JPH0276600A - 標識を付した分子プローブ、その製造及び利用 - Google Patents
標識を付した分子プローブ、その製造及び利用Info
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は酵素反応によって生体分子を検出するための、
酵素で標識化させた分子プローブ、その製造方法及び利
用方法に関する。本発明の利用分野は分子生物学、医学
、生物学、遺伝生物学、植物病理学、遺伝子工学、農業
及び獣医学である。
酵素で標識化させた分子プローブ、その製造方法及び利
用方法に関する。本発明の利用分野は分子生物学、医学
、生物学、遺伝生物学、植物病理学、遺伝子工学、農業
及び獣医学である。
酵素に結合させた分子プローブを用いて生体分子を検出
する方法ば公知そある。この場合にこれまでは免疫活性
のプローブ〔例えば Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ−５，へｖｒａｍｃａｓ等編集、（１９８３）Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ ５ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ参
照〕、ハイブリダ参照−ションプローブ〔例えばＢ、Ｍ
、Ｒｅｎｚ、ＣｈｒＫｕｒｚ ： Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅｓ、 （１９８４）■、 ３４３５−３４４
４頁参照〕ばかりでなく更に、他の生体分子に対して特
別な親和性を有する種々のプローブも種々の酵素に結合
させている。結合用酵素としては主としてアルカリ性ホ
スファターゼ、ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、
グルコースオキシダーゼ、グル３ロニダーゼ、ラフター
トデヒドロゲナーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ペルオ
キシダーゼ、リボヌクレアーゼ及びチロシナーゼが通常
の架橋化剤によって種々の分子プローブに結合されてい
る（Ｓ、Ａｖｒａｍｅａｓ、 Ｔ、Ｔｅｒｎｙｎｃｋ、
Ｊ几、 Ｇｕｅｓｄｏｎ ；雑誌５ｃｎｓ、 Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ、 （１９７８）第７，２７頁参照〕。
する方法ば公知そある。この場合にこれまでは免疫活性
のプローブ〔例えば Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ−５，へｖｒａｍｃａｓ等編集、（１９８３）Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ ５ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ参
照〕、ハイブリダ参照−ションプローブ〔例えばＢ、Ｍ
、Ｒｅｎｚ、ＣｈｒＫｕｒｚ ： Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅｓ、 （１９８４）■、 ３４３５−３４４
４頁参照〕ばかりでなく更に、他の生体分子に対して特
別な親和性を有する種々のプローブも種々の酵素に結合
させている。結合用酵素としては主としてアルカリ性ホ
スファターゼ、ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、
グルコースオキシダーゼ、グル３ロニダーゼ、ラフター
トデヒドロゲナーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ペルオ
キシダーゼ、リボヌクレアーゼ及びチロシナーゼが通常
の架橋化剤によって種々の分子プローブに結合されてい
る（Ｓ、Ａｖｒａｍｅａｓ、 Ｔ、Ｔｅｒｎｙｎｃｋ、
Ｊ几、 Ｇｕｅｓｄｏｎ ；雑誌５ｃｎｓ、 Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ、 （１９７８）第７，２７頁参照〕。
従来は検出法に用いられる酵素は本質的に上述のものに
限定されており、すなわちそれらの限定された数のもの
しか実用されていない。このような限定の理由の一つは
他の種々の基質についての検出の可能性が劣っているこ
とである。これまでは酵素反応によって着色した反応生
成物がもたらされるような基質が用いられてきた。種々
の固体相に結合されているような生体分子のための酵素
と結合されたプローブによる検出方法においてはその反
応しなかった基質の検出はこれまで常にその生体分子も
その上に存在している同一の固体和の上で、または溶液
中で行われている。このような検出方法の原理的な手順
は例えば上にあげたＩｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓの第２７４頁にＲ、Ｈ。
限定されており、すなわちそれらの限定された数のもの
しか実用されていない。このような限定の理由の一つは
他の種々の基質についての検出の可能性が劣っているこ
とである。これまでは酵素反応によって着色した反応生
成物がもたらされるような基質が用いられてきた。種々
の固体相に結合されているような生体分子のための酵素
と結合されたプローブによる検出方法においてはその反
応しなかった基質の検出はこれまで常にその生体分子も
その上に存在している同一の固体和の上で、または溶液
中で行われている。このような検出方法の原理的な手順
は例えば上にあげたＩｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓの第２７４頁にＲ、Ｈ。
Ｙｏｌｋｅｎによって抗原の決定（免疫学的検出）につ
いて次のように説明されている； １）測定されるべき抗原の対象となる抗体１をミクロタ
イター板の上に固定する。
いて次のように説明されている； １）測定されるべき抗原の対象となる抗体１をミクロタ
イター板の上に固定する。
２）試験物質を加え、存在する抗原を抗体によって結合
させる。
させる。
３）何回か洗浄した後に酵素の結合された抗体２を加え
る。このものは上記抗体１に結合されている抗原と反応
する。
る。このものは上記抗体１に結合されている抗原と反応
する。
４）何回か洗浄した後に基質を加える。上記のミクロタ
イター板の壁に固定された酵素（ＡＫＩ−抗原、Δに２
−酵素）はその基質を可視的な形に変える。その溶液の
中で測定できる着色強度は試験物質中の抗原の量に比例
する。
イター板の壁に固定された酵素（ＡＫＩ−抗原、Δに２
−酵素）はその基質を可視的な形に変える。その溶液の
中で測定できる着色強度は試験物質中の抗原の量に比例
する。
このような検出反応においてはほとんどの場合に水溶性
の反応生成物が生ずる。水不溶性の生成物は担体物質の
上に析出分離される。従来用いられている酵素の性質に
条件付＆Ｊられてこの様なプローブに直接結合された酵
素は極端な条件で使用することができない（例えばハイ
ブリダイゼーションの諸条件、高温度あるいは界面活性
剤の存在等）。
の反応生成物が生ずる。水不溶性の生成物は担体物質の
上に析出分離される。従来用いられている酵素の性質に
条件付＆Ｊられてこの様なプローブに直接結合された酵
素は極端な条件で使用することができない（例えばハイ
ブリダイゼーションの諸条件、高温度あるいは界面活性
剤の存在等）。
生体分子が成る固体相の上に固定されているような生体
分子の検出反応においてはこれまではその検出は常にそ
の目的とする分子がその上に存在している同一の固体相
の上で行われていた（例えばペルオキシダーゼと結合さ
れた抗体を用いてのポリアクリルアミドゲルからのニト
ロセルローズへのプロッティングによる抗原の検出等）
。
分子の検出反応においてはこれまではその検出は常にそ
の目的とする分子がその上に存在している同一の固体相
の上で行われていた（例えばペルオキシダーゼと結合さ
れた抗体を用いてのポリアクリルアミドゲルからのニト
ロセルローズへのプロッティングによる抗原の検出等）
。
この検出に際してその抗原はポリアクリルアミドゲル電
気泳動によって先ず最初子らな担体物質の」二に移され
てそこに固定される。この抗原がその上に載っている担
体物質は次に酵素が結合された抗体と共に培養し、その
際これはその抗原と結合する。何回か洗浄してその酵素
と結合した過剰を洗い流してしまったあとで可ン容性の
、例えばジアミノヘンチジンまたは４−クロロナフトー
ル等の基質を過酸化水素の存在のもとに加える。ペルオ
キシダーゼはこの基質を水不溶性の、着色した化合物（
ジアミノヘンチジン：褐色、４−クロロナフト−ル：紫
色）に変え、これが抗原−抗体−ペルオギシダーゼ錯化
合物の存在する部位において担体の上に現われ、そして
それによっである分離された蛋白混合物中の抗原の位置
を担体物質の上にマークする。その際抗原はそれがマー
クされている同じ担体物質の上で着色してマークされる
。この様な酵素的検出反応の後のプロ・ノドを染料を用
いて再び使用することは困難であり、というのはその結
合された染料分子がほとんどの場合に副反応を生じ、従
ってそれ以降の段階における背景の問題に導（。
気泳動によって先ず最初子らな担体物質の」二に移され
てそこに固定される。この抗原がその上に載っている担
体物質は次に酵素が結合された抗体と共に培養し、その
際これはその抗原と結合する。何回か洗浄してその酵素
と結合した過剰を洗い流してしまったあとで可ン容性の
、例えばジアミノヘンチジンまたは４−クロロナフトー
ル等の基質を過酸化水素の存在のもとに加える。ペルオ
キシダーゼはこの基質を水不溶性の、着色した化合物（
ジアミノヘンチジン：褐色、４−クロロナフト−ル：紫
色）に変え、これが抗原−抗体−ペルオギシダーゼ錯化
合物の存在する部位において担体の上に現われ、そして
それによっである分離された蛋白混合物中の抗原の位置
を担体物質の上にマークする。その際抗原はそれがマー
クされている同じ担体物質の上で着色してマークされる
。この様な酵素的検出反応の後のプロ・ノドを染料を用
いて再び使用することは困難であり、というのはその結
合された染料分子がほとんどの場合に副反応を生じ、従
ってそれ以降の段階における背景の問題に導（。
着色反応を用いる検出方法の感度は放射能検出法よりも
常に低い。これまで特定的な核酸配列の酵素と結合した
ハイブリダイゼーションプローブによる検出は原理的に
同様な手順で行われてきた。
常に低い。これまで特定的な核酸配列の酵素と結合した
ハイブリダイゼーションプローブによる検出は原理的に
同様な手順で行われてきた。
中でも極めて僅かな量の生物学的物質からの核酸配列の
検出、例えば最小量のＤＮＡ ｉから個々の遺伝子を検
出する場合には本質的により感度の高い検出方法が必要
となる。
検出、例えば最小量のＤＮＡ ｉから個々の遺伝子を検
出する場合には本質的により感度の高い検出方法が必要
となる。
更にまた、これまでは生体分子を酵素と結合させたプロ
ーブによってその生体分子と独立した支持層の上で検出
することは不可能であった。
ーブによってその生体分子と独立した支持層の上で検出
することは不可能であった。
分子プローブとしては他の生体分子に対する特別な親和
性を有し、そしてそのためにその検出や親和性タラマド
グラフ的精製に適しているような多数の化合物及び生体
分子があげられる。
性を有し、そしてそのためにその検出や親和性タラマド
グラフ的精製に適しているような多数の化合物及び生体
分子があげられる。
これらのプローブには下記があげられる：○免疫活性プ
ローブ類、例えば抗体、抗血清、免疫学的に反応性の蛋
白質 ○ハイブリダイゼーションプローブ類、例えば異った鎖
長の核酸断片、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子、 ○他の生体分子に対して特別な親和性を有する蛋白質類
、例えばアビジン、レクチン、ストレプトアビジン等 ○種々の生体分子に対して特別な親和性を有する種々の
有機化合物類、例えばビオチン等特定の生体分子（目的
分子）の検出は分子生物学においてはその目的分子と種
々の分子プローブとの反応によって行われ（例えば免疫
反応やハイブリダイゼーションにより）、その際それら
のプローブは直接に（例えば放射性同位元素や蛍光染料
により）標識されているか、またはもう一つの特殊な反
応によってその目的分子の検出をもたらすような（例え
ば着色物質の析出及び引続く写真技術的評価）第２の検
出系と結合されている。これらの検出方法は多くの公表
文献に記述されていて公知技ｆネｊに属する。これらの
検出方法において酵素をプローブに結合させることが益
々大きな役割を果たすようになっている〔例えば前にあ
げたＴｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ及びＲ４，Ｂｕｒｄｏｎ及びＰ、Ｈ，ｖａｎ Ｋ
ｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ編集のアムスデルダム（Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ ５ｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）
１９８５年刊行のＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１５巻第１１章
の“酵素の調製、抗体または他の酵素マクロ分子抱合体
”第２２１−２７８頁参照〕。
ローブ類、例えば抗体、抗血清、免疫学的に反応性の蛋
白質 ○ハイブリダイゼーションプローブ類、例えば異った鎖
長の核酸断片、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子、 ○他の生体分子に対して特別な親和性を有する蛋白質類
、例えばアビジン、レクチン、ストレプトアビジン等 ○種々の生体分子に対して特別な親和性を有する種々の
有機化合物類、例えばビオチン等特定の生体分子（目的
分子）の検出は分子生物学においてはその目的分子と種
々の分子プローブとの反応によって行われ（例えば免疫
反応やハイブリダイゼーションにより）、その際それら
のプローブは直接に（例えば放射性同位元素や蛍光染料
により）標識されているか、またはもう一つの特殊な反
応によってその目的分子の検出をもたらすような（例え
ば着色物質の析出及び引続く写真技術的評価）第２の検
出系と結合されている。これらの検出方法は多くの公表
文献に記述されていて公知技ｆネｊに属する。これらの
検出方法において酵素をプローブに結合させることが益
々大きな役割を果たすようになっている〔例えば前にあ
げたＴｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ及びＲ４，Ｂｕｒｄｏｎ及びＰ、Ｈ，ｖａｎ Ｋ
ｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ編集のアムスデルダム（Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ ５ｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）
１９８５年刊行のＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１５巻第１１章
の“酵素の調製、抗体または他の酵素マクロ分子抱合体
”第２２１−２７８頁参照〕。
一連の酵素が例えば抗体に結合された（前記Ｓ、Ａｖｒ
ａｍｅａｓ、 Ｔ、 Ｔｅｒｎｙｎｃｋ、 Ｊ、Ｌ、
Ｇｕｅｓｄｏｎ：アルカリ性ホスファターゼ、ガラクト
シダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ
、グルクロニダーゼ、ラフタートデヒドロゲナーゼ、ラ
フｊ・ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、リボヌク
レアーゼ、チロシナーゼ）６上記Ａｖｒａｍｅａｓ等に
よれば種々の分子プローブに結合するために用いるべき
酵素類は特定の下記のような一般的な要求条件を満足し
なければならない： １）基質の高い比活性及び透過速度（Ｄｕｒｃｈｓａｔ
ｚｒａｔｅ）２）実温及び作業温度における良好な安定
性３）結合のあとで活性に損失がないか、または損失が
少ないこと ４）容易に入手できる物質から高い純度で容易に入手で
きることまたは簡単な調製ができること これらの要求条件はこれまで用いられてきた酵素によっ
て部分的にしか満足されない。検出反応において極めて
多くの場合に用いられている酵素はペルオキシダーゼ及
びアルカリ性ホスファクターゼである。この場合にされ
らの酵素の比較的低い熱安定性は特にハイブリダイゼー
ション反応での使用（例えば６５℃において４８時間）
に際して困難をもたらし、あるいはまた使用を全く不可
能にする。それら従来用いられている酵素のもう一つの
欠点は検出のために一般に着色反応を利用する点にあり
、その際比較的低い検出感度しか達成されない。３２ｐ
で標識された燐酸の基質への転移は種々記述された方法
におけるよりも本質的に感度のよい検出を許容すると思
われる。しかしながら３２ｐで標識された燐酸の、プロ
ーブに結合された酵素を用いてのある基質の上への転移
はこれまで報告されていない。
ａｍｅａｓ、 Ｔ、 Ｔｅｒｎｙｎｃｋ、 Ｊ、Ｌ、
Ｇｕｅｓｄｏｎ：アルカリ性ホスファターゼ、ガラクト
シダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ
、グルクロニダーゼ、ラフタートデヒドロゲナーゼ、ラ
フｊ・ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、リボヌク
レアーゼ、チロシナーゼ）６上記Ａｖｒａｍｅａｓ等に
よれば種々の分子プローブに結合するために用いるべき
酵素類は特定の下記のような一般的な要求条件を満足し
なければならない： １）基質の高い比活性及び透過速度（Ｄｕｒｃｈｓａｔ
ｚｒａｔｅ）２）実温及び作業温度における良好な安定
性３）結合のあとで活性に損失がないか、または損失が
少ないこと ４）容易に入手できる物質から高い純度で容易に入手で
きることまたは簡単な調製ができること これらの要求条件はこれまで用いられてきた酵素によっ
て部分的にしか満足されない。検出反応において極めて
多くの場合に用いられている酵素はペルオキシダーゼ及
びアルカリ性ホスファクターゼである。この場合にされ
らの酵素の比較的低い熱安定性は特にハイブリダイゼー
ション反応での使用（例えば６５℃において４８時間）
に際して困難をもたらし、あるいはまた使用を全く不可
能にする。それら従来用いられている酵素のもう一つの
欠点は検出のために一般に着色反応を利用する点にあり
、その際比較的低い検出感度しか達成されない。３２ｐ
で標識された燐酸の基質への転移は種々記述された方法
におけるよりも本質的に感度のよい検出を許容すると思
われる。しかしながら３２ｐで標識された燐酸の、プロ
ーブに結合された酵素を用いてのある基質の上への転移
はこれまで報告されていない。
酵素類を分子プローブに結合させる際には、結合試薬と
して一般に同一の官能基を有する２官能性分子、例えば
グルタルアルデヒド〔例えば八ｖｒｅｍｅａｓ ；
Ｂｕｌｌ、 Ｓｏｃ、 Ｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｌ
、（１９６８）５０． 第１頁１６９行以下参照〕ベ
ンゾキノン〔例えばＭ、 Ｒｅｎｇ、 Ｃｈ、
Ｋｕｒｇ ： （１９８４）Ｎｕｃｌ、 八ｃ
ｉｄｓ、 Ｒｅｓ。
して一般に同一の官能基を有する２官能性分子、例えば
グルタルアルデヒド〔例えば八ｖｒｅｍｅａｓ ；
Ｂｕｌｌ、 Ｓｏｃ、 Ｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｌ
、（１９６８）５０． 第１頁１６９行以下参照〕ベ
ンゾキノン〔例えばＭ、 Ｒｅｎｇ、 Ｃｈ、
Ｋｕｒｇ ： （１９８４）Ｎｕｃｌ、 八ｃ
ｉｄｓ、 Ｒｅｓ。
８ 、３４８５−３４４４参照〕、ビスイミドエステル
〔例えばＷ、Ｃ，Ｍｅｎｔｚｅｒ ： Ｊ、Ｐｒｏｔ
ｅＬｎ Ｃｈｅｍ、（１９８２） Ｉｔ１４１−１５５
参照〕または異ったいくつかの基を有する分子、例えば
アジドアリールオキシスクシンイミド （例えばＴ、Ｈ
，Ｊｉ及びＪ、Ｊｉ ：八ｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
〔例えばＷ、Ｃ，Ｍｅｎｔｚｅｒ ： Ｊ、Ｐｒｏｔ
ｅＬｎ Ｃｈｅｍ、（１９８２） Ｉｔ１４１−１５５
参照〕または異ったいくつかの基を有する分子、例えば
アジドアリールオキシスクシンイミド （例えばＴ、Ｈ
，Ｊｉ及びＪ、Ｊｉ ：八ｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
（１９８２）１２１．２８６−２８９参照〕、アジドア
リールグリオキザル〔例えばＳ、Ｍ、Ｐｏ１ｉｔｚ、八
、Ｆ、 Ｎｏ１ｌｅｒ、 Ｐ、Ｄ。
リールグリオキザル〔例えばＳ、Ｍ、Ｐｏ１ｉｔｚ、八
、Ｆ、 Ｎｏ１ｌｅｒ、 Ｐ、Ｄ。
ＭｃＷｉｒｔｈｅｒ ： Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
（１９８１） −２０，３７２−３７８参照〕または
アジドアリールチオフタールイミド〔例えばＲｏＢ、Ｍ
ｏｒｅｌａｎｄ等；Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 （
１９８２）皿３２１／６参照〕が用いられる。
（１９８１） −２０，３７２−３７８参照〕または
アジドアリールチオフタールイミド〔例えばＲｏＢ、Ｍ
ｏｒｅｌａｎｄ等；Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 （
１９８２）皿３２１／６参照〕が用いられる。
ビオチン／アビジン（ストレプトアビジン）の系が益々
重要性を得ており、というのはこのものを使用すること
によってファクター８に達するまでのカスケード弐強度
増幅を行うことができるからである（例えば米国特許第
４４６３０９０号公報参照）。
重要性を得ており、というのはこのものを使用すること
によってファクター８に達するまでのカスケード弐強度
増幅を行うことができるからである（例えば米国特許第
４４６３０９０号公報参照）。
この検出系はほとんどの場合にそのストレプトアビジン
またはビオチンに結合されているペルオキシダーゼまた
はアルカリ性ホスファクーゼよりなり従ってこれも再び
着色反応が検出に利用される。
またはビオチンに結合されているペルオキシダーゼまた
はアルカリ性ホスファクーゼよりなり従ってこれも再び
着色反応が検出に利用される。
今日最も感度の高いハイブリダイゼーション法（例えば
人のＤＮＡから個々の遺伝子を検出する場合）において
この放射性同位元素を用いないプローブに結合された酵
素を用いる検出方法はなお明らかに直接放射能元素で標
識された核酸プローブを用いる検出方法より劣っている
。この領域においては特に本質的により高い検出感度を
有する方法が要求される。これまで公知のプローブを用
いた場合には一方においてファクター８までの強度増幅
がカスケードを利用してビオチン／アビジンを用いて達
成することができるけれども、しかしながらその隙間−
の固体担体の上で操作が行われる。着色物質を析出させ
る検出方法の場合にはそ＝ １９〜 のような強度増幅は不可能であり、その上にその析出し
た着色物質によって一般に生体分子の再使用を不可能に
してしまう。
人のＤＮＡから個々の遺伝子を検出する場合）において
この放射性同位元素を用いないプローブに結合された酵
素を用いる検出方法はなお明らかに直接放射能元素で標
識された核酸プローブを用いる検出方法より劣っている
。この領域においては特に本質的により高い検出感度を
有する方法が要求される。これまで公知のプローブを用
いた場合には一方においてファクター８までの強度増幅
がカスケードを利用してビオチン／アビジンを用いて達
成することができるけれども、しかしながらその隙間−
の固体担体の上で操作が行われる。着色物質を析出させ
る検出方法の場合にはそ＝ １９〜 のような強度増幅は不可能であり、その上にその析出し
た着色物質によって一般に生体分子の再使用を不可能に
してしまう。
酵素と結合させたプローブを用いる検出は従来着色法と
結び合わされており、これらの方法においてはオートラ
ジオグラフィー的方法の比較的高い検出感度は利用され
ない。信号強度の増幅を用いる放射能による検出のため
には、すべての反応段階の諸条件に耐えることのできる
ような酵素は利用することができない。
結び合わされており、これらの方法においてはオートラ
ジオグラフィー的方法の比較的高い検出感度は利用され
ない。信号強度の増幅を用いる放射能による検出のため
には、すべての反応段階の諸条件に耐えることのできる
ような酵素は利用することができない。
本発明の目的は新規な、酵素で標識された分子プローブ
、このものの製造方法及びこのような、酵素で標識され
た新しい分子プローブの使用のもとに生体分子のための
感度の高い検出方法を作り出すことである。
、このものの製造方法及びこのような、酵素で標識され
た新しい分子プローブの使用のもとに生体分子のための
感度の高い検出方法を作り出すことである。
本発明の課題は種々の分子プローブを結合可能な酵素で
標識し、そしてこの酵素で標識した分子プローブ及び特
殊な固体相をその反応した基質の結合と検出とのために
用いることにより比較的高い検出感度が得られるような
種々の生体分子を検出するための方法を開発することで
ある。
標識し、そしてこの酵素で標識した分子プローブ及び特
殊な固体相をその反応した基質の結合と検出とのために
用いることにより比較的高い検出感度が得られるような
種々の生体分子を検出するための方法を開発することで
ある。
標識を付した分子プローブによる種々の生体分子の検出
のための本発明に従う方法は溶液の中に存在するかまた
はゲルの中に含まれているか、あるいはまた固体相■に
結合されている生体分子をある酵素と結合させた分子プ
ローブによって識別し、この分子プローブに結合されて
いるかまたはこれから分離させた上記酵素を成る共基質
（Ｃｏｓｕｂｓｔｒａｔ）の存在のもとに成る基質と反
応させ、そしてその反応した固体相■または■の上で検
出することを特徴とするものである。本発明に従う方法
によってはじめて、種々の生体分子の検出方法における
識別段階と検出段階とを異なった種々の相の上で、例え
ば二つの平板担体の上で種々の酵素を反応に関与させて
実施し、そしてそれによって第２の相の上でその酵素反
応による強度増幅の可能性を完全に利用することができ
るような方法を実現することができる。
のための本発明に従う方法は溶液の中に存在するかまた
はゲルの中に含まれているか、あるいはまた固体相■に
結合されている生体分子をある酵素と結合させた分子プ
ローブによって識別し、この分子プローブに結合されて
いるかまたはこれから分離させた上記酵素を成る共基質
（Ｃｏｓｕｂｓｔｒａｔ）の存在のもとに成る基質と反
応させ、そしてその反応した固体相■または■の上で検
出することを特徴とするものである。本発明に従う方法
によってはじめて、種々の生体分子の検出方法における
識別段階と検出段階とを異なった種々の相の上で、例え
ば二つの平板担体の上で種々の酵素を反応に関与させて
実施し、そしてそれによって第２の相の上でその酵素反
応による強度増幅の可能性を完全に利用することができ
るような方法を実現することができる。
本発明に従う方法にはその原線に基くすべての方法段階
を経る多数の変法が可能である。従って本発明によれば
種々の生体分子の検出は下記の方法段階で行われる： ａ）識別段階：この段階において、結合された酵素によ
り標識された分子プローブが、溶液中に存在し、ゲルの
中に含まれ、あるいは固体層■に結合されてそれに対し
て特異的な親和性を有する生体分子に付加される。
を経る多数の変法が可能である。従って本発明によれば
種々の生体分子の検出は下記の方法段階で行われる： ａ）識別段階：この段階において、結合された酵素によ
り標識された分子プローブが、溶液中に存在し、ゲルの
中に含まれ、あるいは固体層■に結合されてそれに対し
て特異的な親和性を有する生体分子に付加される。
ｂ）洗浄段階：この段階においてその標識の付された分
子プローブの過剰が洗い流され、及び／又は分離除去さ
れる。
子プローブの過剰が洗い流され、及び／又は分離除去さ
れる。
Ｃ）酵素反応段階：この段階においてその基質がある共
基質の存在のもとに酵素と反応する。
基質の存在のもとに酵素と反応する。
ｄ）分離段階：この段階において未反応の共基質及び場
合により基質が洗い流されるか、あるいは分離除去され
る。
合により基質が洗い流されるか、あるいは分離除去され
る。
ｅ）評価段階：この段階においてその反応した基質があ
る固体層■又は■の上で測定されるか、または適当な検
出方法によって検出される。
る固体層■又は■の上で測定されるか、または適当な検
出方法によって検出される。
これらの方法段階のそれぞれにおいて多様的な技術に基
いて種々の生体分子の検出のために再び多数の変法が可
能である。すなわち例えばその検出されるべき生体分子
が溶液中またはある固体層に結合して存在している場合
が考えられる。この場合にその固体層は粒状または板状
担体のみならずそれら生体分子が自由に動くことばでき
るけれども結合されて存在しているようなゲルの形であ
ってもよい。それらのゲルとしては分子生物学において
しばしば使用されるアガロースゲルやポリアクリルアミ
ドゲルがあげられ、これらは一般に分離操作のために使
用される。洗浄段階及び分離段階において多数の変法が
可能であり、というのはそれらの段階においては公知の
方法で実施される多数の個別の段階が一緒に組合されて
いるからである。すなわち例えば固体層における洗浄は
その系に合致した種々の緩衝溶液を用いて行うことがで
きる。しかしながらまた−成分または多数の成分を分離
することが必要となることもあり、これはカラムや分離
ゲルを用い、またはクロマドグラフィ的方法によって行
うこｉができる。他方において生体分子と酵素に結合さ
れたプローブとの錯イヒ金物のみを分離し、そして次に
酵素反応段階において検出するごとも可能である。これ
らの方法段階のいずれか一つにおいて酵素を再びそのプ
ローブから分解分離し、次いでこの酵素のみをこのもの
と基質及び共基質との反応に基いである固体層の上で検
出することも可能である。
いて種々の生体分子の検出のために再び多数の変法が可
能である。すなわち例えばその検出されるべき生体分子
が溶液中またはある固体層に結合して存在している場合
が考えられる。この場合にその固体層は粒状または板状
担体のみならずそれら生体分子が自由に動くことばでき
るけれども結合されて存在しているようなゲルの形であ
ってもよい。それらのゲルとしては分子生物学において
しばしば使用されるアガロースゲルやポリアクリルアミ
ドゲルがあげられ、これらは一般に分離操作のために使
用される。洗浄段階及び分離段階において多数の変法が
可能であり、というのはそれらの段階においては公知の
方法で実施される多数の個別の段階が一緒に組合されて
いるからである。すなわち例えば固体層における洗浄は
その系に合致した種々の緩衝溶液を用いて行うことがで
きる。しかしながらまた−成分または多数の成分を分離
することが必要となることもあり、これはカラムや分離
ゲルを用い、またはクロマドグラフィ的方法によって行
うこｉができる。他方において生体分子と酵素に結合さ
れたプローブとの錯イヒ金物のみを分離し、そして次に
酵素反応段階において検出するごとも可能である。これ
らの方法段階のいずれか一つにおいて酵素を再びそのプ
ローブから分解分離し、次いでこの酵素のみをこのもの
と基質及び共基質との反応に基いである固体層の上で検
出することも可能である。
従って酵素反応段階の実施のためにも様々の可能性が存
在する。この段階は同様に溶液において行い、或はこれ
を固体層の上で、またはゲルの中で行うことも可能であ
る。この酵素反応段階を例えば溶液中で実施する場合に
は、次にその基質の反応生成物をある固体層に結合させ
てここで検出しなければならない。このことはその反応
した基質を選択的に結合するような支持媒体が用いられ
ることを意味する。しかしながらもしこの酵素反応段階
がすでに固体層の上で行なわれる時は、すなわちその基
質及び／又はその生体分子と分子プローブとからなる錯
化合物になお結合しているかまたはすでにこのものから
分解分離されているような酵素がある固体担体の上に存
在している時は、その基質はこの固体層の上で反応し、
そして次にそこで検出されるが、その際反応しなかった
共基質は注意深く分離する必要がある。生体分子と分子
プローブとからなる錯化合物から分解分離されてしまっ
ている酵素が溶液の中に存在しているか、またはゲルの
中に閉じ込められている場合であっても、この反応はあ
る固体層の上で行ってその反応した基質を次にこの固体
層の上で検出することができる。その反応しなかった基
質の分離はこの場合にも同様に行うことができるけれど
もこれはほとんどの場合に不必要である。
在する。この段階は同様に溶液において行い、或はこれ
を固体層の上で、またはゲルの中で行うことも可能であ
る。この酵素反応段階を例えば溶液中で実施する場合に
は、次にその基質の反応生成物をある固体層に結合させ
てここで検出しなければならない。このことはその反応
した基質を選択的に結合するような支持媒体が用いられ
ることを意味する。しかしながらもしこの酵素反応段階
がすでに固体層の上で行なわれる時は、すなわちその基
質及び／又はその生体分子と分子プローブとからなる錯
化合物になお結合しているかまたはすでにこのものから
分解分離されているような酵素がある固体担体の上に存
在している時は、その基質はこの固体層の上で反応し、
そして次にそこで検出されるが、その際反応しなかった
共基質は注意深く分離する必要がある。生体分子と分子
プローブとからなる錯化合物から分解分離されてしまっ
ている酵素が溶液の中に存在しているか、またはゲルの
中に閉じ込められている場合であっても、この反応はあ
る固体層の上で行ってその反応した基質を次にこの固体
層の上で検出することができる。その反応しなかった基
質の分離はこの場合にも同様に行うことができるけれど
もこれはほとんどの場合に不必要である。
好ましくは実施されるいくつかの変法を以下に更に詳細
に記述べする： 変法Ｉ ａ）種々の生体分子をゲルまたは他の分離担体物質の中
で分離し、そしてそれら生体分子を含有するゲルまたは
他の分離担体物質をある酵素に結合された分子プローブ
の含まれている溶液と接触させ、その際生体分子とプロ
ーブとは互いに反応してそれにより生体分子とを酵素の
結合した分子プローブとの錯化合物がゲルの中に生ずる
（識別段階）。
に記述べする： 変法Ｉ ａ）種々の生体分子をゲルまたは他の分離担体物質の中
で分離し、そしてそれら生体分子を含有するゲルまたは
他の分離担体物質をある酵素に結合された分子プローブ
の含まれている溶液と接触させ、その際生体分子とプロ
ーブとは互いに反応してそれにより生体分子とを酵素の
結合した分子プローブとの錯化合物がゲルの中に生ずる
（識別段階）。
ｂ）洗浄段階においで標識のイリけられた分子プローブ
の過剰分がゲルから洗い流されるかまたは分解除去され
る。
の過剰分がゲルから洗い流されるかまたは分解除去され
る。
Ｃ）酵素反応段階においてそのゲルを基質と共基質とが
含まれている第二のゲルまたは分離担体物質と接触させ
てその基質を反応させる。
含まれている第二のゲルまたは分離担体物質と接触させ
てその基質を反応させる。
ｄ）分離段階において上記第２のゲルまたは分離担体物
質をその加えられた基質と一緒にある固体相■と接触さ
せ、そしてその反応した基質と選択的にこれに結合させ
る。
質をその加えられた基質と一緒にある固体相■と接触さ
せ、そしてその反応した基質と選択的にこれに結合させ
る。
ｅ）いくつかの洗浄段階のあとで検出段階においてその
固体相■の上の反応した基質を放射能の測定により、オ
ートラジオグラフィにより、または他の適当な検出方法
により検出する。
固体相■の上の反応した基質を放射能の測定により、オ
ートラジオグラフィにより、または他の適当な検出方法
により検出する。
この方法の特別な実施形態の一つにおいて段階ａ及びｂ
のあとでその生体分子と標識の付けられた分子プローブ
とからなる錯化合物の含まれているゲルを基質の結合し
ているある固体相■と共基質の存在のもとに接触させ、
そしてその酵素的に反応した基質をその固体相■の上で
検出する。この特別な実施形態は酵素の活性の検出のた
めの酵素テストとしても用いることができ、それによっ
て本発明に従う方法の更にもう一つの利用の可能性が与
えられる。
のあとでその生体分子と標識の付けられた分子プローブ
とからなる錯化合物の含まれているゲルを基質の結合し
ているある固体相■と共基質の存在のもとに接触させ、
そしてその酵素的に反応した基質をその固体相■の上で
検出する。この特別な実施形態は酵素の活性の検出のた
めの酵素テストとしても用いることができ、それによっ
て本発明に従う方法の更にもう一つの利用の可能性が与
えられる。
聚抜工
ａ）識別段階においである酵素に結合された分子プロー
ブ及び生体分子は溶液の中に存在しており、そしてそこ
で互いに付加される。
ブ及び生体分子は溶液の中に存在しており、そしてそこ
で互いに付加される。
ｂ）洗浄段階においてその標識のつけられた過剰の分子
プローブを分離除去する。
プローブを分離除去する。
Ｃ）酵素反応段階においてその生体分子と標識の付けら
れた分子プローブとからなる錯化合物の酵素を基質と、
溶液の中で共基質の存在のもとに反応させる。
れた分子プローブとからなる錯化合物の酵素を基質と、
溶液の中で共基質の存在のもとに反応させる。
ｄ）分離段階においてその酵素的に反応した基質の過剰
の共基質との分離を、基質が選択的に結合されるような
固体相■によって行う。及び ｅ）評価段階においてその反応した基質を固体相■の上
で測定するかまたはオートラジオグラフによって測定す
る。
の共基質との分離を、基質が選択的に結合されるような
固体相■によって行う。及び ｅ）評価段階においてその反応した基質を固体相■の上
で測定するかまたはオートラジオグラフによって測定す
る。
上記段階ｂ）、すなわち標識のついた分子プローブの過
剰の分離は例えばカラム、中でも親和力力ラムにより、
あるいは親和作用を有する粒子懸濁液で行うことができ
る。
剰の分離は例えばカラム、中でも親和力力ラムにより、
あるいは親和作用を有する粒子懸濁液で行うことができ
る。
酵素反応段階はこの変法においてはプローブに結合され
てこれがまた同様に生体分子に付加されて存在するよう
な酵素を用いて行うことができ、あるいはまたこの酵素
はある中間に挿入された段階によってそのプローブと生
体分子とからなる錯化合物から分解分離させてもよい。
てこれがまた同様に生体分子に付加されて存在するよう
な酵素を用いて行うことができ、あるいはまたこの酵素
はある中間に挿入された段階によってそのプローブと生
体分子とからなる錯化合物から分解分離させてもよい。
この場合にこの分解は酵素と分子プローブとのもともと
の結合位置において行うこともできるが（すなわちこれ
は可逆的結合である）、また酵素と分子プローブとを結
合させるために用いられていた分子鎖（スペーサ分子）
の中で分解することも可能である。
の結合位置において行うこともできるが（すなわちこれ
は可逆的結合である）、また酵素と分子プローブとを結
合させるために用いられていた分子鎖（スペーサ分子）
の中で分解することも可能である。
もちろんこのような分解はこめ変法において可能である
ばかりでなく本発明に従う方法の他の種々の変法におい
ても行うことができる。
ばかりでなく本発明に従う方法の他の種々の変法におい
ても行うことができる。
炎広見
ａ＞識別段階において、結合された酵素によって標識の
つけられた分子プローブは固体相Ｉに結合された生体分
子に付加される。
つけられた分子プローブは固体相Ｉに結合された生体分
子に付加される。
ｂ）洗浄段階において、その標識の付けられた分子プロ
ーブの過剰分が洗い流され、及び／又は分離除去される
。
ーブの過剰分が洗い流され、及び／又は分離除去される
。
Ｃ）酵素反応段階において、その生体分子と標識の付け
られた分子プローブとからなり固体相■に結合されてい
る錯化合物の酵素は溶液中に存在する基質及び共基質と
反応させる。
られた分子プローブとからなり固体相■に結合されてい
る錯化合物の酵素は溶液中に存在する基質及び共基質と
反応させる。
ｄ）分離段階において反応しなかった共基質及び場合に
より基質も分離し、そして反応した基質は固体相■と結
合させる。及び ｅ）評価段階においてその反応した基質は固体相■の上
で測定されるか、またはオートラジオグラフ的に測定さ
れる。
より基質も分離し、そして反応した基質は固体相■と結
合させる。及び ｅ）評価段階においてその反応した基質は固体相■の上
で測定されるか、またはオートラジオグラフ的に測定さ
れる。
この変法によれば分子プローブがそれに付加される生体
分子及び反応した基質はそれぞれ固体相の上に存在して
いる。この固体相は同一であることもできるが、しかし
ながらこの場合にそれらは常にそれぞれの特別な生体分
子及び反応した基質に適合されている。その酵素反応段
階はこの場合にも再びその生体分子、プローブ及び結合
された酵素からなる完全な錯化合物と、または上記変法
■において記述したように分解分離させたその酵素と反
応させることができる。
分子及び反応した基質はそれぞれ固体相の上に存在して
いる。この固体相は同一であることもできるが、しかし
ながらこの場合にそれらは常にそれぞれの特別な生体分
子及び反応した基質に適合されている。その酵素反応段
階はこの場合にも再びその生体分子、プローブ及び結合
された酵素からなる完全な錯化合物と、または上記変法
■において記述したように分解分離させたその酵素と反
応させることができる。
この変法のもう一つの態様はその固体相Ｉをこれに結合
している生体分子及びそれに付加された標識のついた分
子プローブと一緒に前記方法段階ａ）及びｂ）のあとで
ゲルと共にまたは他の分離担体物質で被覆され（ｉｉｂ
ｅｒｓｃｈｉｃｈｔｅｔ） 、その際その中に基質と共
基質とが存在しており、それによって酵素反応が行われ
、引続いてそのゲルから反応した基質が固体相■の上に
転移される。
している生体分子及びそれに付加された標識のついた分
子プローブと一緒に前記方法段階ａ）及びｂ）のあとで
ゲルと共にまたは他の分離担体物質で被覆され（ｉｉｂ
ｅｒｓｃｈｉｃｈｔｅｔ） 、その際その中に基質と共
基質とが存在しており、それによって酵素反応が行われ
、引続いてそのゲルから反応した基質が固体相■の上に
転移される。
変広工
この変法は本発明に従う好ましい実施形態の１つを表わ
す。これによれば各方法段階は次のように実施される。
す。これによれば各方法段階は次のように実施される。
ａ＞ｍ別段階において結合された酵素により標識の付け
られた分子プローブはある固体相Ｉと結合された生体分
子に付加される。
られた分子プローブはある固体相Ｉと結合された生体分
子に付加される。
ｂ）洗浄段階において標識の付けられた分子プローブの
過剰分が洗い流され及び／又は分離除去される。
過剰分が洗い流され及び／又は分離除去される。
Ｃ）酵素反応段階において固体相Ｉに結合されていて生
体分子と標識のつけられた分子プローブとからなる錯化
合物の酵素をある固体相■に結合されている基質と溶液
中に存在する共基質の存在のもとに反応させる。
体分子と標識のつけられた分子プローブとからなる錯化
合物の酵素をある固体相■に結合されている基質と溶液
中に存在する共基質の存在のもとに反応させる。
ｄ）分離段階において過剰の共基質を洗い流すかまたは
分離する。
分離する。
ｅ）評価段階においてその反応した基質を固体相■の上
で測定するかまたはオートラジオグラフ的に測定する。
で測定するかまたはオートラジオグラフ的に測定する。
この変法においては二つの固体担体、中でも平板担体を
互いに接触させである共基質の溶液を加えることによっ
て酵素反応を開始させるということが可能であって、そ
してこれは種々の生体分子の検出を実施するための完全
に新しい技術でもある。この場合に例えば東ドイツ経済
特許出願第Ｃ０７Ｇ／２９６．７５４−２号に記述され
ているような平板担体が好ましい。しかしながら差別的
に被覆されている粒状物、中でも磁性核を有する合成樹
脂からなるラテックス粒子等を互いに反応させることも
同様に可能である。
互いに接触させである共基質の溶液を加えることによっ
て酵素反応を開始させるということが可能であって、そ
してこれは種々の生体分子の検出を実施するための完全
に新しい技術でもある。この場合に例えば東ドイツ経済
特許出願第Ｃ０７Ｇ／２９６．７５４−２号に記述され
ているような平板担体が好ましい。しかしながら差別的
に被覆されている粒状物、中でも磁性核を有する合成樹
脂からなるラテックス粒子等を互いに反応させることも
同様に可能である。
酵素は反応段階Ｃ）において分子プローブに結合させて
もよ（、またそのものから再び分解分離されていてもよ
い。この後者の場合は特にもしもＯＮ八が基質として用
いられ、そして酵素が例えばリガーゼまたは他の修復酵
素である場合に好都合である。
もよ（、またそのものから再び分解分離されていてもよ
い。この後者の場合は特にもしもＯＮ八が基質として用
いられ、そして酵素が例えばリガーゼまたは他の修復酵
素である場合に好都合である。
識別段階においてはすべての変法の場合に、すでにここ
でその反応のある分岐を開始させるか、または生体分子
と標識の付けられた分子プローブの間に別な分子を間挿
させるということが可能である。これは敏感な酵素の場
合に有利であることを指摘できよう。この場合に公知の
アビジン／ビオチンの系を使用してそれにより可能な強
度の増幅をすでに識別段階において利用することが可能
である。この識別段階の最後の過程として、この場合に
その標識の付けられた分子プローブは直接にその生体分
子自身を識別するのではなくて、カスケードの先行する
反応の相手分子を識別するのである。従って識別段階に
おいては生体分子が一つ以上の識別系において且つ一つ
以上の反応段階において先ず最初特異的な親和性を有す
る一つ以上の分子によって識別されるか、または一つ以
上の分子と共に用いられ、そしである酵素に結合された
分子プローブがこれらの分子の少なくとも一つ以上と反
応するという可能性が生ずる。
でその反応のある分岐を開始させるか、または生体分子
と標識の付けられた分子プローブの間に別な分子を間挿
させるということが可能である。これは敏感な酵素の場
合に有利であることを指摘できよう。この場合に公知の
アビジン／ビオチンの系を使用してそれにより可能な強
度の増幅をすでに識別段階において利用することが可能
である。この識別段階の最後の過程として、この場合に
その標識の付けられた分子プローブは直接にその生体分
子自身を識別するのではなくて、カスケードの先行する
反応の相手分子を識別するのである。従って識別段階に
おいては生体分子が一つ以上の識別系において且つ一つ
以上の反応段階において先ず最初特異的な親和性を有す
る一つ以上の分子によって識別されるか、または一つ以
上の分子と共に用いられ、そしである酵素に結合された
分子プローブがこれらの分子の少なくとも一つ以上と反
応するという可能性が生ずる。
固体相としては従来技術水準に従って公知であり、且つ
種々の生体分子のための担体物質として使用されるよう
な一連の物質が適している。生体分子がそれと結合され
ているところの固体相Ｉは共有結合により、イオン性結
合により、または静電的相互作用により結合するような
支持材であることができる。静電的相互作用によって例
えばニトロセルローズとポリビニリデンジフルオライト
。
種々の生体分子のための担体物質として使用されるよう
な一連の物質が適している。生体分子がそれと結合され
ているところの固体相Ｉは共有結合により、イオン性結
合により、または静電的相互作用により結合するような
支持材であることができる。静電的相互作用によって例
えばニトロセルローズとポリビニリデンジフルオライト
。
が結合されるが、一方ポリアマイト（例えばキンレンー
膜）または荷電されたポリアマイド並びにジエチルアミ
ノアルキルセルローズはイオン的力によって結合される
。共有結合的に結合される担体物質は例えばセルローズ
誘導体、例えばジアヅベンジロキシメチルセルローズ、
シアメルク１コライドによって活性化されたセルローズ
（例えば東ド′イッ経済特許第２２０，３１６号に従う
もの等）等である。その上にポリスチレンを活性化する
ことなくまたは活性化して（例えばスルホン化またはア
ミノ化／ジアゾ化等により）、或はまた化学的に活性化
されたガラスを使用することができる。本発明に従う方
法の実施には好ましくは平板構造の形で存在するような
固体相Ｉが用いられる。固体相■は一つの担体であって
これもその分子プローブに結合している酵素に左右され
るけれども基質を結合することができる。ここでも基質
に依存して再び、すでにあげであるような共有結合によ
り、イオン的な力により、または静電気的相互作用によ
って結合される担体物質を使用することができる。従っ
て固体相■としては再びニトロセルローズ、ポリビニリ
デンジフルオライド、ポリアミド、荷電されたポリアミ
ド、ジエチルアミノエチルセルローズ、シアヌルクロラ
イドで活性化されたセルローズ、活性化されたポリスチ
レン、化学的に活性化されたガラスまたは他のセルロー
ズ誘導体があげられる。中でもイオン的力により結合す
るセルローズ類、例えば燐セルローズ（セルローズと燐
酸との反応生成物であって、従ってセルローズの無水グ
ルコース単位に燐酸基が結合したもの）カルボキシメチ
ルセルローズまたはシアヌルクロライド及びアミノ基と
カルボン酸基、燐酸基またはスルホン酸基とを有する化
合物によって改質された東ドイツ経済特許出願第Ｃ０７
Ｇ／２９６．７５４−２号または東ドイツ経済特許第２
３７．８４４号に記述されているようなセルローズ誘導
体があげられる。
膜）または荷電されたポリアマイド並びにジエチルアミ
ノアルキルセルローズはイオン的力によって結合される
。共有結合的に結合される担体物質は例えばセルローズ
誘導体、例えばジアヅベンジロキシメチルセルローズ、
シアメルク１コライドによって活性化されたセルローズ
（例えば東ド′イッ経済特許第２２０，３１６号に従う
もの等）等である。その上にポリスチレンを活性化する
ことなくまたは活性化して（例えばスルホン化またはア
ミノ化／ジアゾ化等により）、或はまた化学的に活性化
されたガラスを使用することができる。本発明に従う方
法の実施には好ましくは平板構造の形で存在するような
固体相Ｉが用いられる。固体相■は一つの担体であって
これもその分子プローブに結合している酵素に左右され
るけれども基質を結合することができる。ここでも基質
に依存して再び、すでにあげであるような共有結合によ
り、イオン的な力により、または静電気的相互作用によ
って結合される担体物質を使用することができる。従っ
て固体相■としては再びニトロセルローズ、ポリビニリ
デンジフルオライド、ポリアミド、荷電されたポリアミ
ド、ジエチルアミノエチルセルローズ、シアヌルクロラ
イドで活性化されたセルローズ、活性化されたポリスチ
レン、化学的に活性化されたガラスまたは他のセルロー
ズ誘導体があげられる。中でもイオン的力により結合す
るセルローズ類、例えば燐セルローズ（セルローズと燐
酸との反応生成物であって、従ってセルローズの無水グ
ルコース単位に燐酸基が結合したもの）カルボキシメチ
ルセルローズまたはシアヌルクロライド及びアミノ基と
カルボン酸基、燐酸基またはスルホン酸基とを有する化
合物によって改質された東ドイツ経済特許出願第Ｃ０７
Ｇ／２９６．７５４−２号または東ドイツ経済特許第２
３７．８４４号に記述されているようなセルローズ誘導
体があげられる。
特別な実施形態の一つにおいて固体相■はある光学的に
透過性の媒体の形で、例えばフィルムの−３５＝ 形で構成されていてこれが基質を結合させることができ
るものであってもよい。このような物質は特に例えば医
学的測定法のような毎日の評価作業に特に適しており、
というのは多数の試料を同時に機械的に評価することが
できるからである。固体相■は検出のために好ましくは
平板状材料として用いられ、その場合に上記のフィルム
は光学的に透過性の平板材の場合を表わす。基質及び／
又は酵素的に反応した基質を選択的に結合することので
きる固体相■はゲルまたは他の分離担体物質であること
ができる。同様にこの固体相■は共有結合的に、イオン
結合的に、または静電気的相互・作用によって結合する
担体であることができる。
透過性の媒体の形で、例えばフィルムの−３５＝ 形で構成されていてこれが基質を結合させることができ
るものであってもよい。このような物質は特に例えば医
学的測定法のような毎日の評価作業に特に適しており、
というのは多数の試料を同時に機械的に評価することが
できるからである。固体相■は検出のために好ましくは
平板状材料として用いられ、その場合に上記のフィルム
は光学的に透過性の平板材の場合を表わす。基質及び／
又は酵素的に反応した基質を選択的に結合することので
きる固体相■はゲルまたは他の分離担体物質であること
ができる。同様にこの固体相■は共有結合的に、イオン
結合的に、または静電気的相互・作用によって結合する
担体であることができる。
これには、その反応した基質が極めて多種多様の性質の
ものでありうるので、すでに上に記述したのと原理的に
同一の公知の物質があげられ、即ち例えばニトロセルロ
ーズ、ポリビニリデンジフルオライド、ポリアミド、改
質されたポリアミド、ジアゾベンジロギシメチルセルロ
ーズ、ジエチルアミノエチルセルローズ、シアヌルクロ
ライドによって活性化されたセルローズ、活性化された
ポリスチレン、化学的に活性化されたガラス、燐セまた
はスルホン酸基とを有するような化合物によって改質さ
れたセルローズがあげられる。この固体相■も工学的に
透過性の媒質の形で使用することができる。ここで前記
固体相■の場合と同様な種々の可能性及び変法が同しく
当てはまる。この固体相■を用いる検出はもしもこれが
例えばフィルム、膜または捲縮繊維フリースとして形成
されている時に平板物質として実施するのが好ましい。
ものでありうるので、すでに上に記述したのと原理的に
同一の公知の物質があげられ、即ち例えばニトロセルロ
ーズ、ポリビニリデンジフルオライド、ポリアミド、改
質されたポリアミド、ジアゾベンジロギシメチルセルロ
ーズ、ジエチルアミノエチルセルローズ、シアヌルクロ
ライドによって活性化されたセルローズ、活性化された
ポリスチレン、化学的に活性化されたガラス、燐セまた
はスルホン酸基とを有するような化合物によって改質さ
れたセルローズがあげられる。この固体相■も工学的に
透過性の媒質の形で使用することができる。ここで前記
固体相■の場合と同様な種々の可能性及び変法が同しく
当てはまる。この固体相■を用いる検出はもしもこれが
例えばフィルム、膜または捲縮繊維フリースとして形成
されている時に平板物質として実施するのが好ましい。
光学的に透過性の固体相の場合の評価は特にこれがフィ
ルムの形に構成されている場合に種々の光学的方法によ
り、例えば着色した生成物の場合にはデンシトメトリー
により、カラリメトリー、または写真技術によって行わ
れる。生体細胞は固体相■の上に通常の方法で載せるこ
とができる。
ルムの形に構成されている場合に種々の光学的方法によ
り、例えば着色した生成物の場合にはデンシトメトリー
により、カラリメトリー、または写真技術によって行わ
れる。生体細胞は固体相■の上に通常の方法で載せるこ
とができる。
すなわちそれら細胞は中でもスポット法（Ｔｕｅｐｆｅ
ｌｎ）によりゲルまたは他の分離担体物質の中で分離し
た後にいわゆる転移法またはトランスファ法（プロッテ
ィング法）により載せることができる。本発明に従う方
法の好ましい実施形態の一つは、？客演の中に存在して
いるか、ゲルの中に含まれているか、または固体相Ｉに
結合されていてもよい生体分子をアミノグルコシド−燐
酸トランスフェラーゼの結合した分子プローブによって
識別し、この分子プローブに結合しているかまたはそれ
から分解分離させたアミノグルコシド−燐酸トランスフ
ェラーゼをある共基質の存在のもとに基質と反応させ、
そしてそのホスボリル化された基質を固体相■または■
の上で検出し、その際この方法を下記の木質的ないくつ
かの方法段階で実施することよりなる： ａ）識別段階：この段階においである結合されたアミノ
グルコシド−燐酸１−ランスフェラーゼによって標識化
された分子プローブを溶液の中に存在しているか、ゲル
の中に含まれているか、または固体相■に結合されてい
てそれに特異的な親和性を有する生体分子に付加させる
。
ｌｎ）によりゲルまたは他の分離担体物質の中で分離し
た後にいわゆる転移法またはトランスファ法（プロッテ
ィング法）により載せることができる。本発明に従う方
法の好ましい実施形態の一つは、？客演の中に存在して
いるか、ゲルの中に含まれているか、または固体相Ｉに
結合されていてもよい生体分子をアミノグルコシド−燐
酸トランスフェラーゼの結合した分子プローブによって
識別し、この分子プローブに結合しているかまたはそれ
から分解分離させたアミノグルコシド−燐酸トランスフ
ェラーゼをある共基質の存在のもとに基質と反応させ、
そしてそのホスボリル化された基質を固体相■または■
の上で検出し、その際この方法を下記の木質的ないくつ
かの方法段階で実施することよりなる： ａ）識別段階：この段階においである結合されたアミノ
グルコシド−燐酸１−ランスフェラーゼによって標識化
された分子プローブを溶液の中に存在しているか、ゲル
の中に含まれているか、または固体相■に結合されてい
てそれに特異的な親和性を有する生体分子に付加させる
。
ｂ）洗浄段階：この段階においてその標識の付けられた
分子プローブの過剰分を洗い流し、及び／又は分離除去
する。
分子プローブの過剰分を洗い流し、及び／又は分離除去
する。
Ｃ）酵素反応段階：この段階において基質のホスボリル
化をそのアミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼの
共基質の存在のもとにおける基質との反応によって行な
わせる。
化をそのアミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼの
共基質の存在のもとにおける基質との反応によって行な
わせる。
ｄ）分離段階：この段階においてその反応しなかった共
基質及び場合により基質を洗い流すかまたは分離除去す
る。
基質及び場合により基質を洗い流すかまたは分離除去す
る。
ｅ）評価段階においてそのホスホリル化された基質を固
体相■または■の上で測定するかまたは特別な検出方法
によって検出する。
体相■または■の上で測定するかまたは特別な検出方法
によって検出する。
アミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼはアデノシ
ン３燐酸（ＡＴＰ）から燐酸残基を分解分離してこの燐
酸残基をホスホリル化することのできる基質の上に転移
させるような酵素である。この基質は溶液の中に存在す
るか、担体の中に閉じ込められているか、またはある固
体相に結合されていることができる。ＡＴＰばこの反応
において共基質として作用する。
ン３燐酸（ＡＴＰ）から燐酸残基を分解分離してこの燐
酸残基をホスホリル化することのできる基質の上に転移
させるような酵素である。この基質は溶液の中に存在す
るか、担体の中に閉じ込められているか、またはある固
体相に結合されていることができる。ＡＴＰばこの反応
において共基質として作用する。
このＡＴＰＯ代りに３２ｐで標識されたＡＴＰ（”Ｐ−
γ−ＡＴＰ）を用いた場合には、そのアミノグルコシド
−燐酸トランスフェラーゼによって３２ｐで標識された
燐酸がその基質の上に転移される。その分子プローブに
結合されている酵素はこの反応を唯１度だけしか行なわ
ないのではなくて、下記の三つの条件が満足されるまで
進行させる。すなわち○基質が存在すること Ｏ共基質（ずなわちＡＴＰまたは３２Ｐ−γ−ＡＴＰ）
の存在すること Ｏ酵素が基質に確実に移動すること しかしながら本発明に従う方法には、各酵素分子が多数
の燐酸残基を多数の基質分子に転移させ、それによって
少なくとも１０以上の増幅倍率が与えられるようにする
ことが重要であるが、但し殆んどの場合、これよりも本
質的に高い。この方法によれば基質が存在する相の中で
分子プローブの拡大された複製像が作り出される。従っ
て本発明に−４〇− 従う方法によれば検出は分子プローブが存在する相の中
で行われるのではなくて基質の存在する相の中で行われ
るのである。ある分子プローブにおいて共基質の存在の
もとに基質を含んだ多数の相が望まれる場合（両側に、
または前後に）、ある検出されるべき生体分子によって
多数の拡大されたレプリカを作ることができる。もとの
生体分子からはプローブと酵素とよりなる錯化合物は通
常の方法によって再び分解分離でき、そして検出は、場
合により同様にアミノグルコシド−燐酸トランスフェラ
ーゼによって標識された分子プローブを用いて繰り返す
ことができる。種々のトランスフェラーゼの中でアミノ
グルコシド−燐酸トランスフェラーゼは驚くべきことに
次のように表わすことができるようなある特別な位置を
占める：Ｏこのものは高い熱安定性を有する：この酵素
はその活性を１００℃に加熱した後においても維持し、
従ってより高い温度における長時間のインキュベーショ
ンが可能である。
γ−ＡＴＰ）を用いた場合には、そのアミノグルコシド
−燐酸トランスフェラーゼによって３２ｐで標識された
燐酸がその基質の上に転移される。その分子プローブに
結合されている酵素はこの反応を唯１度だけしか行なわ
ないのではなくて、下記の三つの条件が満足されるまで
進行させる。すなわち○基質が存在すること Ｏ共基質（ずなわちＡＴＰまたは３２Ｐ−γ−ＡＴＰ）
の存在すること Ｏ酵素が基質に確実に移動すること しかしながら本発明に従う方法には、各酵素分子が多数
の燐酸残基を多数の基質分子に転移させ、それによって
少なくとも１０以上の増幅倍率が与えられるようにする
ことが重要であるが、但し殆んどの場合、これよりも本
質的に高い。この方法によれば基質が存在する相の中で
分子プローブの拡大された複製像が作り出される。従っ
て本発明に−４〇− 従う方法によれば検出は分子プローブが存在する相の中
で行われるのではなくて基質の存在する相の中で行われ
るのである。ある分子プローブにおいて共基質の存在の
もとに基質を含んだ多数の相が望まれる場合（両側に、
または前後に）、ある検出されるべき生体分子によって
多数の拡大されたレプリカを作ることができる。もとの
生体分子からはプローブと酵素とよりなる錯化合物は通
常の方法によって再び分解分離でき、そして検出は、場
合により同様にアミノグルコシド−燐酸トランスフェラ
ーゼによって標識された分子プローブを用いて繰り返す
ことができる。種々のトランスフェラーゼの中でアミノ
グルコシド−燐酸トランスフェラーゼは驚くべきことに
次のように表わすことができるようなある特別な位置を
占める：Ｏこのものは高い熱安定性を有する：この酵素
はその活性を１００℃に加熱した後においても維持し、
従ってより高い温度における長時間のインキュベーショ
ンが可能である。
Ｏこのものは良好な界面活性材安定性を有する：この酵
素は種々の界面活性材によってその２次構造が変化する
にも拘らずなお酵素活性を有する。
素は種々の界面活性材によってその２次構造が変化する
にも拘らずなお酵素活性を有する。
○その特異的親和性は非常に高い。
○このものは容易に入手でき、そして微生物の溶菌生成
物（Ｚｅｌｌｙｓａｔ）から、比較的容易に得ることが
できる。
物（Ｚｅｌｌｙｓａｔ）から、比較的容易に得ることが
できる。
従って７ミノグルコシドー燐酸トランスフエラーゼは例
えば３．ｌｌｖｒｅｍｅａｓによって雑誌Ｂｕ１１．
Ｓｏｃ。
えば３．ｌｌｖｒｅｍｅａｓによって雑誌Ｂｕ１１．
Ｓｏｃ。
Ｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｌ、 （１９６８）５０．第１頁１
６９以下にあげられているような他の生体分子に結合さ
れるべき酵素についての諸要求条件を著しく満足させる
ものである。それらは微生物学的に例えばＢ、Ｒｅ１ｓ
ｓ。
６９以下にあげられているような他の生体分子に結合さ
れるべき酵素についての諸要求条件を著しく満足させる
ものである。それらは微生物学的に例えばＢ、Ｒｅ１ｓ
ｓ。
Ｒ，Ｓｐｒｅｎｇｅｌ、 Ｈ，Ｗｉｌｌ及びＨ，５ｃｈ
ａｌｌｅｒによって雑誌Ｇｅｎｅ（（１９８４）３０．
２１１−２１８頁に記述されているように製造すること
ができる。種々の分子プローブをアミノグルコシド−燐
酸トランスフェラーゼに結合させることができるという
ような多くの可能性に基いて種々の生体分子の検出のた
めの一連の技術が可能である。先ず第一に、結合に適し
ている分子プローブとして免疫活性の種々のプローブ、
核酸、種々の蛋白質あるいは生体分子に親和性を有する
化合物等を使用することができる。
ａｌｌｅｒによって雑誌Ｇｅｎｅ（（１９８４）３０．
２１１−２１８頁に記述されているように製造すること
ができる。種々の分子プローブをアミノグルコシド−燐
酸トランスフェラーゼに結合させることができるという
ような多くの可能性に基いて種々の生体分子の検出のた
めの一連の技術が可能である。先ず第一に、結合に適し
ている分子プローブとして免疫活性の種々のプローブ、
核酸、種々の蛋白質あるいは生体分子に親和性を有する
化合物等を使用することができる。
免疫活性のプローブにはモノクローナル及びポリクロー
ナルな抗体、抗血清、蛋白質類、中でもプロティン八、
天然の、または合成のペプチド類が含まれる。核酸類と
しては一本鎖の、二重鎖の、又は部分的に二重鎖のＤＮ
Ａまたはそれらの断片、オリゴデオキシリボヌクレオシ
ド、ＲＮＡまたはそれらの断片あるいはオリゴリボヌク
レオチド類を使用することができる。ある生体分子に対
して特異的な親和性を有する蛋白質は例えばアビジン、
ストレプトアビジン、プレタミン、ゼラチン、フェツイ
ン、ベプスクチン、レクチン及び多数の酵素類である。
ナルな抗体、抗血清、蛋白質類、中でもプロティン八、
天然の、または合成のペプチド類が含まれる。核酸類と
しては一本鎖の、二重鎖の、又は部分的に二重鎖のＤＮ
Ａまたはそれらの断片、オリゴデオキシリボヌクレオシ
ド、ＲＮＡまたはそれらの断片あるいはオリゴリボヌク
レオチド類を使用することができる。ある生体分子に対
して特異的な親和性を有する蛋白質は例えばアビジン、
ストレプトアビジン、プレタミン、ゼラチン、フェツイ
ン、ベプスクチン、レクチン及び多数の酵素類である。
最後にある生体分子に対して親和性を有する化合物はビ
オチン、ｎ−アミノフェニル硼酸及びＣ１ｂａｃｒｏｎ
Ｂｌｕｅ Ｆ３０Ａである。他の生体分子に対して特
異的な親和性を有する蛋白質はこの場合に好ましくはア
ビジンまたはストレプトアビジンである。ある生体分子
に対して親和性を有する化合物は好ましくはビオチンで
ある。
オチン、ｎ−アミノフェニル硼酸及びＣ１ｂａｃｒｏｎ
Ｂｌｕｅ Ｆ３０Ａである。他の生体分子に対して特
異的な親和性を有する蛋白質はこの場合に好ましくはア
ビジンまたはストレプトアビジンである。ある生体分子
に対して親和性を有する化合物は好ましくはビオチンで
ある。
酵素としては二つの大きなグループがあげられそれらば
トランスフェラーゼ（Ｅ、Ｃ，に従うグループ２）及び
（Ｅ、Ｃ１に従うグループ６）である。トランスフェラ
ーゼの中でも放射性同位元素で標識をつけることのでき
る基を転移する、例えばアシルトランスフェラーゼ（Ｅ
、Ｃ，２，３） 、１８含有基を転移させる酵素類（Ｅ
、Ｃ，２，７）またはポリメラーゼ類（Ｅ、Ｃ。
トランスフェラーゼ（Ｅ、Ｃ，に従うグループ２）及び
（Ｅ、Ｃ１に従うグループ６）である。トランスフェラ
ーゼの中でも放射性同位元素で標識をつけることのでき
る基を転移する、例えばアシルトランスフェラーゼ（Ｅ
、Ｃ，２，３） 、１８含有基を転移させる酵素類（Ｅ
、Ｃ，２，７）またはポリメラーゼ類（Ｅ、Ｃ。
２．７．７）のような酵素が好ましい。中でも下記の酵
素が特に本発明に従う方法を実施するために適している
と考えられるニ プロチインキナーゼ（Ｅ、Ｃ，２，７，Ｌ） 、アミノ
グルコシド−燐酸トランスフェラーゼ（Ｅ、Ｃ，２，７
，１） 、中でもカナマイン−燐酸トランスフェラーゼ
（Ｅ、Ｃ。
素が特に本発明に従う方法を実施するために適している
と考えられるニ プロチインキナーゼ（Ｅ、Ｃ，２，７，Ｌ） 、アミノ
グルコシド−燐酸トランスフェラーゼ（Ｅ、Ｃ，２，７
，１） 、中でもカナマイン−燐酸トランスフェラーゼ
（Ｅ、Ｃ。
２．７，１．９５） 、Ｔ４−ポリヌクレオチド−キナ
ーゼ（Ｅ、Ｃ，２，７，１，７８）、ヌクレオチジルト
ランスフエラーゼ（Ｅ、Ｃ，２，７，７） 、ＤＮΔポ
リメラーゼ（Ｅ、Ｃ，２，７，７゜７）、ポリヌクレオ
チド−アデニルトランスフェラーゼ（Ｅ、Ｃ，２，７，
７，１９）、ＤＮＡ−ヌクレオチジルオキソトランスフ
エラーゼ（Ｅ、Ｃ，２，７，７，３１＞、レヘルターゼ
（Ｅ、Ｃ，２，７，７，４９）、燐酸エステル形成性抗
素（補修酵素）（Ｅ、Ｃ，６，５）、ＤＮΔ−リガーゼ
（ｌＥ、ｃ、６．９．１１）。
ーゼ（Ｅ、Ｃ，２，７，１，７８）、ヌクレオチジルト
ランスフエラーゼ（Ｅ、Ｃ，２，７，７） 、ＤＮΔポ
リメラーゼ（Ｅ、Ｃ，２，７，７゜７）、ポリヌクレオ
チド−アデニルトランスフェラーゼ（Ｅ、Ｃ，２，７，
７，１９）、ＤＮＡ−ヌクレオチジルオキソトランスフ
エラーゼ（Ｅ、Ｃ，２，７，７，３１＞、レヘルターゼ
（Ｅ、Ｃ，２，７，７，４９）、燐酸エステル形成性抗
素（補修酵素）（Ｅ、Ｃ，６，５）、ＤＮΔ−リガーゼ
（ｌＥ、ｃ、６．９．１１）。
これらの酵素はいずれもある特別な基質と反応する。以
下にあげる各種基質は従ってすべての酵素にではなくて
その基材が特異的であるような酵素に対してのみ有効で
ある。しかしながら多数の酵素によって多くの基質が反
応するけれども、しかしながら一般にそれぞれ異った機
構により、そして異なった態様で、あるいは異った反応
生成物を形成して反応する。すなわち基質としては、ク
ロムフェニコール、アミノグルコシド−抗生物質、中で
もカナマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン及びパ
ロモマイシン、例えばヒストンのようなホスボリル化可
能な蛋白質類、ＤＮＡ、ＲＮＡ 、デオキシリボヌクレ
オチドまたはリボ−オリゴヌクレオチド、デオキシリボ
ポリヌクレオチドまたはりボポリヌクレオチド、２重鎖
ＤＮへ、単鎖ＤＮＡ＋フ゛ライマー （即ちスターター
）である。
下にあげる各種基質は従ってすべての酵素にではなくて
その基材が特異的であるような酵素に対してのみ有効で
ある。しかしながら多数の酵素によって多くの基質が反
応するけれども、しかしながら一般にそれぞれ異った機
構により、そして異なった態様で、あるいは異った反応
生成物を形成して反応する。すなわち基質としては、ク
ロムフェニコール、アミノグルコシド−抗生物質、中で
もカナマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン及びパ
ロモマイシン、例えばヒストンのようなホスボリル化可
能な蛋白質類、ＤＮＡ、ＲＮＡ 、デオキシリボヌクレ
オチドまたはリボ−オリゴヌクレオチド、デオキシリボ
ポリヌクレオチドまたはりボポリヌクレオチド、２重鎖
ＤＮへ、単鎖ＤＮＡ＋フ゛ライマー （即ちスターター
）である。
それらの酵素はその基質に加えて共基質を必要とする。
この共基質は基質の変化のために用いられる構成要素で
ある。アシルトランスフェラーゼの場合には従ってその
共基質は例えば１４Ｇまたは３１１で標識したアセテー
トであることができる。燐酸トランスフェラーゼの場合
にはその共基質は一般にアデノシン３燐酸及び／又は３
２ｐで標識したアデノシン３燐酸（ＡＴＰ）である。そ
の他になお４つのデオキシヌクレオシド３燐酸（それぞ
れアデノシン、グアノシン、シトシン、及びチミジンの
それ）も転移させることができる。デオキシヌクレオシ
ド３燐酸の標識化はそのα位置またはγ位置において行
うことができ、そしてそれぞれ酵素に従ってその一方の
形または他方の形のものが反応する。３２ｐによる以外
にデオキシヌクレオシド３燐酸を３５Ｓ、３Ｈまたは１
２５Ｉによって標識することも可能であり、この際それ
ぞれのヌクレオシドが標識されてもよいが、また唯１つ
のヌクレオシドだけが標識されていてもよい。
ある。アシルトランスフェラーゼの場合には従ってその
共基質は例えば１４Ｇまたは３１１で標識したアセテー
トであることができる。燐酸トランスフェラーゼの場合
にはその共基質は一般にアデノシン３燐酸及び／又は３
２ｐで標識したアデノシン３燐酸（ＡＴＰ）である。そ
の他になお４つのデオキシヌクレオシド３燐酸（それぞ
れアデノシン、グアノシン、シトシン、及びチミジンの
それ）も転移させることができる。デオキシヌクレオシ
ド３燐酸の標識化はそのα位置またはγ位置において行
うことができ、そしてそれぞれ酵素に従ってその一方の
形または他方の形のものが反応する。３２ｐによる以外
にデオキシヌクレオシド３燐酸を３５Ｓ、３Ｈまたは１
２５Ｉによって標識することも可能であり、この際それ
ぞれのヌクレオシドが標識されてもよいが、また唯１つ
のヌクレオシドだけが標識されていてもよい。
更に、その共基質はビオチニル化されたヌクレオチドで
あることができ、それによって酵素反応のあとで例えば
アビジンあるいはストレプトアビジンに結合されている
酵素との反応が可能であってそれにより着色物質による
評価手段が利用できるようになっていてもよい。
あることができ、それによって酵素反応のあとで例えば
アビジンあるいはストレプトアビジンに結合されている
酵素との反応が可能であってそれにより着色物質による
評価手段が利用できるようになっていてもよい。
共基質としてはその他にすでに標識のつけられているＴ
ＮＡまたはデオキシリボポリヌクレオチド類が場合によ
り標識のつけられていない分子との混合物の形で使用す
ることができ、これは特にリガーゼ類のための共基質と
してあげられる。
ＮＡまたはデオキシリボポリヌクレオチド類が場合によ
り標識のつけられていない分子との混合物の形で使用す
ることができ、これは特にリガーゼ類のための共基質と
してあげられる。
本発明に従う方法を実施するために好ましい酵素はアミ
ノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼ類である。これ
らは中でもカナマイシン−燐酸トランスフエラアゼ、ま
たはＡＰＨ６またはＡＰＩ１３とも表わされるアミノグ
ルコシド−ネオマイシン−燐酸ｌ・ランスフェラーゼＩ
及び■である。アミノグルコシド−燐酸トランスフェラ
ーゼ類のための基質はアミノグルコシド−抗生物質また
はアミノシクリトール−抗生物質である〔これについて
はに、Ｌ。
ノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼ類である。これ
らは中でもカナマイシン−燐酸トランスフエラアゼ、ま
たはＡＰＨ６またはＡＰＩ１３とも表わされるアミノグ
ルコシド−ネオマイシン−燐酸ｌ・ランスフェラーゼＩ
及び■である。アミノグルコシド−燐酸トランスフェラ
ーゼ類のための基質はアミノグルコシド−抗生物質また
はアミノシクリトール−抗生物質である〔これについて
はに、Ｌ。
Ｒｊｎｅｈａｒｄｔ：雑誌Ｊ、 Ｔｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ
ｅａｓｅｓ （１９６９）上け。
ｅａｓｅｓ （１９６９）上け。
３４５−５０参照〕。そのようなものとしては例えばネ
一 ４７− オマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン及び］・ブ
ラマイシン等をあげることができる。好ましくは基質と
してカナマイシンまたはネオマイシンが用いられる。共
基質は標識のつげられたカーテンまたは標識のつりられ
ていないアデノシン３燐酸（ＡＴＰ）である。検出のた
めには通常３Ｚｐ−γ−ＡＴＰが用いられるが、これば
標識を付していないＡＴＰと混合されていてもよい。
一 ４７− オマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン及び］・ブ
ラマイシン等をあげることができる。好ましくは基質と
してカナマイシンまたはネオマイシンが用いられる。共
基質は標識のつげられたカーテンまたは標識のつりられ
ていないアデノシン３燐酸（ＡＴＰ）である。検出のた
めには通常３Ｚｐ−γ−ＡＴＰが用いられるが、これば
標識を付していないＡＴＰと混合されていてもよい。
アミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼを用いて種
々の生体分子を検出するための本発明に従う方法の好ま
しい実施形態は種々異った態様で実施することのできる
多数の方法段階からなり、従ってこれら特別な群の酵素
のために一連の実施形態が存在する。この場合にそれぞ
れの実施形態は生体分子の種類、その形、そのものの場
合により担体への結合の態様、基質の結合の態様等に左
右される。検出されるべき生体分子は溶液中に、分離操
作の前後においてゲルの中に、スポット法により固体担
体の上に移転されて、又は種々のゲルからの分離法の後
で平板担体等の上に存在して＝４８ ＝ いることができる。生体分子の担体上での分離、転移及
び固定は当業者にはよく知られており、従ってここでは
詳細には説明しない。
々の生体分子を検出するための本発明に従う方法の好ま
しい実施形態は種々異った態様で実施することのできる
多数の方法段階からなり、従ってこれら特別な群の酵素
のために一連の実施形態が存在する。この場合にそれぞ
れの実施形態は生体分子の種類、その形、そのものの場
合により担体への結合の態様、基質の結合の態様等に左
右される。検出されるべき生体分子は溶液中に、分離操
作の前後においてゲルの中に、スポット法により固体担
体の上に移転されて、又は種々のゲルからの分離法の後
で平板担体等の上に存在して＝４８ ＝ いることができる。生体分子の担体上での分離、転移及
び固定は当業者にはよく知られており、従ってここでは
詳細には説明しない。
生体分子がその検出されるべき形にされてしまったあと
で下記の方法段階が本発明に従い実施される： ａ）識別段階：この段階において結合されたアミノグル
コシド−燐酸トランスフェラーゼによって標識された分
子プローブがそれに特異的な親和性を存する生体分子に
付加（ａｎ ｌａｇｅｒｎ）される。
で下記の方法段階が本発明に従い実施される： ａ）識別段階：この段階において結合されたアミノグル
コシド−燐酸トランスフェラーゼによって標識された分
子プローブがそれに特異的な親和性を存する生体分子に
付加（ａｎ ｌａｇｅｒｎ）される。
ｂ）洗浄段階：この段階において標識のつけられた分子
プローブの過剰分が洗い流されるかまたは分離除去され
る。
プローブの過剰分が洗い流されるかまたは分離除去され
る。
Ｃ）酵素反応段階二分子プローブに結合されたアミノグ
ルコシド−燐酸トランスフェラーゼを成る共基質の関与
のもとに基質と反応させる。
ルコシド−燐酸トランスフェラーゼを成る共基質の関与
のもとに基質と反応させる。
ｄ）分離段階：この段階において反応しなかった共基質
及び場合により基質が洗い流されるか、または分離除去
される。
及び場合により基質が洗い流されるか、または分離除去
される。
ｅ）評価段階：この段階においてそのホスボリル化され
た基質を測定するかまたは特殊な検出方法によって検出
する。
た基質を測定するかまたは特殊な検出方法によって検出
する。
それぞれの方法段階の実施は互いに組合わ・けることが
できて、従って多数の変法を許容するような特定のパラ
メータと結び合わされている。各変法の中でそれぞれの
方法段階について異った種々の条件が可能であり、従っ
て特別な反応条件は一般的なものではなくである特定の
例についてのみ記述できるものである。これについては
本発明の説明のためにあげる各実施例を参照すべきであ
る。
できて、従って多数の変法を許容するような特定のパラ
メータと結び合わされている。各変法の中でそれぞれの
方法段階について異った種々の条件が可能であり、従っ
て特別な反応条件は一般的なものではなくである特定の
例についてのみ記述できるものである。これについては
本発明の説明のためにあげる各実施例を参照すべきであ
る。
ホスホリル化された基質の検出は例えばシンチレーショ
ンカウンターで、又はオートラジオグラフィーによって
行うこともできる。このオートラジオグラフィは特に平
板担体の場合に好ましい。
ンカウンターで、又はオートラジオグラフィーによって
行うこともできる。このオートラジオグラフィは特に平
板担体の場合に好ましい。
しかしながら他の、例えば走査法あるいは発光法等の検
出方法も可能である。
出方法も可能である。
同様に本発明に従う方法には一般にその好ましい実施態
様の変法がその方法の個々の段階において可能である。
様の変法がその方法の個々の段階において可能である。
以下これらの変法のいくつかを記述する。
実施形態ｌ
生体分子をゲルまたは他の分離担体物質の中で分離する
。
。
ａ）識別段階二上記生体分子が含まれている分離物質を
アミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼがそれに結
合されているような分子プローブを含む溶液と接触させ
、それにより生体分子とプローブとが互いに付加するよ
うにし、そしてそのようにして生体分子と酵素の結合し
たプローブとからなる錯化合物がゲルの中で形成される
ようにする。
アミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼがそれに結
合されているような分子プローブを含む溶液と接触させ
、それにより生体分子とプローブとが互いに付加するよ
うにし、そしてそのようにして生体分子と酵素の結合し
たプローブとからなる錯化合物がゲルの中で形成される
ようにする。
ｂ）洗浄段階：標識のつけられた過剰の分子プローブを
ゲルから洗い流す。
ゲルから洗い流す。
Ｃ）酵素反応段階：生体分子と酵素の結合したプローブ
とからなる錯化合物を含んでいるゲルを基質と共基質と
の含まれている第２のゲルと接触させ、それによりこの
ような条件のもとて基質をホスホリル化する。
とからなる錯化合物を含んでいるゲルを基質と共基質と
の含まれている第２のゲルと接触させ、それによりこの
ような条件のもとて基質をホスホリル化する。
ｄ）上記ホスホリル化された基質が含まれている第２の
ゲルをある固体相■と接触させ、そしてそのホスボリル
化された基質をこれに選択的に結合させる。
ゲルをある固体相■と接触させ、そしてそのホスボリル
化された基質をこれに選択的に結合させる。
ｅ）過剰の基材及び／又は共基質を除去するための洗浄
段階のあとでその固体相■の上のホスホリル化された基
質を放射能の測定により、またはオートラジオグラフィ
ーにより検出する。
段階のあとでその固体相■の上のホスホリル化された基
質を放射能の測定により、またはオートラジオグラフィ
ーにより検出する。
上記実施形態１の第２の変法において上記段階Ｃ）、す
なわち酵素反応段階を次のように、即ち生体分子と標識
のつけられた分子プローブとからなる錯化合物の含まれ
たゲルを基質がそれに結合されているような固体相■と
共基質の存在のもとに接触させてそのホスホリル化され
た基質を固体相■の上で検出するように実施する。
なわち酵素反応段階を次のように、即ち生体分子と標識
のつけられた分子プローブとからなる錯化合物の含まれ
たゲルを基質がそれに結合されているような固体相■と
共基質の存在のもとに接触させてそのホスホリル化され
た基質を固体相■の上で検出するように実施する。
実施夏用」
この変法においては生体分子は場合により多数の生体分
子の混合物として存在しており、そしてその標識のつけ
られた分子プローブは溶液中に存在している。
子の混合物として存在しており、そしてその標識のつけ
られた分子プローブは溶液中に存在している。
ａ）識別段階ニアミノグルコシド−燐酸トランスフェラ
ーゼが結合している分子プローブ及びその検出されるべ
き生体分子は溶液の中に存在しており、そして溶液中で
互いに付加される。
ーゼが結合している分子プローブ及びその検出されるべ
き生体分子は溶液の中に存在しており、そして溶液中で
互いに付加される。
ｂ）洗浄段階：標識のつけられた過剰の分子プローブを
分離除去する。
分離除去する。
Ｃ）酵素反応段階：分子プローブに結合されていてこの
錯化合物が生体分子に付加されているようなアミノグル
コシド−燐酸トランフフエラーゼを溶液の中で基質及び
共基質と反応させる。
錯化合物が生体分子に付加されているようなアミノグル
コシド−燐酸トランフフエラーゼを溶液の中で基質及び
共基質と反応させる。
ｄ）分離段階：反応しなかった共基質及び場合により基
質を分離除去する。
質を分離除去する。
ｅ）評価段階：ホスホリル化された基質の活性を測定す
る。
る。
去隻長皿」
この変法は生体分子と標識のつけられた分子プローブと
が溶液中に存在するけれども但しある固体相の上で検出
されるべき場合のもう一つの可能性を表わす。
が溶液中に存在するけれども但しある固体相の上で検出
されるべき場合のもう一つの可能性を表わす。
ａ）識別段階：その検出されるべき生体分子とアミノグ
ルコシド−燐酸トランスフェラーゼの結合している分子
プローブとが溶液の中に存在していてそこで互いに反応
する。
ルコシド−燐酸トランスフェラーゼの結合している分子
プローブとが溶液の中に存在していてそこで互いに反応
する。
ｂ）洗浄段階：標識の付けられた過剰の分子プローブを
分離除去する。
分離除去する。
Ｃ）酵素反応段階：分子プローブに結合されていてこの
錯化合物が生体分子に付加されているようなアミノグル
コシド−燐酸トランスフェラーゼを溶液の中で基質及び
共基質と反応させる。
錯化合物が生体分子に付加されているようなアミノグル
コシド−燐酸トランスフェラーゼを溶液の中で基質及び
共基質と反応させる。
ｄ）分離段階二基質を選択的に結合する担体■によって
そのホスホリル化された基質の過剰の共基質との分離が
行われる。
そのホスホリル化された基質の過剰の共基質との分離が
行われる。
ｅ）評価段階：ホスホリル化された基質の活性を測定す
るかまたはオートラジオグラフィーにより測定する。
るかまたはオートラジオグラフィーにより測定する。
大旌旭旭」
この本発明に従う変法を実施する際に生体分子はある固
体相、例えば平板担体または重合物粒子の分散物に結合
しており、そして標識のつけられた分子プローブを付加
した後に溶液中で基質及び共基質と反応させる。
体相、例えば平板担体または重合物粒子の分散物に結合
しており、そして標識のつけられた分子プローブを付加
した後に溶液中で基質及び共基質と反応させる。
ａ）識別段階：ある固体相ｌに結合された生体分子に、
結合したアミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼに
よって標識された分子プローブを結合させる。
結合したアミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼに
よって標識された分子プローブを結合させる。
ｂ）洗浄段階：標識のつけられた分子プローブの過剰分
を洗い流すか、または分離除去する。
を洗い流すか、または分離除去する。
Ｃ）酵素反応段階：ある固体相Ｉに結合している生体分
子と標識のつけられた分子プローブとの錯化合物を溶液
中に存在する基質及び共基質と反応させる。
子と標識のつけられた分子プローブとの錯化合物を溶液
中に存在する基質及び共基質と反応させる。
ｄ）分離段階：反応しなかった共基質及び場合により基
質を分離除去し、そしてホスホリル化された基質を場合
により固体相■に結合させる。
質を分離除去し、そしてホスホリル化された基質を場合
により固体相■に結合させる。
ｅ）評価段階：ホスホリル化された基質の活性を溶液中
で、または場合により固体相■の上で測定するか、或い
はオー１〜ラジオグラフ的に求める。
で、または場合により固体相■の上で測定するか、或い
はオー１〜ラジオグラフ的に求める。
この実施形態は酵素反応段階を変えるごとによって更に
変形させることができ、その際これはその固体相ｒがこ
れに結合している生体分子及びこれと結合している標識
のついた分子プローブと一緒にゲルで被覆され、その際
そのゲルの中に基質と共基質とが存在していてそれによ
り酵素反応が行われ、そして引続いてそのゲルからホス
ホリル化された基質が固体相■の上に転移される。ゲル
の中で基質と共基質とは溶液の形で存在しているけれど
も、同時に“密封された”の状態（エントラップされた
状態）になっている。
変形させることができ、その際これはその固体相ｒがこ
れに結合している生体分子及びこれと結合している標識
のついた分子プローブと一緒にゲルで被覆され、その際
そのゲルの中に基質と共基質とが存在していてそれによ
り酵素反応が行われ、そして引続いてそのゲルからホス
ホリル化された基質が固体相■の上に転移される。ゲル
の中で基質と共基質とは溶液の形で存在しているけれど
も、同時に“密封された”の状態（エントラップされた
状態）になっている。
大施髭皿」
この変法はプローブのみならず基質もある固体相に結合
されていて共基質だけが溶液の中に存在しているような
新規なサンドインチ法を示す。この方式は特に有利であ
り、というのは２つの固体相の使用によって分子プロー
ブの生体分子への結合、基質の結合及び酵素反応が極め
て異なった反−５６＝ 応条件のもとて実施でき、その固体相が生体分子と標識
のつげられた分子プローブとからなるそれに結合された
錯化合物と共に変化することなく維持され、従って何回
も使用することができ、あるいはそのプローブを洗い落
して場合により他のものと取り替え、そしてそのように
して多くのプローブを用いる検出が実施できるからであ
る。
されていて共基質だけが溶液の中に存在しているような
新規なサンドインチ法を示す。この方式は特に有利であ
り、というのは２つの固体相の使用によって分子プロー
ブの生体分子への結合、基質の結合及び酵素反応が極め
て異なった反−５６＝ 応条件のもとて実施でき、その固体相が生体分子と標識
のつげられた分子プローブとからなるそれに結合された
錯化合物と共に変化することなく維持され、従って何回
も使用することができ、あるいはそのプローブを洗い落
して場合により他のものと取り替え、そしてそのように
して多くのプローブを用いる検出が実施できるからであ
る。
ａ）識別段階：固体相■に生体分子が結合されていてこ
のものにアミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼに
より標識された分子プローブが付加される。
のものにアミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼに
より標識された分子プローブが付加される。
ｂ）洗浄段階；標識のついた分子プローブの過剰分を洗
い流し、及び／又は分離除去する。
い流し、及び／又は分離除去する。
Ｃ）酵素反応段階：固体相■に結合している生体分子と
標識のついた分子プローブとからなる錯化合物のアミノ
グルコシド−燐酸トランスフェラーゼを固体相■に結合
されている基質と溶液の中に存在している共基質の存在
のもとに反応させる。
標識のついた分子プローブとからなる錯化合物のアミノ
グルコシド−燐酸トランスフェラーゼを固体相■に結合
されている基質と溶液の中に存在している共基質の存在
のもとに反応させる。
ｄ）分離段階：過剰の共基質を洗い流すか、または分離
除去する。
除去する。
ｅ）評価段階：固体相■の上のホスホリル化された基質
の活性を測定するか、またはオートラジオグラフィーに
より求める。
の活性を測定するか、またはオートラジオグラフィーに
より求める。
本発明に従う方法の好ましい実施形態のすべての変法に
おいてその識別段階の生体分子と標識の付けられた分子
プローブとの反応を直接にではなくである中間段階を介
して行うことが可能である。
おいてその識別段階の生体分子と標識の付けられた分子
プローブとの反応を直接にではなくである中間段階を介
して行うことが可能である。
生体分子は例えば先ず最初アビジンとストレプトアビジ
ンと、またはビオチンと結合されたプローブによって識
別され、そしてこれを次にビオチンと、アビジンと、ま
たはストレプトアビジンと結合されたアミノグルコシド
−燐酸トランスフェラーゼと反応させることができる。
ンと、またはビオチンと結合されたプローブによって識
別され、そしてこれを次にビオチンと、アビジンと、ま
たはストレプトアビジンと結合されたアミノグルコシド
−燐酸トランスフェラーゼと反応させることができる。
この原理はその識別段階において生体分子がある１つ以
上の識別系中で且つ１つ以上の反応段階において先ず最
初特異的親和性を有する１つ以上の分子によって識別さ
れるか、または１つ以上の分子と反応させられてそのア
ミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼと結合された
分子プローブが少なくとも１つ以上のこのような分子と
反応させられるように一般化させることができる。
上の識別系中で且つ１つ以上の反応段階において先ず最
初特異的親和性を有する１つ以上の分子によって識別さ
れるか、または１つ以上の分子と反応させられてそのア
ミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼと結合された
分子プローブが少なくとも１つ以上のこのような分子と
反応させられるように一般化させることができる。
これによって更にもう一つの可能性が与えられ、即ちこ
の方法を１度以上何度も繰返すことができると言うこと
である。
の方法を１度以上何度も繰返すことができると言うこと
である。
最後に、識別段階と洗浄段階との後の酵素反応をその生
体分子と標識の付いた分子プローブとよりなる錯化合物
をその結合位置においてアミノグルコシド−燐酸トラン
スフェラーゼと分子プローブとから再び分解分離し、即
ちそれ自身分解可能であるような種々の反応剤を用いて
結合を行なわせるか又はその結合が両方の反応剤の少な
くとも一方について可逆的であるように実施することが
同様に可能である。この場合に酵素は溶液中で、又は成
る他の固体相に結合した後で共基質の存在のもとにその
溶液中に存在するか又は固体に結合している基質をホス
ホリル化することができる。
体分子と標識の付いた分子プローブとよりなる錯化合物
をその結合位置においてアミノグルコシド−燐酸トラン
スフェラーゼと分子プローブとから再び分解分離し、即
ちそれ自身分解可能であるような種々の反応剤を用いて
結合を行なわせるか又はその結合が両方の反応剤の少な
くとも一方について可逆的であるように実施することが
同様に可能である。この場合に酵素は溶液中で、又は成
る他の固体相に結合した後で共基質の存在のもとにその
溶液中に存在するか又は固体に結合している基質をホス
ホリル化することができる。
本発明に従う方法の好ましい実施形態において生体分子
、プローブ又は基質の結合のために用いられた担体はこ
こでもまた異った形で、例えば粉末、粒状物、ゲル、球
状体、繊維等、また分散液、エマルジョン、ラテックス
、フィルム、カラム充填物、マトリックス、フリース又
は−設面に平板状担体として構成されていることができ
る。その材料は天然又は合成の重合物或いはそれらの混
合物であることができる。その結合はその固体相が対応
する化合物、例えばシアヌルクロライド又はブロムシア
ン等によって活性化されている場合には共有結合を介し
て行なわれる。結合はまた、イオン性の結合或いは静電
気的相互作用によることも可能である。
、プローブ又は基質の結合のために用いられた担体はこ
こでもまた異った形で、例えば粉末、粒状物、ゲル、球
状体、繊維等、また分散液、エマルジョン、ラテックス
、フィルム、カラム充填物、マトリックス、フリース又
は−設面に平板状担体として構成されていることができ
る。その材料は天然又は合成の重合物或いはそれらの混
合物であることができる。その結合はその固体相が対応
する化合物、例えばシアヌルクロライド又はブロムシア
ン等によって活性化されている場合には共有結合を介し
て行なわれる。結合はまた、イオン性の結合或いは静電
気的相互作用によることも可能である。
固体相Ｉとしては従って３つの全ての結合の原理を組合
せることができるような担体物質が適している。静電気
的な、即ち例えば疎水性の、双極子−双極子間の、又は
ファンデアワールス力、或いは相互作用等により結合し
ているような固体相の例は中でもニトロセルローズ又は
ポリビニリデンジフルオライドである。イオン的力で結
合している固体相の例は、例えば変性され且つイオン的
に荷電されたポリアミド類、中でもナイロン膜、イオン
性の基によって置換された、例えばジエチルアミノエチ
ルセルローズのようなセルローズ誘導体及びスルホン化
したポリスチレン等である。
せることができるような担体物質が適している。静電気
的な、即ち例えば疎水性の、双極子−双極子間の、又は
ファンデアワールス力、或いは相互作用等により結合し
ているような固体相の例は中でもニトロセルローズ又は
ポリビニリデンジフルオライドである。イオン的力で結
合している固体相の例は、例えば変性され且つイオン的
に荷電されたポリアミド類、中でもナイロン膜、イオン
性の基によって置換された、例えばジエチルアミノエチ
ルセルローズのようなセルローズ誘導体及びスルホン化
したポリスチレン等である。
共有結合した固体相の例はジアゾベンジロキシメチルセ
ルローズ、シアヌルクロライドで活性化されたセルロー
ズ、ブロムシアンにより活性化されたセルローズ、又は
活性化されたポリスチレンやガラスである。更にまた、
化学的に活性化されてイオン結合及び／又は共有結合に
よって結合することのできるようなガラスが使用可能で
ある。本発明に従う方法の実施のために上に記述した種
々の物質からなる平板状担体が特に好ましい。
ルローズ、シアヌルクロライドで活性化されたセルロー
ズ、ブロムシアンにより活性化されたセルローズ、又は
活性化されたポリスチレンやガラスである。更にまた、
化学的に活性化されてイオン結合及び／又は共有結合に
よって結合することのできるようなガラスが使用可能で
ある。本発明に従う方法の実施のために上に記述した種
々の物質からなる平板状担体が特に好ましい。
固体相■は中でも負の荷電を有するイオン性結合の担体
であるか、又は共有結合で結合する担体である。陰イオ
ン的に荷電した担体としては中でも種々のセルローズ誘
導体、例えば燐セルローズ、カルボキシメチルセルロー
ズ、東ドイツ経済特許第２３７８４４号（参考文献とし
て引用する）に記述されているような、シアヌルクロラ
イドによって変性されていて、引続いて少なくとも一つ
以上のアミノ恭と１個のカルボン酸基、燐酸基又はスル
ボン酸基を分子中に有するような化合物と反応させたセ
ルローズ等が好ましい。共有結合的に結合する担体は固
体相Ｉについてあげたと同じものが適している。本発明
に従う方法に特に好ましいものは平板材の形の固体相■
である。
であるか、又は共有結合で結合する担体である。陰イオ
ン的に荷電した担体としては中でも種々のセルローズ誘
導体、例えば燐セルローズ、カルボキシメチルセルロー
ズ、東ドイツ経済特許第２３７８４４号（参考文献とし
て引用する）に記述されているような、シアヌルクロラ
イドによって変性されていて、引続いて少なくとも一つ
以上のアミノ恭と１個のカルボン酸基、燐酸基又はスル
ボン酸基を分子中に有するような化合物と反応させたセ
ルローズ等が好ましい。共有結合的に結合する担体は固
体相Ｉについてあげたと同じものが適している。本発明
に従う方法に特に好ましいものは平板材の形の固体相■
である。
選択的な結合を行う固体相■は負のイオン性に荷電した
担体である。ここで再び種々のセルローズ誘導体又はス
ルホン化されたポリスチレン類、或いはカルボン酸基を
有するアクリレートで被覆された種々の材料が通してい
る。燐セルローズ、カルボキシメチルセルローズ又は東
ドイツ経済特許第２３７８４４号公報に従いシアヌルク
ロライドで活性化し、そして引続いて少なくとも１個の
アミノ基と少なくとも１個のカルボン酸基、燐酸基又は
スルホン酸基を分子中に含む化合物と反応させることに
よってセルローズから作られるようなセルローズ誘導体
が好ましい。
担体である。ここで再び種々のセルローズ誘導体又はス
ルホン化されたポリスチレン類、或いはカルボン酸基を
有するアクリレートで被覆された種々の材料が通してい
る。燐セルローズ、カルボキシメチルセルローズ又は東
ドイツ経済特許第２３７８４４号公報に従いシアヌルク
ロライドで活性化し、そして引続いて少なくとも１個の
アミノ基と少なくとも１個のカルボン酸基、燐酸基又は
スルホン酸基を分子中に含む化合物と反応させることに
よってセルローズから作られるようなセルローズ誘導体
が好ましい。
基質の固体相への結合のための好ましい方法の一つが東
ドイツ経済特許第２５４，０１２号公報に記述されてお
り、これは参考文献としてここに採用する。分子プロー
ブにその標識のために酵素を結合さ−けるのは特定の幾
つかの酵素について記述されているような種々の方法に
よって行うことができる。プローブを酵素に結合させる
のは例えば一連の２官能性の結合試薬によって共有結合
的に行うことができる。このような結合試薬は例えばグ
ルタルアルデヒド、ビスースルホスクシニミジルスベレ
ーＩ・及びジスクシニミジルタルタレートのようなビス
−スクシニミジルエステル類、ジメチルスベリミデート
及びジメチルアジピミデートのようなビスイミデート、
Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシニ
ミド又は４，４°−ジチオ−ビス（フェニルアジド）の
ようなアジド類である。この場合に１個の結合分子は２
つの異った基を有しているか、又は場合により分子中に
還元性の、又はフォト化学的に分解することのできる幾
つかの基を有していることができる。このような結合試
薬の例はＮ−スクシニミジル−（４−アジドフェニル）
−１，３“−ジチオプロピオネート又はスルホスクシニ
ミジル−２−（ｍ−アジド−０−ニドＩコヘンズアミド
）−エチル−１，３゛−ジチオプロピオネ−１・である
。
ドイツ経済特許第２５４，０１２号公報に記述されてお
り、これは参考文献としてここに採用する。分子プロー
ブにその標識のために酵素を結合さ−けるのは特定の幾
つかの酵素について記述されているような種々の方法に
よって行うことができる。プローブを酵素に結合させる
のは例えば一連の２官能性の結合試薬によって共有結合
的に行うことができる。このような結合試薬は例えばグ
ルタルアルデヒド、ビスースルホスクシニミジルスベレ
ーＩ・及びジスクシニミジルタルタレートのようなビス
−スクシニミジルエステル類、ジメチルスベリミデート
及びジメチルアジピミデートのようなビスイミデート、
Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシニ
ミド又は４，４°−ジチオ−ビス（フェニルアジド）の
ようなアジド類である。この場合に１個の結合分子は２
つの異った基を有しているか、又は場合により分子中に
還元性の、又はフォト化学的に分解することのできる幾
つかの基を有していることができる。このような結合試
薬の例はＮ−スクシニミジル−（４−アジドフェニル）
−１，３“−ジチオプロピオネート又はスルホスクシニ
ミジル−２−（ｍ−アジド−０−ニドＩコヘンズアミド
）−エチル−１，３゛−ジチオプロピオネ−１・である
。
更に分子プローブ及び酵素は直接に共有結合によって互
いに結合していてもよい。このような結合は例えばカル
ボジイミドのような縮合剤の存在のもとに行うことがで
きる。
いに結合していてもよい。このような結合は例えばカル
ボジイミドのような縮合剤の存在のもとに行うことがで
きる。
酵素の分子プローブへの結合は同様にイオン性結合を介
して行うことができる。イオン性結合は例えば蛋白質と
ＤＮＡとの間で直接形成されていてもよい。しかしなが
ら一般に、例えば異った分子量を有するポリエチレンイ
ミン、ポリエレクトロライト又は両性電解質のような、
結合を可能とする種々の薬剤が用いられる。
して行うことができる。イオン性結合は例えば蛋白質と
ＤＮＡとの間で直接形成されていてもよい。しかしなが
ら一般に、例えば異った分子量を有するポリエチレンイ
ミン、ポリエレクトロライト又は両性電解質のような、
結合を可能とする種々の薬剤が用いられる。
酵素は疎水性から親水性の領域に及んでいるので、それ
らを静電気的相互作用によって分子プローブに結合させ
ることも可能である。静電気的相互作用としては更にフ
ァンデアワールス力、双極子−双極子の相互作用及び水
素結合もそれに包含されると理解すべきである。
らを静電気的相互作用によって分子プローブに結合させ
ることも可能である。静電気的相互作用としては更にフ
ァンデアワールス力、双極子−双極子の相互作用及び水
素結合もそれに包含されると理解すべきである。
標識された分子プローブとして癒合蛋白質を使＝６４
＝ 用するのは特別な場合であり、これは天然のもの又は遺
伝子工学的に作り出されるものであることができる。こ
の場合に酵素及び分子プローブは既に互いに結合されて
いる。
＝ 用するのは特別な場合であり、これは天然のもの又は遺
伝子工学的に作り出されるものであることができる。こ
の場合に酵素及び分子プローブは既に互いに結合されて
いる。
分子プローブと酵素との結合位置は分解可能であること
ができる （例えば酵素反応的に）。
ができる （例えば酵素反応的に）。
本発明に従う方法の好ましい実施形態のために用いられ
るアミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼの分子プ
ローブへの結合は新規であり、従ってそのようにして作
られた酵素で標識された分子プローブも新規生成物であ
る。それらは本発明に従う方法の第２の対象をなす。こ
のアミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼによって
標識された分子プローブの製造は同様に新規であり、そ
して本発明に従う方法の更にもう一つの対象をなす。本
発明に従えばそれらの分子プローブはアミノグルコシド
−燐酸トランスフェラーゼに直接に、又は成るスペーサ
を介して結合される。
るアミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼの分子プ
ローブへの結合は新規であり、従ってそのようにして作
られた酵素で標識された分子プローブも新規生成物であ
る。それらは本発明に従う方法の第２の対象をなす。こ
のアミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼによって
標識された分子プローブの製造は同様に新規であり、そ
して本発明に従う方法の更にもう一つの対象をなす。本
発明に従えばそれらの分子プローブはアミノグルコシド
−燐酸トランスフェラーゼに直接に、又は成るスペーサ
を介して結合される。
驚くべきことに、アミノグルコシド−燐酸トランスフェ
ラーゼ類は生体分子を信号増幅のもとに検出するのに特
に好適となるような種々の特性を有することが見出され
た。これらの特別な性質は下記の通りである。
ラーゼ類は生体分子を信号増幅のもとに検出するのに特
に好適となるような種々の特性を有することが見出され
た。これらの特別な性質は下記の通りである。
○高い熱安定性：それらの酵素は１００℃に加温した後
においてもその活性を維持し、貯蔵安定性についての要
求条件を満足し、そして長時間のインキュベーションを
生体分子とプローブとの識別反応の間のみならず酵素と
基質との反応の間においても保証する。
においてもその活性を維持し、貯蔵安定性についての要
求条件を満足し、そして長時間のインキュベーションを
生体分子とプローブとの識別反応の間のみならず酵素と
基質との反応の間においても保証する。
Ｏ界面活性剤安定性：これらの酵素は他の酵素と異って
、界面活性剤によるその２次構の変化にも拘らずなお酵
素的に活性である。
、界面活性剤によるその２次構の変化にも拘らずなお酵
素的に活性である。
○高い特異的親和性：３２Ｐで標識された燐酸の基質へ
の転移によって放射能的に強く標識された基質を作るこ
とができる。
の転移によって放射能的に強く標識された基質を作るこ
とができる。
Ｏ入手の容易性ニアミノグルコシド−燐酸トランスフェ
ラーゼ類は微生物の溶菌生成物（Ｚｅｌｌｙｓａｔ）か
ら比較的容易に得ることができる。
ラーゼ類は微生物の溶菌生成物（Ｚｅｌｌｙｓａｔ）か
ら比較的容易に得ることができる。
酵素にとって厳しい種々の反応条件においても放射能で
標識された燐酸を障害なく転移させるアミノゲルコンド
−燐酸１−ランスフェラーゼの能力及びこのものの通常
のハイブリダイゼーションの条件（即ち６５℃において
４８時間に達する）での操作可能性はこれらの酵素の特
別な地位を明らかに示すものであり、従ってそれらを種
々の検出方法に特に適するものにしている。
標識された燐酸を障害なく転移させるアミノゲルコンド
−燐酸１−ランスフェラーゼの能力及びこのものの通常
のハイブリダイゼーションの条件（即ち６５℃において
４８時間に達する）での操作可能性はこれらの酵素の特
別な地位を明らかに示すものであり、従ってそれらを種
々の検出方法に特に適するものにしている。
本発明に従う標識された分子プローブによって、放射能
が強く、また従って容易に検出することのできる反応生
成物が作り出される。検出は従来公知の検出方法によっ
ては検出することができないような検出分子の濃度にお
いても達成される。
が強く、また従って容易に検出することのできる反応生
成物が作り出される。検出は従来公知の検出方法によっ
ては検出することができないような検出分子の濃度にお
いても達成される。
アミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼと結合させ
るための適当な分子プローブは下記のものである。
るための適当な分子プローブは下記のものである。
ａ）免疫活性のプローブ類、中でもモノクローナルな、
又はポリクローナルな抗体、抗血清、蛋白質類、中でも
プロティンＡ、ペプチド類（天然のもののみならず合成
又は遺伝子工学によって作られたもの） ｂ）核Ｍ類又はそれらの誘導体或いはそれらの断片、中
でも一木１ｉ Ｄ Ｎ Ａ又はその断片、二重鎖の、又
は部分的に二重鎖のＤＮＶＩ又はその断片、オリゴデオ
キシリボヌクレオチド類、ｔｌＮ八又はその断片或いは
オリゴリボヌクレオチド類又は遺伝子工学的に作り出さ
れたハイゾ°リダイゼーションプローブ類 Ｃ）他の生体分子に対して特異的親和性を有する蛋白質
類、例えばストレプトアビジン、アビジン、レクチン又
は結合可能な特定の種々の酵素類 ｄ）成る生体分子に親和性を有する化合物、中でもビオ
チン、ｍ−アミノフェニル硼酸又ハＣ１ｂａｃｒｏｎ
Ｂｌｕｅ Ｆ３ＧＡアミノグルコシド−燐酸トランスフ
ェラーゼ類はアミノシクリトール−燐酸トランスフェラ
ーゼとも呼ばれる。これらには比較的よく知られたネオ
マイシン−燐酸トランスフェラーゼＩ及び■〔カナマイ
シン−燐酸トランスフェラーゼＩ及び■、リビドマイシ
ンー燐酸トランスフェラーゼニー〇 ８− 名命法についてばＭ、Ｊ、 １ｌａａｓ、 Ｊ、Ｅ、
Ｄｏｗｄｉｎｇ ：雑誌Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ （１９７５）４３．６１１−６１７
頁及びＥｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９
８４ ｉ ＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｔｔｅ
ｅ、 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ
ｏｆ ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙにューヨークＡｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８４年刊行）参照〕ス
トレプトマイシンー燐酸トランスフェラーゼ（省略記号
：ＮＰＴＩ又はＮＰＴｌｌ）、Ｏ−ホスボリル化で表わ
されるＡＰＲ、例えばＡＰＩ（６（これについては前記
のに、Ｌ、 Ｒｉｎｅｈａｒｄｔ参照）が含まれる。上
述のアミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼの中で
は本発明に従う酵素で標識したソオマイシンー燐酸トラ
ンスフェラーゼＩ及び■の分子プローブが好ましい。
又はポリクローナルな抗体、抗血清、蛋白質類、中でも
プロティンＡ、ペプチド類（天然のもののみならず合成
又は遺伝子工学によって作られたもの） ｂ）核Ｍ類又はそれらの誘導体或いはそれらの断片、中
でも一木１ｉ Ｄ Ｎ Ａ又はその断片、二重鎖の、又
は部分的に二重鎖のＤＮＶＩ又はその断片、オリゴデオ
キシリボヌクレオチド類、ｔｌＮ八又はその断片或いは
オリゴリボヌクレオチド類又は遺伝子工学的に作り出さ
れたハイゾ°リダイゼーションプローブ類 Ｃ）他の生体分子に対して特異的親和性を有する蛋白質
類、例えばストレプトアビジン、アビジン、レクチン又
は結合可能な特定の種々の酵素類 ｄ）成る生体分子に親和性を有する化合物、中でもビオ
チン、ｍ−アミノフェニル硼酸又ハＣ１ｂａｃｒｏｎ
Ｂｌｕｅ Ｆ３ＧＡアミノグルコシド−燐酸トランスフ
ェラーゼ類はアミノシクリトール−燐酸トランスフェラ
ーゼとも呼ばれる。これらには比較的よく知られたネオ
マイシン−燐酸トランスフェラーゼＩ及び■〔カナマイ
シン−燐酸トランスフェラーゼＩ及び■、リビドマイシ
ンー燐酸トランスフェラーゼニー〇 ８− 名命法についてばＭ、Ｊ、 １ｌａａｓ、 Ｊ、Ｅ、
Ｄｏｗｄｉｎｇ ：雑誌Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ （１９７５）４３．６１１−６１７
頁及びＥｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９
８４ ｉ ＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｔｔｅ
ｅ、 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ
ｏｆ ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙにューヨークＡｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８４年刊行）参照〕ス
トレプトマイシンー燐酸トランスフェラーゼ（省略記号
：ＮＰＴＩ又はＮＰＴｌｌ）、Ｏ−ホスボリル化で表わ
されるＡＰＲ、例えばＡＰＩ（６（これについては前記
のに、Ｌ、 Ｒｉｎｅｈａｒｄｔ参照）が含まれる。上
述のアミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼの中で
は本発明に従う酵素で標識したソオマイシンー燐酸トラ
ンスフェラーゼＩ及び■の分子プローブが好ましい。
その酵素は遺伝子的に操作された宿主細胞から、又は野
生種のものから分離することができ、この方法は例えば
Ｂ、 Ｒｅ１ｓｓ、 Ｒ，Ｓｐｒｅｎｇｅｌ、 Ｈ，Ｗ
ｉｌｌ＋Ｉ１．５ｃｈａｌｌｅｒ” ：雑誌Ｇｅｎｅ
（１９８４） ３０．２１１４８、及びＴ、 Ｔｒｉｅ
ｕ−Ｃｕｏｔ及びＰ、 Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ ： Ｊ、
Ａｎｔｉｍｉｏｒ。
生種のものから分離することができ、この方法は例えば
Ｂ、 Ｒｅ１ｓｓ、 Ｒ，Ｓｐｒｅｎｇｅｌ、 Ｈ，Ｗ
ｉｌｌ＋Ｉ１．５ｃｈａｌｌｅｒ” ：雑誌Ｇｅｎｅ
（１９８４） ３０．２１１４８、及びＴ、 Ｔｒｉｅ
ｕ−Ｃｕｏｔ及びＰ、 Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ ： Ｊ、
Ａｎｔｉｍｉｏｒ。
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、 （１９８６） １Ｂ、 ５ｕｐ
ｐ１． Ｃ，９３−１０２に記述されている。
ｐ１． Ｃ，９３−１０２に記述されている。
この酵素の分子プローブへの結合は多くの方法と反応剤
とを用いて行うことができる。即ち第１の実施形態にお
いては共有結合的な結合を形成して例えば２官能性反応
剤との反応により、又は縮合剤の存在のもとて縮合させ
ることにより化学的反応を行なわせることができる。第
２の実施形態においては分子プローブと標識用の酵素と
のイオン性結合による結合が例えばポリエレクトロライ
ト、両性電解質又は上記両方の分子とイオン的な結合を
形成するような種々の薬剤の存在のもとで反応させるこ
とによって形成される。もう一つの実施形態においては
分子プローブと標識用の酵素とを例えば両方の分子を変
性させることによるか、又はそれらを界面活性剤と反応
させることによって静電的な相互作用を形成させること
により互いに結合させる。第４の実施形態においては成
る酵素と分子プローブとしての蛋白質とからなる、天然
の、合成的に作られた、又は遺伝子工学的に作り出され
た癒合蛋白質を標識された分子プローブとして用いるか
、又は作り出して使用する。
とを用いて行うことができる。即ち第１の実施形態にお
いては共有結合的な結合を形成して例えば２官能性反応
剤との反応により、又は縮合剤の存在のもとて縮合させ
ることにより化学的反応を行なわせることができる。第
２の実施形態においては分子プローブと標識用の酵素と
のイオン性結合による結合が例えばポリエレクトロライ
ト、両性電解質又は上記両方の分子とイオン的な結合を
形成するような種々の薬剤の存在のもとで反応させるこ
とによって形成される。もう一つの実施形態においては
分子プローブと標識用の酵素とを例えば両方の分子を変
性させることによるか、又はそれらを界面活性剤と反応
させることによって静電的な相互作用を形成させること
により互いに結合させる。第４の実施形態においては成
る酵素と分子プローブとしての蛋白質とからなる、天然
の、合成的に作られた、又は遺伝子工学的に作り出され
た癒合蛋白質を標識された分子プローブとして用いるか
、又は作り出して使用する。
酵素と分子プローブとの結合のために現在利用できる多
数の可能性のうちで、好ましい方法及びそのようにして
作られた生成物を記述するが、その際但し当業者にはこ
こであげる他の２官能性の分子又は他の方法以外に、中
でも遺伝子工学的方法や構成も同様に利用することがで
き、そしてその際本発明に従う標識された分子プローブ
が得られることは当業者には自明である。この標識の付
いた分子プローブをアミノグルコシド−燐酸トランスフ
ェラーゼと分子プローブとの共有結合的結合によって形
成するための本発明に従う方法の第１の好ましい実施形
態は、１個から１５０個の原子の長さを有する成るスペ
ーサを結合部として使用することよりなり、その際この
分子鎖の中に１つ以上の環構造が含まれていてもよい。
数の可能性のうちで、好ましい方法及びそのようにして
作られた生成物を記述するが、その際但し当業者にはこ
こであげる他の２官能性の分子又は他の方法以外に、中
でも遺伝子工学的方法や構成も同様に利用することがで
き、そしてその際本発明に従う標識された分子プローブ
が得られることは当業者には自明である。この標識の付
いた分子プローブをアミノグルコシド−燐酸トランスフ
ェラーゼと分子プローブとの共有結合的結合によって形
成するための本発明に従う方法の第１の好ましい実施形
態は、１個から１５０個の原子の長さを有する成るスペ
ーサを結合部として使用することよりなり、その際この
分子鎖の中に１つ以上の環構造が含まれていてもよい。
この結合によっては生物体分子についてのプローブの識
別能力も酵素の作動能力も本質的に阻害されない。
別能力も酵素の作動能力も本質的に阻害されない。
本発明に従う標識の付けられた分子プローブを作り出す
ための共有結合の形成は例えばグルタルアルデヒド、ｐ
−ヘンゾキノン、ビスースクシニミジルエステル、ビス
イミデー！・類及び／又はアジド類によって行うことが
できる。ビス−スクシニミジルエステルには例えばビス
−２−（スクシニミドオキシ力ルポニルオキシ）−エチ
ルスルホン、ビス−（スルホスクシニミジル）−スベレ
ート、ジスクシニミジルスへレート、ジスクシニミジル
ータルタレ−１・、ジチオビスー（スクシニミジルプロ
ピオネート）、３．３’−ジチオビス−（スルホスクシ
ニミジル）−プロピオネート、エチレングリコールビス
ー（スクシニミジルスクシネート）、エチレングリコー
ルビス−（スルホスクシニミジルスクシネート）、ビス
−２−スルホスクシニミドキシ力ルポキシロキシ）−エ
チルスルホン及びジスルボスクシニミジルタルタレート
が含まれる。ビスイミデート類には例えば、ジメチチル
アジビミデート、ジメチル−３，３°−ジチオビス−（
プロピオニミデート）、ジメチル−ピメリニミデート、
ジメチルースベリミデート等が含まれる。アジド類の例
はＮ−５−アジド−２−ニトロペンゾイルオキシスクシ
ニミド、ｐ−アジドフェナシルブロマイド、ｐ−アジド
フェニルグリフ ２− オキザール、Ｎ−（４−アジドフェニルチオ）−フタル
イミド、４，４゛−ジチオビス−（フェニルアジド）、
４−（アジドフェニル）−Ｌ４−ジチオ−酪酸イミド−
エチルエステル、４−フルオロ−３−ニトロフェニルア
ジド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル−４−アジドベン
ゾエート、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル−４−アジド
ザリチル酸、４−アジド安息香酸イミドメチルエステル
、２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオニル
クロライド、ｐ−ニトロフェニル−２−ジアゾ−３，３
，３−トリフルオロプロピオネート、Ｎ−スクシニミジ
ル−６−（４’−アジド−２”−ニトロフェニルアミノ
）−ヘキサノエートである。このクラスにはまた分解可
能な結合試薬も含まれ、これらを本発明に従うプローブ
の製造に使用することによって検出方法の成る反応段階
において再び分解分離させることができ、従ってその酵
素反応を自由に動き得る酵素により実施することができ
て機械的利益をもたらすような生成物が作り出される。
ための共有結合の形成は例えばグルタルアルデヒド、ｐ
−ヘンゾキノン、ビスースクシニミジルエステル、ビス
イミデー！・類及び／又はアジド類によって行うことが
できる。ビス−スクシニミジルエステルには例えばビス
−２−（スクシニミドオキシ力ルポニルオキシ）−エチ
ルスルホン、ビス−（スルホスクシニミジル）−スベレ
ート、ジスクシニミジルスへレート、ジスクシニミジル
ータルタレ−１・、ジチオビスー（スクシニミジルプロ
ピオネート）、３．３’−ジチオビス−（スルホスクシ
ニミジル）−プロピオネート、エチレングリコールビス
ー（スクシニミジルスクシネート）、エチレングリコー
ルビス−（スルホスクシニミジルスクシネート）、ビス
−２−スルホスクシニミドキシ力ルポキシロキシ）−エ
チルスルホン及びジスルボスクシニミジルタルタレート
が含まれる。ビスイミデート類には例えば、ジメチチル
アジビミデート、ジメチル−３，３°−ジチオビス−（
プロピオニミデート）、ジメチル−ピメリニミデート、
ジメチルースベリミデート等が含まれる。アジド類の例
はＮ−５−アジド−２−ニトロペンゾイルオキシスクシ
ニミド、ｐ−アジドフェナシルブロマイド、ｐ−アジド
フェニルグリフ ２− オキザール、Ｎ−（４−アジドフェニルチオ）−フタル
イミド、４，４゛−ジチオビス−（フェニルアジド）、
４−（アジドフェニル）−Ｌ４−ジチオ−酪酸イミド−
エチルエステル、４−フルオロ−３−ニトロフェニルア
ジド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル−４−アジドベン
ゾエート、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル−４−アジド
ザリチル酸、４−アジド安息香酸イミドメチルエステル
、２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオニル
クロライド、ｐ−ニトロフェニル−２−ジアゾ−３，３
，３−トリフルオロプロピオネート、Ｎ−スクシニミジ
ル−６−（４’−アジド−２”−ニトロフェニルアミノ
）−ヘキサノエートである。このクラスにはまた分解可
能な結合試薬も含まれ、これらを本発明に従うプローブ
の製造に使用することによって検出方法の成る反応段階
において再び分解分離させることができ、従ってその酵
素反応を自由に動き得る酵素により実施することができ
て機械的利益をもたらすような生成物が作り出される。
これらの分解可能な結合試薬には例えばＮ−スクシニミ
ジル−（４−アジドフェニル）−１，３’−ジチオプロ
ビオネート、スルホスクシニミジル−２−（ｍ−アジド
−０−二Ｉ・ロベンズアミド）−エチル−１，３゛−ジ
チオプロピオネート、スルホスクシニミジル−（４−ア
ジドフェニル−ジチオ）−プロピオ矛−１・、スルホス
クシニミジル−２−（ｐ−アジドザリチルアミド）−エ
チル−１，３−ジチオプロピオネ−１・等が含まれる。
ジル−（４−アジドフェニル）−１，３’−ジチオプロ
ビオネート、スルホスクシニミジル−２−（ｍ−アジド
−０−二Ｉ・ロベンズアミド）−エチル−１，３゛−ジ
チオプロピオネート、スルホスクシニミジル−（４−ア
ジドフェニル−ジチオ）−プロピオ矛−１・、スルホス
クシニミジル−２−（ｐ−アジドザリチルアミド）−エ
チル−１，３−ジチオプロピオネ−１・等が含まれる。
酵素と分子プローブとの直接の共有結合的結合も可能で
ある。その例は例えばカルボジイミド類のような縮合剤
の存在のもとにおける両方の分子の縮合である。
ある。その例は例えばカルボジイミド類のような縮合剤
の存在のもとにおける両方の分子の縮合である。
癒合蛋白質は分子プローブと酵素との共有結合的結合の
特別な場合である。それらは殆んどの場合に遺伝子工学
的に作り出されるけれども、合成的に作ることもでき、
その際プローブの蛋白質と酵素とがペプチドの形で互い
に結合する。
特別な場合である。それらは殆んどの場合に遺伝子工学
的に作り出されるけれども、合成的に作ることもでき、
その際プローブの蛋白質と酵素とがペプチドの形で互い
に結合する。
この場合に遺伝子工学的に作られた癒合蛋白質の場合に
はプローブ蛋白質と酵素との遺伝情報は隣り合っており
、そして通常の読取りスクリーン（Ｌｅｓｅｒａｓ ｔ
ｅｒ）において遺伝子工学的ヘククーの」二に局在され
ていて、その際プローブをコードするＤＮＡ と酵素を
コードするＤＮＡとの間に別なアミノ配配列を（例えば
プロテアーゼ分裂部位について）コードする１）ＮＡ断
片を挿入することができるばかりでなく、一定のＤＮＡ
断片が繰返し出現し得る（例えば多数のプローブ分子及
び／又は酵素の分子よりなる癒合蛋白質の形成）。
はプローブ蛋白質と酵素との遺伝情報は隣り合っており
、そして通常の読取りスクリーン（Ｌｅｓｅｒａｓ ｔ
ｅｒ）において遺伝子工学的ヘククーの」二に局在され
ていて、その際プローブをコードするＤＮＡ と酵素を
コードするＤＮＡとの間に別なアミノ配配列を（例えば
プロテアーゼ分裂部位について）コードする１）ＮＡ断
片を挿入することができるばかりでなく、一定のＤＮＡ
断片が繰返し出現し得る（例えば多数のプローブ分子及
び／又は酵素の分子よりなる癒合蛋白質の形成）。
それらヘクターの上に存在する情報はその宿主生物、例
えばＥ、 Ｃｏ１１のようなバクテリアによって通常の
アミノ酸配列に翻訳され、そしてその癒合蛋白質を微生
物工学的に得ることができる。
えばＥ、 Ｃｏ１１のようなバクテリアによって通常の
アミノ酸配列に翻訳され、そしてその癒合蛋白質を微生
物工学的に得ることができる。
本発明に従う方法及び本発明に従う標識された分子プロ
ーブの第２の実施形態はプローブと標識の付いた酵素と
のイオン性の基を介しての結合である。この場合に酵素
のみならず分子プローブもそれに結合されるような種々
の化合物、例えばポリエチレンイミン、ポリエレクトロ
ライト、又は両性電解質を使用することができる。
ーブの第２の実施形態はプローブと標識の付いた酵素と
のイオン性の基を介しての結合である。この場合に酵素
のみならず分子プローブもそれに結合されるような種々
の化合物、例えばポリエチレンイミン、ポリエレクトロ
ライト、又は両性電解質を使用することができる。
本発明に従う方法及び本発明に従う標識された分子プロ
ーブの第３の実施形態に従えば、それらは静電的相互作
用によって結合される。それらの静電的相互作用には例
えば親水性−疎水性相互作本発明はアミノグルコシド−
燐酸トランスフェラーゼを用いて標識された分子プロー
ブの製造方法にも関する。この方法は、分子プローブ又
は幾つかの分子プローブの混合物にアミノグルコシド−
燐酸トランスフェラーゼを結合させることによりなる。
ーブの第３の実施形態に従えば、それらは静電的相互作
用によって結合される。それらの静電的相互作用には例
えば親水性−疎水性相互作本発明はアミノグルコシド−
燐酸トランスフェラーゼを用いて標識された分子プロー
ブの製造方法にも関する。この方法は、分子プローブ又
は幾つかの分子プローブの混合物にアミノグルコシド−
燐酸トランスフェラーゼを結合させることによりなる。
プローブとしては既に前にあげた免疫活性の種々のプロ
ーブ、ヌクレインスコイレ（Ｎｕｃｌｅｉｎ−ｓｑｅｕ
ｒｅ） 、蛋白質類及び種々の化合物を使用することが
できる。アミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼと
してはネオマイシン−燐酸トランスフェラーゼ■及び■
が好ましい。その老台法及びこの方法を実施するための
他の変法については前と同じものがあげられる。
ーブ、ヌクレインスコイレ（Ｎｕｃｌｅｉｎ−ｓｑｅｕ
ｒｅ） 、蛋白質類及び種々の化合物を使用することが
できる。アミノグルコシド−燐酸トランスフェラーゼと
してはネオマイシン−燐酸トランスフェラーゼ■及び■
が好ましい。その老台法及びこの方法を実施するための
他の変法については前と同じものがあげられる。
標識のついた分子プローブの製造のための本発明に従う
方法の第１の実施形態は、アミノグルコシド−燐酸トラ
ンスフェラーゼを成る直接の共有結合的結合を形成させ
ることにより分子プローブに結合をさせるか、又は結合
試薬を介して共有結合的に結合させることによりなる。
方法の第１の実施形態は、アミノグルコシド−燐酸トラ
ンスフェラーゼを成る直接の共有結合的結合を形成させ
ることにより分子プローブに結合をさせるか、又は結合
試薬を介して共有結合的に結合させることによりなる。
結合試薬としては既にあげたものがあげられる。反応条
件は分子プローブの種類、アミノグルコシド−燐酸トラ
ンスフェラーゼ及びその結合試薬によって左右される。
件は分子プローブの種類、アミノグルコシド−燐酸トラ
ンスフェラーゼ及びその結合試薬によって左右される。
しかしながらその結合を形成させるための既に述べた標
準的処方も使用することができる。
準的処方も使用することができる。
種々の結合の態様において好ましい実施形態としては連
鎖の中に１ないし１５０個の原子及び場合によりその連
鎖の中に構造を含むスペーサ基であってその標識された
分子プローブにできるだけ多数の基質分子に到達する機
会を与えるようなものを使用することに注意すべきであ
る。好ましくは既に記載したようなグルタルアルデヒド
、叶ベンゾキノン、ビス−スクシニミジルエステル類、
ビスイミデート類又はアジド類を用いる結合が用いられ
る。
鎖の中に１ないし１５０個の原子及び場合によりその連
鎖の中に構造を含むスペーサ基であってその標識された
分子プローブにできるだけ多数の基質分子に到達する機
会を与えるようなものを使用することに注意すべきであ
る。好ましくは既に記載したようなグルタルアルデヒド
、叶ベンゾキノン、ビス−スクシニミジルエステル類、
ビスイミデート類又はアジド類を用いる結合が用いられ
る。
酵素で標識された分子プローブを製造するための本発明
に従う方法の第２の実施形態は、イオン性結合の形成に
よる結合を行なわせることである。
に従う方法の第２の実施形態は、イオン性結合の形成に
よる結合を行なわせることである。
この結合はこの場合に成る蛋白質（酵素）と分子プロー
ブとしての成るＤＮＡとの間で直接行うことができる。
ブとしての成るＤＮＡとの間で直接行うことができる。
好ましくはこの結合を両方の反応剤がイオン性結合を形
成することができるような一つの化合物によって行う変
法が用いられる。このような化合物は例えば種々異った
分子量を有するポリエチレンイミン類、ポリエレクトロ
ライト又は両性電解質であるが、また分子中に荷電を有
するオリゴマー又はポリマーの化合物もあげられる。
成することができるような一つの化合物によって行う変
法が用いられる。このような化合物は例えば種々異った
分子量を有するポリエチレンイミン類、ポリエレクトロ
ライト又は両性電解質であるが、また分子中に荷電を有
するオリゴマー又はポリマーの化合物もあげられる。
酵素で標識された分子プローブを製造するための本発明
に従う方法の第３の実施形態は、酵素と分子プローブと
の静電的相互作用を結合のために多様することである。
に従う方法の第３の実施形態は、酵素と分子プローブと
の静電的相互作用を結合のために多様することである。
このような相互作用は親水性−疎水性の相互作用又は双
極子−双極子の相互でもよい。
極子−双極子の相互でもよい。
酵素で標識された分子プローブを製造するための本発明
に従う方法の第４の実施形態は、プローブと酵素とが直
接に互いに結合されているような癒合蛋白質（Ｆｕｓ＋
ｏｎ’ｖｉｐｒｏｔｅｉｎ）の遺伝子工学的又は合成的
製造よりなる。種々のヘクター及び癒合蛋白質の製造に
ついての一般的な手順についてはＴ。
に従う方法の第４の実施形態は、プローブと酵素とが直
接に互いに結合されているような癒合蛋白質（Ｆｕｓ＋
ｏｎ’ｖｉｐｒｏｔｅｉｎ）の遺伝子工学的又は合成的
製造よりなる。種々のヘクター及び癒合蛋白質の製造に
ついての一般的な手順についてはＴ。
Ｍａｎｉａｆ、ｉｓ、 Ｅ、Ｆ、 Ｆｒ１ｔｓｃｈ、
Ｊ、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ ：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ″−Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８２）の第９７頁以下及
び第２４７頁以下に記述されている。ネオマイシン−燐
酸トランスフェラーゼ■及びプロティン八よりなる新規
な癒合蛋白質の製造及び利用（これも同様に新しい方法
である）の詳細な内容は以下の実施例に記述する。
Ｊ、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ ：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ″−Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８２）の第９７頁以下及
び第２４７頁以下に記述されている。ネオマイシン−燐
酸トランスフェラーゼ■及びプロティン八よりなる新規
な癒合蛋白質の製造及び利用（これも同様に新しい方法
である）の詳細な内容は以下の実施例に記述する。
酵素で標識された分子プローブを用いる種々の生体分子
の本発明に従う検出方法は生体分子検出の新しい原理を
示す。結合した酵素を有する分子プローブの利用及び成
る固体相の上での反応した基質の検出は多くの実施形態
を包含する。この方法は多数の生体分子に利用すること
ができ、また従って凡用的に利用することができる。そ
の適用に際しては少なくとも１０以上の増幅係数が達成
されるが、−設面にはこれを木質的に越える。その＝７
９− 到達可能な増幅率（Ｖｅｒｓ を五ｒｋｕｎｇ）は用い
た物質及び選んだ方法の実施形態によって左右され、そ
して特別な場合についてのみ厳密に記述することができ
る。それら種々異った実施形態によって特定の変法を実
施する際にその用いた生体分子を多数のプローブによっ
て検出すること、即ちプロットを例えば再び使用できる
と言う可能性がある。本発明に従う方法の利用はここに
記載する具体的な幾つかの実施形態のみに制限されるも
のではなく、それら以外にこの木方の多くの変法が可能
である。
の本発明に従う検出方法は生体分子検出の新しい原理を
示す。結合した酵素を有する分子プローブの利用及び成
る固体相の上での反応した基質の検出は多くの実施形態
を包含する。この方法は多数の生体分子に利用すること
ができ、また従って凡用的に利用することができる。そ
の適用に際しては少なくとも１０以上の増幅係数が達成
されるが、−設面にはこれを木質的に越える。その＝７
９− 到達可能な増幅率（Ｖｅｒｓ を五ｒｋｕｎｇ）は用い
た物質及び選んだ方法の実施形態によって左右され、そ
して特別な場合についてのみ厳密に記述することができ
る。それら種々異った実施形態によって特定の変法を実
施する際にその用いた生体分子を多数のプローブによっ
て検出すること、即ちプロットを例えば再び使用できる
と言う可能性がある。本発明に従う方法の利用はここに
記載する具体的な幾つかの実施形態のみに制限されるも
のではなく、それら以外にこの木方の多くの変法が可能
である。
本発明に従う生体分子のアミノグルコシド−燐酸トラン
スフェラーゼに結合させた分子プローブを用いる検出方
法の好ましい実施形態によって種々の生体分子を従来知
られているものよりも高い感度の分子プローブによって
検出することが可能である。
スフェラーゼに結合させた分子プローブを用いる検出方
法の好ましい実施形態によって種々の生体分子を従来知
られているものよりも高い感度の分子プローブによって
検出することが可能である。
その上に種々の生体分子の検出を第２の、別なる状態に
保たれる。このような間接的検出方法は遺伝生物学にお
ける種々の検出、人の遺伝生物学的な種々の疾病の検出
及びビールス分解生成物の検出等において大きな意味を
存するものであり、と言うのはその検出を多くのプロー
ブによって実施することができ、種々の生物学的分子が
温和なインキュベーションによって損傷されず、そして
最後に従来達成することができなかったような高い増幅
率が得られるからである。
保たれる。このような間接的検出方法は遺伝生物学にお
ける種々の検出、人の遺伝生物学的な種々の疾病の検出
及びビールス分解生成物の検出等において大きな意味を
存するものであり、と言うのはその検出を多くのプロー
ブによって実施することができ、種々の生物学的分子が
温和なインキュベーションによって損傷されず、そして
最後に従来達成することができなかったような高い増幅
率が得られるからである。
本発明に従う方法の好ましい実施形態のために作られる
標識された分子プローブは一般的でない種々の特性を有
する新規な生成物であり、そして特に生体分子の検出に
使用することができる。
標識された分子プローブは一般的でない種々の特性を有
する新規な生成物であり、そして特に生体分子の検出に
使用することができる。
好ましく使用される酵素、即ちアミノグルコシド−燐酸
トランスフェラーゼ類は全ての検出段階において高い安
定性を有することによって優れており、即ち本発明に従
う標識された分子プローブはハイブリダイゼーション法
において６５°Ｃ程度の温度で使用することができる。
トランスフェラーゼ類は全ての検出段階において高い安
定性を有することによって優れており、即ち本発明に従
う標識された分子プローブはハイブリダイゼーション法
において６５°Ｃ程度の温度で使用することができる。
このプローブを用いることによってオートラジオグラフ
ィー的検出において極めて高い増幅率を得ることができ
る。
ィー的検出において極めて高い増幅率を得ることができ
る。
これまで酵素に結合させたプローブを用いてそのような
増幅率は得られていない。
増幅率は得られていない。
すなわち蛋白質の検出に際して１０ｇｇの検出を確実に
行うことができた。
行うことができた。
従来の種々の蛋白質の検出においては＋２５１−プロテ
ィン八を用いてＬｏｎｇの範囲の量について−７゜°Ｃ
においてオートラジオグラフィー時間は１ないし３日で
あった。本発明に従う方法では上記の条件のもとて室温
において３０分ないし１時間のオートラジオグラフィー
時間が強く信号について通常的である。
ィン八を用いてＬｏｎｇの範囲の量について−７゜°Ｃ
においてオートラジオグラフィー時間は１ないし３日で
あった。本発明に従う方法では上記の条件のもとて室温
において３０分ないし１時間のオートラジオグラフィー
時間が強く信号について通常的である。
以下、本発明を諸実施例により更に詳細に説明する。
狭更」１１歇
ＰＢＳ ： ＮａＣ１８ｇ 、 ＫＨｇＰＯｔ
０．２ｇ １Ｎａ２ＨＰＯ，・１２Ｈ２０２，９ｇ及
びＭＣｌ０．２ｇを水に溶解して全体を１ｐに する （ｐＨ＝ ７．４） ＴＢＳ ： ＮａＣ１０，１５モル、トリス−
（ヒドロキシメチル）−アミ傳メタン（以下 トリスと略記する）５０ミリモル （ｐＨ＝７．４） ＧＥＴニドリス／ＨＣＩ ２．５ミリモル（ｐＨ＝８．
０）グルコース５ミリモル、エチレン ジアミンテトう酢酸テトラナトリ ウム塩（ＥＤＴ八）１ミリモル 溶菌緩衝液二 トリス／）ｌｃ１１２５ ミリモル（ｐ
ｌ（＝６．８）ドデシルスルホン酸ナトリウム （ＳＯ５） ２％、グリセロ−ん１０％、β−メルカプ
トエタノール１０％ 溶離緩衝液： トリス／ＨＣｌ２０ミリモル（ｐｌ（＝
７．４）ジチオスレイトール１０ミリモル、 ＳＯ５０，１％ 溶解緩衝液二 トリス／ＨＣｌ２０ミリモル（ρ１（＝
８．８）の１００ｍｆ中に４８ｇの尿素を溶解し、そし
てこれに１％のＮｏｎ１ｄｅｔ ＮＰ４０及び１０％の
メルカプトエタノール を加える 酵素緩衝液二 トリス／ＨＣｌ２０ミ９モル（ｐＨ＝
７．２）ＮＨ４Ｃｌ１２５ミリモル、ＭｇＣ１ｚ ２０
ミリモル、ジチオスレイトール１０ミリ モル 訂 カナマイシン−燐酸トランスフェラーゼへのポリクロー
ナルな抗体の結合 ０．９％のＮａＣ１を含む１ｍＲの抗−大血清アルブミ
ン−抗血清（家免）をエタノール３ｍ１ｌ中の１０ｍｇ
のベンゾキノンと室温において１時間反応させる。次に
過剰のベンゾキノンをセファデックス６２５カラムによ
り分離し、そしてそのベンゾキノン／抗体の対する免疫
テストで調べる。そのテストしたフラクションを１モル
の重炭酸塩緩衝液（ｐＨ＝ ９）の１−中の１ｍｇのカ
ナマイシン−燐酸トランスフェラーゼと一夜室温におい
て光を遮断して反応させる。
０．２ｇ １Ｎａ２ＨＰＯ，・１２Ｈ２０２，９ｇ及
びＭＣｌ０．２ｇを水に溶解して全体を１ｐに する （ｐＨ＝ ７．４） ＴＢＳ ： ＮａＣ１０，１５モル、トリス−
（ヒドロキシメチル）−アミ傳メタン（以下 トリスと略記する）５０ミリモル （ｐＨ＝７．４） ＧＥＴニドリス／ＨＣＩ ２．５ミリモル（ｐＨ＝８．
０）グルコース５ミリモル、エチレン ジアミンテトう酢酸テトラナトリ ウム塩（ＥＤＴ八）１ミリモル 溶菌緩衝液二 トリス／）ｌｃ１１２５ ミリモル（ｐ
ｌ（＝６．８）ドデシルスルホン酸ナトリウム （ＳＯ５） ２％、グリセロ−ん１０％、β−メルカプ
トエタノール１０％ 溶離緩衝液： トリス／ＨＣｌ２０ミリモル（ｐｌ（＝
７．４）ジチオスレイトール１０ミリモル、 ＳＯ５０，１％ 溶解緩衝液二 トリス／ＨＣｌ２０ミリモル（ρ１（＝
８．８）の１００ｍｆ中に４８ｇの尿素を溶解し、そし
てこれに１％のＮｏｎ１ｄｅｔ ＮＰ４０及び１０％の
メルカプトエタノール を加える 酵素緩衝液二 トリス／ＨＣｌ２０ミ９モル（ｐＨ＝
７．２）ＮＨ４Ｃｌ１２５ミリモル、ＭｇＣ１ｚ ２０
ミリモル、ジチオスレイトール１０ミリ モル 訂 カナマイシン−燐酸トランスフェラーゼへのポリクロー
ナルな抗体の結合 ０．９％のＮａＣ１を含む１ｍＲの抗−大血清アルブミ
ン−抗血清（家免）をエタノール３ｍ１ｌ中の１０ｍｇ
のベンゾキノンと室温において１時間反応させる。次に
過剰のベンゾキノンをセファデックス６２５カラムによ
り分離し、そしてそのベンゾキノン／抗体の対する免疫
テストで調べる。そのテストしたフラクションを１モル
の重炭酸塩緩衝液（ｐＨ＝ ９）の１−中の１ｍｇのカ
ナマイシン−燐酸トランスフェラーゼと一夜室温におい
て光を遮断して反応させる。
その反応生成物を０．９％のＮａＣＩ溶液で一夜透析し
た後、使用する。透析の後でいくつかに等分して一２０
℃において貯蔵してもよく、或いはまたその抗体／ベン
ゾキノン／カナマイシン−燐酸トランスフェラーゼの生
成物を直ちに免疫学的反応に使用してもよい。
た後、使用する。透析の後でいくつかに等分して一２０
℃において貯蔵してもよく、或いはまたその抗体／ベン
ゾキノン／カナマイシン−燐酸トランスフェラーゼの生
成物を直ちに免疫学的反応に使用してもよい。
酊
反応した基質を固体相■の上で検出する、カナマイシン
−燐酸トランスフェラーゼと結合した抗体によるＨ５Ａ
Ｓの免疫学的反応種々の標識用蛋白質とＩＳＡとの混合
物をポリアクリルアミドゲル（ＦＡＡゲル）の中で電気
泳動により分離し、そしてエレクトロトランスファによ
りニトロセルローズフィルタの上に転移させた（プロッ
ト）を上記例１に従うカナマイシン−燐酸トランスフェ
ラーゼに結合させた抗体と共にＴＢＳ〔トリス−（ヒド
ロキシメチル）−アミノメタンで緩衝した０、９％の食
塩溶液〕及び１％ゼラチンの中で室温において４時間イ
ンキュベーションする（希釈度’＝ １ ： ５００）
。次にその酵素と結合して付加させた抗体を含むプロッ
トを１５分間づつ４回ＴＢＳで洗浄し、そして２０ミリ
モルのトリス／ＨＣＩ （ｐＨ＝７．２）、１２５ミリ
モルのＮＨ，、ＣＩ、１ミリモルのジチオニリスロール
、２０ミリモルのＭｇＣｌ２、及び２ミリモルのアデノ
シン３燐酸（八ＴＰ）を含み、ｌ ｍＩ！当り１ μＣ
ｉのγ−３２ｐ−八ＴＰ及びＩ ｍＲ当り２０ｎｇのカ
ナマイシンが含まれている１％アガロースゲル（反応緩
衝液中で作ったもの）を用いて３７℃において３０分間
インキュヘーシ３ンする。このアガロースゲルを茨賢翁
セルローズー平板担体の上に載せてカナマイシンを此の
燐セルローズに転移させる（セルローズ量０．５ｋｇ／
３時間／室温）。３Ｚｐで標識したカナマイシンの検出
は燐セルローズ平板担体のオートラジオグラフィーによ
って行う（２時間、室温）。
−燐酸トランスフェラーゼと結合した抗体によるＨ５Ａ
Ｓの免疫学的反応種々の標識用蛋白質とＩＳＡとの混合
物をポリアクリルアミドゲル（ＦＡＡゲル）の中で電気
泳動により分離し、そしてエレクトロトランスファによ
りニトロセルローズフィルタの上に転移させた（プロッ
ト）を上記例１に従うカナマイシン−燐酸トランスフェ
ラーゼに結合させた抗体と共にＴＢＳ〔トリス−（ヒド
ロキシメチル）−アミノメタンで緩衝した０、９％の食
塩溶液〕及び１％ゼラチンの中で室温において４時間イ
ンキュベーションする（希釈度’＝ １ ： ５００）
。次にその酵素と結合して付加させた抗体を含むプロッ
トを１５分間づつ４回ＴＢＳで洗浄し、そして２０ミリ
モルのトリス／ＨＣＩ （ｐＨ＝７．２）、１２５ミリ
モルのＮＨ，、ＣＩ、１ミリモルのジチオニリスロール
、２０ミリモルのＭｇＣｌ２、及び２ミリモルのアデノ
シン３燐酸（八ＴＰ）を含み、ｌ ｍＩ！当り１ μＣ
ｉのγ−３２ｐ−八ＴＰ及びＩ ｍＲ当り２０ｎｇのカ
ナマイシンが含まれている１％アガロースゲル（反応緩
衝液中で作ったもの）を用いて３７℃において３０分間
インキュヘーシ３ンする。このアガロースゲルを茨賢翁
セルローズー平板担体の上に載せてカナマイシンを此の
燐セルローズに転移させる（セルローズ量０．５ｋｇ／
３時間／室温）。３Ｚｐで標識したカナマイシンの検出
は燐セルローズ平板担体のオートラジオグラフィーによ
って行う（２時間、室温）。
五」
固体相■の上でのカナマイシン−燐酸トランスフェラー
ゼで標識された抗体によるＨ３＾の免疫学的検出 大血清を１．５％アガロスゲルの中で電気泳動により分
離する。このゲルをカナマイシン−燐酸トランスフェラ
ーゼに結合させた抗体と共に室温において１時間牛血清
アルブミン（ＩＳＡ） ２％を含むＴＢＳを用いてイン
キュベーションし、次いで１時間ＴＢＥで洗浄する。そ
のゲルを先ず最初上記例２におけると同様に２０ミリモ
ルのトリス／ｌｌＣｌ （ｐＨ＝７．２）１２５ ミリ
モルのＮｌ＋４．ＣＩ 、１ ミリモルのジチオエリス
ロール、２０ミリモルのＭｇＣｈ 及び２ ミリモルの
ＡＴＰよりなり、１μＣｉの”Ｐ−Ｔ −ＡＴＰを含む
反応緩衝液中で３０分間インキュベーションし、次にシ
アヌルクロライド及び次いでスルファニル酸と反応させ
たセルローズからなり、そしてこの生成物にカナマイシ
ンをイオン的に結合させた東ドイツ経済特許出願第Ｃ０
７Ｇ／２９６．７５４−２号に従う担体と接触させ、そ
して３７°Ｃにおいて３０分間反応させる。この基質及
びホスホリル化した基質を含む担体を洗浄（水中で３０
分間）した後にこのものを室温で１時間オートラジオグ
ラフィーにかけ、そしてその担体■の上の′Ｐで標識し
たカナマイシンを検出し、それによりその分離ゲル中の
ＩＳＡの存在を証明する。
ゼで標識された抗体によるＨ３＾の免疫学的検出 大血清を１．５％アガロスゲルの中で電気泳動により分
離する。このゲルをカナマイシン−燐酸トランスフェラ
ーゼに結合させた抗体と共に室温において１時間牛血清
アルブミン（ＩＳＡ） ２％を含むＴＢＳを用いてイン
キュベーションし、次いで１時間ＴＢＥで洗浄する。そ
のゲルを先ず最初上記例２におけると同様に２０ミリモ
ルのトリス／ｌｌＣｌ （ｐＨ＝７．２）１２５ ミリ
モルのＮｌ＋４．ＣＩ 、１ ミリモルのジチオエリス
ロール、２０ミリモルのＭｇＣｈ 及び２ ミリモルの
ＡＴＰよりなり、１μＣｉの”Ｐ−Ｔ −ＡＴＰを含む
反応緩衝液中で３０分間インキュベーションし、次にシ
アヌルクロライド及び次いでスルファニル酸と反応させ
たセルローズからなり、そしてこの生成物にカナマイシ
ンをイオン的に結合させた東ドイツ経済特許出願第Ｃ０
７Ｇ／２９６．７５４−２号に従う担体と接触させ、そ
して３７°Ｃにおいて３０分間反応させる。この基質及
びホスホリル化した基質を含む担体を洗浄（水中で３０
分間）した後にこのものを室温で１時間オートラジオグ
ラフィーにかけ、そしてその担体■の上の′Ｐで標識し
たカナマイシンを検出し、それによりその分離ゲル中の
ＩＳＡの存在を証明する。
炎」
グルタルアルデヒドを用いてのプロティンへのネオマイ
シン−ｐｖ＋−ランスフェラーゼ■への結合 Ｈ，ｃｏｌｉ （ＮＰＴ Ｕで過エキスプライマ（ｕ
ｂｅｒｅｘｐｒｉｍｉｅｒｔ） Ｌ／た〕の細胞培養物
（ｐＲＫ８９）の１０ ｍｌの細胞ペレット（Ｚｅｌｌ
ｐｅｌｌｅｔ）をｌ ｍＲの溶菌緩衝液中に取り込み、
１分間超音波照射し、３分間煮沸し、そして改めて超音
波照射する。細胞の残りは４℃において５分間遠心分離
除去する。この溶菌生成物をポリアクリルアミド／ＳＯ
３のプレパラートゲルの上に載せて電気泳動により分離
する。
シン−ｐｖ＋−ランスフェラーゼ■への結合 Ｈ，ｃｏｌｉ （ＮＰＴ Ｕで過エキスプライマ（ｕ
ｂｅｒｅｘｐｒｉｍｉｅｒｔ） Ｌ／た〕の細胞培養物
（ｐＲＫ８９）の１０ ｍｌの細胞ペレット（Ｚｅｌｌ
ｐｅｌｌｅｔ）をｌ ｍＲの溶菌緩衝液中に取り込み、
１分間超音波照射し、３分間煮沸し、そして改めて超音
波照射する。細胞の残りは４℃において５分間遠心分離
除去する。この溶菌生成物をポリアクリルアミド／ＳＯ
３のプレパラートゲルの上に載せて電気泳動により分離
する。
このゲルを氷冷水ですすいで０．２５ＭのＫｃ＋溶液の
中に、暗い下地に対して良好に識別されるまで入れる。
中に、暗い下地に対して良好に識別されるまで入れる。
そのＮＰＴ ＩＩバンドをスカルベルで切り取ってその
ゲルを小さなさいの目に切断する。このゲルからの蛋白
質の溶離のためにこのものを溶離緩衝液で覆って先ず最
初３時間室温において振とうする。緩衝液を取り換えた
後に一夜もう一度溶離する。
ゲルを小さなさいの目に切断する。このゲルからの蛋白
質の溶離のためにこのものを溶離緩衝液で覆って先ず最
初３時間室温において振とうする。緩衝液を取り換えた
後に一夜もう一度溶離する。
そのようにして得られた溶Ｗを−ｒｏｏＯｒｐｍで遠心
分離し、そして上澄液に４倍体積の冷たいアセ１−ンを
加えて〜２０°Ｃにおいて２ないし３時間静置する。次
にｏ’ｃｐこおいて４０００ｒｐｍで遠心分離する。
分離し、そして上澄液に４倍体積の冷たいアセ１−ンを
加えて〜２０°Ｃにおいて２ないし３時間静置する。次
にｏ’ｃｐこおいて４０００ｒｐｍで遠心分離する。
沈殿を２０ミリモルのトリス／ＨＣＩ （ｐｌ＋＝７．
４）の−部とアセトン４部とからなる溶液で冷時におい
て洗浄し、そしてもう−度遠心分離する。細胞ペレット
を２００μｐの溶解緩衝液に溶解して次にｐＨ７の燐酸
ナトリウム緩衝液２０ミリモルで一夜透析する（５００
ｍｆｆ、２回交換、４℃）。最終容積は約２００μ！で
あり、そしてＥ、 ｃｏｌｉの蛋白質の残存不純物の少
ない約２００μｇのＮＰＴ ｆｆを含んでいる。
４）の−部とアセトン４部とからなる溶液で冷時におい
て洗浄し、そしてもう−度遠心分離する。細胞ペレット
を２００μｐの溶解緩衝液に溶解して次にｐＨ７の燐酸
ナトリウム緩衝液２０ミリモルで一夜透析する（５００
ｍｆｆ、２回交換、４℃）。最終容積は約２００μ！で
あり、そしてＥ、 ｃｏｌｉの蛋白質の残存不純物の少
ない約２００μｇのＮＰＴ ｆｆを含んでいる。
ｂ）グルタルアルデヒドによる結合
４００ μｇのプロティンＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ａ
Ｂ）及び上記ａ）において精製したＮＰＴ ［４００，
１７ｇを１．５ｍ１ｌの容積の透析チューブの中でＰＢ
Ｓに対して透析する（４℃、８００成、２回交換、１６
時間）。その透析液を小さなガラス管の中に入れ換えた
後に６μρのグルタルアルデヒド（２５％濃度溶液：
５ｅｒｖａ）を加えて室温において２時間軽く振とうし
ながら反応させる。次にこの生成物を再び透析チューブ
の中に満たし、そして先ず最初ＰＢＳに対して（４℃に
おいて４時間）そして次にＴＢＳ （４°Ｃ１８００ｍ
ｌ、２回交換）に対して１６時間透析する。この透析の
後でその反応生成物をガラス管の中に移して４℃におい
て貯蔵する。コントロール−電気泳動（１０％ＳＤＳ／
ポリアクリルアミドゲル）により結合の前と後とに採取
した２０μｐの各試料を分離して分析する （東ドイツ
経済特許第２５４ 、０２９号に従う固体相−ＮＰＴ−
ＩＩテストにより）。ＮＰＴ Ｕとプロティン八との高
分子量の生成物に架橋していることが示される。その酵
素活性は上記の結合の後にほぼ完全に維持されている。
Ｂ）及び上記ａ）において精製したＮＰＴ ［４００，
１７ｇを１．５ｍ１ｌの容積の透析チューブの中でＰＢ
Ｓに対して透析する（４℃、８００成、２回交換、１６
時間）。その透析液を小さなガラス管の中に入れ換えた
後に６μρのグルタルアルデヒド（２５％濃度溶液：
５ｅｒｖａ）を加えて室温において２時間軽く振とうし
ながら反応させる。次にこの生成物を再び透析チューブ
の中に満たし、そして先ず最初ＰＢＳに対して（４℃に
おいて４時間）そして次にＴＢＳ （４°Ｃ１８００ｍ
ｌ、２回交換）に対して１６時間透析する。この透析の
後でその反応生成物をガラス管の中に移して４℃におい
て貯蔵する。コントロール−電気泳動（１０％ＳＤＳ／
ポリアクリルアミドゲル）により結合の前と後とに採取
した２０μｐの各試料を分離して分析する （東ドイツ
経済特許第２５４ 、０２９号に従う固体相−ＮＰＴ−
ＩＩテストにより）。ＮＰＴ Ｕとプロティン八との高
分子量の生成物に架橋していることが示される。その酵
素活性は上記の結合の後にほぼ完全に維持されている。
結合が不完全な場合にはもう一度グルタルアルデヒドで
架橋化するか、又は反応しなかったプロデイン八を小さ
なカラムによりセファデックスＧ−５０の上で分離して
もよい。
架橋化するか、又は反応しなかったプロデイン八を小さ
なカラムによりセファデックスＧ−５０の上で分離して
もよい。
そのようにして作られた生成物は抗体で標識した生体分
子の検出のために使用される。
子の検出のために使用される。
■」
グルタルアルデヒドを用いるネオルイシンー燐酸トラン
スフェラーゼ■の抗−馬鈴薯ウィルスー免疫グロブリン
への結果上記ａ）に従い調製され且つ精製されたＮＰＴ
ＩＩの４００８ｇをｌ ｍｇの抗馬鈴薯ウィルスー免
疫グロブリンと一緒に透析チューブ中でＰＢＳに対しチ
ューブ体積１蔵において透析する （１６時間、４°Ｃ
１Ｃ１３Ｏ０，２回交換）。その透析された試料を小さ
なガラス管の中に移した後に５μβのグルタルアルデヒ
ド（２５％濃度溶液：５ｅｒｖａ）を加えて室温におい
てゆるく振とうしながら２時間反応させる。
スフェラーゼ■の抗−馬鈴薯ウィルスー免疫グロブリン
への結果上記ａ）に従い調製され且つ精製されたＮＰＴ
ＩＩの４００８ｇをｌ ｍｇの抗馬鈴薯ウィルスー免
疫グロブリンと一緒に透析チューブ中でＰＢＳに対しチ
ューブ体積１蔵において透析する （１６時間、４°Ｃ
１Ｃ１３Ｏ０，２回交換）。その透析された試料を小さ
なガラス管の中に移した後に５μβのグルタルアルデヒ
ド（２５％濃度溶液：５ｅｒｖａ）を加えて室温におい
てゆるく振とうしながら２時間反応させる。
次にこの結合反応混合物を透析チューブの中に戻し、そ
して先ず最初ＰＢＳに対しく４時間、−夜）、次いでＴ
ＢＳに対しく４℃、８００−１２回交換、１６時間）透
析する。次にその反応生成物を小さなガラス管に移して
４℃において貯蔵する。熟成（１日間）させた後、その
結合生成物、すなわちＮＰＴ １１で標識したグルクル
アルデヒドを介して結合されている抗体はピコグラムの
範囲の植物体液から馬鈴薯ウィルスを免疫学的に検出す
るために使用することができる。
して先ず最初ＰＢＳに対しく４時間、−夜）、次いでＴ
ＢＳに対しく４℃、８００−１２回交換、１６時間）透
析する。次にその反応生成物を小さなガラス管に移して
４℃において貯蔵する。熟成（１日間）させた後、その
結合生成物、すなわちＮＰＴ １１で標識したグルクル
アルデヒドを介して結合されている抗体はピコグラムの
範囲の植物体液から馬鈴薯ウィルスを免疫学的に検出す
るために使用することができる。
炎」
プロティン／ｌ／ＮＰＴ Ｉ＋癒癒合蛋白質ツククー構
成、表現及びその癒合プロティンの回収 癒合蛋白質ヘクターｐＲＩＴ ２ （Ｂ、 Ｎｉ１ｓｏ
ｎ、 Ｌ。
成、表現及びその癒合プロティンの回収 癒合蛋白質ヘクターｐＲＩＴ ２ （Ｂ、 Ｎｉ１ｓｏ
ｎ、 Ｌ。
Ａｂｒａｈｍｓｅｎ、 Ｎ、 Ｕｈｌｅｎ ： ＥＭＢ
ＯＪｏｕｒｎａｌ ４． （４）＋（１９８５） １
０７５ないし１０８０頁参照〕の複数のクローニング位
置にＥ、 Ｃｏ１１からのＮＰＴ Ｈ−遺伝子（Ｔｎ
５）（Ｓ、 Ｂｒｅｎｎｅｒ ： Ｎａｔｕｒｅ ３２
９ （１９８７）、 ２１頁参照〕を古典的なりローユ
ング法（ＢａｍＨＩ、 ＥｃｏＲｒ−分解、Ｔ４−リガ
ーゼ反応）により開放読み取りスクリーンの中で挿入す
る。Ｅ、 Ｃｏ１ｔ （ＮＰＩ）のトランスフォーメー
ション及び対応するアンピシリン抵抗性による選別は通
常の方法（Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｅ、Ｆ。
ＯＪｏｕｒｎａｌ ４． （４）＋（１９８５） １
０７５ないし１０８０頁参照〕の複数のクローニング位
置にＥ、 Ｃｏ１１からのＮＰＴ Ｈ−遺伝子（Ｔｎ
５）（Ｓ、 Ｂｒｅｎｎｅｒ ： Ｎａｔｕｒｅ ３２
９ （１９８７）、 ２１頁参照〕を古典的なりローユ
ング法（ＢａｍＨＩ、 ＥｃｏＲｒ−分解、Ｔ４−リガ
ーゼ反応）により開放読み取りスクリーンの中で挿入す
る。Ｅ、 Ｃｏ１ｔ （ＮＰＩ）のトランスフォーメー
ション及び対応するアンピシリン抵抗性による選別は通
常の方法（Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｅ、Ｆ。
Ｆｒ１ｔｓｃｈ、 Ｊ、 Ｓａｍｂｒｏｃｋ ； Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｅｒ−研究所（１９８２） ）に従い行
なった。
１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｅｒ−研究所（１９８２） ）に従い行
なった。
７”ｏティンＡ／ＮＰＴ ＩＩ癒合蛋白−クローンの培
養は一夜実施した予備培養のあとで液体培地ＮＢＩ （
東ドイツベルリンの免疫製剤）の中で６時間３０”Ｃに
おいて行う。４２℃に温度を上昇させた後にその癒合蛋
白質をエキスプライマー（ｅｘｐｒｉｍｉｅｒｅｎ）す
る（λ−ファージのＰＲプロモータ）。２時間の後に細
胞を遠心分離し、ＧＥＴ緩衝液で１回洗浄し、ＧＥＴの
中にもう１度懸濁させ、そしてエソベンドルフ管の中で
１０１０個の細胞の部分に分けて遠心分離する。それら
の細胞を一２０℃において貯蔵し、そしてその癒合蛋白
質を得るために用いる。癒合蛋白質を得るためには１０
個の細胞をエソペンドルフ管の中で２０ミリモルの
トリス／）ＩＣＩ緩衝液（ｐＨ６，８）の１ ｍｌに０
℃において再び懸濁させ、そして短時間外部からの超音
波処理を５回行う。氷で冷却した後もう一度超音波照射
を３回行う。細胞の残りは４℃において５分間遠心分離
除去する。上澄液を注意深くピペットで吸出して第２の
エソペンドルフ管中に移す。その溶菌生成液（Ｚｅｌｌ
ｙｓａｔ）をそのままの形で検出反応に使用するかまた
は一２０℃において貯蔵する。
養は一夜実施した予備培養のあとで液体培地ＮＢＩ （
東ドイツベルリンの免疫製剤）の中で６時間３０”Ｃに
おいて行う。４２℃に温度を上昇させた後にその癒合蛋
白質をエキスプライマー（ｅｘｐｒｉｍｉｅｒｅｎ）す
る（λ−ファージのＰＲプロモータ）。２時間の後に細
胞を遠心分離し、ＧＥＴ緩衝液で１回洗浄し、ＧＥＴの
中にもう１度懸濁させ、そしてエソベンドルフ管の中で
１０１０個の細胞の部分に分けて遠心分離する。それら
の細胞を一２０℃において貯蔵し、そしてその癒合蛋白
質を得るために用いる。癒合蛋白質を得るためには１０
個の細胞をエソペンドルフ管の中で２０ミリモルの
トリス／）ＩＣＩ緩衝液（ｐＨ６，８）の１ ｍｌに０
℃において再び懸濁させ、そして短時間外部からの超音
波処理を５回行う。氷で冷却した後もう一度超音波照射
を３回行う。細胞の残りは４℃において５分間遠心分離
除去する。上澄液を注意深くピペットで吸出して第２の
エソペンドルフ管中に移す。その溶菌生成液（Ｚｅｌｌ
ｙｓａｔ）をそのままの形で検出反応に使用するかまた
は一２０℃において貯蔵する。
五ユ
遺伝子工学的に作り出したプロティンＡ／ＮＰＴ１１−
癒合蛋白質のグルタルアルデヒドによる架橋 例６に記述したように溶菌生成ン夜を作る。この溶菌液
をコントロール−電気泳動のために５Ｑ＋＋＋ｆｆだけ
工、ペンドルフ管の中にピペットで取り出す。
癒合蛋白質のグルタルアルデヒドによる架橋 例６に記述したように溶菌生成ン夜を作る。この溶菌液
をコントロール−電気泳動のために５Ｑ＋＋＋ｆｆだけ
工、ペンドルフ管の中にピペットで取り出す。
この溶菌液を透析チューブの中に満たしてＰＢＳに対し
て透析する（４°Ｃ１１６時間、８００ ｍｌ、 ２回
交換）この透析された溶菌液を小さなガラス管中に移し
た後、これに３μｐのグルクルアルデヒド（２５％濃度
溶液：５ｅｒｖａ）を加えて室温においてゆるく振とう
しながら２時間インキュベーションする。次にその反応
混合物を透析チューブに戻し、そして先ず最初３時間Ｐ
ＢＳに対しく４℃）、そして次に一夜ＴＢＳに対して透
析する（４℃、８００−１２回交換）その透析された結
合反応混合物を透析チューブから取り出して小さなガラ
ス管の中で４℃において貯蔵する。コントロール−電気
泳動のために５０μｌを取出す。
て透析する（４°Ｃ１１６時間、８００ ｍｌ、 ２回
交換）この透析された溶菌液を小さなガラス管中に移し
た後、これに３μｐのグルクルアルデヒド（２５％濃度
溶液：５ｅｒｖａ）を加えて室温においてゆるく振とう
しながら２時間インキュベーションする。次にその反応
混合物を透析チューブに戻し、そして先ず最初３時間Ｐ
ＢＳに対しく４℃）、そして次に一夜ＴＢＳに対して透
析する（４℃、８００−１２回交換）その透析された結
合反応混合物を透析チューブから取り出して小さなガラ
ス管の中で４℃において貯蔵する。コントロール−電気
泳動のために５０μｌを取出す。
コントロール電気泳動（１０％ＳＤＳ／ポリアクリルア
ミドゲル）により上記の取出された試料を分離し、そし
て３２ｐ−γ−ＡＴＰ及びカナマ詐シンを用いて固体相
−ＮＰＴ Ｉｆテストにより分析する。」二記結合反応
の間にプロティンＡ−ＮＰＴ ＩＩの癒合蛋白質（分子
量約６０ｋＤ）は全て高分子量の結合生成物に架橋され
ていたと言うことが示される。その結合生成物の酵素活
性は完全に維持されている。この得られた生成物は直ち
に抗体で標識された抗原類の検出に使用することができ
る。
ミドゲル）により上記の取出された試料を分離し、そし
て３２ｐ−γ−ＡＴＰ及びカナマ詐シンを用いて固体相
−ＮＰＴ Ｉｆテストにより分析する。」二記結合反応
の間にプロティンＡ−ＮＰＴ ＩＩの癒合蛋白質（分子
量約６０ｋＤ）は全て高分子量の結合生成物に架橋され
ていたと言うことが示される。その結合生成物の酵素活
性は完全に維持されている。この得られた生成物は直ち
に抗体で標識された抗原類の検出に使用することができ
る。
±」
遺伝子工学的に作り出したプロティンＡ／ＮＰＴＩＩ−
［ｉ（合蛋白質の別なＮＰＴ ＩＩ分子とのグルタルア
ルデヒドによる結合 溶菌生成液を例６におけると同様に作ってこれに１００
ｐ ｇの前記例４に従い作られ且つ電気泳動で精製し
たＮＰＴ ＩＩを加える。この混合物をＰＢＳに対して
１６時間透析する （透析チューブ容積１．５−８００
ｍｌ、 ２回交換、４℃）。この透析された混合物に
小さなガラス管中で３μｌのグルタルアルデヒド（２５
％濃度溶液：５ｅｒｖａ）を加えて振とうしながら２時
間室温においてインキュベーションする。
［ｉ（合蛋白質の別なＮＰＴ ＩＩ分子とのグルタルア
ルデヒドによる結合 溶菌生成液を例６におけると同様に作ってこれに１００
ｐ ｇの前記例４に従い作られ且つ電気泳動で精製し
たＮＰＴ ＩＩを加える。この混合物をＰＢＳに対して
１６時間透析する （透析チューブ容積１．５−８００
ｍｌ、 ２回交換、４℃）。この透析された混合物に
小さなガラス管中で３μｌのグルタルアルデヒド（２５
％濃度溶液：５ｅｒｖａ）を加えて振とうしながら２時
間室温においてインキュベーションする。
結合の完全性は電気泳動と固体相／ＮＰＴ ［−テスト
によってコン１〜ロールする。
によってコン１〜ロールする。
結合の後に改めて、先ず最初Ｉ’ＢＳに対して、そして
次にＴＢＳに対して透析する（それぞれ４℃、８００
ｍｌ、２回交換）。透析された結合生成物を４℃におい
て貯蔵するが、このものは抗体で標識された種々の抗原
の検出に用いられる。
次にＴＢＳに対して透析する（それぞれ４℃、８００
ｍｌ、２回交換）。透析された結合生成物を４℃におい
て貯蔵するが、このものは抗体で標識された種々の抗原
の検出に用いられる。
斑」
ストレプトアビジンとＮＰＴ ｎとのグルタルアルデヒ
ドによる結合 ストレプトアビジン１００μｇ及び例４に従い作られた
ＮＰＴ Ｕ ４００ｐｇを上記例８におけると同様にＰ
ＢＳに対して透析（チューブ容積１−）し、次いで５μ
ｌのグルタルアルデヒド（２５％濃度溶液； ５ｅｒｖ
ａ）を加えて室温においてゆるやかな振とうのもとに１
時間反応させる。この反応混合物を改めて、先ず最初Ｐ
ＢＳに対し、次にＴＢＳに対して透析する（それぞれ４
℃、８００−１４時間、２回交換）。この透析された生
成物を４℃において貯蔵する。結合の完全性をコントロ
ール−電気泳動と固体相−ＮＰＴ ＩＩテストによって
調べる。
ドによる結合 ストレプトアビジン１００μｇ及び例４に従い作られた
ＮＰＴ Ｕ ４００ｐｇを上記例８におけると同様にＰ
ＢＳに対して透析（チューブ容積１−）し、次いで５μ
ｌのグルタルアルデヒド（２５％濃度溶液； ５ｅｒｖ
ａ）を加えて室温においてゆるやかな振とうのもとに１
時間反応させる。この反応混合物を改めて、先ず最初Ｐ
ＢＳに対し、次にＴＢＳに対して透析する（それぞれ４
℃、８００−１４時間、２回交換）。この透析された生
成物を４℃において貯蔵する。結合の完全性をコントロ
ール−電気泳動と固体相−ＮＰＴ ＩＩテストによって
調べる。
結合させた生成物はビオチンで標識した生体分子（例え
ばビオチニル化したＤＮＡ）の検出のために用いる。
ばビオチニル化したＤＮＡ）の検出のために用いる。
桝烈
ＮＰＴ ｎとプロティン八とのトルイレンジイソシアネ
ートプレポリマーによる結合ａ）結合試薬の調製 １７．４ｇの新しく蒸留したトルイレンジイソシアネー
ト２，４を窒素雰囲気のもとて５０°Ｃに加温する。
ートプレポリマーによる結合ａ）結合試薬の調製 １７．４ｇの新しく蒸留したトルイレンジイソシアネー
ト２，４を窒素雰囲気のもとて５０°Ｃに加温する。
攪拌しなから５０−５５℃において３０ｇのポリエチレ
ングリコール６００（イオン交換樹脂で精製して３時間
８０°Ｃ１０，１Ｔｏｒｒにおいて脱水したもの）及び
０．０５ｇのシアヌルクロライドをゆっくりと滴加する
（約３０分間）。この滴加が終った後、更に４時間６０
℃において攪拌する。次いで５０℃１０．１Ｔｏｒｒに
おいてガス抜きする （イソシアネート当量−４５３）
。
ングリコール６００（イオン交換樹脂で精製して３時間
８０°Ｃ１０，１Ｔｏｒｒにおいて脱水したもの）及び
０．０５ｇのシアヌルクロライドをゆっくりと滴加する
（約３０分間）。この滴加が終った後、更に４時間６０
℃において攪拌する。次いで５０℃１０．１Ｔｏｒｒに
おいてガス抜きする （イソシアネート当量−４５３）
。
このプレポリマー１００Ｂを５００ｍｇのアセトン中に
溶解する。完全に溶解させた後にこの溶液の０ 、３
ｄを急速に攪拌しなから７ｏｏｍｒｐの水中にスプレー
する。そのようにして得られ太エマルジョンを直ちに使
用する。
溶解する。完全に溶解させた後にこの溶液の０ 、３
ｄを急速に攪拌しなから７ｏｏｍｒｐの水中にスプレー
する。そのようにして得られ太エマルジョンを直ちに使
用する。
ｂ）結合
前記例４に従い作られたＮＰＴ ｎ １００μｇを含
む溶菌生成液８００μβをエソペンドルフ管の中で１５
０μβの水中の１５０μｇのプロティンΔと混合する。
む溶菌生成液８００μβをエソペンドルフ管の中で１５
０μβの水中の１５０μｇのプロティンΔと混合する。
この溶液に上で作った結合試薬の２００μｌを加えて１
時間軽く振とうする。１５分毎にＶｉｒｔｅｘを用いて
よく混合する。１時間の反応時間の後にあらためて１０
０μりの新しく作った結合試薬を加えて更に１時間反応
させる。次に反応を停止させるために１５０μβのリジ
ン溶液（２００μｇ）を加えて室温において３０分間振
とうする。その結合の完全性はコントロール−電気泳動
及び固体相／ＮＰＴ ＩＩテストによって確認した。そ
の高分子量の結合生成物は完全な酵素活性を有している
。
時間軽く振とうする。１５分毎にＶｉｒｔｅｘを用いて
よく混合する。１時間の反応時間の後にあらためて１０
０μりの新しく作った結合試薬を加えて更に１時間反応
させる。次に反応を停止させるために１５０μβのリジ
ン溶液（２００μｇ）を加えて室温において３０分間振
とうする。その結合の完全性はコントロール−電気泳動
及び固体相／ＮＰＴ ＩＩテストによって確認した。そ
の高分子量の結合生成物は完全な酵素活性を有している
。
このものは、抗体で標識された種々の生体分子の検出に
用いられる。
用いられる。
飢
プロティンＡ／ＮＰＴ ＩＴの癒合蛋白質の生物学的架
橋 前記例６に従い作られた、プロティンＡ／Ｎ［’Ｔ ｔ
Ｉ−癒合蛋白質を含む溶菌生成液の５ｏμｐに５μｅの
家兎−抗−マウスー抗血清を加え、そして４°Ｃにおい
て一夜インキユヘーションする。生ずるプロティンＡ／
ＮＰＴ ＩＩ−癒合蛋白質と家兎−抗−マウスー抗体と
からなる形成された錯化合物を抗体２として抗体１（マ
ウス）による抗原の検出の後に使用する。これによって
酵素的検出（ＮＰＴ ■）が行なわれる。
橋 前記例６に従い作られた、プロティンＡ／Ｎ［’Ｔ ｔ
Ｉ−癒合蛋白質を含む溶菌生成液の５ｏμｐに５μｅの
家兎−抗−マウスー抗血清を加え、そして４°Ｃにおい
て一夜インキユヘーションする。生ずるプロティンＡ／
ＮＰＴ ＩＩ−癒合蛋白質と家兎−抗−マウスー抗体と
からなる形成された錯化合物を抗体２として抗体１（マ
ウス）による抗原の検出の後に使用する。これによって
酵素的検出（ＮＰＴ ■）が行なわれる。
拠肥
レクチンのネオマイシン−燐酸トランスフェラーゼ■へ
のグルタルアルデヒドによる結合 Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ−ｖｕｌｇａｉｓ−レクチン２００
ｐ ｇＯ例４に従い得られる精製されたＮＰＴ ｎと
一緒にＰＢＳに対して透析する （透析チューブ容積Ｌ
ｍＲ５４℃、８００ ｍＲ３２回交換、−夜）。この透
析チューブの内容物を小さなガラス管の中に満たし、そ
してこれに５μｌのグルクルアルデヒド（２５％濃度溶
液： ５ｅｒｖａ）を加えて室温において軽い振とうの
もとに１時間反応させる。この反応混合物を次にあらた
めてＰＢＳに対し、そして引続いてＴＢＳに対して透析
する（それぞれ４℃、４時間、８００ｍβ、２回交換）
。その透析された反応生成物を４°Ｃにおいて貯蔵する
。結合の完全性及び酵素活性をコントロー刀へ電気泳動
及び固体相／ＮＰＴＩＩテストにより調べる。結合生成
物はグリコプロティンの上の対応する炭水化物の検出に
用いる。
のグルタルアルデヒドによる結合 Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ−ｖｕｌｇａｉｓ−レクチン２００
ｐ ｇＯ例４に従い得られる精製されたＮＰＴ ｎと
一緒にＰＢＳに対して透析する （透析チューブ容積Ｌ
ｍＲ５４℃、８００ ｍＲ３２回交換、−夜）。この透
析チューブの内容物を小さなガラス管の中に満たし、そ
してこれに５μｌのグルクルアルデヒド（２５％濃度溶
液： ５ｅｒｖａ）を加えて室温において軽い振とうの
もとに１時間反応させる。この反応混合物を次にあらた
めてＰＢＳに対し、そして引続いてＴＢＳに対して透析
する（それぞれ４℃、４時間、８００ｍβ、２回交換）
。その透析された反応生成物を４°Ｃにおいて貯蔵する
。結合の完全性及び酵素活性をコントロー刀へ電気泳動
及び固体相／ＮＰＴＩＩテストにより調べる。結合生成
物はグリコプロティンの上の対応する炭水化物の検出に
用いる。
±貝
無蛋白質ブロッキング条件のもとでのニロティンＡ／Ｎ
ＰＴ ＩＴ癒合蛋白質の使用）ナノグラム−ピコグラム
の範囲における人血清アルブミン（）ＩｓＡ）を含む蛋
白質の一連の希釈列のものをＳＯ５／ＦＡＡゲルの中で
電気泳動的に分離し、そしてエレクトロトランスファー
によって二Ｉ・ロセルローズ膜の上に転移させた。次に
このニトロセルローズ膜（プロット）を３０分間空気に
さらし−１，ＯＯ− て乾燥させ、次いで１容積％のＴｗｅｅｎ ２０を含む
ＴＢＳの中で３７°Ｃにおいて１時間ブロッキングした
。
ＰＴ ＩＴ癒合蛋白質の使用）ナノグラム−ピコグラム
の範囲における人血清アルブミン（）ＩｓＡ）を含む蛋
白質の一連の希釈列のものをＳＯ５／ＦＡＡゲルの中で
電気泳動的に分離し、そしてエレクトロトランスファー
によって二Ｉ・ロセルローズ膜の上に転移させた。次に
このニトロセルローズ膜（プロット）を３０分間空気に
さらし−１，ＯＯ− て乾燥させ、次いで１容積％のＴｗｅｅｎ ２０を含む
ＴＢＳの中で３７°Ｃにおいて１時間ブロッキングした
。
次に０．２容積％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳの中
で３０分間以内にもう一度ブロッキングを行なった（ブ
ロック）。
で３０分間以内にもう一度ブロッキングを行なった（ブ
ロック）。
抗−ＨＳ Ａ−免疫グロブリン（家兎）のアルブミンを
用いるインキューベーションを室温において１時間、１
：２００の希釈度で行なった。その後で０，１容積％の
Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳによって室温において１
時間洗浄した（６回交換）。ＴＢＳ及び０．２容積％の
Ｔｗｅｅｎ ２０を用いてもう一度プロッキング（室温
において３０分間）した後（ブロック■）、前記例６と
同様にして作ったプロティンＡとＮＰＴ ＴＩとからな
る癒合蛋白質を含む溶菌生成液の５０μＣを加えてｌＱ
ｍｌ！にし、そして室温において軽く振とうしながら１
時間インキユヘーションした。次にそのニトロセルロー
ズ膜（Ｈｙｂｏｎｄ Ｃ； ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａＸ社）をＴＢＳで１時間洗浄する（６
回交換）。
用いるインキューベーションを室温において１時間、１
：２００の希釈度で行なった。その後で０，１容積％の
Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳによって室温において１
時間洗浄した（６回交換）。ＴＢＳ及び０．２容積％の
Ｔｗｅｅｎ ２０を用いてもう一度プロッキング（室温
において３０分間）した後（ブロック■）、前記例６と
同様にして作ったプロティンＡとＮＰＴ ＴＩとからな
る癒合蛋白質を含む溶菌生成液の５０μＣを加えてｌＱ
ｍｌ！にし、そして室温において軽く振とうしながら１
時間インキユヘーションした。次にそのニトロセルロー
ズ膜（Ｈｙｂｏｎｄ Ｃ； ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａＸ社）をＴＢＳで１時間洗浄する（６
回交換）。
東ドイツ経済特許第２５４ 、０１２号に従いシアヌル
クロライドで活性したセルローズとスルファニル酸とか
ら作ってカナマイシンを含浸さゼた担体をガラス板の上
に載し、そして２Ｍ１ｏ・ｃｐｍ／ｍｌの濃度（比放射
能１５０ ＴＢｑ／ ミリモル）で３２Ｐ−ｒ −ＡＴ
Ｐを含む酵素緩衝液で含浸させる。上で作ったニトロセ
ルローズ上のプロットをその電気泳動に際してゲル側で
あった側でその湿潤した、カナマイシンを含む担体の上
に載せる。次にそのニトロセルローズ膜をもう一度その
３２ｐ−γ−ＡＴＢの含まれている酵素緩衝液で上方か
ら含浸させ、次いで同じ大きさのガラス板で覆う。この
系の全ての側をＰＥ膜で閉じ、そして先ず最初３７℃に
おいて１時間インキュベーションし、その際この時間の
間中そのガラス板を成る錘によって軽く圧しつける。こ
のインキュベーションの後でその系からカナマイシンの
含まれている担体を取出し、そして２回蒸留で１時間洗
浄する。そのニトロセルローズ膜を直ちにもう一度カナ
マイシンの含まれている担体の上に載せて３２Ｐ−ｒ−
ＡＴＰの含まれている酵素緩衝液で湿し、そして３７°
Ｃにおいて一夜インキュベーションする。次に２回蒸留
水で洗浄する。評価はカナマイシンを含ませて密着して
用いた担体おオートラジオグラフィーにより行う。その
ニトロセルローズ膜を２回蒸留水（３２Ｐ−ｒ−ＡＴＰ
を含まない）で洗浄した後、コントロールと共にオート
ラジオグラフィーにかける。
クロライドで活性したセルローズとスルファニル酸とか
ら作ってカナマイシンを含浸さゼた担体をガラス板の上
に載し、そして２Ｍ１ｏ・ｃｐｍ／ｍｌの濃度（比放射
能１５０ ＴＢｑ／ ミリモル）で３２Ｐ−ｒ −ＡＴ
Ｐを含む酵素緩衝液で含浸させる。上で作ったニトロセ
ルローズ上のプロットをその電気泳動に際してゲル側で
あった側でその湿潤した、カナマイシンを含む担体の上
に載せる。次にそのニトロセルローズ膜をもう一度その
３２ｐ−γ−ＡＴＢの含まれている酵素緩衝液で上方か
ら含浸させ、次いで同じ大きさのガラス板で覆う。この
系の全ての側をＰＥ膜で閉じ、そして先ず最初３７℃に
おいて１時間インキュベーションし、その際この時間の
間中そのガラス板を成る錘によって軽く圧しつける。こ
のインキュベーションの後でその系からカナマイシンの
含まれている担体を取出し、そして２回蒸留で１時間洗
浄する。そのニトロセルローズ膜を直ちにもう一度カナ
マイシンの含まれている担体の上に載せて３２Ｐ−ｒ−
ＡＴＰの含まれている酵素緩衝液で湿し、そして３７°
Ｃにおいて一夜インキュベーションする。次に２回蒸留
水で洗浄する。評価はカナマイシンを含ませて密着して
用いた担体おオートラジオグラフィーにより行う。その
ニトロセルローズ膜を２回蒸留水（３２Ｐ−ｒ−ＡＴＰ
を含まない）で洗浄した後、コントロールと共にオート
ラジオグラフィーにかける。
この密着して用いた担体のオートラジオグラムによって
ｌｌ５Ａ−バンドの位置がピコグラムの範囲にまでＸ線
フィルムの上に黒色化したハンドとして画かれる（露出
時間：室温で３０分間、ＸｖＡフィルムＨ３１１、ＶＥ
Ｂ ０ＲＷＯＷｏｌｆｅｎ）。
ｌｌ５Ａ−バンドの位置がピコグラムの範囲にまでＸ線
フィルムの上に黒色化したハンドとして画かれる（露出
時間：室温で３０分間、ＸｖＡフィルムＨ３１１、ＶＥ
Ｂ ０ＲＷＯＷｏｌｆｅｎ）。
蛋白質を含まないブロッキング条件を用いたので、その
ニトロセルローズ膜の上の蛋白質はＰｏｎｃｅａｎ Ｓ
によって着色できる（着色＝２分間、水で脱色、５分間
）。評価のために、その密着して用いた担体のオートラ
ジオグラフィーをその着色されたニトロセルローズプロ
ットの上に各バンドが正確な位置に来るように載せる。
ニトロセルローズ膜の上の蛋白質はＰｏｎｃｅａｎ Ｓ
によって着色できる（着色＝２分間、水で脱色、５分間
）。評価のために、その密着して用いた担体のオートラ
ジオグラフィーをその着色されたニトロセルローズプロ
ットの上に各バンドが正確な位置に来るように載せる。
孤旦
蛋白質−ブロッキング条件のもとてのニトロセルローズ
の上での蛋白質プロッティングによる１（ＳＡの免疫学
的検出 上記例１３と同様に行うが、但しブロックＩとして０．
５重量％のゼラチンを含むＴＢＳ （１時間）及び０．
２５重量％のゼラチンを含むＴＢＳ （３０分間）、そ
してブロック■として０．２５重量％のゼラチンを含む
ＴＢＳ （３０分間）を用いる。
の上での蛋白質プロッティングによる１（ＳＡの免疫学
的検出 上記例１３と同様に行うが、但しブロックＩとして０．
５重量％のゼラチンを含むＴＢＳ （１時間）及び０．
２５重量％のゼラチンを含むＴＢＳ （３０分間）、そ
してブロック■として０．２５重量％のゼラチンを含む
ＴＢＳ （３０分間）を用いる。
評価は例１３におけると同様にその密着した担体のオー
トラジオグラフィーによって行う。
トラジオグラフィーによって行う。
炎長
ニトロセルローズの上でのスポットテストでのα−フェ
トプロティンの免疫学的検出 α−フェトプロティン（ＡＦＰ）の一連の希釈列のもの
を帯状のニトロセルローズ膜（Ｈｙｂｏｎｄ Ｃ；Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔ、社）の上にスポットし、そして
室温において３０分間乾燥させる。ブロッキングはブロ
ックＩにおいてはＴＢＳ及び１％Ｔｗｅｅｎ ２０を用
いて３７℃において１時間、そしてその後で０．２％の
Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ中で室温において３０分
間行う。先ず最初１１５Ａ（希釈度−１： １０００）
に対するモノクローナルな抗体（マウス）を用いてイン
キュベーションし、あらためて０．２％のＴｗｅｅｎ
２０を含むＴＢＳでブロッキングし、そして第２の抗体
（カナマイシン−抗−マウス）と共に１時間インキュベ
ーションする （希釈率−１： ５００）。０．１％の
Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳで室温において１時間洗
浄した後、あらためて０．２％のＴ圓ｅｅｎ ２０を含
むＴＢＳでブロッキングする。
トプロティンの免疫学的検出 α−フェトプロティン（ＡＦＰ）の一連の希釈列のもの
を帯状のニトロセルローズ膜（Ｈｙｂｏｎｄ Ｃ；Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔ、社）の上にスポットし、そして
室温において３０分間乾燥させる。ブロッキングはブロ
ックＩにおいてはＴＢＳ及び１％Ｔｗｅｅｎ ２０を用
いて３７℃において１時間、そしてその後で０．２％の
Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ中で室温において３０分
間行う。先ず最初１１５Ａ（希釈度−１： １０００）
に対するモノクローナルな抗体（マウス）を用いてイン
キュベーションし、あらためて０．２％のＴｗｅｅｎ
２０を含むＴＢＳでブロッキングし、そして第２の抗体
（カナマイシン−抗−マウス）と共に１時間インキュベ
ーションする （希釈率−１： ５００）。０．１％の
Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳで室温において１時間洗
浄した後、あらためて０．２％のＴ圓ｅｅｎ ２０を含
むＴＢＳでブロッキングする。
次に前記例６に従って作られ、そしてプロティンＡとＮ
ＰＴ ＩＩとの癒合蛋白質を含むＥ、 ｃｏｌｉ−溶菌
生成液３５μｌを加えて室温において１時間インキュベ
ーションする。ＴＢＳで洗浄（室温で１時間）した後、
そのニトロセルローズ膜をカナマイシンの含まれた担体
（東ドイツ経済特許第２５４，０１２号に従い作られた
）と接触させて例１３に記述したと同じ検出を実施する
。検出限度はピコグラムの領域に存在する。
ＰＴ ＩＩとの癒合蛋白質を含むＥ、 ｃｏｌｉ−溶菌
生成液３５μｌを加えて室温において１時間インキュベ
ーションする。ＴＢＳで洗浄（室温で１時間）した後、
そのニトロセルローズ膜をカナマイシンの含まれた担体
（東ドイツ経済特許第２５４，０１２号に従い作られた
）と接触させて例１３に記述したと同じ検出を実施する
。検出限度はピコグラムの領域に存在する。
罰
ＮＰＴ ＩＩを結合した抗体を用いるニトロセルローズ
の上での植物体液のスボソ１〜による馬鈴薯ウィルスの
検出（東ドイツ経済ときょ第２５１１ 、０２９号に従
う担体上での検出） 前記例４ａに従い作られ、精製されたＮＰＴ ＩＩの４
００μｇを１ｍｇの抗馬鈴薯ウィルスー免疫グロブリン
と一緒に透析チューブ中でＰＢＳに対しく１６時間、４
°Ｃ１Ｂｏｏ ｍＲ，２回交換） 、１ ｍＡのチュー
ブ体積において透析する。その透析した試料を小さなガ
ラス管の中に移した後に５μｌのグルクルアルデヒド（
２５％濃度溶液； ５ｅｒｖａ）を加えて軽く振とうし
ながら室温において２時間反応させる。
の上での植物体液のスボソ１〜による馬鈴薯ウィルスの
検出（東ドイツ経済ときょ第２５１１ 、０２９号に従
う担体上での検出） 前記例４ａに従い作られ、精製されたＮＰＴ ＩＩの４
００μｇを１ｍｇの抗馬鈴薯ウィルスー免疫グロブリン
と一緒に透析チューブ中でＰＢＳに対しく１６時間、４
°Ｃ１Ｂｏｏ ｍＲ，２回交換） 、１ ｍＡのチュー
ブ体積において透析する。その透析した試料を小さなガ
ラス管の中に移した後に５μｌのグルクルアルデヒド（
２５％濃度溶液； ５ｅｒｖａ）を加えて軽く振とうし
ながら室温において２時間反応させる。
次にこの結合混合物を透析チューブの中に戻して先ず最
初ＰＢＳに対しく４℃、−夜）、そして次にＴＢＳに対
しく４℃、８００艷、２回交換、１６時間）透析する。
初ＰＢＳに対しく４℃、−夜）、そして次にＴＢＳに対
しく４℃、８００艷、２回交換、１６時間）透析する。
反応生成物は小さなガラス管の中に分けて充填する。
ｂ）検出の実施
、ｂ鈴薯の葉の圧搾体液の一連の希釈列のものを帯状の
ニトロセルローズ膜の上にスポットして２０分間乾燥さ
せる。そのように処理された膜を１％のＴｗｅｅｎ ２
０を含むＴＢＳの中で３７℃において１時間、そして引
続いて０．２％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳの中で
室温において３０分間乾燥させる。次に前記のようにし
て作った結合生成物を１：２００の希釈率において加え
、そして１時間インキュベーションする。ＴＢＳで洗浄
した後に放射能による検出をカナマイシンの含まれた担
体層の上で例１３と同様な密着法により実施する。検出
限度はピコグラムの範囲にある。
ニトロセルローズ膜の上にスポットして２０分間乾燥さ
せる。そのように処理された膜を１％のＴｗｅｅｎ ２
０を含むＴＢＳの中で３７℃において１時間、そして引
続いて０．２％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳの中で
室温において３０分間乾燥させる。次に前記のようにし
て作った結合生成物を１：２００の希釈率において加え
、そして１時間インキュベーションする。ＴＢＳで洗浄
した後に放射能による検出をカナマイシンの含まれた担
体層の上で例１３と同様な密着法により実施する。検出
限度はピコグラムの範囲にある。
肛
プロティンＡ−ＮＰＴ ＩＩの癒合蛋白質を用い、ニト
ロセルローズの上のスポット法による植物体液からの馬
鈴薯ウィルスの検出（密着担体Ｐ８１） 馬鈴薯の葉の圧搾体液によって一連の希釈列を例１６と
同様に作る。但しブロッキングの後で抗−ｌ０Ｔ− 馬鈴薯ウィルス−免疫グロブリン（家兎）（希釈率１
： １０００）を用いて１時間インキュベーションする
。
ロセルローズの上のスポット法による植物体液からの馬
鈴薯ウィルスの検出（密着担体Ｐ８１） 馬鈴薯の葉の圧搾体液によって一連の希釈列を例１６と
同様に作る。但しブロッキングの後で抗−ｌ０Ｔ− 馬鈴薯ウィルス−免疫グロブリン（家兎）（希釈率１
： １０００）を用いて１時間インキュベーションする
。
０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳで洗浄した後
、改めて０．２％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳでブ
ロッキングし、次に例６に従う溶菌生成液の５０μβを
加えて１時間インキュベーションする。ＴＢＳによる洗
浄の後で例１３ｂ）と同様な密着法を検出のために行う
。しかしながらカナマイシンの含まれた担体として燐セ
ルローズ（Ｐ８１：Ｗｈａｔｍａｎ、英国）を用いる。
、改めて０．２％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳでブ
ロッキングし、次に例６に従う溶菌生成液の５０μβを
加えて１時間インキュベーションする。ＴＢＳによる洗
浄の後で例１３ｂ）と同様な密着法を検出のために行う
。しかしながらカナマイシンの含まれた担体として燐セ
ルローズ（Ｐ８１：Ｗｈａｔｍａｎ、英国）を用いる。
その酵素緩衝液中に１０ Ｍｉｏ ｃｐｍ／ ｍｅ、の
”Ｐ−ｒ −ＡＴＰの比放射能を用いる。
”Ｐ−ｒ −ＡＴＰの比放射能を用いる。
評価は燐セルローズ担体を水で１時間洗浄した後にオー
トラジオグラフィーにより行う。感度は再びピコグラム
の範囲にある。
トラジオグラフィーにより行う。感度は再びピコグラム
の範囲にある。
炎■
プロティンＡ／ＮＰＴ ＩＩ癒合蛋白質を用いてのナイ
ロン膜上のスポット法によるＨＳＡの免疫学的検出（密
着担体：カナマイシンの含まれた燐セルローズ） 一連の希釈列のＨＳＡを帯状のナイロン膜（ｔｌｙｂｏ
ｎｄ Ｎ ；八ｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔ、）の上にスボ
ソ１〜し、そして２０分間乾燥させる。ブロッキングｒ
ば３％の生血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むＴＢＳの中
で２時間、そしてその後で１％の中で３０分間行う。ブ
ロッキングＴＩＮ；ｌ：１％Ｒ３Ａを含むＴＢＳの中で
３０分間行う。全操作は例１３に記述したと同様に行う
。評価は燐セルローズ（Ｐ ８１）−担体のオートラジ
オグラフィーによって行う。
ロン膜上のスポット法によるＨＳＡの免疫学的検出（密
着担体：カナマイシンの含まれた燐セルローズ） 一連の希釈列のＨＳＡを帯状のナイロン膜（ｔｌｙｂｏ
ｎｄ Ｎ ；八ｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔ、）の上にスボ
ソ１〜し、そして２０分間乾燥させる。ブロッキングｒ
ば３％の生血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むＴＢＳの中
で２時間、そしてその後で１％の中で３０分間行う。ブ
ロッキングＴＩＮ；ｌ：１％Ｒ３Ａを含むＴＢＳの中で
３０分間行う。全操作は例１３に記述したと同様に行う
。評価は燐セルローズ（Ｐ ８１）−担体のオートラジ
オグラフィーによって行う。
則
無蛋白ブロッキング条件のもとてのニトロセルローズ膜
上における蛋白質プロッティングによるＨＳＡの免疫学
的検出 例１３に記述したと同じ方法を実施する。但しカナマイ
シンを含有させた担体として燐セルローズ（Ｐ ８１
： Ｗｈａｔｍａｎ）を用いる。評価はその燐セルロー
ズをＸ線フィルムでオートラジオグラフィーにかけるこ
とより行う （露出時間１５分、室温）６五刈 無蛋白ブロッキング条件のもとでニトロセルローズ膜上
の蛋白質プロッティングによるｌｌ５Ａの免疫学的検出
（ネオマイシンを含有させた燐セルローズによる密着法
） 例１３に記述したと同じ方法を繰返す。しかしながら抗
生物質を含有させた担体としてネオマイシンの含まれた
燐セルローズを用いる （６０ｍｆの水中に４００ｍｇ
おネオマイシンを含も☆客演で燐セルローズを３０分間
インキュベーションし、そして水で３０分間洗浄する）
。評価はＸ線フィルムを用いてのその燐セルローズのオ
ートラジオグラフィーによって行う （露出時間１５分
間、室温）。
上における蛋白質プロッティングによるＨＳＡの免疫学
的検出 例１３に記述したと同じ方法を実施する。但しカナマイ
シンを含有させた担体として燐セルローズ（Ｐ ８１
： Ｗｈａｔｍａｎ）を用いる。評価はその燐セルロー
ズをＸ線フィルムでオートラジオグラフィーにかけるこ
とより行う （露出時間１５分、室温）６五刈 無蛋白ブロッキング条件のもとでニトロセルローズ膜上
の蛋白質プロッティングによるｌｌ５Ａの免疫学的検出
（ネオマイシンを含有させた燐セルローズによる密着法
） 例１３に記述したと同じ方法を繰返す。しかしながら抗
生物質を含有させた担体としてネオマイシンの含まれた
燐セルローズを用いる （６０ｍｆの水中に４００ｍｇ
おネオマイシンを含も☆客演で燐セルローズを３０分間
インキュベーションし、そして水で３０分間洗浄する）
。評価はＸ線フィルムを用いてのその燐セルローズのオ
ートラジオグラフィーによって行う （露出時間１５分
間、室温）。
五麩
無蛋白ブロッキング条件のもとてニトロセルローズ上の
蛋白質のプロッティングによるＨＳＡの免疫学的検出（
燐セルローズを用いる密着法、酵素反応緩衝液中にカナ
マイシンを含む） 例１３に記載した方法を同様に実施する。但し密着担体
として燐セルローズ（Ｐ ８１ ； Ｗｈａｔｍａｎ）
を予め抗生物質の含浸処理を行うことなく使用する。
蛋白質のプロッティングによるＨＳＡの免疫学的検出（
燐セルローズを用いる密着法、酵素反応緩衝液中にカナ
マイシンを含む） 例１３に記載した方法を同様に実施する。但し密着担体
として燐セルローズ（Ｐ ８１ ； Ｗｈａｔｍａｎ）
を予め抗生物質の含浸処理を行うことなく使用する。
酵素緩衝液に／Ｉｎ＋ｇ／ｍｅの高い濃度でカナマイシ
ンを加える。
ンを加える。
評価はその燐セルローズのオー１−ラジオグラフィーに
よって行う。
よって行う。
桝η
蛋白質プロットの再使用
ニトロセルローズ（Ｉｌｙｂｏｎｄ Ｃ）の上の蛋白質
プロットを、例１３に記述したと同じ方法の実施（ザイ
クル■）の後に７０°ＣにおいてＴＢＳの中に０．１モ
ルのβ−メルカプトエタノール及び３％のＳＤＳを含む
溶出緩衝液で１５分間づつ２回洗浄し、そしてそれによ
って酵素で標識したプローブを含めて第１の抗体を溶出
する。この洗浄の後で０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を含
むＴＢＳを用いてもう一度ブロンキングし、そして例１
３に記述したと同じ方法を繰返す。
プロットを、例１３に記述したと同じ方法の実施（ザイ
クル■）の後に７０°ＣにおいてＴＢＳの中に０．１モ
ルのβ−メルカプトエタノール及び３％のＳＤＳを含む
溶出緩衝液で１５分間づつ２回洗浄し、そしてそれによ
って酵素で標識したプローブを含めて第１の抗体を溶出
する。この洗浄の後で０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を含
むＴＢＳを用いてもう一度ブロンキングし、そして例１
３に記述したと同じ方法を繰返す。
第１サイクルと第２サイクルとの密着担体を一緒にオー
トラジオグラフィーにかける。プロットを再び使用した
後で強度の損失は全く認められない。
トラジオグラフィーにかける。プロットを再び使用した
後で強度の損失は全く認められない。
桝跋
無蛋白ブロッキング条件のもとてニトロセルローズ上の
蛋白質プロッティングによるＨＳＡの免疫学的検出（密
着担体：カナマイシンを含ませたカルボキシメチルセル
ローズ） 例１３に記述したものと同じ方法を実施する。密着担体
としてカナマイシンを含浸させたカルボキシメチルセル
ローズＣＣＭ−Ｍｅｍｂｒａｎ ； Ｒｅｎｎｅｒ Ｇ
ｍｂｌｌ）を用いる。評価はこのＣＭ−Ｍｅｍｂｒａｎ
のオートラジオグラフィーによって行う。
蛋白質プロッティングによるＨＳＡの免疫学的検出（密
着担体：カナマイシンを含ませたカルボキシメチルセル
ローズ） 例１３に記述したものと同じ方法を実施する。密着担体
としてカナマイシンを含浸させたカルボキシメチルセル
ローズＣＣＭ−Ｍｅｍｂｒａｎ ； Ｒｅｎｎｅｒ Ｇ
ｍｂｌｌ）を用いる。評価はこのＣＭ−Ｍｅｍｂｒａｎ
のオートラジオグラフィーによって行う。
嵐幻
無蛋白ブロッキング条件のもとてニトロセルローズの上
での蛋白質プロソティイグによるＩＳＡの免疫学的検出
（プロティン八とＮＰＴ ＩＩとからなる結合生成物を
トルイレンジイソシアネート−２，４プレポリマーと共
に用いる） （Ａ’）酵素で標識したプローブの調製ａ） Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ溶菌生成液からのＮＰＴ ＩＩの電気泳動による
精製 １０ ｍＡのＥ、 ｃｏｌｉ （ＮＰＴ ＩＩで過エキ
スプライムして）の細胞培養液（ｐＲＫ ８９）の細胞
ベレットを１ｍＲの溶菌緩衝液中に取り込んで超音波照
射する。細胞の残りは４°Ｃにおいて遠心分離する。溶
菌生成液をプレパラ−） ＦＡＡ／ＳＤＳゲルの上に載
せて電気泳動により分離する。このゲルを水で洗浄した
後、０．２５モルのＫＣｌの冷たい溶液に入れ、その可
視化されたＮＰＴ’ ＩＴバンドをスカルペルで切り出
して細分割する。蛋白質を溶離緩衝液により室温で３時
間の間に溶離させる。この溶離によって得られた溶液を
遠心分離し、そしてその上澄液に４倍体積の冷たいアセ
トンを加えて一２０℃において３時間静置する。次に０
℃において遠心分離する。洗浄の後にそのペレットを２
００μβの溶解緩衝液中に熔解して２０ミリモルの燐酸
ナトリウム緩衝液に対して一夜透析する（４℃）。約２
００μｌの最終容積の中に約２００μｇのＮＰＴ ＩＩ
が見出される。
での蛋白質プロソティイグによるＩＳＡの免疫学的検出
（プロティン八とＮＰＴ ＩＩとからなる結合生成物を
トルイレンジイソシアネート−２，４プレポリマーと共
に用いる） （Ａ’）酵素で標識したプローブの調製ａ） Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ溶菌生成液からのＮＰＴ ＩＩの電気泳動による
精製 １０ ｍＡのＥ、 ｃｏｌｉ （ＮＰＴ ＩＩで過エキ
スプライムして）の細胞培養液（ｐＲＫ ８９）の細胞
ベレットを１ｍＲの溶菌緩衝液中に取り込んで超音波照
射する。細胞の残りは４°Ｃにおいて遠心分離する。溶
菌生成液をプレパラ−） ＦＡＡ／ＳＤＳゲルの上に載
せて電気泳動により分離する。このゲルを水で洗浄した
後、０．２５モルのＫＣｌの冷たい溶液に入れ、その可
視化されたＮＰＴ’ ＩＴバンドをスカルペルで切り出
して細分割する。蛋白質を溶離緩衝液により室温で３時
間の間に溶離させる。この溶離によって得られた溶液を
遠心分離し、そしてその上澄液に４倍体積の冷たいアセ
トンを加えて一２０℃において３時間静置する。次に０
℃において遠心分離する。洗浄の後にそのペレットを２
００μβの溶解緩衝液中に熔解して２０ミリモルの燐酸
ナトリウム緩衝液に対して一夜透析する（４℃）。約２
００μｌの最終容積の中に約２００μｇのＮＰＴ ＩＩ
が見出される。
ｂ）結合
結合のために１７．４ｇの新しく蒸留したトルイレンジ
イソシアネート−２，４及び３０ｇのポリエチレン６０
０よりなるプレポリマーを５０−６０°Ｃにおいて作る
。このプレポリマーの１００ｍｇを５００ｍｇのアセト
ン中に熔解し、完全に熔解させた後にこの溶液の３００
ｍｇを７００ｍｇの水の中に乳化させる。
イソシアネート−２，４及び３０ｇのポリエチレン６０
０よりなるプレポリマーを５０−６０°Ｃにおいて作る
。このプレポリマーの１００ｍｇを５００ｍｇのアセト
ン中に熔解し、完全に熔解させた後にこの溶液の３００
ｍｇを７００ｍｇの水の中に乳化させる。
上記ａ）において得られた８００μβの溶菌生成液ニ１
５０μｌの水中の１５０μｇのプロティン八をエノペン
ドルフ管の中で加える。この溶液に上述のようにして作
ったエマルジョンの２００μｌを加えて振とうしながら
１時間反応させる。１時間後にもう一度１００μβの新
しく作ったエマルジョンを加え、そして更に１時間反応
させる。その後で１５０μ！の水中に２００μｇのリジ
ンを溶解した溶液によって室温において３０分間停止反
応させる。
５０μｌの水中の１５０μｇのプロティン八をエノペン
ドルフ管の中で加える。この溶液に上述のようにして作
ったエマルジョンの２００μｌを加えて振とうしながら
１時間反応させる。１時間後にもう一度１００μβの新
しく作ったエマルジョンを加え、そして更に１時間反応
させる。その後で１５０μ！の水中に２００μｇのリジ
ンを溶解した溶液によって室温において３０分間停止反
応させる。
Ｃ）検出
例１３に記述したと同し方法を実施する。但し遺伝子工
学的に作ったプロティンＡ／ＮＰＴ Ｉｔ癒合蛋白質の
代りに上述のように作った結合生成物の５０−を酵素で
標識したプローブとして用いる。
学的に作ったプロティンＡ／ＮＰＴ Ｉｔ癒合蛋白質の
代りに上述のように作った結合生成物の５０−を酵素で
標識したプローブとして用いる。
検出は再びオートラジオグラフィーによって行う。
貫頒
ＣＣＡ紙（東ドイツ経済特許第２ｓ＋ 、 ｏ゛’４号
に従う密着担体）の上でのスポットによるｌｌ５Ａの免
疫学的検出 ＩＩｓへの運の希釈列のものをＣＣＡ紙（ＥＰ第旧３４
，０２５号に従い作った）の上にスポソトシ、そして３
０分間空気にさらして乾燥させる。次にこの担体を１０
％のスルファニル酸と１０％のトリエタノールアミンよ
りなる溶液（ｐｔｌ＝７．５）の中に室温において軽く
振とうしながら１時間インキュベーションする。
に従う密着担体）の上でのスポットによるｌｌ５Ａの免
疫学的検出 ＩＩｓへの運の希釈列のものをＣＣＡ紙（ＥＰ第旧３４
，０２５号に従い作った）の上にスポソトシ、そして３
０分間空気にさらして乾燥させる。次にこの担体を１０
％のスルファニル酸と１０％のトリエタノールアミンよ
りなる溶液（ｐｔｌ＝７．５）の中に室温において軽く
振とうしながら１時間インキュベーションする。
ブロック■は０．５％のゼラチンを含むＴＢＳ中で、は
東ドイツ経済特許第２５４，０１２号に従う密着担体及
び上記ＣＣＡ紙のオートラジオグラフによって行う。両
方の担体の上で Ｐ−γ−ＡＴＰにより標識されたカナ
マイシンを検出することができる。
東ドイツ経済特許第２５４，０１２号に従う密着担体及
び上記ＣＣＡ紙のオートラジオグラフによって行う。両
方の担体の上で Ｐ−γ−ＡＴＰにより標識されたカナ
マイシンを検出することができる。
班刈
ネガ化処理した紙（密着担体：燐セルローズ）の上のス
ポットによるＩＳＡの免疫学的検出 ネガ化した担体をＣＣＡ紙及びスルファニル酸から東ド
イツ経済特許第２３７，８４１号に従って作る。
ポットによるＩＳＡの免疫学的検出 ネガ化した担体をＣＣＡ紙及びスルファニル酸から東ド
イツ経済特許第２３７，８４１号に従って作る。
この担体の上に１（舒の一連の希釈列のものをスポット
し、そしてブロッキング剤（ブロックＩ及び■）として
１０％のスルファニル酸と１０％のトリエタノールアミ
ンとの？容？＆ （ｐｉｔ ＝ ７．５）を用いる。カ
ナマイシンを含ませた担体としてカナマイシン含有燐セ
ルローズ（Ｐ ８１ ； Ｗｈａｔｍａｎ）を用いる。
し、そしてブロッキング剤（ブロックＩ及び■）として
１０％のスルファニル酸と１０％のトリエタノールアミ
ンとの？容？＆ （ｐｉｔ ＝ ７．５）を用いる。カ
ナマイシンを含ませた担体としてカナマイシン含有燐セ
ルローズ（Ｐ ８１ ； Ｗｈａｔｍａｎ）を用いる。
次に検出を例１３におけると同様に行う。＋ＩＳＡの検
出は両方の担体についてオロトラジオグラフィーにより
行う。
出は両方の担体についてオロトラジオグラフィーにより
行う。
罰
疎水性担体の上でのスポットによる１（ＳＡの免疫学的
検出（密着担体：東ドイツ経済特許第２５４，０１２号
に従う） 疎水性の担体を東ドイツ経済特許に従ってＣＣＡ紙（Ｅ
Ｄ第０１３４，０２５号に従う）を等モル量のジ−ｎ−
オクチルアミン及びナトリウム塩としてのスルファニル
酸と反応させることによって作る。この担体の上にＩＳ
Ａの連の希釈列のものを載せる。３０分の後に室温にお
いてそのスポットは担体の上で乾燥しており、更にそれ
らのスポットを１５分間乾燥さゼる。ブロッキングはブ
ロック■及びＨにおいてＴＢＳゼラチンを用いて例Ｊ４
に記述したと同様に行う。この方法はその他の点につい
ては何重３に記述したのと同様に行う。
検出（密着担体：東ドイツ経済特許第２５４，０１２号
に従う） 疎水性の担体を東ドイツ経済特許に従ってＣＣＡ紙（Ｅ
Ｄ第０１３４，０２５号に従う）を等モル量のジ−ｎ−
オクチルアミン及びナトリウム塩としてのスルファニル
酸と反応させることによって作る。この担体の上にＩＳ
Ａの連の希釈列のものを載せる。３０分の後に室温にお
いてそのスポットは担体の上で乾燥しており、更にそれ
らのスポットを１５分間乾燥さゼる。ブロッキングはブ
ロック■及びＨにおいてＴＢＳゼラチンを用いて例Ｊ４
に記述したと同様に行う。この方法はその他の点につい
ては何重３に記述したのと同様に行う。
検出は両方の担体の上でオートラジオグラフィーによっ
て行う。
て行う。
籠
ニトロセルローズ上での蛋白質プロッティングによる）
ＩＳＡの免疫学的検出（密着担体：燐セルローズ）及び
検出反応の増幅 一連の希釈列のものをニトロセルローズ（Ｈｙｂｏｎｄ
Ｃ； Ａｍｅｒｓｈａｍ）の上に例１３に記述したと
同様にブロッティングして引続いてブロッキングする。
ＩＳＡの免疫学的検出（密着担体：燐セルローズ）及び
検出反応の増幅 一連の希釈列のものをニトロセルローズ（Ｈｙｂｏｎｄ
Ｃ； Ａｍｅｒｓｈａｍ）の上に例１３に記述したと
同様にブロッティングして引続いてブロッキングする。
第１の抗体と共にインキュベーションした後に先ず最初
０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳで１時間洗浄
し、その後で再びブロッキング（０，２％のＴｗｅｅｎ
２０を含むＴＢＳ）、そして１０ｍ１の）客演の中の
１０μｇのプロティン八と共に軽く振とうする。それに
引続いてもう一度０．１％のＴｗｅｅｎ ２０の含まれ
たＴＢＳで洗浄して再びブロッキングする。
０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳで１時間洗浄
し、その後で再びブロッキング（０，２％のＴｗｅｅｎ
２０を含むＴＢＳ）、そして１０ｍ１の）客演の中の
１０μｇのプロティン八と共に軽く振とうする。それに
引続いてもう一度０．１％のＴｗｅｅｎ ２０の含まれ
たＴＢＳで洗浄して再びブロッキングする。
上記予め作られたＩｔｓ八−抗人血清アルブミンープロ
テインＡ−ＮＰＴ ＩＴ癒合蛋白質〔例６に従う溶菌生
成液μｌと、Ｉｔｓ八５へｔｔＢ と、及び抗−１１ｓ
Ａ−免疫グロブリン（家兎）の５０μρとから作って４
０℃で一夜インキユヘーションしたもの〕よりなる銘化
合物の１００μβを次に加えて１時間インキユヘーショ
ンする。次にＴＢＳで洗浄し、そして東ドイツ経済特許
第２５４，０１２号に従うカナマイシンの含まれた担体
を用いて例１５に従う密着法を行う。評価はこの密着担
体のオートラジオグラフィーによって行う （室温にお
いて３０分間）。
テインＡ−ＮＰＴ ＩＴ癒合蛋白質〔例６に従う溶菌生
成液μｌと、Ｉｔｓ八５へｔｔＢ と、及び抗−１１ｓ
Ａ−免疫グロブリン（家兎）の５０μρとから作って４
０℃で一夜インキユヘーションしたもの〕よりなる銘化
合物の１００μβを次に加えて１時間インキユヘーショ
ンする。次にＴＢＳで洗浄し、そして東ドイツ経済特許
第２５４，０１２号に従うカナマイシンの含まれた担体
を用いて例１５に従う密着法を行う。評価はこの密着担
体のオートラジオグラフィーによって行う （室温にお
いて３０分間）。
狙刈
ニトロセルローズ上のスポツティングによるα−フェト
プロティンの免疫学的検出（密着担体：東ドイツ経済特
許第 ２５４．０１２号に従う）及び抗体で架橋したプロティ
ンＡ−ＮＰＴ Ｕ癒合蛋白質による増この方法の第１段
階は例１５に記述したものと同様に行う。第１抗体（モ
ノクローナル）と共にインキュベ−ションした後、０．
１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳで洗浄し、そして０
．２％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳでブロッキングす
る。次に生物学的に架橋したプロティンＡ−ＮＰＴ Ｉ
Ｉの癒合蛋白質（例１１参照）５０μβを加えて１時間
インキユヘーションする。
プロティンの免疫学的検出（密着担体：東ドイツ経済特
許第 ２５４．０１２号に従う）及び抗体で架橋したプロティ
ンＡ−ＮＰＴ Ｕ癒合蛋白質による増この方法の第１段
階は例１５に記述したものと同様に行う。第１抗体（モ
ノクローナル）と共にインキュベ−ションした後、０．
１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳで洗浄し、そして０
．２％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳでブロッキングす
る。次に生物学的に架橋したプロティンＡ−ＮＰＴ Ｉ
Ｉの癒合蛋白質（例１１参照）５０μβを加えて１時間
インキユヘーションする。
ＴＢＳで洗浄（１時間）した後に、更に例１５と同様に
行う。評価は密着担体の室温における２０分間のオート
ラジオグラフィーにより行う。
行う。評価は密着担体の室温における２０分間のオート
ラジオグラフィーにより行う。
顛
ＩＳＡの免疫学的検出（溶液中での酵素反応）ＩＳＡの
一連の希釈列のものをニトロセルローズ（Ｈｙｂｏｎｄ
Ｃ； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔ、）よりなる個々の
丸形濾紙の上にスポットし、そして先ず最初例１３と同
様に処理する。プロティンＡ−ＮＰＴ Ｈの癒合蛋白質
と共にインキュベーションした後でこの濾紙をＴＢＳの
中で１時間洗浄し、次いで個別にプラスチック容器中に
移す。これにそれぞれ０．５＋＋＋ｆｆｉの酵素緩衝液
、Ｉ ｍｇのカナマイシン及び３２Ｐ−ｒ −ＡＴＰ（
１０Ｍｉｏ ｃｐｍ７ｍＲ１比放射能５０００Ｃｉ／ｍ
Ｍ）を加えて３７°Ｃにおいて１時間反応させる。前記
のニトロセルローズ膜を取出し、燐セルローズ（Ｐ ８
１．１ｃｍ２）の丸形濾紙を加え、そして３０分間振と
うする。それらの燐セルローズ濾紙を取出し、水で１時
間洗浄し、乾燥してシンチレーションカウンタで測定す
る。
一連の希釈列のものをニトロセルローズ（Ｈｙｂｏｎｄ
Ｃ； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔ、）よりなる個々の
丸形濾紙の上にスポットし、そして先ず最初例１３と同
様に処理する。プロティンＡ−ＮＰＴ Ｈの癒合蛋白質
と共にインキュベーションした後でこの濾紙をＴＢＳの
中で１時間洗浄し、次いで個別にプラスチック容器中に
移す。これにそれぞれ０．５＋＋＋ｆｆｉの酵素緩衝液
、Ｉ ｍｇのカナマイシン及び３２Ｐ−ｒ −ＡＴＰ（
１０Ｍｉｏ ｃｐｍ７ｍＲ１比放射能５０００Ｃｉ／ｍ
Ｍ）を加えて３７°Ｃにおいて１時間反応させる。前記
のニトロセルローズ膜を取出し、燐セルローズ（Ｐ ８
１．１ｃｍ２）の丸形濾紙を加え、そして３０分間振と
うする。それらの燐セルローズ濾紙を取出し、水で１時
間洗浄し、乾燥してシンチレーションカウンタで測定す
る。
評価は直接にその放射能の測定値によって行う（コント
ロールとしてＩＳＡを含まないニトロセルローズ濾紙を
一緒に送る）。
ロールとしてＩＳＡを含まないニトロセルローズ濾紙を
一緒に送る）。
Claims (30)
- （１）分子プローブと標識酵素とよりなる標識を付した
分子プローブにおいて、これらが、直接又はスペーサを
介してトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２）又はリガーゼ
（Ｅ．Ｃ．６）に結合されている分子プローブよりなる
ことを特徴とする、上記標識を付した分子プローブ。 - （２）直接又はスペーサを介してアミノグルコシド−燐
酸転移酵素に結合している分子プローブよりなる、請求
項１記載の標識を付した分子プローブ。 - （３）アミノグルコシド−燐酸転移酵素がネオマイシン
−燐酸転移酵素 I またはIIである、請求項１または２
記載の標識を付した分子プローブ。 - （４）分子プローブが共有結合を介して、またはあるス
ペーサを介して共有結合により酵素に結合している、請
求項１または２記載の標識を付した分子プローブ。 - （５）結合が可逆的である、請求項１または２記載の標
識を付した分子プローブ。 - （６）その標識を付した分子プローブが蛋白と酵素との
癒合蛋白である、請求項１または２記載の標識を付した
分子プローブ。 - （７）分子プローブまたは分子プローブの混合物にトラ
ンスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２）またはリガーゼ（Ｅ．Ｃ
．６）を結合させることを特徴とする、標識を付した分
子プローブの製造方法。 - （８）分子プローブまたは分子プローブの混合物にアミ
ノグルコシド−燐酸転移酵素を結合させる、請求項７記
載の標識を付した分子プローブの製造方法。 - （９）アミノグルコシド−燐酸転移酵素としてネオマイ
シン−燐酸転移酵素 I またはIIを使用する、請求項８
記載の方法。 - （１０）アミノグルコシド−燐酸転移酵素の分子プロー
ブへの結合をある共有結合の形成により、又はスペーサ
を介してのいくつかの共有結合の形成により行なう、請
求項８記載の方法。 - （１１）蛋白質とアミノグルコシド−燐酸転移酵素とか
らなる癒合蛋白が遺伝子工学的に作られる、請求項６な
いし８のいずれかに記載の方法。 - （１２）溶液中に存在するか、ゲルの中に含まれている
か、または固体相 I に結合されている生体分子を識別
するために酵素に結合されている分子プローブを加え、
その分子プローブに結合されているか、またはそれから
分離させた酵素を共基質の存在のもとにある基質と反応
させてその反応した基質を固体相IIまたはIIIの上で検
出することを特徴とする、標識を付した分子プローブに
よって生体分子を検出する方法。 - （１３）生体分子の検出を次の方法段階、すなわちａ）
結合された酵素によって標識化した分子プローブを、溶
液中に存在するか、ゲルの中に含まれているかまたは固
体相 I に結合している生体分子にそれに特有の親和性
によって付加させる識別段階、 ｂ）標識の付けられた分子プローブの過剰を洗浄除去及
び／又は分離する洗浄段階、 ｃ）ある共基質の存在のもとに基質を酵素と反応させる
酵素反応段階、 ｄ）反応しなかった共基質及び場合により基質を洗浄除
去または分離除去する分離段階、ｅ）反応した基質を固
体相IIまたはIIIの上で測定するかまたは適当な検出方
法によって検出する評価段階によって実施する、請求項
１２記載の方法。 - （１４）識別段階ａ）においてゲルまたは他の分離−担
体物質の中で生体分子を分離してその生体分子を含んで
いる分離−担体物質を酵素の結合した分子プローブの含
まれている溶液と接触させ、その際生体分子と標識と付
した分子プローブとが反応してそのゲルまたは分離担体
物質の中で生体分子と酵素の結合したプローブとの錯化
合物を形成させ、 洗浄段階ｂ）においてはそのゲルまたは分離−担体物質
から標識の付いた分子プローブの過剰を洗い流し、 酵素反応段階ｃ）においてそのゲルまたは分離−担体物
質を前記基質と共基質とを含む第二のゲル又は分離一担
体物質と接触させてその基質を反応させ、 分離段階ｄ）において上記の反応した基質を含む第２の
ゲルまたは分離−担体物質を固体相IIIと接触させて、
その反応した基質をそれに結合させ、そして洗浄段階の
あとで 評価段階ｅ）において上記固体相IIIの上の反応した基
質を放射能の測定によりまたはオートラジオグラフィー
により、或は他の手段によって検出する、 請求項１３記載の方法。 - （１５）段階ａ）及びｂ）のあとでその生体分子と酵素
で標識された分子プローブとの錯化合物が含まれたゲル
又は分離−担体物質を、上記基質が結合している固体相
IIと、或は共基質の存在のもとに接触させ、そして酵素
的に反応した基質を固体相IIの上で検出する、請求項１
４記載の方法。 - （１６）識別段階ａ）において酵素に結合している分子
プローブと生体分子とが溶液の中に存在していてここで
互に付加し、 洗浄段階ｂ）においてその標識を付した分子プローブの
過剰を分離除去し、 酵素反応段階ｃ）においてその生体分子と標識の付いた
分子プローブとの錯化合物の酵素を溶液中で共基質の存
在のもとに基質と反応させ、分離段階ｄ）においてその
酵素的に反応した基質の過剰の共基質からの分離をその
基質を選択的に結合する固体相IIIによって実施し、そ
して評価段階ｅ）においてその反応した基質と固体相I
IIの上で測定するか、又はオートラジオグラフ的に測定
する、 請求項１３記載の方法。 - （１７）識別段階ａ）において結合された酵素により標
識の付せられた分子プローブを固体相 I に結合させた
生体分子に付加させ、 洗浄段階ｂ）において過剰の標識の付せられた分子プロ
ーブを洗い流し、及び／又は分離除去酵素反応段階ｃ）
において固体相 I に結合されたその生体分子と標識の
付せられた分子プローブとよりなる錯化合物の酵素を溶
液中に存在する基質及び共基質と反応させ、分離段階ｄ
）においてその反応しなかった共基質と場合により基質
とを分離除去してその反応した基質を固体相IIIに結合
させ、 評価段階ｅ）においてその反応した基質を固体相IIIの
上で測定するかまたはオートラジオグラフ的に測定する
、 請求項１３記載の方法。 - （１８）段階ａ）及びｂ）のあとで酵素反応段階ｃ）に
おいて固体相 I をそれに結合している生体分子及びこ
れに付加されている標識の付せられた分子プローブと共
に、基質と共基質とが含まれているゲルまたは他の分離
−担体物質で被覆し、そして次に分離段階においてその
ゲルまたは分離−担体物質からその反応した基質を固体
相IIIの上に転移させ、そして評価段階ｅ）においてこ
の上で検出する、請求項１７記載の方法。 - （１９）識別段階ａ）において結合した酵素により標識
の付せられた分子プローブを固体相 I に結合した生体
分子に付加させ、 洗浄段階ｂ）において、標識の付せられた分子プローブ
の過剰を洗い流し、及び／又は分離除去し、 酵素反応段階ｃ）においてその固体相 I に結合してい
る生体分子と標識の付せられた分子プローブとよりなる
錯化合物の酵素を固体相IIに結合している基質と溶液中
に存在する共基質の存在のもとに反応させ、 分離段階ｄ）において過剰の共基質を洗い流すかまたは
分離除去し、そして 評価段階ｅ）においてその反応した基質を固体相IIの上
で測定するかまたはオートラジオグラフィー的に測定す
る、 請求項１３記載の方法。 - （２０）識別段階ａ）においてその生体分子を一つ以上
の識別系中で且つ特別な親和性を有する一つ以上の分子
の中で識別するか、または一つ以上の分子と反応させ、
そして酵素と結合されている分子プローブをこれらの分
子の少なくとも一つ以上と反応させる、請求項１３ない
し１９のいずれかに記載の方法。 - （２１）標識を付した分子プローブとして酵素と分子プ
ローブとの癒合蛋白を使用する、請求項１２記載の方法
。 - （２２）酵素の結合した分子プローブとしてその酵素に
可逆的に結合される分子プローブを使用する、請求項１
２記載の方法。 - （２３）酵素として転移酵素（Ｅ．Ｃ．２）を使用する
、請求項１２ないし２０のいずれかに記載の方法。 - （２４）酵素として燐含有基を転移させる酵素（Ｅ．Ｃ
．２，７）を使用する、請求項２３記載の方法。 - （２５）燐含有基転移酵素としてアミノグルコシド−燐
酸転移酵素（Ｅ．Ｃ．２，７，１）を使用する、請求項
２４記載の方法。 - （２６）燐含有基転移酵素としてヌクレオチジルトラン
スフエラーゼ（Ｅ．Ｃ．２，７，７）を使用する、請求
項２４記載の方法。 - （２７）酵素としてリガーゼ（Ｅ．Ｃ．６）を使用する
、請求項１２ないし２０のいずれかに記載の方法。 - （２８）リガーゼとして燐エステル形成性の酵素（修復
酵素）（Ｅ．Ｃ．６，５）を使用する、請求項２７記載
の方法。 - （２９）燐エステル形成性酵素としてＤＮＡ−リガーゼ
（Ｅ．Ｃ．６，５，１１）を使用する、請求項２８記載
の方法。 - （３０）酵素の結合した分子プローブとしてアミノグル
コシド−燐酸転移酵素と結合した請求項１ないし５に従
う分子プローブを使用する、請求項１２ないし２０のい
ずれかに記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22556588A JPH0276600A (ja) | 1988-09-10 | 1988-09-10 | 標識を付した分子プローブ、その製造及び利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22556588A JPH0276600A (ja) | 1988-09-10 | 1988-09-10 | 標識を付した分子プローブ、その製造及び利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0276600A true JPH0276600A (ja) | 1990-03-15 |
Family
ID=16831296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22556588A Pending JPH0276600A (ja) | 1988-09-10 | 1988-09-10 | 標識を付した分子プローブ、その製造及び利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0276600A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1442302A4 (en) * | 2001-10-12 | 2007-03-28 | Molecular Probes Inc | ANTIBODY COMPLEXES AND IMMUNE MARKING METHOD |
-
1988
- 1988-09-10 JP JP22556588A patent/JPH0276600A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1442302A4 (en) * | 2001-10-12 | 2007-03-28 | Molecular Probes Inc | ANTIBODY COMPLEXES AND IMMUNE MARKING METHOD |
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