントと混合して、適齢４ 週間の豚に接種した。

生５−ＰＲＶ−１５５またＧｉ不活性化５−ＰＲＶ−１５５の何れかを接種した 動物は、不利な反応（ＰＲＶの臨床的徴候）がでないかどうかについて、接種後 毎日観察された。生５−ＰＲＶ−１５５を接種した豚の鼻孔からの分泌を採取し 、ワクチンウィルスが他の動物に感染したり広がったりする能力があるか否かを 確認するために培養された。ＰＲＶ血清抗体量を測定することによって、また接 種後３〜４週間のワクチン接種した豚に感染力を持つウィルスを抗原投与するこ とによって免疫性を決定した。後者の場合には、ワクチン接種した動物とワクチ ン接種していない動物群とに、感染性ＰＲＶの肺炎性菌株（ｐｎｅｕｍｏｊｒｏ ｐｉｃ　５ｔｒａｉｎ；　ＶＤＬ４８９２）を、ワクチン接種していない豚の群 の少なくとも８０％にＰＲＶ疾患を惹起させる抗原投与量で接種した。抗原投与 された動物は、病気の徴候および鼻孔ウィルスの脱粒性について毎日観察された 。血清サンプルは抗原投与時、並びに接種後２〜３週間の間は一週毎に採取した 。血清は、血清中和（ＳＮ）抗体について試験され、またｇ　ｐ　Ｘ　ＣＨｅｒ ｄＣｈｅｋ”　、　ＩＤＥＸＩ　Ｃｏｒｐ、　）およびｇｐｌに対する抗体（Ｈ ｅｒｄＣｈｅｋ”　、　ＩＤＥＸＸ　Ｃｏｒｐ、　Ｃｌ１ｎＥａｓｅ。

Ｓｍ１ｔＨＩｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ）についても製造業者の推薦に従ッテ試験 された。

〔実施例〕

５−ＰＲＹ−１５０は、特有の長配列領域のＴＫ遺伝子における欠失と、繰り返 し領域における欠失と、ｇＩコード領域における１４６０塩基対の欠失と、ｇｐ ｘコード領域における１８２５塩基対の欠失とを有するジュードラビーウィルス である。大腸菌βガラクトシダーゼの遺伝子（１１Ｃ２遺伝子）がｇｐｘ遺伝子 の代わりに挿入され、ＨＣＭＶの即時的初期プロモータの制御下に置かれている 。

５−ＰＲＶ−１５０ハ、５−ＰＲＹ−００２カラ三ツノ中間つイルスノ構築を経 て誘導された（米国特許４．８７７、７３７号、１９８９年ｌＯ月３１日発行） 。最初の中間ウィルスは５−ＰＲＹ−０７０である。このウィルスにおいては、 次工程で他の位置あるＸｂｘｌ制限酵素部位を使用できるように、繰り返し領域 （図１参照）にあるｘｂａｆ部位がＥｃｏＲ１部位に変換された。これは、［組 換ＰＲＶを創製するための直接連結法」を利用して、合成オリゴヌクレオチドＣ ＴＡＧＧＡＡＴＴＣＣを５−ＰＲＶ−１）０２　（ＤＸｂｓ夏部位に挿入するこ とによって達成された。第二の中間ウィルス５−ＰＲＹ−０８９においては、ｇ ｐＸ欠失が、βガラクトシダーゼマーカー遺伝子に沿って導入された。これは、 相同ベクター２６３−５８．１８（「材料および方法」参照）と、「組換ＰＲＶ を創製するための相同組換法」における５−ＰＲｖ−０７０を利用して達成され た。

第三の中間ウィルス（５−ＰＲＹ−１１２）においては、βガラクトシダーゼマ ーカー遺伝子（ｌａｃＸ）が、「組換ＰＲＶを創製するための直接連結法」に記 載されているようにしてＸｂａ　Ｉで消化することにより除去された。最後に、 相同ベクター４１６−０９゜２Ｂ（「材料および方法」参照）と、「組換ＰＲＶ を創製するための相同組換法」におけるウィルス５−ＰＲＹ−１５３を使用して 、５−ＰＲＹ−１５０が創製される。５−ＰＲＹ−１５０の構造はＢａｍＨＩお よびＸｂａｌによる制限酵素分析によって確認された。

５−ＰＲＹ−１５１は、特有の長配列領域のＴＫ遺伝子における欠失と、繰り返 し領域における欠失と、ｇＩコード領域における１４６０塩基対の欠失と、ｇｐ Ｘコード領域における１８２５塩基対の欠失とを有するジュードラビーウィルス である。

５−ＰＲＹ−１５１ハ、５−ＰＲＹ−１５０（上記参照）からマーカー遺伝子を 除去したものである。これは、「組換ＰＲＶを創製するための直接連結方法」に 記載されているように、Ｘｂａｌによる５−ＰＲＹ−１５０ノ消化ニヨッテ達成 される。５−ＰＲＹ−１５１の構造は、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＪによる制限酵 素分析で確認された。

５−ＰＲＹ−１５１がジュードラビーウィルス病から豚を守るワクチンとして使 用可能か否かを決定するために、次の実験が行われた。この研究においては、次 のような筋肉注射により、日齢３日の子豚！、：５−ＰＲＹ−１５１を接種した ：４匹を１０’ＰＦＵで、また４匹を１０６で接種した。この研究では５匹の対 照グループも含めた。これら動物は、「豚におけるワクチン接種の研究」に記載 したようにして観察され、次いで抗原投与が行なわれた（下表Ｉ参照）。

（ＰＦυ／ｄｏｓｅ） １０４　４　≦２　４６　４１％　１００％　２０％１０６　４　≦２　９６　 ３３１００％　０無　５　＜２　１０　５５１００％　２０１　幾何学的平均タ イター（相互希釈）ｂ　ウィルス陽性の鼻孔分泌物サンプルのパーセント°　臨 床的徴候および／または呼吸器的徴候のある豚のパーセント本実験において、ワ クチン接種動物はすべて接種後も健康であった。また、扁桃腺分泌物中へのワク チンウィルスの放出はなかった。しかし、中和抗体は検出されなかった。感染性 ウィルスに抗原投与した後、両グループのワクチン接種動物はすべてＰＲＶ病の 臨床的徴候を現した。５−ＰＲＹ−１５１は日齢３日の子豚では安全であったが 、このウィルスはこれら動物における防御性を立証できなかった。

５−ＰＲＹ−１５４は、特有の長配列領域のＴＫ遺伝子における欠失と、繰り返 し領域における欠失と、ｇＩコード領域における１４６０塩基対の欠失と、ｇｐ Ｘコード領域における１４１４塩基対の欠失とを有するジュードラビーウィルス である。大腸菌βガラクトシダーゼの遺伝子（ｌｘｃ２遺伝子）がｇｐＸ遺伝子 の代わりに挿入され、ＨＣＭＶの即時的初期プロモータの制御下に置かれている 。

５−ＰＲＹ−１５４ハ、５−ＰＲＹ−００２カラ三ツ（Ｄ中間’）　イル７、Ｃ Ｄ構築を経て誘導された（米国特許４．８７７、７３７号、１９８９年１０月３ １日発行）。最初の中間ウィルスは５−ＰＲＹ−０７０である。このウィルスに おいては、次工程で他の位置にあるＸｂａｌ制限酵素部位を使用できるように、 繰り返し領域（図１参照）にあるＸｂｘ１部位がＥｃｏＲ１部位に変換され。こ れは、「組換ＰＲＶを創製するための直接連結法」を利用して、合成オリゴヌク レオチドＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣＣを５−ＰＲＹ−００２（７）Ｘｂｘ１部位に挿 入することによって達成された。第二の中間ウィルス５−ＰＲＶ−１４６では、 ｇｌ欠失が、βガラクトシダーゼマーカー遺伝子に沿って導入された。これは、 相同ベクター４１６−０９．２Ｈ（ｒ材料および方法」参照）と、「組換ＰＲＶ を創製するための相同組換法」における５−ＰＲＹ−０７０を利用して達成され た。第三の中間ウィルス（Ｓ−ＰＲＹ−１５３）では、βガラクトシダーゼマー カー遺伝子（ｌａｃｚ）が、「組換ＰＲＶを創製するための直接連結法」に記載 されているようにしてＸｂａｌで消化することにより除去された。最後に、相同 ベクター４３６−８６．３２Ｋ　（ｒ材料および方法」参照）と、「組換ＰＲＶ を創製するための相同組換法」におけるウイ／ｌ、ス５−ＰＲＹ−１５３を使用 して、５−ＰＲＹ−１５４が生成された。５−ＰＲＹ−１５４の構造はＢａｌｌ １ａｌとＸｔ＋ａｌによる制限酵素分析で確認された。

５−ＰＲＹ−１５５は、特有の長配列領域のＴＫ遺伝子における欠失と、繰り返 し領域における欠失と、ｇＩコード領域における１４６０塩基対の欠失と、ｇｐ Ｘコード領域における１４１４塩基対のが欠失とを有するジュードラビーウィル スである。

５−ＰＲＹ−１５５ジユードラビーウイルスは、特許手続きのため微生物の国際 的寄託に関するブタベスト条約に準じて、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲの下に、Ｐａｒ ｋｌａｖｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒ７１ａｎｄ　２０８５２．　Ｕ、Ｓ、Ａ、のアメリカンタイプカルチャー コレクションの特許カルチャー寄託部に寄託されている。

５−ＰＲＹ−１５５ハ、５−ＰＲＹ−１５４（上記参り　カラｖ−１−遺伝子を 除去したものである。これは、「組換ＰＲ／Ｖを創製するための直接連結法」に 記載されているようにして、１ｂａｌによる５−ＰＲＶ−１５５の消化ニヨッテ 達成される。５−ＰＲＹ−１５４）構造はＢａｍＨＩ及びＸｂｘＩによる制限酵 素分析で確認された。ｇｐｘおよびｇｌの欠失は、各々の遺伝子のコード領域に 対するプローブを用いたサザンプロット分析によって確認された。

下記の実験は、５−ＰＲＹ−１５５がジュードラビーウィルス病から豚を防御す るためのワクチンとして有用であること、並びに野生型感染から区別され得る免 疫反応を生じることを示している。

この研究においては、次のような筋肉注射により、日齢３日の子豚をニ５−ＰＲ Ｙ−１５５ヲ接種した。６匹ｉ、ｍｌ　０３ＰＦＵ　、　８匹に１０５ＰＦＵ、 ２０匹に１０３５ＰＦＵのウィルスを夫々接種した。夫々が５匹からなる二つの 対照グループを含めた。

これら動物は、「豚におけるワクチン接種の研究」に記載したようにして観察さ れ、次いで抗原投与が行なわれた（下表■参照）。

表１１ １０’　８　５　６０　０００ 無　５　＜２　２５　０　０　０ １０”　２０　４　３１６　０　０　０１０”　６７％”ＮＴｌ６％　２１％０ ０１０’　６２ＮＴ３７　１２　０　０ 無　１００　）ｆｆ　１００　５０．　１００％　０１０”　９０’　１０（１ ！％　１０（１３４００無　１００　１００　１００　７３　１００　８０％ａ 　幾何学的平均タイター（相互希釈）ｂ　抗原投与臼 ｃ　ｌ１ｅｒｄＣｈｓｋ　ｔｅｓｌ　；　陽性パーセントｄ　Ｃ１１ｎＥｘｓｅ 　ｔｅｓｌ　；　陽性パーセントｅ　抗原投与後１４日 ｆ　抗原投与後２１日 ｇ　ウィルス陽性の鼻孔分泌物サンプルのパーセント本実験において、ワクチン 接種動物はすべて接種後も健康であった。ＰＲＶに対する血清中和抗体を生成し 、また扁桃腺の分泌物中へワクチンウィルスを放出しなかった。感染性ウィルス を抗原投与した後は、三つのグループのワクチン接種動物はすべてＰＲＶ病に罹 患しなかったが、対照グループでは、一つのグループで８０％の死亡率であった ことを含め、対照グループの全動物がＰＲＶ病の臨床的徴候を示した。

ワクチン接種および抗原投与された動物から採取した血清サンプルを、ｇＸ　Ｈ ｒｒｄＣｂｔｋテスト、ｇ　Ｉ　ＨｅｒｄＣｈ！にテストおよびＣ１Ｃ１１ｎＥ ａテストで分析した。予想したように、５−ＰＲＶ−１５５を接種した豚は、抗 原投与試験まではｇｐＸおよびｇＩについて血清的に陰性（ｓ！ｒｏ−ｎｅｇａ 目ＶＺ）であった。野生型ウィルスを抗原投与したとき、ワクチン接種動物はジ ュードラビーウィルス病からワクチン接種により防御された。しかし、ワクチン 接種動物は抗原株により無症状的に重感染しており、従って、誘発時にｇｐＸお よびｇＩに対する抗体を産生じたと考えられる。

表１１に示すように、５−ＰＲＶ−１５５を接種した豚は、野生型ウィルスによ る抗原投与後までは、ｇｐＸおよびｇｌについて血清的に陰性であった。抗原投 与の１４日後までに、接種動物ではｇｐＸおよびｇＩについて血清的反転（ｓｓ ｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）が始まった。これらの結果は、５−ＰＲＶ−１５５ が有効なワクチン株であり、これによって、野生型ウィルスに感染した動物から 簡単な血清診断試験により区別できるワクチン接種が可能となることを示してい る。

例５ 下記の実験は、不活性化５−ＰＲＹ−１５５がジュードラビーウィルスから豚を 防御するワクチンとして使用でき、野生型感染から区別できる免疫反応を生じる ことを示している。５匹の若い血清的に陰性の豚を、「豚におけるワクチン接種 の研究」に記載したようにして、不活性化５−ＰＲＹ−１５５ワクチンで一回接 種を行った。不活性化５−ＰＲＹ−１５５ワクチンは１０７３ＰＦＵ／投与のウ ィルス濃度であった（下表ＩＩ＋参照）。

・　幾何学的平均タイター（相互希釈）ｂ　セロコンバージョンパーセント Ｃウィルス陽性の鼻孔分泌物サンプルのパーセントｄ　動物のバーセント ワクチン接種された動物は、接種に引き続いてＰＲＹ対する血清中和抗体を産生 じたが、ｇｐｘおよびｇｌに対する中和抗体は産生じなかった。感染性ウィルス を抗原投与した後、−匹のワクチン接種動物が一日だけ共調運動不能を示した。

ワクチン接種していない５匹の対照は全て、重度の中枢神経系徴候またはジュー ドラビーウィルス病を発現した。抗原投与の少なくとも２１日後に、ワクチン接 種動物は片方ある０は両方の診断抗原に関して血清的に反転された。これらの結 果は、５−ＰＲＹ−１５５が不活性化ワクチンとしてジュードラビーウィルス病 から豚を防御し、感染動物の免疫反応とは区別できる免疫反応を生じることが分 かる。

５−ＰＲＹ−１５８は、特有の長配列領域のＴＫ遺伝子における欠失と、繰り返 し領域における欠失と、ｇＩコード領域における１４６０塩基対の欠失と、ｇｐ Ｘコード領域における１４１４塩基対の欠失とを有するジュードラビーウィルス である。大腸菌βガラクトシダーゼの遺伝子（ｌｌｌＣ２遺伝子）がｇｐＩ遺伝 子の代わりに挿入され、ＨＣＭＶの即時的初期プロモータの制御下に置かれてい る。

５−ＰＲＹ−１５８ハ、５−ＰＲＹ−０００（ＰＲＹ株ＩＳＵ　Ｓ６２／２６） から二ツの中間ウィルスを経て誘導された。最初の中間ウィルスは５−ＰＲＹ− １５６テある。コノ最初の中間ウィルス５−ＰＲＹ−１５６１コオいては、ｇＩ 欠失が、βガラクトシダーゼマーカー遺伝子（ｌａｃ２）に沿って導入された。

これは、相同ベクター４３６−８６、３Ｋ　（ｒ材料および方法」参照）と、「 組換ＰＲＶを創製するための相同組換法」における５−ＰＲＹ−０７０を利用し て達成された。第二の中間ウィルス（Ｓ−ＰＲＹ−１５７）においては、βガラ クトシダーゼマーカー遺伝子（Ｉａｃｚ）を、「組換ＰＲＶを創製するための直 接連結方法」に記載されているようにして、Ｘｂａｌで消化することにより除去 した。最後に、相同ベクター４１６−０９．２１１　（ｒ材料および方法」参照 ）と、「組換ＰＲＶを創製するための相同組換法」におけるウィルス５−ＰＲＹ −１５３とを使用しテ５−ＰＲＹ−１５８が創製された。５−ＰＲＹ−１５８（ ７）構造は、ＢａｍＨＩおよびＸｂａｌによる制限酵素分析で確認された。

５−ＰＲＹ−１５９は、特有の長配列領域のＴＫ遺伝子における欠失と、繰り返 し領域における欠失と、ｇｌコード領域における１４６０塩基対の欠失と、ｇｐ ｘコード領域における１４１４塩基対の欠失とを有するジュードラビーウィルス である。

５−ＰＲＹ−１５９は、５−ＰＲＹ−１５８（上記参照）　ｂ”）　？　ｆＪ　 ａ伝子を除去したものである。これは、「組換ＰＲＶを創製するための直接連結 法」に記載したように、Ｘｂａｌで５−ＰＲＹ−１５８をの消化することによっ て達成された。５−ＰＲＹ−１５９の構造は、ＢａｍＨＩおよびＩｂｘｌによる 制限酵素分析で確認された。

〔実施例の要約〕

本発明は、動物を病気から守るために、遺伝子的に加工されたヘルペスウィルス 類を使用することを包含する。これらのウィルス類は、二つの糖蛋白（ｇｐＸお よびｇＩ）の欠失を有している。表＋Ｖには、上記で述べた６種類の欠失ウィル スの特徴を要約しである。ウィルスの力価はｒＰＲＶの力価」に準拠して決定し た。安全性有効性のデータは「豚におけるワクチン接種の研究」に準拠して得た 。

表１ｖ Ｓ−ＰＲＹ−１５１３，８０ｘ　１０’　無　１００％　２０％５−ＰＲＹ−１ ５４１，５３ｘ　１０’　試験セｆ　試験セｆ　試験セｆＳ−ＰＲＹ−１５５１ ，４！ＩＩ　Ｉ　１０８　無　０％　０％５−ＰＲＹ−１５８１，４７Ｘ　１０ ”　試験せず　ａｆｆ　試験せｆ６種類の全ての欠失ウィルスは、ｇｐＸおよび ｇＩの欠失を有しテイル。５−ＰＲＹ−１５０オヨび５−ＰＲＹ−１５１！ニオ ｉｔルｇ　ｐＸ欠失領域は、他のウィルスにおけるｇｐｘ欠失領域より大きイ。

ウィルス５−ＰＲｖ−１５０，５−ＰＲＹ−１５１，５−ＰＲＹ−１５４及び５ −ＰＲＶ−１５５もまた、ＴＫ領領域よび繰り返し領域に欠失を有する。

大腸菌βガラクトシダーゼ（Ｌａｃ２）マーカー遺伝子が、５−ＰＲＶ−１５０ ，５−ＰＲＹ−１５４及び５−ＰＲＹ−１５８ニ存在スル。

これらの分析から、ｇｐＸおよびｇＩママ−−を含む特異的ワクチンの有効性に とって、欠失の正確な大きさおよび組み合わせが重要であることは明らかである 。５−ＰＲＹ−１５０及び５−ＰＲＹ−１５１は、顕著に低下したウィルス力価 を示す。細胞培養で成育するためのウィルス力価は、ワクチンの製造に重要であ ル。５−ＰＲＹ−１５０及び５−ＰＲＹ−１５１の低力価は、これらをワクチン として製造することをコスト的に不可能にするであろつ、　５−ＰＲＹ−１５５ と５−ＰＲＹ−１５１とテハ、ＰＲＶ病から豚を防御する能力が著しく異なる。

５−ＰＲＹ−１５５は完全な防御性を与えるのに対して、５−ＰＲＹ−１５１は 満足できるレベルの防御性を与えない。５−ＰＲＹ−１５５に存在する欠失の組 み合わせは、この株を優れたワクチン製品とする要因である。この製品は、日齢 ３日の小林に対する安全性、全年齢の豚に対する防御性、および一つまたは二つ の診断マーカーを用いた血清学的差別性を与える。当該技術の現状に基づいては 、欠失のこの組み合わせの優れた有用性は予期し得ないものであった。これらの 結果は新規であり、予測不可能であり、優れたジュードラビーウィルスワクチン 製品の選択において有用である。

Ｌ　Ｆ、Ｌ、Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ人、Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、、ＶｉｒｏＬｏ ｇｙ　５２，５５６−５６７、　１９フコ。

２、　Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　＠ｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ ｏｎｉｎｇ：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８２゜コ、　Ｍ、ｖａｎ　ｚｉ″Ｊ１ ．　ａｔ　ａｔ、、Ｊ、ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７Ｌ　１７４７−１７５５゜ ４、　Ｔ、Ｊ、Ｒａａ、ａｔ　ａｌ、、Ｊ、ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５４．　 ２１−２９．　１９Ｂ５゜５、Ｅ、入、Ｐｏｔｒｏｖｓｋｉｓ、ａｔ　ａｌ、、 Ｊ、ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５９．　２１６−２２コ、１９８６゜ ６、Ｅ、＾、　ｐａｔｒｏｖｓｋｉｓ、　ａｔ　ａｌ、、　、ｒ、　ｏｒ　Ｖｉ ｒｏｌａｇｙ　６０．　ｚａｓ−１９３，１９８６゜ ７、　Σ、　入、Ｐｏｔｒｏｖｓｋｉｓ、ａｔ　ａｌ、、Ｊ、ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ ｏｇｙ　６０．　１１６６−１１６９．１９８６゜ １１、　Ｔ＋　Ｂａｎ−Ｐｏｒａｔ　ａｎｄ　入＋　Ｓ−Ｘａｐｌａｎ、Ｖｉｒ ｏｌｏｇｙ　４１，２６５−２フ〕。

９、　Ｔ、Ｂａｎ−ＰＯｒａｔ、　＠ｔ　ａｌ、、　Ｊ、　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ　４９．９７０−９７９゜１０、　Ｔ、Ｂａｎ−Ｐｏｒａｔ、ａｔ　ａｌ、 、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５４．　コ２５−３３４．　１９８６゜１１、　Ｆ、λ 、ｒ＠ｒｒａｒｔ、＠セ　ａｌ、、Ｊ、ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１６ １．　５５６−５６２、　１９８５゜ １２、　Ｄ、Ｒ，Ｔｈｏｍｓｅｎ、＠ｔ　ａｌ、、Ｇａｎ＠　１６．　２０７− ２１６．　１．９８１１３、　Ｒ，Ｗ、Ｐｒ１ｃｅ　ａｎｄ　＾、Ｋａｈｎ、工 ｎｆａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　工ｍｍｕｎｉｔｙ　コ４゜５フ１−５８０．　１９ １１Ｌ １４、Ｐ、Ｂ、Ｔ＠ｎ５ｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉ ｒｏＬｏｇｙ　６４゜１コロ９−１コ７コ、　１９８コ。

１５、　Ｂ−ＬＯ！１ｎｉｃＺＬ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　ｏｆ　ｖｉｒｏｌｏｇ ｙ　４９．　９７０−９７９゜１９８４゜ １６、　Ｂ、Ｒｏｉｚｍａｎ、＠ｔ　ａｌ、、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎＮｅｗ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　Ｖ ｉｒａＬ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｓａｐｔｅｍｂｅｒ、１９１３コ。

１７、　Ｒ，Ｌ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、ａｔ　ａｌ＋、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１１１ ．　ＬＥＩＯ−１９２，１９８３゜１Ｂ、Ｋ、Ｆｕｋｕｃｈｉ、ａｔ　ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ。

８２、　７５１−７５４．　１９８５゜１９、　Ｊ、Ｍ、Ｋｏｏｍｅｙ、ａｔ　 ａｌ、、Ｊ、ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５０．　６６２−６６５゜２０、Ｍ、Ｗ 、Ｌｉｇａｓ　ａｎｄ　Ｄ、Ｃ０Ｊａｈｎｓｏｎ、Ｊ、ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 　６２゜１４８６−１４９４．　１９８８゜ ２Ｌ　Ｆ、　Ｚｕｃｋ＠ｒｍａｎ、　ａｔ　ａｌ、、Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ　 ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ入ｄプａｓｚｋｙ’ｓ　Ｄｉｓａａｓａ、　ｐｐ 、　１０７−１１７．　Ｅｄ、　Ｊ、　ｖａｎＯｉｒｓｃｈｏｔ、Ｋｌｕｗ＠ｒ 、′ｒＡｎｄＯｎ、１９８９゜２２、Ｔ、Ｃ，Ｍ＠ｔｔａｎｌｅｉｔｅｒ、ａｔ 　ａｌ、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５８．　１４１−１４６゜１９８７゜ ２コ、入、Ｌ　Ｒｏｂｂｉｎｓ、ａｔ　ａｌ、、Ｊ、ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　 ５ｇ、ココ９−３４７゜１９８６゜ ２４、λ、　Ｋ、　Ｒｏｂｂｉｎｓ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　ｏｆ　Ｖｉｒｏ ｌｏｇｙ　６１．２６９１−２７０１゜１９８７゜ ２５、Ｌ、　Ｅ、　Ｐｏ５ｔ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｒ１ｉ！ｐｒｏｄ、　 Ｆｅｒｔ、　５ｕｐｐ１．４１．９７−１０４．１９９０゜ ｐＱＩ（ｊ　ｈＬ７１ ＜ｔｌｌ　ロ　Ｕ− ロ（ＣＪ　ＣＪ（ ト ロ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成５年９月１日 ２、発明の名称 名称ジントロ・コーポレーション ４、代理人 ５、補正の提出年月日 １９９３年５月３日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の翻訳文　１通 ＣＣ受付番号ＶＲ２３１１）を提供する。本発明はまた、有効な免疫量の遺伝子 的に加工され且つ弱毒化されたジュードラビーウィルス（Ｓ−ＰＲＶ−１５５と 命名されたもの）と、適切なキャリアーとを含有するワクチンを提供する。本発 明は更に、ジュードラビーウィルスによって惹起される疾患に対して動物を免疫 化する方法であって、本発明のワクチンのを有効免疫量を前記動物に投与するこ とを具備した方法を提供する。最後に本発明は、本発明のワクチンを接種された 動物を、天然に存在する野生型ジュードラビーウィルスに感染した動物から区別 する方法を提供する。

〔図面の簡単な説明〕

図１： ＰＲＶ株ＩＳＵ　５６２／２６の詳細。特有の長い内部繰り返し領域、特有の短 い領域、および末端リピート領域を示すＰＲＶゲノムＤＮＡ図。酵素ＢａｍＢ［ 、Ｘｂａｌ、　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩの制限酵素地図が示されている。サイズを縮小 するために、断片を番号化あるいは記号化しである。特異的な短い領域は、詳細 を示すため拡大しである。幾つかの遺伝子の位置が示されている：これら遺伝子 は、糖蛋白Ｉｆ　（ｇｌｌ）　（２４）　、糖蛋白ＩＩＩ（ｇｌｌｌ　）　（２ ３）　、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、即時的初期遺伝子（ｉｍａ＋ｅｄｉｘｔｅ 　ｅｉｒ１７　ｇ！ｎ；　Ｉ　Ｅ）　、プロティンキナーゼ（ＰＫ）（３）、糖 蛋白Ｘ　（ｇｐＸ）（４）、糖蛋白５０（ｇ５０）　（５）、糖蛋白６３　（ｇ ６３）　（６）　、糖蛋白Ｉ（ｇＩ）（６）である。

本発明は５−ＰＲＶ−１５５と命名された、遺伝的に加工され且つ弱毒化された ジュードラビーウィルス（ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ２３１１）を提供する。５−Ｐ ＲＶ　１５’３ジユードラビーウイルスは、特許手続上の微生物の国際的寄託に 関するブタベスト条約に準じ、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ２３１１の下に、アメリカ 合衆国メリーランド州ロックウィルパークローンドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ　 ＤｒｉｖＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｘｒ７１ａｎｄ　２０８５２゜Ｕ、　Ｓ、 　Ａ、　）のアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている。本発 明はまた、有効な免疫量の遺伝子的に加工され且つ弱毒化されたジュードラビー ウィルス（Ｓ−ＰＲＶ−１５５と命名されたもの）と、適切なキャリアーとを含 有するワクチンを提供する。該ワクチンは、不活性化された又は生のジュードラ ビーウィルス５−ＰＲＶ−１５５の何れかを含む。

ジュードラビーウィルスの適切なキャリアは当該技術において周知であり、蛋白 、糖等を含む。この様な適切なキャリアの一例は、安定化され加水分解された蛋 白、ラクトース等のような一以上安定化剤を含有する生理学的に均衡のとれた培 地である。

一般に、本発明のワクチンは有効免疫量（１０３〜１０９ＰＦＵ　／　ｄｏｓｅ ）の５−ＰＲＶ−１５５ウイルスを含む。好ましくは、生ワクチンの有効免疫量 は約１０４〜１０’　ＰＦＵ／ｄｏｓ！、不活性化ワクチンの有効免疫量は約１ ０７〜１０９ＰＦＵ　／ｄｏｓｅである。生ワクチンは、好ましくは組織培養液 を採取し、安定化され加水分解された蛋白等の安定化剤を配合では、ｇＩ欠失が 、βガラクトシダーゼマーカー遺伝子に沿って導入された。これは、相同ベクタ ー４１６−０９．２Ｈ（ｒ材料および方法」参照）と、「組換ＰＲＶを創製する ための相同組換法」における５−ＰＲＹ−０７０を利用して達成された。第三の 中間ウィルス（５−ＰＲＹ−１５３）では、βガラクトシダーゼマーカー遺伝子 （ＩａｃＸ）が、「組換ＰＲＶを創製するための直接連結法」に記載されている ようにしてＸｂａ　Ｉで消化することにより除去された。最後に、相同ベクター ４３６−８６．３２Ｋ　（ｒ材料および方法」参照）と、「組換ＰＲＶを創製す るための相同組換法」におけるウィルス５−ＰＲｖ−１５３を使用して、５−Ｐ ＲＹ−１５４が生成された。５−ＰＲＹ−１５４ノ構造はＢｉｍＨＩとＸｂｘｌ ｌ、：ヨル制限酵素分析で確認された。

５−ｐｉ−１５５は、特有の実記列領域のＴＫ遺伝子における欠失と、繰り返し 領域における欠失と、ｇｌコード領域における１４６０塩基対の欠失と、ｇｐｘ コード領域における１４１４塩基対のが欠失とを有するジュードラビーウィルス である。

５−ｐｘｖ−１５５ジユードラビーウイルスは、特許手続きのため微生物の国際 的寄託に関するブタベスト条約に準じて、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ２３１１の下に 、Ｐｘｒｋｌａｖｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒ７１ａｎｄ　２０８５２．　Ｕ、Ｓ、Ａ、のアメリカンタイプカルチャー コレクションの特許カルチャー寄託部に寄託されている。

５−ＰＲＹ−１５５は、５−ＰＲＹ−１５４（上記参照）　カラマー７’７−遺 伝子を除去したものである。これは、「組換ＰＲＶを創製する請求の範囲 １．８−ＰＲＶ−１５５と命名された、遺伝的に加工され且つ弱毒化されたジュ ードラビーウィルス（ＡＴＣＣ寄託番号ＶＲ２３１１）。

２、有効免疫量の請求の範囲第１項に記載の弱毒化ウィルスと、適切なキャリア ーとを含有するワクチン。

３、請求の範囲第２項に記載のワクチンであって、前記弱毒化ウィルスが不活性 化されているワクチン。

４、請求の範囲第２項に記載のワクチンであって、前記弱毒化ウィルスが生であ るワクチン。

５、請求の範囲第２項に記載のワクチンであって、前記キャリアーが、安定化剤 を含有する生理学的に均衡のとれた培地であるワクチン。

６、請求の範囲第２項に記載のワクチンであって、前記有効免疫量が約１０３〜 約１０９ＰＦＵ　／ｄｏｓｅであるワクチン。

７、請求の範囲第６項に記載のワクチンであって、前記有効免疫量が約１０４〜 約１０６ＰＦυ／ｄｏｓＣであるワクチン。

８、請求の範囲第６項に記載のワクチンであって、前記有効免疫量が約約１０７ 〜約１０’　ＰＦＵ　／ｄｏｓｅであるワクチン。

９、ジュードラビーウィルスによって惹起される病気に対して動物を免疫化する 方法であって、有効免疫投与量の請求の範囲第２項に記載のワクチンを、前記動 物に投与することを具備した方法。

１０、請求の範囲第９項に記載の方法であって、前記動物が豚である方法。

１１、請求の範囲第９項に記載の方法であって、前記ワクチンが筋肉内注射、皮 下注射、腹腔内注射または静脈内注射によって投与される方法。

１２、請求の範囲第９項に記載の方法であって、前記ワクチンが鼻孔内投与され る方法。

１３、請求の範囲第９項に記載の方法であって、前記ワクチンが経口投与される 方法。

１４、請求の範囲第２項のワクチンを接種した動物を、天然に存在する野生型ジ ュードラビーウィルスに感染した動物から区別する方法であって、ｇｐＸの存在 および天然の野生型ジュードラビーウィルスに感染した動物中に通常発現する少 なくとも一つの他の抗原の存在について、動物からの採取した体液のサンプルを 分析することと、該体液中に前記抗原およびｇｌ）Ｘが存在するか否かを決定す ることとを具備し、体液中に前記抗原が存在し且つｇｐＸが存在しないことによ って、その動物がワクチン接種されたものであり、天然の野生型ジュードラビー ウィルスには感染していないことが示される方法。

１５、請求の範囲第１４項に記載の方法であって、前記体液中における前記抗原 およびｇｐＸの存在が、体液中において、前記抗原およびｇｐｘに対して特異的 な抗体を検出することによって決定される方法。

１６、請求の範囲第１４項に記載の方法であって、更に、ｇｌの存在についてサ ンプルを分析することを具備し、体液中に前記抗原が存在し且つｇＩが存在しな いことによって、その動物がワクチン接種されたものであり、天然の野生型ジュ ードラビーウィルスには感染していないことが示される方法。

１７、請求の範囲第２項のワクチンを接種した動物を、天然に存在する野生型ジ ュードラビーウィルスに感染した動物から区別する方法であって、ｇＩの存在お よび天然の野生型ジュードラビーウィルスに感染した動物中に通常発現する少な くとも一つの他の抗原の存在について、動物からの採取した体液のサンプルを分 析することと、該体液中に前記抗原およびｇＩが存在するか否かを決定すること とを具備し、体液中に前記抗原が存在し且つｇＩが存在しないことによって、そ の動物がワクチン接種したものであり、天然の野生型ジュードラビーウィルスに は感染していないことが示される方法。

国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｖ 　８３１０−２Ｊ３３１５６９　Ｌ　９０１５−２Ｊ Ｉ

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｓ−ＰＲＶ−１５５と命名された、遺伝的に加工され且つ弱毒化されたシユ ードラビーウイルス（ＡＴＣＣ寄託番号ＶＲ）。
2. ２．有効免疫量の請求の範囲第１項に記載の弱毒化ウイルスと、適切なキャリア ーとを含有するワクチン。
3. ３．請求の範囲第２項に記載のワクチンであって、前記弱毒化ウイルスが不活性 化されているワクチン。
4. ４．請求の範囲第２項に記載のワクチンであって、前記弱毒化ウイルスが生であ るワクチン。
5. ５．請求の範囲第２項に記載のワクチンであって、前記キャリアーが、安定化剤 を含有する生理学的に均衡のとれた培地であるワクチン。
6. ６．請求の範囲第２項に記載のワクチンであって、前記有効免疫量が約１０３〜 約１０９ＰＦＵ／ｄｏｓｅであるワクチン。
7. ７．請求の範囲第６項に記載のワクチンであって、前記有効免疫量が約１０４〜 約１０６ＰＦＵ／ｄｏｓｅであるワクチン。
8. ８．請求の範囲第６項に記載のワクチンであって、前記有効免疫量が約約１０７ 〜約１０９ＰＦＵ／ｄｏｓｅであるワクチン。
9. ９．シユードラビーウイルスによって惹起される病気に対して動物を免疫化する 方法であって、有効免疫投与量の請求の範囲第２項に記載のワクチンを、前記動 物に投与することを具備した方法。
10. １０．請求の範囲第９項に記載の方法であって、前記動物が豚である方法。
11. １１．請求の範囲第９項に記載の方法であって、前記ワクチンが筋肉内注射、皮 下注射、腹腔内注射または静脈内注射によって投与される方法。
12. １２．請求の範囲第９項に記載の方法であって、前記ワクチンが鼻孔内投与され る方法。
13. １３．請求の範囲第９項に記載の方法であって、前記ワクチンが経口投与される 方法。
14. １４．請求の範囲第２項のワクチンを接種した動物を、天然に存在する野生型シ ユードラビーウイルスに感染した動物から区別する方法であって、ｇｐＸの存在 および天然の野生型シユードラビーウイルスに感染した動物中に通常発現する少 なくとも一つの他の抗原の存在について、動物からの採取した体液のサンプルを 分析することと、該体液中に前記抗原およびｇｐＸが存在するか否かを決定する こととを具備し、体液中に前記抗原が存在し且つｇｐＸが存在しないことによっ て、その動物がワクチン接種されたものであり、天然の野生型シユードラビーウ イルスには感染していないことが示される方法。
15. １５．請求の範囲第１４項に記載の方法であって、前記体液中における前記抗原 およびｇｐＸの存在が、体液中において、前記抗原およびｇｐＸに対して特異的 な抗体を検出することによって決定される方法。
16. １６．請求の範囲第１４項に記載の方法であって、更に、ｇＩの存在についてサ ンプルを分析することを具備し、体液中に前記抗原が存在し且つｇＩが存在しな いことによって、その動物がワクチン接種されたものであり、天然の野生型シユ ードラビーウイルスには感染していないことが示される方法。
17. １７．請求の範囲第２項のワクチンを接種した動物を、天然に存在する野生型シ ユードラビーウイルスに感染した動物から区別する方法であって、ｇＩの存在お よび天然の野生型シユードラピーウイルスに感染した動物中に通常発現する少な くとも一つの他の抗原の存在について、動物からの採取した体液のサンプルを分 析することと、該体液中に前記抗原およびｇＩが存在するか否かを決定すること とを具備し、体液中に前記抗原が存在し且つｇＩが存在しないことによって、そ の動物がワクチン接種したものであり、天然の野生型シユードラビーウイルスに は感染していないことが示される方法。