JPH0286771A - 生体触媒の製法、生体触媒及び光学活性化合物の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、当初は存在しなかった立体選択的酵素活性？
有する生体触媒の製法に関する。

従来の技術 当初は存在しなかった立体選択的酵素活性會有する生体
触媒金製造するための方法は従来記載されていなかった
。

本発明によりその方法が達成される。殊に、本方法はＬ
−又はＤ−立体選択的酵素活性、例えば光学活性アミノ
酸の製法で使用することのできるＬ−又ｉ１１．Ｄ−ア
ミノーペグテダーゼ活性（α−Ｈ−及びα−アルキル置
換されたアミノ酸の両方に関して）、Ｌ−又はＤ−ヒダ
ントイナーゼ活性、Ｌ−又はＤ−カルバモイラーゼ活性
、Ｌ−又はＤ−アシラーゼ活性、Ｌ−又はＤ−エステラ
ーゼ活性、Ｌ−又はＤ　＝　ＩＪパーゼ活性及びＬ−又
はＤ−トランスアミナーゼ活性を有する生体触媒の製造
に関する。本明細省中でアミノ酸とはα−Ｈ−又はα−
アルキル置換アミノ酸もしくはその誘導体９例えばエス
テル。

カルバモイル化合物、ヒダントイン化合物及びＮ−アシ
ル化合物である。

このような立体選択的酵素活性はＬ−又はＤ−配置の光
学的に純粋な化合物の生成に極めてｌ要である。立体選
択的酵素活性の適用についての概略はＢｉｏｃｈｅｍ、
　Ｅｎｇ、　＆　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ。

６３巻、１０９〜１１７頁（１９８６年つに記載されて
いる。これらの化合物は薬剤、農薬等として又はこれら
全製造する際の中間体として使われる（　Ｅ、　Ｍ、　
Ｍｅｉｊｅｒ及びその他共著。

Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　：　”
　Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ　ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　５
ｙｎｔｈｅｓｅｓ’　　＊　Ｎｏｏｒｄｗｉｊｋｓｒｈ
ｏｕｔ　、　４月１４〜１７　＋　１９８５　、ｔ　Ｅ
ｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｓＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ
　＠照〕。

光学活性中心を有する多数の化学的に生成した化付物は
光学異性体のラセミ混合物として得られる。一般に、２
つの光学異性体の１つは所謂用途において明瞭な作用効
果を有するが、他方の光学異性体は活性を示さないか又
は実質的に活性を示さないかあるいは不所望な副作用を
示すことがある。それ故、これらの化合物の立体選択的
製法が必要である。一般に、ラセミ混合物の分割は困難
であシ、その際にリサイクルせずにかつラセミ化工程な
しにラセミ体の半分だけ全使用して所望の異性体を得る
ことができる。酵素法ｔ、該方法の反応条件が穏やかで
ありかつ生体触媒の選択性が高いので、光学活性生成物
の生成に通用すると有利である。この点で、立体選択性
は殊に重要である〔例えば”　Ａｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍ
、　’　ｉ　Ｑ　０巻、６４０〜６６１頁（１９８８年
〕参照〕。前記の活性を有する天然酵素は非立体選択活
性であるか又はＤ−又はＬ−選択活性ｋ　’４＋する。

天然酵素が立体選択性であるが使用には好ましくない異
性体全生成する場合、反対の立体選択的（対掌の）活性
を有する酵素を得る必要がおる。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は当初は存在しなかった立体選択的酵素活
性を有する生体触媒の製法を開示することである。

課題を解決するための手段 当初は存在しなかった立体選択的酵素活性を有する生体
触媒が、微生物を連続培養においてＣ−及び／又はＮ−
源について好適な制限条件（選択的圧力）全適用して、
該微生物が当初は対応する立体選択的酵素活性全欠損し
ていた安定な基質の存在において成長させることによジ
１生体内”で生成しうろことが判明し驚異的であった。

当初は存在しなかった立体選択的酵素活性を有する生体
触媒上生成するための本発明方法は、立体選択的酵素活
性七有する微生物を連続培養において好適なＣ−及び／
又はＮ−制限条件下に、該微生物が当初は立体選択的酵
素活性を欠損していた光学活性を有する安定な基質の存
在において、該微生物が新しい立体選択的酵素活性によ
って前記の基質ｉｃ−及び／又はＮ源として使用するま
で成長させて、連続培地のバイオマスを増加させること
を特徴とする。

このようにして、当初存在しなかつ九立体選択的酵素活
性を有する生体触媒を生成する念めの、広範に適用し得
る簡単な方法が得られる。

微生物を連続培養においてＣ−及び／又はＮ−制限条件
（選択的圧力〕下に成長させる方法は数十年間例えば生
理的調節現象についての開発研究分野で公知であった。

この方法において、変性された酵素活性のために恒温保
持条件に一層良好に適合する微生物が選択される。成長
する微生物、植物及び動物の細胞における連続培養の適
用に関しては、　バイオテクノロジー包括的処理（Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　、　Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓ
ｉｖｅＴｒｅａｔｉａｓ　）　’　ｓ全８巻、Ｅ（、Ｊ
、レーム（Ｒａｈｍ）及びＧ、リード（Ｒｅｅｄ　）編
、八、フイーヒタ（Ｆｉｅｃｈｔｅｒ　）著、第１巻、
第７章”微生物。

植物及び動物の細胞のバッチ及び連続培養（Ｂａｔｃｈ
　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏ
ｆ　Ｍｉｃｒｏｂ−１ａｌ　、　Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　
Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　）″に記載されている。連
続培養における微生物選択についての優れた文献はＪ、
　Ａｐｐｌ、　Ｂａｃｔ、　　、　４３巻、１〜２４頁
（１９７７年）である。Ｍｉｃ−ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ
ｓ　　ａｓ　　ｍｏｄｅｌ　　ｇｏｒ　　Ｓｔｕｄｙｉ
ｎｇ　　ｅｖｏｌｎ−ｔｉｏｎ　’　　（Ｒ，Ｐ、Ｍｏ
ｒｔｌｏｃｋ　　、Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ　　１ｎｅｖ
ｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｂｉｏｌｏｇｙ　、　ＰＬｅｎ
ｕｍ　Ｐｒｅｓｓ出版。

ニューヨーク在、１９８４年）の第２章においてバート
リー（、Ｈａｒｔｌｅｙ　）は、連続培養における恒温
保持は、過剰生産する突然変異体及び変性した基質特異
性を有する突然変異体の両方全書るのに使用できると明
らかにしている。しかしながら、当初存在しなかった立
体選択的酵素活性？有する生体触媒を生成し得る基質は
使われなかった。

変性した酵素活性を有する生体触媒？生成する前記の“
生体内”法に加えて”試験管内”法も使われる。例えば
、ＵＶ照射、アルキル化試薬（例えばニトロソグアニシ
ン）による処理又は組換ＤＮＡ法（例えば部位特異的突
然変異誘発を介するモデル化〕のような古典的な遺伝的
方法である。これらの方法、殊に古典的方法において、
望ましい活性を有する生体触媒上、突然変異実験にもた
らされる多量の微生物ｔスクリーニングすることにより
見出す研究がなされている。勿論、このような方法は困
難でありかつ時おシ成功するに過ぎない。突然変異誘発
及びスクリーニング法については、例えば”Ｅｎｚｙｍ
ｅＭｉｃｒｏｂ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、　　＊第６巻、３〜
１０頁（１９８４年）及び第９巻、１９４〜２１６頁（
１９８７年〕に記載されている。これまでは、当初は存
在しなかった立体選択的酵素活性？有する生体触媒は１
試験管内”法のいずれによっても得られなかった。

殊に、本発明による方法は、光学活性アミノ酸の製法に
使用することのできる立体選択的酵素活性を有する生体
触媒の生成に好適である。

好適な基質としては、微生物が元来立体選択的酵素活性
を有していなかった光学活性アミノ酸を便用する。

例えば、立体選択的り一活性（例えばＬ−アミ、）酸ア
ミド七相応するＬ−アミノ酸に変換することにより）を
有する微生物を連続培地中でＮ−制限条件下に相応する
Ｄ−アミノ酸アミド（これに対して該微生物は元来立体
選択的酵素活性會有していなかった）の存在において培
養することができる。このようにして、元来存在する立
体選択的り一活性に加えて立体選択的り一活性ヶも有す
る生体触媒が得られる。光学活性アミノ酸金製造する方
法に適用するという点では、もっばら新しい立体選択的
酵素活性ケ有する立体選択的酵素活性を有する生体触媒
を取得する必要がある。これは、酵素精製あるいは古典
的な遺伝学的技術又は組み換えＤＮＡ技術のような（公
知の）方法により行なうことができる。

本発明方法は稽々の立体選択的酵素活性を生成するのに
好適である。選択すべき基質の型。

培地及び制限条件は、生成すべき活性に左右される。こ
のことは、Ｃ−及び／又はＮ−制限を選択する際に異な
る立体選択的酵素反応の化学に関して十分な配慮をする
ことによｐ当業者であれば容易に決定することができる
。

Ｃ−及び／又はＮ−制限条件とは、微生物のＣ−及び／
又はＮ源が、その濃度の低下によジ存 バイオマスが減少するような濃度で及在する条件である
。Ｃ−及び／又はＮ源の特性は、存在する立体選択的酵
素活性に相応してＤ−、Ｌ−又はＤＬ−選択性であるか
又は非選択性であってもよい。非選択的Ｃ−又はＮ源の
例はそれぞれグルコース及びピルベートあるいはアンモ
ニア、ニトレート及び尿素である。本発明による方法で
は、選択されたＣ−及び／又はＮ−制限条件は既に設定
されておりかつ開始状態で安定化されている。この開始
状態の安定化は制限条件下の微生物の特異的な成長速度
に左右され、−船釣には少なくとも１０世代時間後に得
られる。世代時間とは細胞数が倍加する時間である。

一般に、これは至適条件下に少なくとも１５〜６０分間
である。しかしながら、選択した培地の組成及び他の条
件、殊に連続培養における稀釈率に相応して、世代時間
’ａ−１０〜２０時間に長くすることができる。微生物
が対応する立体選択的酵素活性をまだ有していないその
光学活性を有する安定な基質も、欠乏するＣ−及び／又
はＮ源と共に、既に安定化された開始状態で存在してい
てよい。

例えば、立体選択的アミノペプチダーゼ活性はＮ制限条
件下に、例えばＣ源としてグルコース全便って生成する
ことができる。Ｄ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸の両方を
代謝することのできる条件（例えばフェニルグリシンの
場合〕ではアミノ酸アミドｔ１例えばＮ源としての無制
限濃度のアンモニウム塩の存在において制限Ｃ源として
使用することもできる。

立体選択的ヒダントイナーゼ活性及び／又はカルバモイ
ラーゼ活性はＣ−制限条件下に並びにＮ−制限条件下に
生成することができる。同様のことが立体選択的トラン
スアミナーゼにも該当する。立体選択的アシラーゼ活性
はＣ−制限条件下に生成することができ、その際に形成
されたカルボン酸″ｋＣ−制限基質として使用する。立
体選択的リパーゼ及びエステラーゼ活性はアシラーゼ活
性と同じようにして発現させることができ、その際に形
成され念カルボン酸に加えて、生成した（ポリ〕アルコ
ールも使用することができる。

良好な結果を得るには、連続培養における微生物が常に
Ｃ−及び／又はＮ−制限条件下に存在することが重賛で
ある。

制限するＣ−及び／又はＮ源の濃度が、制限がちょうど
起るＣ−及び／又はＮ源の濃度よりも少なくとも１０％
低いようなＣ−及び／又はＮ−制限条件全適用すると有
利である。制限するＣ−及び／又はＮ源に加えて、微生
物が当初は対応する立体選択的酵素活性を有していなか
った光学活性を有する安定な基質が存在しなければなら
ない。基質の安定性は、化学的安定性（つ１り基質は所
定の恒温保持条件下に笑質的な副反応を展開しないつ及
びエナンチオマー安定性（つま９ラセミ化が惹起されて
はならない）？包含する。更に、基質（あるいはその誘
導体）は、生成しようとする立体選択的酵素活性以外の
活性によってＣ−及び／又はＮ源として利用されないよ
うなものを選択すべきである。

これもまた当業者が容易に確定することができる。例え
ばヒダントイナーゼの場合、Ｄ−又はＬ−ペンシルヒダ
ントインが恒温保持条件下に、但しｐＨ７以下で安定な
基質である。

例えば、Ｄ−α−Ｈ−アミノペプチダーゼ活性の生成に
は属：アルカＩＪ　ｒネス（Ａ、ｌｃ改１１ｇｅ−ｎｅ
ｓ　）　、アルトロパクタ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
　）　、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）
　、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）　＋クリプトコッ
クス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏ−ｃｃｕｓ　）　、フラボバク
テリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉ−ｕｍ　）　、ミ
コバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）。

ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ　）　、プソイドモナス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）　、　０ドコツクス（Ｒ
ｈｏｄｏｃｏ−ｃｃｕｓ　）又はスタフイロコツクス（
５ｔａｐｈｙｌｏ−ｃｏｃｃｕｓ　）に包含されるＬ−
α−Ｈ−アミノペプチダーゼ活性？有する微生物全使用
することができる。Ｌ−α−Ｈ−アミノ酸アミドのＮ−
制限条件下又は尿素、ニトレート、アンモニウム塩等の
ような非特異的Ｎ源下の連続培養ではＤ−α−Ｈ−アミ
ノ酸アミド會安定な基質として使用することができる。

Ｎ−制限条件を連続培養において維持すれば、安定なり
一及びＬ−（χ−Ｈ−アミノ酸アミドの混合物上使用し
得ることは勿論である。

Ｄ−α−Ｈ−及びＬ−α−Ｈ−アミノペプチダーゼ活性
を有する生体触媒の生成で出発物質として使用する微生
物に関しては、それぞれＬ−α−Ｈ−又はＤ−α−Ｈ−
アミノペプチダーゼ活性を有する微生物を使用すると有
利であり、微生物はプソイドモナス鵬、殊にプソイドモ
ナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ
　）　ｔｊｌｉに含まれる。優れた結果はプソイドモナ
ス・プチダＡＴＣＣ１２６３３で得られる。

Ｄ−及びＬ−アミノペプチダーゼの生成について特開昭
６１−１８７７８８号公報及び特公昭６１−１８７７８
９号公報に記載されていることに注意すべきであゐ。該
文献には、出発物質としてＬ−及びＤ−アミノペプチダ
ーゼ活性ｒ有する微生物を使うことによυ、このＬ−又
はＤ−活性における一時的な上昇が得られる生体触媒の
生成が記載されており、その際に永久的に上昇した立体
選択性についての問題は提起されていない。それ故、前
記の方法は、連続培養においてＣ−及び／又はＮ−制限
条件下に、当初は存在しなかった立体選択的酵素活性會
有する生体触媒全生成するものではない。

Ｄ−α−アルキル−又はＬ−α−アルキルアミノペプチ
ダーゼ活性を有する生体触媒の生成に当つ１は、例えば
前記の属に包含されるが、但しそれぞれＬ−α−アルキ
ル−又ＵＤ−α−アルキルーアミノペプチダーゼ活性勿
有する微生物全出発物質として使用することができる。

この場合には、ミコバクテリウム属、殊にミコバクテリ
ウム・ネオアウルム種の微生物を使うと有利である。優
れた結果はミコバクテリウム・ネオアウルムＡＴＣＣ２
５７９５によって得られる。この場合には当初存在しな
かった立体選択的酵素活性を有する生体触媒は連続培養
においてＮ−制限条件下にそれぞれ安定なＬ−α−アル
キル−又ＵＤ−α−アルキルアミノ酸（あるいはその混
合物）の存在において生成することができる。

Ｄ−又はＩ、−トランスアミナーゼ活性金有する生体触
媒の生成に当っては、Ｌ−又はＤ−トランスアミナーゼ
活性を有する前記の属の微生物上使用することができる
。この場合は、プソイドモナス属、殊にプソイドモナス
・プチダ種の微生物を使用すると有利である。優れた結
果はプソイドモナス・プチダＮＣＩＢ　１２５６５で得
られる。当初は存在しなかつ九立体選択的酵素活性の生
成は、Ｃ−制限条件下並びにＮ−制限条件下に行なうこ
とができる。

ヒダントイナーゼ、カルバモイラーゼ、アシラーゼ−、
リパーゼ−及びエステラーゼ活性を有する生体触媒と同
じように生成する際にも、例えばそれぞれのＤ−又はＬ
−立体選択的酵素活性を有する前記の属の微生物ケ使用
することができる。微生物がＤ−又はＬ−立体選択的酵
素活性のいずれを有するかは当業者が容易に決定するこ
とができる。Ｃ−及び／又はＮ源に関する好適な制限条
件は常に適用しなければならないことは明らかである。

当初存在しなかった立体選択的酵素活性を有する生体触
媒を生成するための前記の例は可能性？包括的に表わし
たものではない。Ｃ−及び／又はＮ−制限条件と安定な
基質との組合せの例もまた可能性すべてケ記載したもの
ではない。

しかしながら好適な選択は当業者であればすることがで
きる。

恒温保持は、連続培養での例えばケモスタット中で、一
般に温度２５〜６０°Ｃ，ｐＨ３〜１０で行なう。一般
に、恒温保持は水性媒体中で行なうが、しかし時々は（
例えばリパーゼ及びエステラーゼの場合〕有機溶剤中で
行なうこともできる。

培養に使用しかつ微生物が開始時に対応する立体選択的
酵素活性で有していない安定な基質は開始状態で既に存
在していてもよいが、連続培養において１選択した制限
条件下に行なう恒温保持では絶対に存在しなければなら
ない。例えば、安定な基質の固定した濃度を選択するか
又は徐々に（連続的か又は段階的に、安定な基質の濃度
を１回で５〜１０％変動すると有利である）この濃度を
高めることにより達成することができる。

それぞれの変動は、いずれの場合にも新しい状態が各変
化の後で安定化するように行なうべきである。濃度？段
階的に変化させる場合には、一般に各段階は新しい安定
な状態全達成するのに少なくとも１０回の世代時間の期
間を必要とする。これは、例えばバイオマス曲線を確定
することにより決定することができる。安定な範囲では
バイオマスは一定である。

安定な基質の固定された濃度全選択するかもくしは濃度
を保々に又は段階的に変動させるかどうか、また段階の
程度は、生成すべき立体選択的酵素活性を得るのに必要
な調節変化についての微生物の生理特性をベースとして
決定することができる。

バイオマスの減少が伴なう安定な開始状態の達成後ある
いは制限するＣ−及び／又はＮｒｉ、の濃度が更に減少
した後でバイオマスが増加し始めると、制限を補償する
ように微生物が存在する安定な基質？Ｃ−及び／又はＮ
源として使用できるような状態が直ちに達成された。好
適な検定において、微生物が当初は持っていなかったそ
の基質に対する立体選択的酵素活性？有するという小火
により前記の現象が惹起されることが確認さｎる。

このような恒温保持時間の最終的期間は数週間乃至数カ
月間にわたって変動する。

実施例 次に、本発明？生体触媒の製造実験及びその後で行なわ
れた生体触媒全ベースとする実験について詳説するが、
これに限定さ扛るものではない。

水ｉｏｍｇ中のＬ−フェニルグリシンアミド０．９ｇを
唯一のＮ源として添加したＹＣＢ　（１０ｇ／　ｌ　：
　Ｙｅａｓｔ　Ｃａｒｂｏｎ　Ｂａ５ｅ　、　Ｄｉｆｃ
ｏＲ）　０．９１ｋ２をバイオリアクタ（ＭＢＲ、Ｗｅ
ｔｚｉｎｋｏｎ）中に装入した。ＹＣＢ培地は予め１２
０℃で１５分間滅菌し、Ｌ−フェニルグリシンアミドは
０．２μｍの濾過器？通して濾過することにより滅菌し
た（加熱滅菌による自動加水分解全回避するため〕。

使用するＬ−フェニルグリシンアミドは、ラセミ体ＤＬ
−フェニルグリシンアミド混合物を米国％許諾３９７１
７００号明細曹に記載烙れているように酵素分割にもた
らし、生成したＬ−フェニルグリシンとＤ−フェニルグ
リシンアミドと？米国特許第４１７２８４６号明細曹に
記載されているように分離し、このようにして得られた
Ｌ−フェニルグリシン奮塩化チオニル及びメタノールに
よジメチルエステルに変換しかつこのメチルエステル１
ＮＨＪを用いて光学的ＫＭ粋なＬ−フェニルグリシンア
ミドに変換することにより得られた。培地に微生物ブン
イドモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３の培養液１００
ｍｚ２３０°Ｃ、Ｐ）４７．０で攪拌（６００ｒｐｍ　
）及び空気２１／ｈの供給下に接種し友。微生物の成長
曲線は光学密度（ＯＤ　６２０　ｎｍ　）　ｆ測定する
ことにより作成し次。最大特異的成長率（μｍａｘ　）
は曲線の指数部分から明らかなように０．０７２　ｈ−
１であった。

定常期に入ったら、連続培養を同じバイオリアクタ中で
μｍａｘ　’／２に相当する稀釈率０．０３６ｈ−１で
開始した（培地に接種してから２２時間後）口 １時間当り同じＹＣＢ溶液（１０，９／［）３６ｍ６及
び水中の１　％　（ｗ／ｖ　）　Ｌ−フェニルグリシン
アミド溶液４ｍ３？バイオリアクタ？更に添加し皮。こ
れ？全４日間継続した。

このようにして新しい状態に達し、この際に光学密度（
ｏｐ　６２０　ｎｍ　）の測定により立証されるように
バイオマスは一定であった。

ＮＲとしてのＬ−フェニルグリシンアミドの供給？、従
前使用したＬ−フェニルグリシンアミド溶液と同じよう
に滅菌した水中の１％（Ｗ／ｖ）　Ｄ　、　Ｌ−フェニ
ルグリシンアミド溶ｉ　４　ｍｅ／ｈに代えた。ＹＣＢ
浴液の供給は３６ｍｅ　／　ｈに維持した。

これもまろ４日間継続しｆｃｃ　ここではＮ−市ｌｊ限
は惹起されなかった。１チ（ｗ／ｖ）　Ｄ　、　Ｌ−フ
ェニルグリシンアミド浴液の供給弁は２，５．れ／ｈＫ
減少させた。次の期間にＮ−制限が生じたのが認められ
た。それというのも測定するとバイオマスが減少したか
らであった。

供給量ｋ　２．５　！ｎＬ／　ｈ　（ｔＣ変えてから６
日後に完全に安定な状態に入った。この状態でのＮ源と
してのＬ−フェニルグリシンアミドの濃度は、Ｎ　−Ｉ
Ｉ限がちょうど起る８度より２５Ｌｙ６低かったＣ培地
中に言１れでいたＤ−フェニルグリシンアミド？Ｎ源と
して微生物は使用しなかった。

それというのもこの微生物はこの安定な基質に対する（
立体選択的）酵素活性才有していないからである。

注： Ｄ−（選択的〕アミノペプチダーゼ活性の欠損は酵素検
定で認められ、その際にＤ−フェニルグリシンアミド（
ｐＨ８，５）の１％（ｗ／ｖ）水溶液５彪及び連続培地
から遠心分離及び洗浄により得られた湿潤細胞物質１０
０〜を攪拌容器中で１６時間４０°Ｃで反応させた。反
応生成物としてのＤ−フェニルグリシンによる、酵素的
加水分解の形跡は認められなかった。変換率（１〜２％
）は、細胞物質ｋｍ加しなかった空試験の場会と同じレ
ベルであった。

前記の１で得られた連続培地？、当初は存在しなかった
立体選択的酵素活性を有する生体触媒全生成するのに使
用した。ＹＣＢ溶液（１０Ｊ９／１）３６１ｒＬｔ／ｈ
及び１％（Ｗ／Ｖ）　Ｄ　Ｉ　Ｌ−フェニルグリシンア
ミド水溶液２．５成の供給を同じ恰幌保持条件（３０°
（Ｌｐｌ（７−０、６０Ｏｒｐｍ。

空気供給ｔ２１／ｈ）下に継続した。

バイオマスは、培地成分の供ｌ＠に短時間中断した結果
として若干の彷徨変異が認められたもののほぼ一定であ
った。

該条件下の連続培養において７２日間恒温保持した後で
、バイオマスは明らかに増加した。

恒温保持會更に４日間同じ条件下に継続し次。

この間安定な状態に再度式つ友ようであった。

当初は存在しなかつ几立体選択的酵素活性の存在は次の
実験によジ確認した： Ａ、前記の２．に記載の実験により培養した微生物を連
続培地から採取し、かつ培地として寒天、　ＹＣＢ　（
Ｉ　ＣＪ９／ｌ　）及びＤ−フェニルグリシンアミド（
１ｇ／／）ｋ有するプレート上にストリーク（Ｓｔｒθ
ａｋ　）　した。恒温保持上継続しかつこれが純培地で
あることが認められたときに、傾斜配置のチューブ（こ
れもまた培地としてＹＣＢ　／　Ｄ−フェニルグリシン
アミド紮含有する〕に接穐し友。微生物ｉ　ＮＣＩＢに
よりグツイドモナス・プチダと同定し友。培地（ＹＣＢ
　。

ｉｏ、！＋’／ｌ；Ｄ−フェニルグリシンアミド、１ｇ
／ｌ　；ｐ１４７．０　）　５００成に傾斜配置したチ
ューブから前記のＡに記載の方法により得られた微生物
を接種した。Ｄ−フェニルグリシンアミドｄ、Ｄ、Ｌ−
フェニルグリシンアミドを米国特許諾３７９１７００号
明細書に記載されているように酵素分割し、反応生成物
を米国％行第４１７２８４６号明細書によ９分離し、か
つその後このようにして得られたｌ）　−７工：　ルｆ
リシナード及びベンズアルデヒドのシッフ塩基から酸加
水分解によりＤ−フェニルクリシンアミドケ回収するこ
とによっても得られた。恒温保舟全−晩２８°Ｃで行な
った。七の後、湿潤細胞物質が遠心分離及び洗浄によｐ
得ら？した。

多数の酵素検定において、１回当９１２０ｒｌｌＱのこ
の湿潤細胞物質を基質としてのＤ−フェニルクリシンア
ミド又はＬ−フェニルグリシンアミドを含有する１　％
　（Ｗ／Ｖ）水溶液５Ｍ中で生体触媒として使用した。

３７℃及び−８，５で２０時間反応させた後で、法衣に
記載の変換率が測定され之（キラルＨＰＬＣＩ／Ｃよす
〕。

基質　　　　　　生成物　　　　　　変次率＊）この試
験により、本発明による方法を適用しかつ専らＬ−アミ
ノ酸アミドのＬ−アミノペプチダーゼ活性を有するプソ
イドモナス・プチダＡＴＣ０１２６３３ケ使うことによ
って、Ｌ−フェニルグリシンアミド及びＤ−フェニルグ
リシンアミドの両方全加水分解し得るグツイドモナス・
プチダ変異体が得られることが明らかになる。

Ｂ、同様に、Ｄ−又はＬ−フェニルグリシンアミドの代
りに連続的にＤ−ホモフェニルアラニンアミド、Ｄ−バ
リンアミド及びＤ−ロイシンアミド音用いて酵素検定奮
行なった。

この場合にも、これらのＤ−アミノ酸アミドに相応する
Ｄ−アミノ酸への酵素的加水分解が認められた（キラル
ＴＬＣ分析にょす〕。これは、得られた生体触媒が芳香
族並びに脂肪族のＤ−アミノ酸アミド全加水分解し得る
こと？示す。

Ｃ１種々の組成を有する培地（ｐｉ（７，０）　ｋ傾斜
配置チューブ（前記のＡ参照）から接触し、かつ定常状
態になるまで２８°Ｃで恒温保持した。

遠心分離しかつ洗浄した後で、１回当り１２０〜の湿潤
面１胞物質を種々の酵素検定で使用して、Ｄ−フェニル
グリシンアミド＆［Ｌ−７エニルグリシンアミドに対す
る＃未活性全測定した。

それぞれ相応するアミドの１　％　（Ｗ／Ｖ）水溶液５
ｍε全使用しかつ反応時間６７°Ｃで２０時間？適用し
た。キラルＴＬＣにより次の結果が得られた。

この試験によシ、Ｎ源とは関係なく常に形成されかつそ
の徴候が現われるＬ−アミノ酸アミドに対する活性とは
異なり、Ｄ−アミノ酸アミドに対する酵素活性は培地が
Ｄ−アミノ酸アミド七含有する場合にのみ誘発されかつ
その徴候が現わｎることが認められる。それぞれがＮ−
調節性及び立体選択性を有する２つの異なる酵系系に関
することが明らかである。

Ｄ、３０１−バイオリアクタ（ＭＢＲ、Ｗｅをｚｉｋｏ
ｎ　）中で、ＹＣＢ　／　Ｄ−フェニルグリシンアミド
培地（それぞれ１０９／ｌ及び１９／ｌ　；ｐ）１７．
０　）に前培養した培地（前記の２で得られた微生物を
使用する傾斜配置チューブで得られた同じ組成）２１ｋ
接糧した。−晩２８°Ｃで恒酩保持した後で、湿潤細胞
物質上限外濾過、次いで遠心分離及び洗浄により回収し
た。細胞を含まない抽出物はこの湿潤細胞物質から５Ｑ
ｍＭトリス・Ｈ２Ｓｏ　、緩衝液（ｐ８８．０　）中で
プレンチプレス破壊により次いで遠心分離することによ
り得られた。細胞？含まない抽出物をプロタミンサルフ
ェート沈殿（最終濃度０．２　％　）、次いで遠心分離
によｐ前精製した。このようにして得られた上澄みを疎
水的相互作用カラム、つま、！９０．８　Ｍ硫酸アンモ
ニウムで飽和したフェニルセファロースカラム中で更に
精製した。１０ｍＭトリス・Ｈ２ＳＯ，緩衝液（−８，
０）で溶離後、このようにし得られた溶離液上地の疎水
的相互作用カラム、即ちフェニルセファロースカラム中
でＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｑｕｉ
ｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ−ｐｈｙ　）によシ更に精
製した。このフェニルセファロースカラムから溶出液０
．５成が得られ之ら、ＰＨ８，０の５０ｍＭトリス・Ｈ
，Ｓｏ、出発緩衝液中の１．７Ｍ硫酸アンモニウム溶液
及び最終緩衝液として５３　ｍＭ　）リス・Ｈ２ＳＯ４
溶液（ｐｉ−１８，０）を用いて傾斜溶離分析を行なっ
た。このように（、［、専らＬ−アミノペプチダーゼ活
性を有する）２クシヨン及び実質的にＤ−アミノペプチ
ダーゼ活性を有するフラクション七分離した。

Ｄ−アミノペプチダーゼ活性を有するフラクションは低
い割合でＬ−アミノペプチダーゼ活性を有する。それと
いうのもこれらの蛋白質の疎水特性により集塊するから
である。このことは、異なるフラクションの変性ｒルミ
気泳動で得られた類似のバンドパターンによって確証さ
れた。

それ故、Ｄ−及びＬ−選択的アミノペプチダーゼ活性を
有する酵素が異なる立体選択的酵素活性ケ有する異なる
蛋白質であることが明らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、当初は存在しなかつた立体選択的酵素活性を有する
   生体触媒を製造する方法において、立体選択的酵素活性
   を有する微生物を連続培地中で好適なＣ−及び／又はＮ
   −制限条件下に、該微生物が当初は立体選択的酵素活性
   を欠損していた光学活性を有する安定な基質の存在にお
   いて、該微生物が新しい立体選択的酵素活性によつて前
   記基質をＣ−及び／又はＮ源として使用するまで成長さ
   せて、連続培地のバイオマスを増加させることを特徴と
   する生体触媒の製法。 ２、安定な基質として、微生物が当初は立体選択的酵素
   活性を欠損していた光学活性アミノ酸を使用する請求項
   １記載の方法。 ３、培養のために、Ｌ−α−Ｈ−、Ｌ−α−アルキル−
   、Ｄ−α−Ｈ−、Ｄ−α−アルキルアミノペプチダーゼ
   ；Ｌ−ヒダントイナーゼ、Ｄ−ヒダントイナーゼ；Ｌ−
   カルバモイラーゼ、Ｄ−カルバモイラーゼ；Ｌ−トラン
   スアミナーゼ、Ｄ−トランスアミナーゼ；Ｌ−エステラ
   ーゼ、Ｄ−エステラーゼ；Ｌ−リパーゼ、Ｄ−リパーゼ
   ；Ｌ−アシラーゼ、Ｄ−アシラーゼの群類からの立体選
   択的酵素活性の１つを有する微生物を使い、かつ安定な
   基質としては、微生物が当初は立体選択的酵素活性を欠
   損していた光学活性アミノ酸を使用する請求項１又は２
   記載の方法。 ４、培養のために、属：アルカリゲネス、アルトロバク
   タ、アスペルギルス、バチルス、クリプトコツクス、フ
   ラボバクテリウム、ミコバクテリウム、ノカルジア、プ
   ソイドモナス、ロドコツクス又はスタフイロコツクスの
   １種であるＬ−α−Ｈ−アミノペプチダーゼ活性又はＤ
   −α−Ｈ−アミノペプチダーゼ活性を有する微生物を使
   用する請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。 ５、プソイドモナス属の微生物を培養に使う請求項４記
   載の方法。 ６、プソイドモナス・プチダ種の微生物を培養に使う請
   求項５記載の方法。 ７、プソイドモナス・プチダＡＴＣＣ１２６３３を培養
   に使う請求項６記載の方法。 ８、属：アルカリゲネス、アルトロバクタ、アスペルギ
   ルス、バチルス、クリプトコックス、フラボバクテリウ
   ム、ミコバクテリウム、ノカルジア、プソイドモナス、
   ロドコツクス又はスタフイロコツクスの１種であるＬ−
   α−アルキル−アミノペプチダーゼ活性又はＤ−α−ア
   ルキル−アミノペプチダーゼ活性を有する微生物を培養
   のために使用する請求項１から３までのいずれか１項記
   載の方法。 ９、ミコバクテリウム属の微生物を培養に使用する請求
   項８記載の方法。 １０、ミコバクテリウム・ネオアウルム種の微生物を培
   養に使用する請求項９記載の方法。 １１、ミコバクテリウム・ネオアウルムＡＴＣＣ２５７
   ９５を培養に使用する請求項１０記載の方法。 １２、属：アルカリゲネス、アルトロバクタ、アスペル
   ギルス、バチルス、クリプトコックス、フラボバクテリ
   ウム、ミコバクテリウム、ノカルジア、プソイドモナス
   、ロドコツクス又はスタフイロコツクスの１種であるＬ
   −トランスアミナーゼ活性又はＤ−トランスアミナーゼ
   活性を有する微生物を培養に使用する請求項１から３ま
   でのいずれか１項記載の方法。 １６、プソイドモナス属の微生物を培養に使用する請求
   項１２記載の方法。 １４、プソイドモナス・プチダ種の微生物を培養に使用
   する請求項１６記載の方法。 １５、プソイドモナス・プチダＮＣＩＢ１２５６５を培
   養に使用する請求項１４記載の方法。 １６、請求項１から１５までのいずれか１項記載の方法
   により得られる生体触媒。 １７、請求項１６により得られた生体触媒を使用する光
   学活性化合物の製法。