JPH0279973A - セリンアルカリプロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、植物由来のセリンタイプアルカリプロテアー
ゼ、特に低ｐ）Ｉｆｉｌ域において安定なアルカリプロ
テアーゼに関する。

（従来の技術） プロテアーゼは、医薬品や臨床検査用試薬として、ある
いは食品加工、水産加工、醸造、醗酵。

繊維加工、皮革加工などの用途に利用されている。

最近では、洗剤、化粧品などの添加物としの需要も多い
。プロテアーゼには、動物由来、微生物由来および植物
由来のプロテアーゼがあり、このなかでは、既知の植物
由来のプロテアーゼの数は比較的少ない。植物由来のプ
ロテアーゼとしては。

パパイン、プロメラインなどがよく知られている。

この他の植物由来のプロテアーゼとしては２例えば、メ
ロン（Ｃｕｃｕ＋＋＋ｉｓ　　Ｍｅｌｏ　Ｌ、　ｖａｒ
　Ｐｒ１ｎｃｅ）由来のセリンプロテアーゼ［ククミシ
ン、　Ｃｕｃｕｍｉｓｉｎ；Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ＋＊、、
７Ｊｌ、　１２８７（１９７５）］　；パバラゴムツキ
来のセリンプロテアーゼ（Ｋ、Ｒ，Ｌｙｎｎら）；トウ
ガン（Ｗｈｉｔｅ　Ｇｏｕｒｄ　　；　Ｂｅｎ１ｎｃａ
ｓａ　ｃｅｒｉｆｅｒａ）由来のプロテアーゼ（Ｍ、Ｋ
ａｎｅｄａ　ｅｔ、ａｌＨＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、　１６３４５−３４６　（１９７７）　；そして、
カラスウリ（Ｓｎａｋｅ−Ｇｏｕｒｄ　；Ｔｒｉｃｈｏ
ｓａｎｔｈｅｓ　　ｃｕｃｕｍｅｒｏｉｄｅｓ　Ｍａｘ
ｉｍ）由来のプロテアーゼ（Ｍ、Ｋａｎｅｄａ　ｅｔ　
ａｌ　；　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、９９＋　５６９−５７
７　（１９８６）が知られている。

種々の用途に利用し得るプロテアーゼ、特に医薬品、検
査用試薬などの用途に使用し得るプロテアーゼとしては
、広いｐＨ安定領域を有する酵素が望まれる。上記植物
由来のプロテアーゼは、いずれもｐｔ＋安定領域が中性
〜弱アルカリ側にあり２例えば、ククミシンのｐＨ安定
領域は７．０〜１１．０　（２５”Ｃ，２０時間）であ
る。経口投与の医薬品、各種検査用試薬などとして使用
する場合には特に低ｐＨｐＩ域における安定性が望まれ
る。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の課題を解決するものであり。

その目的とするところは、広範囲の用途に使用し得るプ
ロテアーゼを提供することにある。本発明の他の目的は
、広いｐＨ安定領域を有する植物由来のプロテアーゼを
提供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明のセリンタイプのアルカリプロテアーゼは、植物
由来の酵素であり、次の性質を有する：■作用および基
質特異性：単純タンパク質および複合タンパク質に作用
し、オリゴペプチドまたはアミノ酸を生成する。

■至適ｐＨ範囲：　ｐＨ１０，５付近 ■安定ｐＨ範囲：２０’Ｃにおいて２４時間保持したと
きに、ｐＨ２〜１２の範囲において安定である。

■作用適温の範囲７０．６Ｗ／Ｖ％カゼインを基質とし
たときの至適反応温度は７０℃である。

■熱安定性：　ｐＨ５，０において１０分間保持したと
き、７０℃まで安定である。

■分子ｉｉ　：ソディウムドデシルサルフェート−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は６７．０
００である。

本発明のアルカリプロテアーゼは、ウリ科植物。

特にキュウリ属（Ｃｕｃｕ＋ｗｉｓ　）に属する植物か
ら得られるセリンタイプの新規アルカリプロテアーゼで
ある。この酵素は、好適には、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ
Ｍｅｌｏ　Ｌ、νａｒ、　　Ｐｒ１ｎｃｅ）から得られ
、特に、受粉後２０日前後の幼若メロン果実の胎座付近
から採取される。

Ｍ１１１１λ汰 ウリ科植物１例えばメロンの幼若果実を採取し。

胎座およびその周辺の組織から果汁を採取する。

本酵素は、この果汁から既知の精製法を単独でもしくは
組み合わせて使用することにより、単離・精製される。

例えば、この果汁の上清を硫酸アンモニウムによる塩析
にかけ、セファデックスＧ−７５゜Ｃトセルロースなど
のカラムクロマトグラフィーにかけることにより、精製
酵素が得られる。精製法の一例を次に示す。

（１）新鮮な幼若メロン果実の胎座およびその周辺から
果汁を採取しく胎座部分は食塩水で抽出を行う）、遠心
分離を行い上清を得る。（２）この上清を硫酸アンモニ
ウム（６０％飽和）で塩析する。（３）得られた粗酵素
をセファデックスＧ−７５のカラムクロマトグラフィー
にかける（ｐＨ５，０；０．３Ｍ　ＮａＣ１含有５０ｎ
＋Ｍ酢酸緩衝液）。（４）上記塩析およびセファデック
スＧ−７５によるカラムクロマトグラフィーを繰り返し
て行なう。（５）側−セルロースのカラムクロマトグラ
フィーにかける（０〜０．３Ｍ　ＮａＣ１含有５０ｍＭ
酢酸緩衝液）。

このような方法で精製したときの各ステップにおける酵
素の純化の度合を表１に示す。表１における活性は後述
の活性測定法により測定した値である。ステップ１の値
はメロン幼若果実３ｋｇから得た上清を試料としたとき
の測定値である。このようにして、ステップ５では１２
．６　Ｘ　１０’単位／■タンパク質の精製酵素が得ら
れる。以下、後述の酵素の性質は、この精製酵素を用い
て調べられた。

（以下余白） 話ｊＪＬＬ決 カゼインを０．６Ｗ／Ｖ％の割合で含有するＯ、　１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，６）を基質溶液とし、この基質
溶液２．５ｓｆに、活性が未知の酵素液０．５ｄを加え
る。

これを３０℃で１０分間インキエベートした後１反応停
止液（０，１１Ｍ　　）リクロロ酢酸、　０．２２Ｍ酢
酸ナトリウムおよび０．３３Ｍ酢酸を含有する水溶液）
２．５−を加えて反応を停止させる。これを３０℃で３
０分間放置した後、濾紙（ワットマンＮα６）を用いて
濾過し、濾液の吸光度を測定する。別に、上記基質溶液
と反応停止液の順序を逆にした系を調製して同様の操作
を行い、これをブランクとする。酵素の１単位は、　２
７５ｎｍにおける吸光度を１分間に０．００１だけ増加
させる酵素量とする。

能衆■血１ 本発明酵素の理化学的性質を以下に示す。

■作用および基質特異性：単純タンパク質および複合タ
ンパク質に作用し、オリゴペプチドまたはアミノ酸を生
成する。広い基質特異性を有し。

特に、八５ｎ−Ｇｉｎ、　Ｃｙｓ−Ｇｌｙ、　Ｌｅｕ−
Ｔｒｙなどのペプチド結合を優先的に切断する。

■至適ｐｌ（範囲および安定ｐｌ（範囲本酵素を用い、
　ｐＨ２，６〜１１．２の範囲のｐｌ＋条件下で活性測
定法の方法に準じて酵素反応を行った。

酵素溶液には１２Ｍｇのタンパク質を含む。使用した緩
衝液は、　ｐＨ２，６〜８．０の範囲ではクエン酸−リ
ン酸ナトリウム緩衝液、　ｐｔｔ　７．７〜１０．５の
範囲ではホウ酸−リン酸ナトリウム緩衝液、そしてｐＨ
１０，２〜１１゜２の範囲では水酸化ナトリウム−リン
酸ナトリウム緩衝液である。その相対活性を第１図に示
す。第１図から、至適ｐＨは３０″Ｃにおいて約１０．
５であることがわかる。第１図において５点線の部分は
、基質であるカゼインが析出するため測定できなかった
ことを示す。

本酵素を所定のｐＨの緩衝液に溶解しくタンパク質１２
　ｕｇ／　０．５ｄ）　、　２０℃で２４時間保持した
後。

残存活性を測定した。ｐ）ｌは第２図に示す１１種に設
定した。その結果を第２図に白プロットで示す。

安定ｐＨ範囲は２０℃で２．０〜１２．０であることが
わかる。

■作用適温の範囲 本酵素を用いカゼインを基質とし、２０〜９０℃（７）
範囲において８種類の温度条件下で、活性測定法に準じ
て酵素反応を行うた。その相対活性を第３図に示す。第
３図からカゼイン（０，６Ｗ／シ％）を基質としたとき
の至適温度は７０℃であることがわかる。

■温度による失活の条件 本酵素をｐＨ５，０の５０ｍＭ酢酸緩衝液に溶解させ（
１２Ｍｇタンパク質；　１０．５ｄ）　、所定温度で１
０分間保持した後、その残存活性を測定した。保持温度
は、第４図に示す８種類に設定された。それぞれの残存
活性を第４図に白プロットで示す。第４図からこの酵素
は上記条件下で７０℃まで安定であることがわかる。

■阻害剤による影響 ■−１金属イオン、プロテアーゼ阻害剤などによる影響 下記に示す金属化合物やプロテアーゼ阻害剤による影響
を調べた。本酵素１８μｇおよび下記の化金物を所定の
濃度で含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　
０．５＃！ｉ！を、３０℃において１０分間インキエベ
ートシた。活性測定法に従って残存活性を測定した。そ
の結果を表２に示す。

表２ （以下余白） 表２により１本酵素はセリンプロテアーゼ阻害剤である
ジイソプロピルフルオロフォスフェート（ＤＦＰ）で完
全に阻害される。このため１本酵素は。

活性中心にセリンを有するセリンプロテアーゼであるこ
とがわかる。本酵素は、　０．５ｍＭのＨｇＣ１，およ
び０．５ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオロライ
ド（ＰＭＳＦ）によりいずれも１０％程度阻害される。

Ｈｇ以外の金属イオン、　ＥＤＴＡ、チオール試薬、　
ＴＰＣＫ（Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメ
チルケトン；キモトリプシンに特異的な阻害剤である）
、および表２に示すその他の阻害剤には阻害されない。

■−２変性剤による影響 尿素、　　ＳＯＳおよびグアニジン・ＨＣＩによる影響
を調べた。本酵素６０μｇを変性剤溶液８０μｌに加え
て、３０℃で１０分間インキュベートした。上記変性剤
溶液は、　０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）中に尿
素（０〜８Ｍ）、　５ＯＳ（０〜１％）、またはグアニ
ジン・ＨＣＩ（０〜６Ｍ）を有する。インキュベート後
の残存活性を測定し、その結果を第５図（ａ）および［
有］）に示す。第５図から本酵素は尿素に対しては安定
であり、そして、２Ｍまでのグアニジン・ＩＩｃＩおよ
び０．０１％までのＳＯＳに安定であることがわかる。

０分子量 ソゲイウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法（ＳＯＳ−ＰＡＧＥ）およびゲル濾過法
により分子量の測定を行った。

上記５Ｏ５−ＰＡＧＥ　（１１％ゲル）において、単一
のタンパク質バンドが検出された。ウシ血清、卵白アル
ブミン、キモトリプシノーゲンＡおよびチトクロームＣ
を標準分子量物質として使用し２分子量を測定したとこ
ろ約６７．０００であった。ゲル濾過法においてはセフ
ァデックスＧ−７５カラムを用い、ウシ血清、卵白アル
ブミンおよびキモトリプシノーゲンＡを標準分子量物質
として使用し１分子量を測定したところ、約６２．００
０であった。

■アミノ酸分析 本酵素を１１０　’Ｃにして塩酸で加水分解しく２４゜
４８および７２時間）、アミノ酸分析装置でアミノ酸組
成を分析した。その結果を表３に示す。

表３ 測定値を最も近い整数とした値である。本酵素のアミノ
酸配列のＮ末端は、トレオニンである。

双皿ｎ案上皇比較 本酵素は、同じくメロン果実から得られるセリンタイプ
のプロテアーゼであるククミシン［Ｃｕｃｕｍｉｓｉｎ
　Ｋａｎｅｄａら；　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｏａ＋、　７８
．１２８７〜１２９６（１９７５）　］とその性質が類
偵する。本酵素およびＫａｎｅｄａらが報告したククミ
シンの特性を表４に比較して記載する。表５にそれぞれ
のアミノ酸組成を示す。

（以下余白） 表３において、測定値は、　２４．４８および７２時間
の加水分解により得た平均値である。但し、　Ｔｈｒお
よびＳｅｒについては、　２４．４８および７２時間の
加水分解により得た値を外挿して０時間の値を求めたも
のである。ＶａｌおよびＩＩｓについては７２時間の加
水分解により得た平均値である。Ｔｒｐについては分光
光度法により測定を行った。括弧内は。

表５ 表４および表５から１本酵素はククミシンに比較して２
分子量およびアミノ酸組成が異なること；そして、安定
ｐＨ範囲、熱安定性および阻害剤による影響が異なるこ
とから、ククミシンとは異なる新規プロテアーゼである
ことが確認される。

のその　の 発明者らの研究により９本酵素は５０〜６０℃における
溶液中で徐々に自己分解し、　５４ｋＤおよび１４ｋＤ
のタンパク質に変化することが見い出された。

本酵素を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）に溶解さ
せ（０，５ｍｇ／Ｉｎ１）　、　５０℃で２４０分間イ
ンキュベートした。所定の時間ごとにＳＯ５−ＰＡＧＥ
にかけ、さらに残存活性の測定を行った。その結果を第
６図および第７図に示す。第６図から上記条件下におい
て本酵素は５４ｋＤおよび１４ｋＤのタンパク質に分解
することがわかる。他方、第７図から酵素活性は実質的
に変化しないことが明らかである。

市販のククミシン（全酒造■製）を同時にＳＯＳ　−Ｐ
ＡＧＥにかけたところ、この５４ｋＤの位置に主バンド
が観察された。従って１本酵素は、自己分解によって２
種のタンパク質に分解し、そのひとつである５４ｋＤの
タンパク質はククミシンであることが示唆される。精製
されて得られた５４ｋＤのタンパク質のアミノ酸分析の
結果を表６に示す。

表６ 次に１本酵素と、その分解産物である上記５４ｋＤタン
パク質とのｐＨ安定性および温度安定性を比較した。

まず、　５４ｋＤタンパク質の安定ｐＨ範囲を調べるた
めに１本酵素と同様の条件を採用し、　５４ｋＤタンパ
ク質を種々のｐＨ条件下でインキュベートした。そのと
きの残存活性を第２図に黒プロットで示す。

第２図から５４ｋＤタンパク質は、特にｐＨ４以下の低
ｐＨＴｉＪｆ域において不安定であり、ｐＨ２では活性
が約２５％低下することがわかる。このように低ｐＨ条
件下での安定性の相違が明らかとなったため９両酵素を
低ｐＨ条件下で保持してその残存活性を比較する実験を
行った。これらの酵素１５μｇを０．０５Ｍクエン酸−
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐ１４２．３）に溶解させ、
それぞれ３７゛Ｃで６０分間インキュベートした。

時間の経過による残存活性を第８図に示す、第８回から
９本酵素は、６０分後においても８０％程度の活性が保
持されるのに対し、　５４ｋＤタンパク質は。

その活性が５０％以下となることがわかる。

さらに、　５４ｋＤタンパク質を９本酵素の場合と同様
の条件を用い１種々の温度条件下でインキュベートして
、その残存活性を調べた。その結果を第４図に黒プロッ
トで示す。第４図から１本酵素と５４ｋＤタンパク質は
、特に６０〜８０℃の温度条件下における残存活性が異
なることがわかる。本酵素は７０″Ｃまで安定であるの
に対し、　５４ｋＤタンパク質は６０℃を越えると安定
性が急激に低下する。

本発明者らによる研究で、成熟メロン果実には。

上記５４ｋＤタンパク質がプロテアーゼの主成分として
、そして本発明の酵素が少量成分として含有されること
が見い出されている。このことからも本酵素は自己分解
により５４ｋＤタンパク質と１４ｋＤタンパク質とに分
解することが考えられる。しかし。

本酵素は、単離・精製された状態においては極めて安定
であり、空気酸化を受けず、長期間の保存が可能である
。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ　　Ｍｅ旦り、ｖａｒ　Ｐｒ１
ｎｃｅ）の幼若果実（受粉後２０日目に採取）６個（３
ｋｇ）から給圧およびその周辺部を採取し果汁を得た。

給圧部は１％ＮａＣ１水溶液で抽出し、この抽出液（１
５０ｄ）と果汁とを合併した。これを遠心分離にかけ（
７，８００Ｘｇ、１０分間）、上清を得た。この上清に
６０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、生じ
た沈殿を遠心分離（７，８００Ｘ　ｇ　、　３０分間）
にかけて回収した。得られた沈殿を少量の０．３Ｍ　Ｎ
ａＣ１を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）に溶解させ
、セファデックスＧ−７５（ファルマシアＬＫＢ社製）
を充填したカラムにチャージした。０，３Ｍ　ＮａＣ１
を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）で溶出させ、プロ
テアーゼ活性を有する両分を集めた。６０％飽和の硫安
沈殿を行い上記と同様の操作で再びセファデックスＧ−
７５を用いるカラムクロマトグラフィーにかけた。プロ
テアーゼ活性を有する両分を集め脱塩水で６倍に希釈し
た後、　ＣＭ−セルロースカラムにチャージした。

５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）で洗浄の後、　５０ｍＭ
酢酸緩衝液中０〜０．３ＭのＮａＣ１リニアグラジェン
トによる溶出を行い、単一ピークでプロテアーゼ活性を
有する両分を集めた。この両分から得られた酵素の特性
を調べたところ１本発明のプロテアーゼとその特性が一
致することが確認された。この酵素を５０ｍＭ酢酸緩衝
液（ｐＨ５，０）中、４℃にて保存したところ、３ケ月
間にわたり安定であることが確認された。さらに、上記
溶液を冷凍して保存したところ、１年間にわたり安定で
あることが確認された。

（発明の効果） 本発明によれば、このように１メロンの幼若果実由来の
新規セリンプロテアーゼが提供される。

この酵素は、他の植物由来のプロテアーゼに比較して特
に低ｐＨ条件において安定であり、かつ熱安定性にも比
較的価れる。システィンなどの活性化剤を必要とせず、
界面活性剤に対しても比較的安定である。本酵素は、空
気酸化を受けることなく所定の条件下において長期間安
定に保存され得る。

従って本酵素は、経口投与用の消化酵素製剤、各種検査
用試薬９食品用添加剤などとして好適に利用され得る。

４、　゛　　の　　　なｉ′　日 第１図は本酵素の至適ｐＨを示すグラフ、第２図は本酵
素および本酵素が自−己分解して得られる５４ｋＤタン
パク質の安定ｐ）Ｉ範囲を示すグラフ、第３図は９本酵
素の至適温度を示すグラフ、第４図は。

本酵素および５４ｋＤタンパク質の安定温度範囲を示す
グラフ、第５図（ａ）および（ｂ）は本酵素に対する変
性剤の影響を示すグラフ、第６図は２本酵素に自己分解
の過程を示す電気泳動図、第７図は、自己分解にともな
うプロテアーゼ活性の変化を示すグラフ、そして、第８
図は１本酵素および５４ｋＤタンパク質の低ｐＨ条件下
における安定性を示すグラフである。

以上 尭１　図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、セリンを活性中心に有する植物由来のアルカリプロ
   テアーゼであって、次の性質を有するアルカリプロテア
   ーゼ： ［１］作用および基質特異性：単純タンパク質および複
   合タンパク質に作用し、オリゴペプチドまたはアミノ酸
   を生成する。 ［２］至適ｐＨ範囲：ｐＨ１０．５付近 ［３］安定ｐＨ範囲：２０℃において２４時間保持した
   ときに、ｐＨ２〜１２の範囲において安定である。 ［４］作用適温の範囲：０．６Ｗ／Ｖ％カゼインを基質
   としたときの至適反応温度は７０℃である。 ［５］熱安定性：ｐＨ５．０において１０分間保持した
   とき、７０℃まで安定である。 ［６］分子量：ソディウムドデシルサルフェート−ポリ
   アクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は６７，０
   ００である。 ２、ウリ科植物由来の特許請求の範囲第１項に記載のア
   ルカリプロテアーゼ。