JPH0280959A

JPH0280959A - 銀染色方法及び銀染色剤キツト

Info

Publication number: JPH0280959A
Application number: JP63232059A
Authority: JP
Inventors: Yoriyoshi Ehata; 順良江幡; Hiroko Tanaka; 裕子田中; Akiko Negishi; 根岸　章子
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Current assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Priority date: 1988-09-16
Filing date: 1988-09-16
Publication date: 1990-03-22
Anticipated expiration: 2012-05-14
Also published as: JP2610493B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、電気泳動分析等において蛋白質。

核酸、楯及び脂質等の如く支持担体上に分画された生体
成分の検出を目的とすＺ銀染色法の改良方法に関する。

〔従来の技術及びその課題〕

銀染色法は、検出すべき物質（以下「被検物」という）
を言む支持担体を固定化剤で処理し、被咲ｖｌＪを固定
化した後、前処理し、次いで銀染色液で処理したのち還
元剤で現像する方法でるり、蛋白質、核酸、糖、脂質等
破検物の低−度試料即ち１血清尿、ＩｋＡを髄峡等を濃
縮操作を行うことなく、分析することが可能で生化学研
死、臨床倹ｆ等において広く利用されている有用な分析
法である。

銀染色の染色方法は櫨々報告されているが（生化学５２
巻４１１頁１９８０年、蛋白質。

核酸、酵素２７巻１２７７頁、１９８２年、Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　２巻１３５頁及び１４１頁１９
８１年ン　　いずれも朱色が完了するまで長時間を賛し
たり煩雑な操作全必要とし更に得られた銀染色源も■被
染色物質によシ染色性が異なる、■高濃度試料では完全
に染らない（中抜は状態となる）、■バックグラウンド
上昇によシコントラストが悪い等多くの問題点をもち改
善が望まれていた。

〔課題を解決するための手段」本発明者らは、斯る問題点を解決すぺぐ。

銀染色法の操作時間の短縮、染色能の向上及びコントラ
ストの改善を目的として鋭意研死をおこなった結果、還
元剤中にチオ硫酸塩を加えれば支持担体上の遊離の銀イ
オンを可溶化することができ、支持担体の着色が防止さ
れ現像後の染色像のコントラストが向上することを見出
し１本発明を完成した。

即ち本発明は、被検物を含む支持担体金固定化剤で処理
しａ恢物を固定化した後、増感剤で前処理し、次いで銀
染色液で処理したのち還元剤で現像する銀染色法におい
て、還元剤にチオｎ酸塩を宮Ｍせしめたことを特徴とす
る銀染色方法及びこれに用いる銀染色剤キットを提供す
るものである。

本発明の銀染色方法において用いる還元剤は、銀イオン
の還元能を有し、その中にチオ硫酸塩を含■していれば
いずれであっても良いが、好ましいものとしては、ホル
ムアルデヒドとクエン酸を含有するものが挙げられる。

チオｎ酸塩としては、チオ鎖酸ナトＩＪウム。

チオ硫酸アンモニウム等が挙けられるが、このりち、チ
オ懺酸ナトリウムが好ましい。

本発明に関る還元剤中のチオ硫酸ナトリウムｄｉｒｉ、
０．０００００５Ｎ／Ｖ％以上で６ればよイア％、特に
０．００００２〜０．００ＬＶＶ／Ｖ％が好ましい。ま
た、還元剤がホルムアルデヒドとクエン酸を官有するも
のである場合、ホルムアルデヒド濃度は一般にはｏ、　
ｏ　ｏ　ｉ　ｗ７ｖ％以上、好ましくは０．０１−０．
０４　Ｗ／Ｖｆｌｂテｈシ、また、クエン酸ｒＩ！に度
は、０．０Ｏ０５Ｗ／Ｖ％以上、好ましくは０．００２
〜０．０１Ｗ／Ｖ％ａＸとするのが艮い。また、ホルム
アルデヒドとクエン酸の重盪比はｌ　：　０．２５〜０
．５が好ましい。

この還元剤を用いておこなう現像時間は、５〜ｌＯ分で
光分でめる。

本発明方法は、銀染色法の現＃！を上記した還元剤でお
こなう以外は、常法に従って実施することができる。

本発明に使用される支持担体としては、通常網目構造を
有する？リアクリルア、ミドグル。

アガロースゲル及び尊大グル等の高分子担体よシ成る支
持担体が代表的なものとして挙げられる。

被検物を含む支持担体を固定化するための固定化剤も公
知のものを利用することができるが、好ましいものとし
ては、炭素数１〜４の低級アルコール及び有機酸を含有
するものが挙げられる。炭素ａ１〜４の低級アルコール
としては例えばメチルアルコール、エチルアルコール、
　　ｎ−ｆロビルアルコール、インブチルアルコール、
ｎ−ブチルアルコール、インブチルアルコール、第二級
ブチルアルコール、第三級ブチルアルコールなどが挙け
られ、有機酸としては例えばｒｎｒＲｌ　ゾロピオン酸
のよりな一塩基酸をはじめ、コノ飄り酸、酒石酸のよう
な二塩基酸やクエン酸のような三塩基酸も用いることが
できる。また、この固定化剤中にチオ尿素を添加すれば
、これが銀染色剤中の銀イオンとコンブレックスを形成
し、銀イオンの還元が容易になって現像時間を短縮する
ことが可能となる。この場付、固定化剤中のチオ尿素濃
度はｏ、ｏｏｏｏｘｖＶ／Ｖ％以上であればよいが通常
０．００１〜０．　ｌ　Ｗ／Ｖ％の濃度が好ましく用い
られる。また、上記固定化剤中のアルコール濃度は特に
限定されないが、通常１０〜６０　Ｖ／Ｖ％の濃度が好
ましく用いられる。更に、有機酸の濃度は５Ｗ／Ｖチ以
上でめればよいが、通常ｌＯ〜３ＱＷｌＶチが好ましく
用いられる。

固定処理は１例えばチオ尿素と低級アルコール及び有機
酸を宮む溶液で１回行うだけでもよいが、好ましくは、
（１）初め低級アルコール及び有機酸よりなる第１固足
化剤で処理後チオ尿素、低級アルコール及び有機酸よシ
なる第２固足化剤で処理する方法（ｉ）初めチオ尿素、
低級アルコール及び有機酸よシなる第ｌ固定化剤で処理
後、低級アルコール及び有機酸よシなる５ｇ２固定化剤
で処理する方法（Ｉｌｌ）チオ尿素、低級アルコール及
び有機酸よりなる固定化剤を二つに分け、同じ操作ｔ−
２回行う方法等二段階でおこなわれる。これら２段階処
理する方法に於ては、通常第１固定化剤中のアルコール
濃度は第２固定化剤中のアルコール濃度よシ高いことが
望ましく、固定処理の為の浸漬時間は第１固定ｌＯ分程
度、第２固定１５分程度くらいで充分でるる。

また、前処理に用いる増感剤としても公知のものを用い
ることができるが、好ましいものとしては、例えばジチ
オスレイトール及びグルタルアルデヒドを含有するもの
が挙げられる。

増感剤中のジチオスレイトール（Ｌ）ＴＴ　Ｊ　ｄ度は
、特に限定されるものではないが通常０．０００２〜０
．００２Ｗ／Ｖ％　カ好Ｉ　Ｌ　＜　用イラレル。

グルタルアルデヒド濃度は０．００５Ｗ／Ｖ％以上でめ
ればよく、通常０．００５〜０．２　Ｗ／Ｖ％が好まし
く用いられる。

また、増感剤中にチオ尿素を配付した場合。

このものの硫化増感によ＃）銀の黒化が増強され、染色
像のコントラストが明瞭となる。このような目的のため
に配合するチオ尿素の濃度は、０．００００１〜ｏ、ｏ
１ｗ／Ｖ％　でｈればｘいが１通常０．０００２〜０．
０００５Ｗ／Ｖ’ｌＫ好’！Ｌ＜用いられる。

前処理は、固足化剤で固定化された支持担体を増感液に
浸漬することによりおこなわれ、この浸ｄｌｔ時間は１
０分程度で元号でるる。

更に、本発明方法で用いられる銀染色液にも神に限定は
なく、公知のもの全利用することができるが、例えば、
硝酸銀、Ｒ−Ｎ）１２（但しトＮへはアンモニア又はｊ
ｇ１級アミンを示す）で表わされる化合物及び苛性アル
カリヲ分子量比としてｌ：４．５〜９．５：Ｌ、０〜２
６．０の割合で含有するものを用いることが好ましい。

また、硝酸銀の濃度も待に限定されないが通常０．０５
〜Ｑ、４　Ｗ／Ｖチが好ましい。

銀染色処理は、固定・増感処理された支持担体を銀染色
液に浸漬することによりおこなわれ、その浸漬時間は１
０〜１５分で元号である。

〔実施例〕

以下に実施例を挙げて本発明全史に詳細に説明するが１
本発明はこれら実施例によシ何ら限定されるものではな
い。

実施例１　血清タン、ｅり分画の染色 ■、電気泳動〔試薬の調製〕 ■　支持担体市販されている電気泳動用ポリアクリルアミドグラジェ
ントグル５ＤＳ−ＰＡＧ　ｆレート４／２０，１０１０
１０（化学楽品四販売＃）を使用した。

■　試料処理液４、３　Ｗ／Ｖ％ドデシル億酸ナトリウム、０．０２Ｗ
／Ｖ％フｏ　ム７　エンールｆルー及（ｆｉ　３０　Ｖ
／Ｖチグリセロールを含む、０．１２５Ｍトリス−埴ｒ
Ｒ緩衝液（−伐８）を調製した。

■　試料水で５０倍に希釈した正常人血清を更に水で２．４．８
、！６．３２．６４．１２８゜２５６．５１２倍希釈し
たものと、試料処理ｇを各々等量混せし、洲騰水中で５
分間煮那処理したものを調製した。

■　泳動用緩衝液Ｑ、ｌ　Ｗ／Ｖ％ドデシル謔酸ナトリウムを含む、０．
０２５Ｍトリス−０，１９２Ｍグリシン後備歇（ｐｉｌ
＆４）を調製した。

〔原動操作〕

支持担体を泳動槽に装層した後、体動用緩衝液を充填し
た。煮那処理した試料を各々５μｔずつ支持担体のサン
グルウェルにアゾライし、６０ｍＡ定電流で約１時間泳
動を行った。

■、銀染色〔試楽の調製］ ■　第ｌ固定化剤メｌｌ／−に５０Ｖ／Ｖ％＆Ｕｎｍｌ　ＯＷ／Ｖ％を含
む溶液ｔ−ＦＡ製した。

■　第２固定化剤メｐノーｈｓｏＶ／Ｖ％、　酢ｆｌＲ１０Ｗ／Ｖ％及び
チオ尿素ｏ、ｏｏｚｌ／／Ｖ％を含む溶液を調製した。

■　増感剤メタノール５０　Ｖ／Ｖ％　、−ジチオスレイトールｏ
、ｏｏｏｓｗ７ｖｓ及びグルタルアルデヒド０、１　Ｗ
／Ｖ％を宮む溶液を調製した。

■　ｆｓ染色液硝ｇ嶽０．２Ｗ／ＶＴｏ、７７％ニア０．１４Ｗ／Ｖチ
及び水酸化す）　ＩＪウム０．２　Ｗ／ＶＴｏ　ｔ−含
む溶ｇを調製した。

■　還元剤ホルムアルデヒド０．０２Ｗ／Ｖ％、クエン酸０、００
５　Ｗ／Ｖ％及びチオ硫酸ナトリウムｏ、ｏ　ｏ　ｏ　
ｏ　５ｗ７ｖ％を含む溶液を調製した。

Ｑ　停止剤クエン酸Ｉ　Ｑ　Ｗ／Ｖ％を含む溶液を調製した。

〔染色操作」支持担体を第１固足化剤でｌＯ分間振とう浸漬し、次い
でｌ１１ｇ２固定化剤で１５分間振とう浸漬した。支持
担体を増感剤で１０分間熾とう浸漬した後、イオン交換
水で５分間振とう水洗した。支持担体を銀染色液で１５
分間振とう浸漬した後、イオン交換水で２分間ずつ３回
振とり水洗した。支持担体を還元剤で染色像が机われる
まで振とう浸漬した（約５分）　ｆ！に、停止剤を加え
現像を停止した。

以上の染色操作に於ける総所要時間は６６分でめった。

実施例２　血清タンノ♀り分画の染色〔試薬の調製」 ■　第１固足化剤実施例１と同じ ■　第２固定化剤メｆｉ　／　−ルａ　ｏ　Ｖ／Ｖ％及Ｕｔｒ−ｅｌｌ　
ｌｏ　Ｗ／Ｖ％を含む溶液を調製した。

■　増感剤メタノール５０　Ｖ／Ｖ％、ソテオスレイトーに０．０
００５Ｗ／Ｖ％、ｆｋｌｌｋＴｋｆヒ）’０．ＩＷ／Ｖ
’４及びｆオ尿ＩＡＯｒｏｏ０２５Ｗ／Ｖ％ｆ含む溶液
を調製した。

■　銀染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作〕実施例１と同じ実施例３　血清タン／？り分画の染色〔試薬のｖ４１１ｔ！Ｊ ■　第１固定化剤実施例１と同じ ■　第２固定化剤実施例１と同じ ■　増感剤実施例２と同じ ■　銀染色級実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ（りＩ！Ｐ止剤実施例１と同じ〔染色操作」実施例１と同じ実施例４　血清タン／ｅり分画の染色〔試薬の調製〕（り第１固定化剤ｊり／−に５０Ｖ／Ｖ％、ｒｎｒＲＬＯＷ／Ｖ％及Ｕｆ
オＷ＄０．００２５Ｗ／ＶｔＩＪ２含む溶液を調製した
。

■　第２固定化剤実施例２と同じ ■　増感剤実施例１と同じ ■　銀染色液実施例１と同じ（２）　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作〕実施例１と同じ浸漬した（５分）後、停止剤を加え、現像を停止した。

以上の染色操作に於ける総所要時間は５０分でめった。

実施例５　血清タンノ９り分画の染色〔試薬の調製〕（０固定化剤メタ／−ル３０　Ｖ／Ｖ％、酢酸ｘｏｗ７ｖ％及びチオ
尿素０．００２５Ｗ／Ｖ％を含む溶液を調製した。

■　増感剤実施例２と同じ ■　銀染色液実施例１と同じ（Ｊ　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作〕支持担体を固定化剤で１ｏ分間娠とぅ浸漬した後、増感
剤で１ｏ分間振とり浸漬し、次いでイオン交換水で５分
間蚕とぅ水洗した。

支持担体を銀染色液で１５分間振とぅ１５！潰した後、
イオン交喚水で２分間ずつ３回水洗した。支持担体を還
元剤で銀像が現われるまで振とり浸漬した（５分）後、
停止剤を加え現像を停止した。

以上の染色操作に於ける緒ＰＪｒ賛時間は５０分であっ
た。

実施例６　血清タン）Ｑり分画の染色〔試薬の調製〕 ■　固定化剤メｐ　／　−ルａ　ＯＶ／Ｖ％　及Ｕｎｅｌｔ　ｌＯＷ
／Ｖ％を含む溶ｇをｆＡ［した。

■　増感剤メタノール５　Ｑ　Ｖ／Ｖ％、グルタルアルデヒ）’０
．０５Ｗ／Ｖ’％及ヒチオｆｆｉ素０．０００２５Ｗ／
Ｖ％を富む溶液を調製した。

■　銀染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作〕実施例５と同じ実施例７　血清タンパク分画の染色〔試薬のｖ！４製」 ■　固定化剤実施例６と同じ ■　増感剤メタノール５　Ｑ　Ｖ／Ｖ％、ジテオスレイトール０．
０００５Ｗ／Ｖチ及びチオ尿素０．０００２５Ｗ／Ｖ％
を含む溶液を調製した。

■　銀染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作」実施例５と同じ実施例８　血清タン、Ｑり分画の染色〔試薬の調製〕 ■　第１固足化剤実施例１と同じ ■　第２固足化剤実施例２と同じ ■　増感剤実施例１と同じ ■　銀染色液実施例１と同じ ■　還元剤実施例１と同じ ■　停止剤実施例１と同じ〔染色操作〕実施例１と同じ〔発明の効果〕以上述べた如く１本発明は支持担体上に分画された生体
成分の検出に用いられる銀染色法の改良技術を提供する
ものである。本発明の方法により、染色能が著しく同上
し、得られた染色像のコントラストも光分に増強された
。

以上

Claims

【特許請求の範囲】１、検出すべき物質を含む支持担体を固定化剤で固定化
した後、増感剤で前処理し、次いで銀染色液で処理した
のち還元剤で現像する銀染色法において、還元剤にチオ
硫酸塩を含有せしめたことを特徴とする銀染色方法。２、チオ硫酸塩がチオ硫酸ナトリウムである請求項第１
項記載の銀染色方法。３、還元剤が更にホルムアルデヒド及びクエン酸を含有
するものである請求項第１項又は第２項記載の銀染色方
法。４、（１）炭素数１〜４の低級アルコール及び有機酸を
含有する固定化剤、（２）ジチオスレイトール及びグルタルアルデヒドを含
有する増感剤、（３）硝酸銀、アンモニア若しくは第１級アミン及び苛
性アルカリを含有する銀染色液及び（４）チオ硫酸塩を含有する還元剤を含む銀染色剤キット。５、（４）の還元剤が更にホルムアルデヒド及びクエン
酸を含有するものである請求項第４項記載の銀染色剤キ
ット。