JPH0283337A - 癌診断薬及びそれを用いた腫瘍マーカーの回収方法 - Google Patents
癌診断薬及びそれを用いた腫瘍マーカーの回収方法Info
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- JPH0283337A JPH0283337A JP63233314A JP23331488A JPH0283337A JP H0283337 A JPH0283337 A JP H0283337A JP 63233314 A JP63233314 A JP 63233314A JP 23331488 A JP23331488 A JP 23331488A JP H0283337 A JPH0283337 A JP H0283337A
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- cancer
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
この発明は、癌性フコシル化糖鎖を有する腫瘍マーカー
を生じる癌のための癌診断薬及び上記腫瘍マーカーの回
収方法に関する。
を生じる癌のための癌診断薬及び上記腫瘍マーカーの回
収方法に関する。
[従来の技術]
腫瘍マーカーは腫瘍なスクリーニングする、腫瘍の診断
をする、腫瘍の実態をモニターする等に応用され、大き
な成果をあげている。特に膵癌のマーカーCA19−9
、卵巣癌のマーカーCA125等の癌関連抗原、α−フ
ェトプロティン(AFP)、癌胎児性抗原(CEA)
、塩基性フェトプロティン等の胎児性タンパク質等は特
異性の優れたモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体
の開発があり、血清診断キットとしても簡便かつ有効な
診断法として成功をおさめている。
をする、腫瘍の実態をモニターする等に応用され、大き
な成果をあげている。特に膵癌のマーカーCA19−9
、卵巣癌のマーカーCA125等の癌関連抗原、α−フ
ェトプロティン(AFP)、癌胎児性抗原(CEA)
、塩基性フェトプロティン等の胎児性タンパク質等は特
異性の優れたモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体
の開発があり、血清診断キットとしても簡便かつ有効な
診断法として成功をおさめている。
これらの腫瘍マーカーについては、血中抗原測定用のR
IAキット、次いでEIAキットが開発され、広く普及
している。膵癌、胆管系の癌で最も優れた血中マーカー
と言われるCA19−9ではこれらの癌の約80%に高
い血中抗原濃度が検出されるが、胃癌38.6%、大腸
癌59.1%、肺腺癌28.6%、肝細胞癌32.3%
等と癌組織に広く分布しており、低いとはいえ健常人で
も検出される。
IAキット、次いでEIAキットが開発され、広く普及
している。膵癌、胆管系の癌で最も優れた血中マーカー
と言われるCA19−9ではこれらの癌の約80%に高
い血中抗原濃度が検出されるが、胃癌38.6%、大腸
癌59.1%、肺腺癌28.6%、肝細胞癌32.3%
等と癌組織に広く分布しており、低いとはいえ健常人で
も検出される。
従って、偽陰性、偽陽性の出現を低くする手段が必要で
ある。
ある。
また、これらのII!Iマーカーを検出するためのモノ
クローナル抗体は、それらの腫瘍マーカを抗原として用
いて作製されるので、もし、腫瘍マーカーを簡便に回収
することができる方法があれば、癌の診断薬として用い
られるモノクローナル抗体の作製にとって有利である。
クローナル抗体は、それらの腫瘍マーカを抗原として用
いて作製されるので、もし、腫瘍マーカーを簡便に回収
することができる方法があれば、癌の診断薬として用い
られるモノクローナル抗体の作製にとって有利である。
[発明が解決しようとする問題点]
従って、この発明の目的は、腫瘍マーカーを検出するこ
とによっていくつかの種類の癌の診断に用いることがで
きる新規な癌診断薬を提供することである。
とによっていくつかの種類の癌の診断に用いることがで
きる新規な癌診断薬を提供することである。
さらにまた、この発明の目的は、いくつかの種類の腫瘍
マーカーの簡便な回収方法を提供することである。
マーカーの簡便な回収方法を提供することである。
[問題点を解決するための手段]
本願発明者らは、鋭意研究の結果、癌性フコシル化糖鎖
を有する腫瘍マーカーが固定化レクチンに吸着される性
質を何することを見出し、この発明を完成した。
を有する腫瘍マーカーが固定化レクチンに吸着される性
質を何することを見出し、この発明を完成した。
すなわち、この発明は、固定化AALレクチンを有効成
分とする、癌性フコシル化糖鎖を有する腫瘍マーカーを
生じる癌のための診断薬を提供する。
分とする、癌性フコシル化糖鎖を有する腫瘍マーカーを
生じる癌のための診断薬を提供する。
さらにまた、この発明は、癌性フコシル化糖鎖を有する
腫瘍マーカーを含む流体を固定化AALレクチンに作用
させ、固定化AALレクチンに吸着された腫瘍マーカー
を回収することから成る、上記腫瘍マーカーの回収方法
を提供する。
腫瘍マーカーを含む流体を固定化AALレクチンに作用
させ、固定化AALレクチンに吸着された腫瘍マーカー
を回収することから成る、上記腫瘍マーカーの回収方法
を提供する。
[発明の効果]
この発明により、癌性フコシル化糖鎖を有する腫瘍マー
カーを生じる癌に対する新規な診断薬が提供された。こ
の発明の癌診断薬は、免疫反応により腫瘍マーカーと結
合するのではなく、全く別の原理により結合するので、
腫瘍マーカーに対する従来のモノクローナル抗体と併用
することにより、従来の癌診断における偽陽性及び偽陰
性が生じる確率を低下させることができる。
カーを生じる癌に対する新規な診断薬が提供された。こ
の発明の癌診断薬は、免疫反応により腫瘍マーカーと結
合するのではなく、全く別の原理により結合するので、
腫瘍マーカーに対する従来のモノクローナル抗体と併用
することにより、従来の癌診断における偽陽性及び偽陰
性が生じる確率を低下させることができる。
さらにまた、この発明により、癌性フコシル化糖鎖を有
する腫瘍マーカーの新規な回収方法が提供された。この
発明の方法によると、−段階のアフィニティクロマトグ
ラフィー操作によりフコシル化糖鎖を担っている腫瘍マ
ーカーを簡便に回収、精製することができ、しかも、フ
コシル化糖鎖を担う種々の腫瘍マーカーに適用できるの
で汎用性に優れている。また、固定化AALレクチンは
何回でも繰り返し使用することができる。さらに、AA
Lレクチンは界面活性剤の存在下でも活性を有するので
例えば可滴化膜タンパク質の回収にも適用することがで
きる。
する腫瘍マーカーの新規な回収方法が提供された。この
発明の方法によると、−段階のアフィニティクロマトグ
ラフィー操作によりフコシル化糖鎖を担っている腫瘍マ
ーカーを簡便に回収、精製することができ、しかも、フ
コシル化糖鎖を担う種々の腫瘍マーカーに適用できるの
で汎用性に優れている。また、固定化AALレクチンは
何回でも繰り返し使用することができる。さらに、AA
Lレクチンは界面活性剤の存在下でも活性を有するので
例えば可滴化膜タンパク質の回収にも適用することがで
きる。
[発明の詳細な説明]
上述したように、この発明の癌診断薬は、固定化された
AALレクチンを(Aleuria aurantia
lectin、 N、 Kochibe and
K、 Furukawa。
AALレクチンを(Aleuria aurantia
lectin、 N、 Kochibe and
K、 Furukawa。
”Biochemistry”、 19巻pP、 2
841−2846 f1980++ を有効成分と
する。AALレクチン自身は公知であり、その調製方法
及び性質も公知であって上記文献に記載されている。ま
た、AALレクチンの固定化方法も種々の公知の方法を
採用することができ、例えばYamashita、 K
ochibe、 0hkura、 Uedaand K
obata、 ”J、 Biological Che
mistry 、 vol。
841−2846 f1980++ を有効成分と
する。AALレクチン自身は公知であり、その調製方法
及び性質も公知であって上記文献に記載されている。ま
た、AALレクチンの固定化方法も種々の公知の方法を
採用することができ、例えばYamashita、 K
ochibe、 0hkura、 Uedaand K
obata、 ”J、 Biological Che
mistry 、 vol。
260、 pp、 4688−4693 (19851
に記載されている。
に記載されている。
好ましい担体としてはセファロースビーズ、アガロース
ビーズ、セルロースビーズ、ポリアクリルアミドビーズ
等を挙げることかでき、固相化するレクチンの濃度は通
常20 B/mlないしl mg/ml、好ましくは約
3 mg/m1程度である。さらにまた、担体がアガロ
ースゲル(例えばセファロース4B、6B(ファルマシ
ア社裂)、バイオゲルA0.5m、A1.5m (登録
商標)をCNBrで活性化してカプリングする(例えば
March et al、、 Anal。
ビーズ、セルロースビーズ、ポリアクリルアミドビーズ
等を挙げることかでき、固相化するレクチンの濃度は通
常20 B/mlないしl mg/ml、好ましくは約
3 mg/m1程度である。さらにまた、担体がアガロ
ースゲル(例えばセファロース4B、6B(ファルマシ
ア社裂)、バイオゲルA0.5m、A1.5m (登録
商標)をCNBrで活性化してカプリングする(例えば
March et al、、 Anal。
Biochem、 60.149−52.1974)こ
ともできる、また、この方法をCNBr−活性化ゲル(
ファルマシア社製)に適用して固定化することもできる
。
ともできる、また、この方法をCNBr−活性化ゲル(
ファルマシア社製)に適用して固定化することもできる
。
さらにまた、活性化スペーサーを導入したゲル(例えば
アフィゲル10.15(バイオラド社製))にAALレ
クチンを作用させて固定化することもできる。さらに、
ホルミル基を導入したゲル(例えば、)オルミルアガロ
ース ミルトヨパール(東ソー株式会社製))にAALレクチ
ンを作用させてカプリングし、これをNaCNBHsで
還元する方法も用いることができる。
アフィゲル10.15(バイオラド社製))にAALレ
クチンを作用させて固定化することもできる。さらに、
ホルミル基を導入したゲル(例えば、)オルミルアガロ
ース ミルトヨパール(東ソー株式会社製))にAALレクチ
ンを作用させてカプリングし、これをNaCNBHsで
還元する方法も用いることができる。
さらに、他のタンパク質(例えばゼラチン)を上記いず
れかの方法により固定化した後、AALレクチンをグル
タルアルデヒドによって上記タンパク質と架橋する方法
も用いることができる。上記いずれの方法により固定化
する場合でも、lOmM程度のし一フコースを加えてフ
コシル化糖鎖がAALレクチンに結合する結合部位を保
護することが好ましい。
れかの方法により固定化した後、AALレクチンをグル
タルアルデヒドによって上記タンパク質と架橋する方法
も用いることができる。上記いずれの方法により固定化
する場合でも、lOmM程度のし一フコースを加えてフ
コシル化糖鎖がAALレクチンに結合する結合部位を保
護することが好ましい。
この発明の診断薬は、特に限定されないが、カラムに充
填して用いることが操作上簡便で好ましい。この場合、
カラムに充填する同相化AALレクチンの量(担体を含
む)は特に限定されないが約1mlで十分である。
填して用いることが操作上簡便で好ましい。この場合、
カラムに充填する同相化AALレクチンの量(担体を含
む)は特に限定されないが約1mlで十分である。
この発明の診断薬により診断することができる癌は、癌
によりフコシル化糖鎖を有する腫瘍マーカーを生じさせ
るものである.この発明の診断薬に吸着される、癌性フ
コシル化糖鎖を有する腫瘍マーカーの例としては、膵癌
に対するCA19−9、消化器系ガンに対するCEA、
膵癌に対するDI−PAN−2、肺腺癌等に対するシア
リル・ルイス・x−i(文献:「化学と生物」26巻、
4号、 220−234 、 1988) 、腺癌に対
するLeI′.その他卵巣癌に対するCA125を挙げ
ることができる。
によりフコシル化糖鎖を有する腫瘍マーカーを生じさせ
るものである.この発明の診断薬に吸着される、癌性フ
コシル化糖鎖を有する腫瘍マーカーの例としては、膵癌
に対するCA19−9、消化器系ガンに対するCEA、
膵癌に対するDI−PAN−2、肺腺癌等に対するシア
リル・ルイス・x−i(文献:「化学と生物」26巻、
4号、 220−234 、 1988) 、腺癌に対
するLeI′.その他卵巣癌に対するCA125を挙げ
ることができる。
この発明の診断薬を用いて癌の診断を行なう場合には、
患者から得た体液、例えば血清を、固定化AALレクチ
ン含有カラムにかけ、PBSのような緩衝液で洗浄して
洗浄画分を集め、次いで例えば約20mM程度のフコー
スを含む緩衝液で溶出させて溶出画分を集め、洗浄画分
及び溶出画分中に存在する腫瘍マーカーを定量して比較
する。
患者から得た体液、例えば血清を、固定化AALレクチ
ン含有カラムにかけ、PBSのような緩衝液で洗浄して
洗浄画分を集め、次いで例えば約20mM程度のフコー
スを含む緩衝液で溶出させて溶出画分を集め、洗浄画分
及び溶出画分中に存在する腫瘍マーカーを定量して比較
する。
溶出画分に腫瘍マーカーの多くが存在している場合には
、その患者が癌に罹患している確率が高いので,癌の診
断を行なうことができる。なお、腫瘍マーカーの定量は
、モノクローナル抗体を用いたETAのような周知の免
疫分析法により行なうことができ、そのためのキットも
種々市販されている。
、その患者が癌に罹患している確率が高いので,癌の診
断を行なうことができる。なお、腫瘍マーカーの定量は
、モノクローナル抗体を用いたETAのような周知の免
疫分析法により行なうことができ、そのためのキットも
種々市販されている。
また、同様な方法により、溶出画分中に腫瘍マーカーを
溶出させた後、それを回収することができる。溶出画分
中の腫瘍マーカーの回収、精製は、例えば溶出液を透析
チューブに入れ、50〜100倍量のPBSに対して半
日毎に4回PBSを取り替えて透析を行なうことにより
腫瘍マーカーの回収を行なうことができる。
溶出させた後、それを回収することができる。溶出画分
中の腫瘍マーカーの回収、精製は、例えば溶出液を透析
チューブに入れ、50〜100倍量のPBSに対して半
日毎に4回PBSを取り替えて透析を行なうことにより
腫瘍マーカーの回収を行なうことができる。
なお、AAL固定化ゲルは、フコース含有緩衝液で溶出
した後、PBSで洗浄すれば再生されるので何回でも使
用できる.また、ゲルの保存には0.02%NaNzを
含むPBSを用いることができる。
した後、PBSで洗浄すれば再生されるので何回でも使
用できる.また、ゲルの保存には0.02%NaNzを
含むPBSを用いることができる。
[実施例1
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する.
なお、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
なお、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
AALレクチンカラムの 製
活性化スペーサー(中性のlO原子のアーム、を導入し
たバイオラド社製Affigel 10に以下のように
してAALレクチンを導入し、4.6 mg/mlウェ
ットゲルのAALが導入°された固定化AALレクチン
を調製した.すなわち、アフィゲル10を4℃にし、ゲ
ルを均一にして1mlを測り取り、イソプロパツールを
浸したポリプロピレン性エコツカラムに入れた.インプ
ロパツールを流し出しだ後10mlの10mM酢酸ナト
リウム(pH4.5 )で洗浄した.洗浄後すぐ2倍量
のカップリングバッファーで洗浄し、AAL5mgを加
え混合した.4℃で一夜撹拌しながら反応させ、0.1
mlのIMエタノールアミンHCI fpH8)を加
え一時間反応させた。カラムから反応液を溶出させ.A
AL含量を測定したところ90%が結合していた.その
後、カップリングバッフyloml、20mlの20m
Mフコース、0.旧M PBSfpH7.21 10
mlで順次洗浄し、固定化AALレクチンとした。これ
を0.13 cll(直径)に7 cmのカラムに充填
し、固定化AALカラムを作製した。
たバイオラド社製Affigel 10に以下のように
してAALレクチンを導入し、4.6 mg/mlウェ
ットゲルのAALが導入°された固定化AALレクチン
を調製した.すなわち、アフィゲル10を4℃にし、ゲ
ルを均一にして1mlを測り取り、イソプロパツールを
浸したポリプロピレン性エコツカラムに入れた.インプ
ロパツールを流し出しだ後10mlの10mM酢酸ナト
リウム(pH4.5 )で洗浄した.洗浄後すぐ2倍量
のカップリングバッファーで洗浄し、AAL5mgを加
え混合した.4℃で一夜撹拌しながら反応させ、0.1
mlのIMエタノールアミンHCI fpH8)を加
え一時間反応させた。カラムから反応液を溶出させ.A
AL含量を測定したところ90%が結合していた.その
後、カップリングバッフyloml、20mlの20m
Mフコース、0.旧M PBSfpH7.21 10
mlで順次洗浄し、固定化AALレクチンとした。これ
を0.13 cll(直径)に7 cmのカラムに充填
し、固定化AALカラムを作製した。
腫瘍マーカーの回収
上記のようにして調製した固定化AALカラムに、CA
19−9 (rエルグ・CA19−9・キット」ミドJ
十字社製)、シアリルLevis X−i (S L
X「オーツカ」、天場製薬社製)、CEA(rCEA
・リアビーズ」、ダイナボット社製) 、 DI−PA
N−2(rデタミナDUPAN2J 、共和メデイック
ス社製)、 Lel′(rLevisリアビーズ」、第
一ラジオアイソトープ社製)、5CC(rscc・リア
ビーズ」、ダイナボット社製) 、 CA125(rセ
ントコアCA125 RIAキット」セントコア社製)
又はa−フェトプロティン(「α−フェト・リアビーズ
」、ダイナボット社製)の各腫瘍マーカーの標品を含む
溶液及び癌患者からの血清1 mlを室温下で流通さ
せ、アフイニティクロマトグラフィーを行なった。洗浄
液としては0.O1閘PBS 1pH7,0)を用い、
溶出液とじてはこのPBSに20mMのI、−フコース
を添加したものを用いた。
19−9 (rエルグ・CA19−9・キット」ミドJ
十字社製)、シアリルLevis X−i (S L
X「オーツカ」、天場製薬社製)、CEA(rCEA
・リアビーズ」、ダイナボット社製) 、 DI−PA
N−2(rデタミナDUPAN2J 、共和メデイック
ス社製)、 Lel′(rLevisリアビーズ」、第
一ラジオアイソトープ社製)、5CC(rscc・リア
ビーズ」、ダイナボット社製) 、 CA125(rセ
ントコアCA125 RIAキット」セントコア社製)
又はa−フェトプロティン(「α−フェト・リアビーズ
」、ダイナボット社製)の各腫瘍マーカーの標品を含む
溶液及び癌患者からの血清1 mlを室温下で流通さ
せ、アフイニティクロマトグラフィーを行なった。洗浄
液としては0.O1閘PBS 1pH7,0)を用い、
溶出液とじてはこのPBSに20mMのI、−フコース
を添加したものを用いた。
洗浄画分及び溶出画分をそれぞれ回収し、蒸留水に対し
て一夜透析しく分子量カットオフ20001 、凍結乾
燥し、上記PB51mlに溶解して、各腫瘍マーカーに
ついての市販の診断キットを用いて腫瘍マーカーを定量
した。結果を下記表に示す。
て一夜透析しく分子量カットオフ20001 、凍結乾
燥し、上記PB51mlに溶解して、各腫瘍マーカーに
ついての市販の診断キットを用いて腫瘍マーカーを定量
した。結果を下記表に示す。
上記表より明らかなように、癌性フコシル糖鎖を担持す
る腫瘍マーカーであるCA19−9、シアリルLewi
s X−i 、 CE A 、 DO−PAN−2、L
eb、 CA125については活性の大部分が溶出画分
に回収され、一方、フコシル糖鎖を有さないSCC及び
a−フェトプロテインについてはほとんどが洗浄画分に
回収された。これにより、固定化AALレクチンを用い
て癌性フコシル糖鎖を担持する腫瘍マカーの回収及び検
出を行なうことができることが明らかになった。
る腫瘍マーカーであるCA19−9、シアリルLewi
s X−i 、 CE A 、 DO−PAN−2、L
eb、 CA125については活性の大部分が溶出画分
に回収され、一方、フコシル糖鎖を有さないSCC及び
a−フェトプロテインについてはほとんどが洗浄画分に
回収された。これにより、固定化AALレクチンを用い
て癌性フコシル糖鎖を担持する腫瘍マカーの回収及び検
出を行なうことができることが明らかになった。
Claims (4)
- (1)固定化AALレクチンを有効成分とする、癌性フ
コシル化糖鎖を有する腫瘍マーカーを生じる癌のための
診断薬。 - (2)上記腫瘍マーカーはCA19−9、シアリルLe
wisX−i、CEA、DU−PAN−2、Le^b又
はCA125である請求項1記載の診断薬。 - (3)癌性フコシル化糖鎖を有する腫瘍マーカーを含む
流体を固定化AALレクチンに作用させ、固定化AAL
レクチンに吸着された腫瘍マーカーを回収することから
成る、上記腫瘍マーカーの回収方法。 - (4)上記腫瘍マーカーはCA19−9、シアリルLe
wisX−i、CEA、DU−PAN−2、Le^b又
はCA125である請求項3記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63233314A JP2721900B2 (ja) | 1988-09-18 | 1988-09-18 | 癌診断薬及びそれを用いた腫瘍マーカーの回収方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63233314A JP2721900B2 (ja) | 1988-09-18 | 1988-09-18 | 癌診断薬及びそれを用いた腫瘍マーカーの回収方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0283337A true JPH0283337A (ja) | 1990-03-23 |
| JP2721900B2 JP2721900B2 (ja) | 1998-03-04 |
Family
ID=16953187
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63233314A Expired - Fee Related JP2721900B2 (ja) | 1988-09-18 | 1988-09-18 | 癌診断薬及びそれを用いた腫瘍マーカーの回収方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2721900B2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0533834A4 (ja) * | 1990-06-15 | 1995-04-19 | Cytel Corp | |
| US5576305A (en) * | 1990-06-15 | 1996-11-19 | Cytel Corporation | Intercellular adhesion mediators |
| US5753631A (en) * | 1990-06-15 | 1998-05-19 | Cytel Corporation | Intercellular adhesion mediators |
| US6033663A (en) * | 1996-04-10 | 2000-03-07 | Neose Technologies, Inc. | Nucleic acids encoding GDP-Fucose pyrophosphorylase |
| WO2005083440A3 (en) * | 2004-02-19 | 2006-03-16 | Univ Yale | Identification of cancer protein biomarkers using proteomic techniques |
| WO2010010674A1 (ja) | 2008-07-22 | 2010-01-28 | 株式会社J-オイルミルズ | フコースα1→6特異的レクチン |
| WO2011105544A1 (ja) * | 2010-02-26 | 2011-09-01 | 地方独立行政法人大阪府立病院機構 | 腫瘍マーカー、それに対する抗体、その検出キット及びその検出方法 |
-
1988
- 1988-09-18 JP JP63233314A patent/JP2721900B2/ja not_active Expired - Fee Related
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