JPH0286777A

JPH0286777A - サル膵臓エラスターゼｉ

Info

Publication number: JPH0286777A
Application number: JP63238292A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Takiguchi; 滝口　洋; Ichiro Kawashima; 一郎川島
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1988-09-22
Filing date: 1988-09-22
Publication date: 1990-03-27

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、サル膵臓エラスターゼ１１該サル膵臓エラス
ターゼ■をコードするＤＮＡ　、該ＤＮＡを含有する組
換えＤＮＡ発現ベクター及び該組換えＤＮＡ発現ベクタ
ーで形質転換せしめた宿主に関するものである。

本発明によシ、血管内に蓄積するエラスチンを特異的に
加水分解するサル膵臓エラスターゼＩを大量に得ること
が可能になり、動脈硬化予防剤又は治療剤としての利用
が期待される。

従来の技術エラスターゼはセリン・プロテアーゼの一種であシ、繊
維状の不溶性蛋白質であるエラスチンを加水分解する酵
素である。エラスチンは、高等動物の結合組織、鍵、大
動脈外皮、頚索の構成成分であシ、ペプシン、トリプシ
ンによシわずかに分解される。

Ｂａ１ｏ’らは、動脈硬化症の研究途上で血管壁のエラ
スチン繊維の分解を見出し、１９４９年にその分解酵素
の存在を推定した。（Ｂａ１ｏ’　、　Ｊ　ｅ　ａｎｄ
Ｂａｎｇａ　、　Ｉ　＊　：　Ｓｅｈｗｅｉｚ　Ｚ、Ｐ
ａｔｈｏｌ　ｅ　Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ　ｍ　、１２゜３
５０（１９４９）ｍｌ、続いてＢａｎｇａらは、１９５
２年、エラスチンを特異的に分解する酵素を膵臓中に見
出し、結晶状に精製してエラスターゼと命名した［　　
Ｂａｎｇａ　　、　　Ｉ　　＊　　：　　Ａｃｔａ　　
Ｐｈｙａｉｏｌ　　壷　Ａｃａｄ　　＊　　Ｓｅｔ　　
、Ｈｕｎｇ、。

３．３１７（１９５２））。

エラスターゼは、ヒト、サル、ネコ、家兎等はとんどの
動物の膵臓に存在することが確認されている。また、ヒ
トのエラスターゼ活性と年令との相関が確認されておシ
、男性４０歳以上、女性６０歳以上では膵臓及び血漿中
のエラスターゼ活性が著しく低下していた［　Ｌｏｅｖ
＠ｎ　、　Ｗ　、　Ａ　ａ　、　ａｎｄＢａｌｄｗｉｎ
　、　Ｍ、Ｍ、：Ｇａｒｏｎｔｏｌｏｇｉａ　、　１７
　、１７０（１９７１））。

動脈硬化の患者の場合、膵臓のエラスターゼの活性は、
健常人のそれよシ著しく低下しているか、又は、消失し
ていた（　Ｂａ１ｏ’　、　Ｊ　、　ａｎｄ　Ｂａｎｇ
ａ　、　Ｉ　、　：Ｎａｔｕｒｅ、１７８，３１０（１
９５６）］。

ラット、家兎等を用いて、エラスターゼの薬理作用が研
究されておシ、以下のような結果が明かとなった。

１）動脈壁への脂質及びカルシウムの沈着抑制作用。

２）動脈壁のコレステロール及びカルシウムの除去作用
。

３）変性エラスチンに対する選択的分解作用。

４）動脈壁弾力繊維の新生促進作用。

５）血清脂質低下作用。

６）リポ蛋白代謝改善作用。

以上の研究結果をもとに行なった臨床研究において、ブ
タ・エラスターゼを経口投与した結果、以下のような効
果が見出された。

１）動脈壁の弾力性、伸展性の回復作用。

２）血清脂質異常の改善作用。

３）リポ蛋白代謝の改善作用。

上記の研究には、ブタの膵臓よシ抽出ｆｆｆｆしたエラ
スターゼが用いられた。２夕膵臓においては、二種類の
エラスターゼ（エラスターゼ■及びｎ）が存在する（　
Ｂｉｅｔｈ　、　Ｊ　、　：　Ｆｒｏｎｔ　Ｍａｔｒｉ
ｘ　Ｂｌｏｔ　ｍ　。

６．１（１９７８））。ここで用いられたブタ・エラス
ターゼはエラスターゼ■と■の混合物であるが、その大
部分はエラスターゼ■であった。

先に本発明者らは、組換えＤＮＡの技術を用いて、ヒト
膵臓中に存在しているヒト・エラスターゼｆｆＡ及びｎ
Ｂ（特開昭６２−１３０６８６号及び特開昭６２−２９
９７７号）ならびにヒト・エラスターゼＩＩ［Ａ及びＩ
［Ｕ（特開昭６２−２９９７６号及び特開昭６２−１７
５１７３号）を大量に得ることを行なった。

また、ブタ・エラスターゼＩに相当するヒト・エラスタ
ーゼＩはヒト膵臓においてはほとんど存在していない（
Ｔａｎ１　、Ｔ、　ｅｔ、ａｌ、　：Ｊ　、Ｂｌｏｃｈ
ｅｍ、。

１０１．５９１（１９８７））ととよシ、ＤＮＡの合成
技術及び組換え技術を併用してヒト・エラスターゼＩを
大量に得ることを行なった（特開昭６２−２５３３８１
号）。

発明が解決する課題本発明者らは、進化的にヒトに近縁な動物種で、かつ膵
ルスでエラスターゼＩを産生じている動物種を検索した
。その結果、カニクイザルにおいて、膵臓でエラスター
ゼＩが産生じていることが明かとなった。そこで、本発
明者らは組換えＤＮＡ技術を用いてサルの膵臓のエラス
ターゼｌ　ｃＤＮＡをクローニングし、得られた組換え
ＤＮＡ分子を好適な宿主に移入して、サル膵臓エラスタ
ーゼｌ　ｃＤＮＡを発現せしめ、目的とするエラスター
ゼ■を得ることのできる技術の開発研究を行なった結果
、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、サル膵臓エラスターゼ■、該サル
膵臓エラスターゼ■をコードするＤＮＡ　、該ＤＮＡを
含有する組換えＤＮＡ発現ベクター、及び該組換えＤＮ
Ａ発現ベクターで形質転換せしめた宿主に関するもので
ある。

本発明は、一般式（■）：（Ｎ）−Ｖａ　１−Ｖａ　ｌ　−Ｇ　１　ｙ−Ｇｌ　ｙ
−Ｔｈｒ−Ｇｌ　ｕ−Ａｌ　ａ−Ｇｌ　ｙ−Ａｒ　ｇ−
Ａｓ　ｎ−３ａｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−８ａｒ−Ｇｌｎ−
１１ｅ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−８
ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｈｌ
ｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−
Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉａ−Ｃｙｓ−Ｖ
ａｌ−Ａａｐ−８ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈ
ｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａａｐ
−Ｈｌｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ−
Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｔｙｒ−Ｖ
ａｌ−８ａｒ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ｌｙｅ−１１ａ−Ｖａ
ｌ−Ｖａｌ−Ｈｌｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ａａｎ
−８ｅｒ−ＡＩＩｎ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＧＩｎ−８ｅｒ−Ｖ
ａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｖａ
ｌ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ｎ−３ａｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−８
ａｒ−Ｇｌｎ−１１ｅ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｔｙ
ｒ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｔｒｐ
−Ｔｙｒ−Ｈｌｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａｒん■−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ−Ｌａｕ−Ｇｉｎ−Ｇ
ｌｎ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌａｕ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｖａ
ｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｃｙｓ−８ｅｒ
−８ｅｒ−９ｅｒ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−
８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｍ
ｅｔ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｈｌｓ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ
−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｌｓ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａ
ｉｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｖａｌ−Ｈｉ
ｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ−Ｔｈｒ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ
−８ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−
Ｖａｌ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｖ
ａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ａｌ
ａ−Ｔｙｒ−１１ｅ−８ｅｒ−Ｔｒｐ−口ｅ−Ａｓｎ−
Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ａｌａ−８ｓｒ−Ａｓｎ−（
Ｃ）で表わされるアミノ酸配列から成る、サル膵臓エラスタ
ーゼ■又はその同効物、並びに該サル膵臓エラスターゼ
Ｉ又はその同効物をコードするＤＮＡに関するものであ
る。

特に、式（Ｉ）において、（Ｎ）末端が水素原子、Ｍｅ
ｔ、又は（Ｎ）−Ｔｈ　ｒ　−Ｇ　１　ｎ−Ａｓ　ｐ−Ｐｈｅ−
］’ｒ　ｏ−Ｇｌ　ｕ−Ｔｈ　ｒ−Ａａ　ｎ−Ａｌ　ａ
−Ａｒ　ｇ−（Ｃ）、（Ｎ）−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ
−Ａａｐ−Ｐｈｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａａｎ−
Ａｌａ−Ａｒｇ−（Ｃ）もしくは（Ｎ）−Ｍｅ　ｔ−Ｌ
ｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈ　ｅ　−Ｌｅ　ｕ　−Ｖａ　１−Ｐ
ｈｅ−Ａｌ　ａ−Ｔｈ　ｒ−Ｌｅｕ　−Ｖａ　１−Ｌｅ
ｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌ　ｙ−Ｈｌ　ａ−８ｏ　ｒ−Ｔｈ　ｒ
−Ｇｌ　ｎ−Ａｓ　ｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒ　ｏ−Ｇｌ　ｕ−
Ｔｈｒ−Ａｓ　ｎ−Ａｌ　ａ　−Ａｒｇ−（Ｃ）のいず
れかひとつで表わされるポリペプチドの、一部又は全部
を有するサル膵臓エラスターゼＩ又はその同効物、並び
に該サル膵臓エラスターゼＩ又はその同効物をコードす
るＤＮＡに関するものである。

特に好ましく（５’　）−ＧＴＡ　ＧＴＧＴＣＡ　ＴＧＧＣＴＧ　ＴＣＴＧＧＡ　ＧＧＧＡＴＧ　ＡＣＡＡＡＧ　ＡＣＴＡＡＣＣＴＧＴＡＣＧＴＧＣＣＡ　ＴＡＣＧＧＣＴＡＴＣＡＧ　ＡＧＣＣＴＧ　ＧＧＴＣＴＧ　ＧＣＴＧＧＣＴＧＧＣＴＧ　ＧＣＣＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＴＣＣは、一般式（■）：ＧＧＡ　　ＧＧＧ　　ＡＣＴ　　ＧＡＧＣＣＣＴＣＴ　
　ＣＡＧ　　ＡＴＴＧＧＡ　　ＧＧＴ　　ＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＡＴＣＡＧＡＧＣＴ　　ＧＣＴ　　ＣＡＣＴＧＣＴＴＣＣＧＣＧＴＧ　　ＧＴＧＡＧＣＣＡＧ　　ＡＡＣＧＡＴＡＧＴ　　ＧＴＡ　　ＣＡＧ　　ＡＡＧＴＧＧ　　ＡＡ
ＣＡＧＣＡＡＴＧＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＧＴＴ　　ＡＣＣＣＴＣＡＡＴＧＴＴ　　ＣＴＧ　　ＣＣＣＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＧＴ　　ＣＣＣＧＧＣＡＧＧ　　ＡＣＣＡＡＧＣＡＧ　　ＡＣＣＣＴＧ　　ＣＡＧＧＴＧ　　ＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＡＣＴＧＧ　　ＧＧＣＴＣＣＧＴＧ　　ＴＧＴ　　ＧＣＴ　　ＧＧＴＧＧＡ　　ＴＧ
ＣＣＡＧ　　ＧＧＴＧＣＣＧＧＧ　　ＡＧＧＴＣＴ　　ＣＴＣＣＡＧＴＡＴ　　ＣＡＣＡＣＣＣＡＧ　　ＡＡＣＴＧＧＧＴＧ　　ＧＡＴ　　ＴＣＣＧＴＴ　　ＧＧＡ　　ＧＡＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＧ　　ＧＴＧＡＡＣＧＴＧ　　ＧＣＴＣＴＧ　　ＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＡＴ　　ＧＴＣＧＡＧ　　ＧＧＡ　　ＧＣＣＴＧＣＴＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＴ　　ＧＧＧＣＡＧ　　ＧＣＴ　　ＴＡＴＡＴＣＴＧＣＴＣＣＡＣＴ　　ＧＴＧ　　ＡＡＧＧＧＡ　　ＧＡＴ　　ＧＧＡＧＡＴ　ＴＣＴ　　ＧＧＧＡＡＴＡＡＣＡＣＣＣＴＣＣＣＣＡＡＴＣＡＣＡＡＴＣＣＣＣＣＣＣＡＣＡＴＣＡＣＡＣＡＣＣＴＣＡＣＣＡＡＣＧＴＴＧＴＣＣＣＣＴＣＣＡＴ　ＴＧＣＴＴＧ　ＧＴＧ　ＡＡＴ　
ＧＧＣＡＡＧ　ＴＡＴＴＣＴ　ＧＴＣＣＡＣＧＧＡ　Ｇ
ＴＧ　ＡＣＣＡＧＣＴＴＴ　ＧＴＧ　ＴＣＣＡＡＧ　Ｃ
ＡＧ　ＧＧＴ　ＴＧＴ　ＡＡＴ　ＧＴＣＴＣＣＡＧＧ　
ＡＡＧ　ＣＣＴＡＣＡ　ＧＴＣＴＴＣＡＣＣＣＧＧ　Ｇ
ＴＣＴＣＴ　ＧＣＴ　ＴＡＣＡＴＴＴＯＯＴＧＧ　ＡＴ
Ａ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＡＣＣＡＴＴ　ＧＣＣＴＣＣＡＡ
ＣＸ　　−（３’）（式中、ＸはＴＡＡ　、　ＴＧＡ又はＴＡＧを示す。）
で表わされる塩基配列又はそれと同効の塩基配列を含有
するＤＮＡに関するものであシ、更に、該ＤＮＡの５′
末端に、ＡＴＧ　、あるいは（５’　）−ＡＣＣＣＡＧ　ＧＡＣＴＴＴ　ＣＣＧ　Ｇ
ＡＡ　ＡＣＣＡＡＣＧＣＣＣＧＣ−（３’　）、（５’
　）−ＡＴＧ　ＡＣＣＣＡＧ　ＧＡＣＴＴＴ　ＣＣＧ　
ＧＡＡＡＣＣＡＡＣＧＣＣＣＧＣ−（３’　）又は（５
’　）−ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＣＧＣＴＴＣＣＴＧ　ＧＴＧ
　ＴＴＣＧＣＡ　ＡＣＯＣＴＧ　ＧＴＣＣＴＴ　ＴＡＴ
　ＧＧＡＣＡＣＡＧＯＡＣＣＣＡＧ　ＧＡＣＴＴＴ　Ｃ
ＣＧ　ＧＡＡ　ＡＣＣＡＡＣＧＣＣＣＧＣ−（３’　）
のいずれかひとつで表わされるポリヌクレオチドの、一
部又は全部を有するものは特に好ましい。

式（Ｉｔ）のＤＮＡが５′末端にＡＴＧを有するときは
、式（Ｉ）の（Ｎ）−末端にＭｅｔを有するポリペプチ
ドをコードする。

式（ＩＩ）（７）ＤＮＡが５′末端Ｋ　（５’　）−Ａ
ｃｅ　ＣＡＧ　ＧＡＣＴＴＴＣＣＧ　ＧＡＡ　ＡＣＣＡ
ＡＣＧＣＣＣＧＣ−（３’　）　　を有するときは、式
（１）の（Ｎ）−末端に（Ｎ）−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓ
ｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ
−Ａｒｇ−（ｃ）を有するポリーｅ７’チドをコードす
る。

式（Ｕ）　ノＤＮＡが５′末端に（５’　）−ＡＴＧ　
ＡＣＣＣＡＧ　ＧＡＣＴＴＴ　ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＡＣＣ
ＡＡＣＧＣＣＣＧＣ−（３’　）　　を有するときは、
式（１）の（Ｎ）−末端に（Ｎ）−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓ
ｎ−Ａｌ　ａ−Ａｒｇ−（Ｃ）を有するポリペプチドを
コードする。

式（ＩＩ）　ＯＤＮＡ　カ５’末端に（５’　）−ＡＴ
Ｇ　ＣＴＧ　ＣＧＣＴＴＣＣＴＧ　ＧＴＧ　ＴＴＣＧＣ
Ａ　ＡＣＣＣＴＧ　ＧＴＣＣＴＴ　ＴＡＴ　ＧＧＡ　Ｃ
ＡＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧ　ＧＡＣＴＴＴ　ＣＣＧ　ＧＡ
Ａ　ＡＣＣＡＡＣＧＣＣＣＧＣ−（３′）を有するとき
は、式（Ｉ）の（Ｎ）−末端に（Ｎ）−Ｍｅ　ｔ−Ｌａ
ｕ−Ａｒ　ｇ−Ｐｈａ　−Ｌｅ　ｕ−Ｖａ　１−Ｐｈｅ
−Ａｌ　ａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｔｙ
ｒ−Ｇｌ　ｙ−Ｈｌ　５ｒ−Ｂｏ　ｒ−Ｔｈ　ｒ−Ｇｌ
　ｎ−Ａｓ　ｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒ　ｏ−Ｇｌ　ｕ−Ｔｈｒ
−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−（Ｃ）を有するポリペプチ
ドをコードする。

また、本発明は、一般式（１）で表わされるアミン現ベ
クターに関するものである。

特に、式（１）において、（Ｎ）末端が水素原子、Ｍｅ
ｔｓ又は（Ｎ）−Ｔｈ　ｒ−Ｇ　１　ｎ−Ａｍ　ｐ−Ｐｈｅ　−
Ｐ　ｒ　ｏ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｔｈ　ｒ−Ａｓ　ｎ−Ａｌ　
ａ−Ａｒ　ｇ−（Ｃ）、（Ｎ）−Ｍｅ　ｔ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｉｎ−Ａａｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓ
ｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−（Ｃ）もしくは（Ｎ）−Ｍｅｔ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈ　ｅ　−Ｌｅ　ｕ−Ｖａ　１−Ｐ
ｈ　ｅ−Ａｌ　ａ−Ｔｈ　ｒ−Ｌｅ　ｕ−Ｖａｌ−Ｌｅ
　ｕ−Ｔｙ　ｒ−Ｇｌ　ｙ−Ｈｌ　ａ−８ｓ　ｒ−Ｔｈ
　ｒ−Ｇｌ　ｎ−Ａｓ　ｐ−Ｐｈ　ｅ−Ｐｒ　ｏ　−Ｇ
　１　ｕ−Ｔｈ　ｒ−Ａｓ　ｎ−Ａｌ　ａ−Ａｒｇ−（
Ｃ）のいずれかひとつで表わされるポリペプチドの、一
部又は全部を有するサル膵臓エラスターゼ■又はその同
効物をコードするＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ発現ベ
クターに関するものである。

特に好ましくは、一般弐Ｑｒ）で表わされる塩基配列又
はそれと同効の塩基配列を含有するＤＮＡを含有する組
換えＤＮＡ発現ベクターに関するものであり、更に、該
ＤＮＡの５′末端に、ＡＴＧ　、あるいは、（５’　）−ＡＣＣＣＡＧ　ＧＡＣＴＴＴ　ＣＣＧ　Ｇ
ＡＡ　ＡＣＣＡＡＣＧＣＣＣＧＣ−（３’　）、（５’
　）−ＡＴＧ　ＡＣＣＣＡＧ　ＧＡＣＴＴＴ　ＣＣＧ　
ＧＡＡＡＣＣＡＡＣＧＣＣＣＧＣ−（３’　）又は（５
’　）−ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＣＧＣＴＴＣＣＴＧ　ＧＴＧ
　ＴＴＣＧＣＡ　ＡＣＣＣＴＧ　ＧＴＣＣＴＴ　ＴＡＴ
　ＧＧＡＣＡＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧ　ＧＡＣＴＴＴ　Ｃ
ＣＧ　ＧＡＡ　Ａｃｅ　ＡＡＣＧＣＣＣＧＣ−（３＃）
のいずれかひとつで表わされるポリヌクレオチドの、一
部又は全部を有するＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ発現
ベクターは、特に好ましい。

組換えＤＮＡ発現ベクターとしては、プラスミド等が用
いられ、特に、ｐＳＶ２−ＭＦＥＩ、ｐＢｓＥＸ−ＭＦ
ＥＩ及びｐＥＣＥＸ−ＭＦＥＩ　　等が用いられる。

また、本発明は、上記各組換えＤＮＡ発現ベクターで形
質転換せしめた、宿主に関するものである。

宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵母又は動物細胞等が
用いられる。

動物細胞としては、例えば、ＣＯ８１細胞が好ましい。

枯草菌としては、例えば、２０７−２５株が好ましい。

大腸菌としては、例えば、ＹＡ２１株が好ましい。

膵臓のＲＮＡの抽出にあたっては、グアニジン・チオシ
アネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシ
アネート・塩化セシウム法なども採用しうるが、グアニ
ジン書チオシアネートーグアニジン・塩酸法が、以下の
点で上述二法よシ優れている。すなわち、（１）操作が簡単である。

（２）抽出・回収率が高い。

（３）比較的大量の臓器からの抽出が可能である。

（４）　　ＤＮＡが混入してこない。

（５）　　ＲＮＡの分解が少ない。

真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３
″末端にポ＋Ｊ　Ａ配列をもつことが知られているので
、この特徴を利用して、オリが（ｄＴ）セルロースのカ
ラムにｍＲＮＡを吸着せしめて、次に、とれを溶出して
精製する。

得られたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて相
補的二重鎖ＤＮＡを合成するが、その方法としてはＳ１
ヌクレアーゼ法（Ｅｆｓｔｒａｔｌａｄｉｓ　、　Ａ　
ａａｔ　ａｌ、：Ｃｅ１ｌ　、７，２７９（１９７６）
）、Ｌａｎｄ法（Ｌａｎｄ　、Ｈ，ｅｔ　ａｌ　、　：
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｅｆｄａ　Ｒｅｓ、　、９　。

２２５１（１９８１）　）、Ｏｌｃａｙａｍａ　−Ｂｅ
ｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ。

Ｈ，ａｎｄ　Ｐ、Ｂｅｒｇ　：Ｍｏｌ　＊　Ｃｅ１ｌ　
、　Ｂｉｏｌ、　、２　、１６１（１９８２）　：］、
Ｏｍ　Ｊｏｏｎ　Ｙｏｏ法［：　Ｏ＠　Ｊｏｏｎ　Ｙｏ
ｏ　。

ｅｔ　　ａｌ　、：Ｐｒｏｅ　、Ｎａｔｌ　＊Ａｃａｄ
　＊　Ｓｅｔ　＊ＵＳＡ、７９　。

１０４９（１９８２）３などを採用しうるが、本発明の
目的には、Ｏｋａｙａｍａ　−Ｂｅｒｇ法が好適であっ
た。

次に、得られた組換えプラスミドを大腸菌、例えばＤＨ
５株に導入して形質転換させる。テトラサイクリン耐性
あるいはアンピシリン耐性を指標として、組換え体を選
択することができる。

得られた組換え体のなかから、エラスターゼをコードす
るＤＮＡを含有するクローンを選択するためには、　Ｐ
で標識したブタ膵臓エラスターゼＩｅＤＮＡ　ＣＴａｎ
１　＠　Ｔ　ａ　ｅｔ　ａｌ　−：　Ｊ　＊　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ　＊　ｇ　１０１１５９１（１９８７））をグロ
ーブに用いるコロニーハイプリダイゼーシ、ン法を用い
た。

選択されたクローンに含有される塩基配列の決定ハ、フ
ァージＭ１３を用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停
止の方法（Ｍｅｓｓｉｎｇ　、　Ｊ　、　ａｔ　ａｌ　
ｍ　：Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、９，３
０９（１９８１）　）及びＭａｘａｍ　−Ｇｉ　１ｂｅ
ｒｔ法（Ｍａｘａｍ　、　Ａ、Ｍｅ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂ
＠ｒｔ　。

Ｗ、：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ、
Ａ、７４．５６０（１９７７）　〕で実施しうるが、本
発明ではジデオキシヌクレオチド合成鎖停止の方法を採
用し、サル膵臓のエラスターゼ１を完全にコードするＤ
ＮＡを有するクローンを決定した。

次に、得られたクローンからエラスターゼ■ｃ　ＤＮＡ
を切り出し、これを好適な発現ベクターにつないで、好
適な宿主に導入して発現せしめることができる。

プロモーターとしては、大腸菌においてはトリプトファ
ン（ｔｒｐ　）　ｆロモーター　ラクトース（ｌａｃ　
）プロモーター　トリプトファン・ラクトース（ｔａａ
）プロモーター　リポプロティン（１ｐｐ）プロモータ
ー　バクテリオファージ由来のラムダ（λ）ＰＬプロモ
ーター、ポＩＪ−ｅプチド鎖伸長因子Ｔｕ　（ｔｕｆＢ
　）　７″ロモーターなどを使用しうる。

宿主としては、大腸菌、枯草菌、などの細菌、本発明の
ＤＮＡを大腸菌の宿主に、形質転換、導入する方法とし
ては、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ。

Ｄ、：Ｊ、Ｍｏｌ　、Ｂｉｏｌ　、　、　１６６　、５
５７（１９８３）　〕、摸化カルシウム法［：　Ｄａｇ
ｅｒｔ　、　Ｍ　、　ａｎｄ　Ｅｈｒｌｉｃｈ　、　Ｓ
　。

Ｄ、Ｇｅｎｅ、６．２３（１９７９））、低−法〔高木
康敬著：遺伝子操作マニュアル、ｐ、４９．講談社すイ
エンティフィク（１９８２））等を採用しうる。

本発明においては、Ｈａｎａｈａｎの方法が好適であっ
た。

このようにして得た宿主（組換え体）を、公知の培地で
培養し、培養物の中に、式（Ｉ）で表わされる列？リペ
プチド（その（Ｎ）−末端に、Ｍｅｔ、又は（Ｎ）−Ｔｈｒ−Ｇｌ　ｎ−Ａｓ　ｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒ　
ｏ−Ｇｌｕ　−Ｔｈ　ｒ−Ａｓ　ｎ−Ａｌ　ａ−Ａｒｇ
−（Ｃ）、（Ｎ）−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａａｐ−
Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ−（Ｃ）もしくは（Ｎ）−Ｍｅ　ｔ−Ｌｅｕ−Ａｒ
ｇ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ｐｈｅ−Ａｌ　ａ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ｌｅ　ｕ−Ｔｙｒ−Ｇ　１　
ｙ−Ｈｌ　５−８ｏ　ｒ−Ｔｈ　ｒ−Ｇｌ　ｎ−Ａｓ　
ｐ−Ｐｈ　ｅ−Ｐｒ　ｏ−Ｇｌ　ｕ−Ｔｈ　ｒ−Ａｙｓ
　ｎ−Ａｌ　ａ−Ａｒｇ−（Ｃ）のいずれかひとつで表
わされるポリベノはその同効物を生成蓄積せしめ、これ
を採取することによシ本発明の目的を達することができ
る。

大腸菌で生産するための培地としては、グルコース□、
カブミノ酸などからなる培地、例えば、Ｍ９培地（Ｍｉ
ｌｌｅｒ　、　Ｊ　、　：　Ｅｘｐｅｒｔｍｅｎｔａ　
ｌｎ　Ｍｏ１ｅ　−ｃｕｌａｒ　Ｇａｎｅｔｉｅｓ　、
　４３１−４３３　（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂ　＃　、Ｎｅｖｒ　Ｙｏｒｋ　（１９７２
）　）　Ｅ等が挙げられる。

組換え体の培養は、通常、１５−４３℃で、３−２４時
間行ない、必要に応じて、通気や攪はんを加えることが
できる。なお、動物細胞を宿主とする場合には、３−１
０日間の培養を必要とする。

培養後は、組換え体細胞を、公知の方法、例えば遠心分
離等で集める。宿主として、枯草菌、酵母、動物細胞な
どを用いる場合、ベクターの選択によっては、生産され
たエラスターゼは細胞外に出て、上澄液に含まれる。

一方、大腸菌を宿主とした場合、生産されたエラスター
ゼは、不溶性の蛋白質として、その細胞内のインクルー
ジヨン？デ４　（１ｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）に含
まれる場合が多い。

この場合は、菌体を破壊して遠心分離することＫより、
生産されたエラスターゼは沈３Ｎ、Ｌ物として得られる
。

菌体の破壊の方法としては、超音波処理、リゾチーム処
理、凍結融解処理等を採用することができる。該上澄液
又は沈Ｅ、１．Ｌ物からのエラスターゼの単離は、通常
知られている蛋白質の精製方法によって実施しうる。

本発明により製造されるエラスターゼは、ブタ膵臓よシ
抽出精製したエラスターゼと同等の生物学的活性を示し
、これと同様の目的に、同様の方法を用いて使用するこ
とができる。

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが
、これらは本発明の範囲を制限するものではない。

実施例（１）　　サル膵臓よシのｍＲ，ＮＡの分離３．８ｇの
カニクイザル膵臓をグアニジンチオシアネート溶液（４
Ｍのグアニジンチオシアネート、１チのサルコシル、２
０　ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）％　２
５　ｍＭのクエン酸ナトリウム（ＰＨ７，０）、１００
　ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．１％のアンチ
７オームＡ）中でポリトロンによって破壊、変性した後
、遠心して上澄を得た。

これに０．０２５倍量の１Ｍ酢酸および０．７５倍量の
エタノールを加え、−２０℃で数時間冷却した後、遠心
処理によって沈澱を得た。次にこの沈澱をグアニジンハ
イドロクロライド溶液（７，５Ｍのグアニジンハイドロ
クロライド、２５　ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７
，０）、５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ））に懸
濁し、０．０２５倍量の１Ｍ酢酸および０１５倍量のエ
タノールを加え、−２０℃で数時間冷却した後、遠心処
理を行った。ここで得られた沈澱をグアニジンハイドロ
クロライド溶液に再懸濁し、酢酸、エタノールを加え、
−２０℃に冷却した後、遠心処理で沈澱を集めた。次に
、この沈澱をエタノールで数回洗い、混在しているグア
ニジンハイドロクロライドを除き、蒸留水に溶かした後
にエタノールでＲＮＡを沈澱させた。遠心分離によシ沈
澱を集め、１５７ｒｖのＲＮＡを得た。

こうして得たＲＮＡのうち１６．８　ｍ９を高塩溶液（
０，５ＭのＮａＣｔ、　２０　ｒｎＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｌ（ｐＨ７，５）、ｌ　ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））中でオリが（ｄＴ）
セルロースカラムに吸着させた後、ポＩＪ　（Ａ）を含
むｍＲＮＡを溶出溶液（ｌｏｍＭのＴｒｉｓ　−ＨＣＬ
　（ｐＨ７，５）、１ｍＭのＥＤＴＡ。

０．０５％のＳＤＳ　）で溶出させ、６２　ｔｔｔ！の
ｍＲＮＡを得た。

（２）　　ｃＤＮＡパンクの作製ｃＤＮＡパンクの作製は、Ｏｋａｙａｍｓ　−Ｂｅｒｇ
法に従って行った。すなわち、５μｙのｍＲＮＡ及び２
４ユニツトの逆転写酵素を２０μｔの反応液〔５０ｍＭ
のＴｒｉｓ　−ＨＣＬ　（ｐＨ８，３）、８ｍＭのＭｇ
Ｃｌ２．３０ｍＭのＫＣｌ−、０，３ｍＭのＤＴＴ、２
ｍＭのｄＡＴＰ　、２　ｍＭのｄＧＴＰ　、２　ｍＭの
ｄＣＴＰ　、　２ｍＭのｄＴＴＰ　、　１０　μｃｉの
α−Ｐ−ｄＣＴＰ、　１．４μｙのベクター・プライマ
ーＤＮＡ　（ＰＬ　−Ｐｈａｒ−ｍａｃｉａより購入）
〕中で、４２℃、６０分反応させた。

２μＬの０．２５　Ｍ　ＥＤＴＡと１μｔの１０チＳＤ
Ｓを加えて反応を止めた後、２０μｔのフェノール・ク
ロロフォルムで除蛋白を行った。遠心した後、水層をと
９．２０μｔの４Ｍ酢酸アンモニウムと８０μｔのエタ
ノールを加え、−７０℃、１５分間冷却した。次いで、
遠心して沈澱を集め７５チエタノールで沈澱を洗った後
、減圧乾燥した。

沈澱を１５μｔのターミナルトランスフェラーゼ反応液
（１４０ｍＭのカコジル酸カリウム、３０　ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｔ（ｐｉ（６，８）　、　１　ｍＭの塩化コ
バルト、０．５　ｍＭのＤＴＴ　、　０．２１１１１　
ＯｐｏｌｙＡ、　１００ｍＭのａｃＴｐ　）に溶かした
。

３７℃で３分間反応液をあたためた後、１８ユニツトの
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
を加え、５分間反応させた０次に、１μｔの０．２５　
Ｍ　ＥＤＴＡ及び０．５μＬの１０チＳＤＳを加え反応
をとめた後、フェノール・クロロフォルムで除蛋白を行
った０反応液を遠心後、水層をとり、１５μｔの４Ｍ酢
酸アンモニウム、６０μｔのエタノールを加えよく混合
した。−７０℃に１５分間おいた後、遠心して沈澱を集
めｆｃ。

沈澱を１０μｔの制限酵素用緩衝液（５０ｍＭのＮａＣ
ｔ、　１０　ｍＭのＴｒｉｍ　−ＨＣＬ　（ｐＨ７，５
）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２．１ｍＭのＤＴＴ　）に溶か
し、２．５ユニツトの制限酵素Ｈ１ｎｄ３を加え、３７
℃で約１時間消化した。つぎに、フェノール・クロロフ
ォルムで除蛋白後、エタノール沈澱を行った。−７０℃
で１５分間冷却した後、遠心によって沈澱を集め、１０
μｔのＴＥ　（１０ｍＭのＴｒｉ８−ＨＣＬ（ｐＨ７，
５）、１　ｍＭのＥＤＴＡ　）に溶かした。

次に、上記試料の１μｔをオリゴｄＧ付きリンカ−（Ｐ
Ｌ−Ｐｈａｒｍａｃｉｍよシ購入）　１０　ｎｇを加え
た反応液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ　（ｐｉ４７．
５　）、１ｍＭのＥＤＴＡ、　１００ｍＭのＮａＣｔ）
に加え、６５℃で５分間加熱し、次いで４２℃で３０分
間保温した。

水中で反応液を冷却した後、１０μｔの１０倍リガーゼ
緩衝液（１０ｍＭのＡＴＰ、　６６０　ｍＭのＴｒｉ　
ｓ　−ＨＣｔ（ｐＨ７，５）、６６ｍＭのＭｇＣ２２，
１００ｍＭのＤＴＴ　）、７８μｔの蒸留水、８ユニツ
トのＴ４ＤＮＡＩ）ガーゼを加え、１２℃で一晩保温し
た。

次に、１０μｔのＩＭのＫＧ／！、、１ユニツトのり？
ヌクレアーゼＨ１３３ユニットのＤＮＡポリメラーゼ■
、４ユニ、トのＴ４ＤＮＡリガーゼ、０．５Ａｔのヌク
レオチド溶液（２０ｍＭのｄＡＴＰ、２０ｍＭのｄＧＴ
Ｐ　、　２０　ｍＭのｄＣＴＰ　、　２０　ｍＭのｄＴ
ＴＰ　）、０．１μＬの５０μＩ／μを牛血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）を加え、１２℃で１時間、ついで２５℃で
１時間保温した。

この反応液を、５倍に希釈した後、ただちにＨａｎａｈ
ａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ　、Ｄ　＊　：　Ｊ　、Ｍ
Ｏｌ　６　Ｂｌｏｌ　、　。

１６６．５５７（１９８３））によりて、大・陽画Ｉ）
Ｈ５株を形質転換し、サル膵臓ｃＤＮＡパンクを作製し
た。

（３）　　サル膵臓エラスターゼｌ　ｃＤＮＡを含有す
る組換え菌の分離上述のサル膵１ｉｃＤＮＡバンクのうち２２，８００株
の組換え菌のＤＮＡを、Ｇｒｕｎａｔｅｉｎ　、　Ｍ　
、　ａｎｄＨｏｇｎａａａ　、　Ｄ　＊　Ｓ　＊の方法
（Ｐｒｏｃ６　Ｎａｔｌ　＠　Ａｅａｄ　。

Ｓｅｔ、、ＵＳＡ、７２，３９６１（１９７５））によ
ってニトロセルロースフィルター上に固着Ｌ７’ｃ。

これらのＤＮＡのなかから、サル膵臓エラスターゼ−１
ｃＤＮＡを含有するものを選択するために、ブタ膵臓エ
ラスターゼＩ　ｃＤＮＡ断片をプローブとして用いた。

ブタ膵臓エラスターゼｌ　ｅＤＮＡ　（特開昭６０−２
０７５８３　）　をニックトランスレーション法（Ｒｌ
ｇｂｙ、Ｐ、Ｗ、ａｔ　ａｌ、：Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｔｏｌ
、。

１１３．２３７（１９７７））によって　Ｐ標識し、上
記ｃＤＮＡパンクとハイブリダイゼーションを行った。

その結果、３５株の陽性クローンが得られ、そのうち２
４株についてプラスミドに含着れるｃ　ＤＮＡの長さを
調べた。ｃＤＮＡの長さが約１　ｋｂのクローン１株を
選定し、それが含有するプラスミドをｐＭＦＥ　１−１
８と命名した。

ｐＭＦＥｌ　−１８に挿入されているｅＤＮＡの制限酵
素地図を第１図に示す、またその全塩基配列とそれがコ
ードするアミノ酸配列を第１表に示す。

第１表サル膵臓エラスターゼＩｅＤＮＡの塩基配列およびそれがコードするアミノ酸配列ＧｌｎＬｙｓＩｌｓＶａＩＶａＩＨＩａＰｒｏＴｙｒＴ
ｒｐＡｍｎｓｅｒＡｓｎＡｓｎＶａＩＡＩｍＡ１ｍＭｅ
ｔＬｅｕＡｒｇＰｈｅＬｓｕＶａｌＰｈｅＡ１ｍＧ１ｙ
ＴｙｒＡｓｐＩｌｅＡ１ａＬ＠ｕＬ＠ｕＡｒｇＬ＠ｕＡ
１ａＧ１ｎｓｅｒＶａＩＴｈｒＬ＠ｕＴｈｒＬａｕＶａ
ＩＬ＊ｕＴｙｒＧ１ｙＨｌａｓｓｒＴｈｒＧｌｎＡｓｐ
ＰｈｅＰｒｏＧｌｕＴｈｒＡｍｎＡｌａＡｒｇＶａＩＶ
ａＩＧ１ｙＧｌｙＴｈｒＧ１ｕＡ１ａＧ１ｙＡｒｇＡｓ
ｎｓｅｒＴｒｐＰｒｏＳａｒＧ１ｎＩ１ｓｓｅｒＬｅｕ
ＧｌｎＴｙｒＬｅｕｓｅｒＧ１ｙＧ１ｙＳｅｒＴｒｐＴ
ｙｒＨｉｇＴｈｒＣ）ｙｓＧ１ｙＧ１ｙＴｈｒＬａｕＩ
１ｅＡｒｇＧ１ｎＡｓｎＴｒｐ’ＶａＩＭｅｔＴｈｒＡ
１ａＡ１ｍＳｅ　ｒＶａ　ＩＡｓｐＴｙｒＡ１　ａＩ　
１　ｅｃｙｓｓｅ　ｒｓａ　ｒｓｅ　ｒｓｅ　ｒＴｙｒ
ＴｒｐＧ１ｙｓｅ　ｒＨｉａｃｙａＶａＩＡｓｐｓａｒ
ＰｒｏＬｙｓＴｈｒＰｈｅＡｒｇＶａＩＶａｌｖａＩＧ
ＩｙＡｓｐＨｌｓＡｓｎＬｅｕｓｅｒＧｌｎＡ＋ｎＡｓ
ｐＧ１ｙＴｂｒＧ１ｕＧ１ｎＴｙｒＶａＩＳｓｒｖａ１
ＧｌｙＣｙｓＧ１ｎＧｌｙＡｓｐｓ＠ｒＧｌｙＧ１ｙＰ
ｒｏＬａｕＨｉｓｃｙｓＬｅｕＶａＩＡｓｎｐＭＦＥ１
−１８は、６個のアミノ酸からなるシＧ１ｙＬｙｓＴｙｒＳｅｒＶａＩＨｉｓＧ１ｙＶａｌＴ
ｈｒＳｅｒＰｈｅＶａｌ　ＳｅｒＬｙａＧｌｎグナルペ
プチドをコードする領域、１０個のアミノ酸からなるアクチペーション４プチドをコードＧｌｙ
ｃｙｓＡｓｎＶａＩＳｅｒＡｒｇＬｙｉＰｒｏＴｈｒＶ
ａｌＰｈｅＴｈｒＡｒｇＶａｌＳｅｒＡ１ａする領域、０個のアミノ酸からなる成熟エラスターゼ蛋白質をコードする領域の全てを持っていることがわかる。

また、ｐＭＦＥ１−１８は、５′及ＴｙｒＩ１＠ＳｅｒＴｒｐＩ１＠ＡｉｎＬｙｍＴｈｒＩ
１＊Ａ１ａＳｅｒＡｇｎ＊＊＋び３′非翻訳領域も含ん
でいる。

ｃＤＮＡの配列から推定されるアξノ酸配列を比較した結果、サル膵ＴＴＣＣＴＧＡＧＴＣＣＡＡＴＧＡＣＣＴＴＣＣＣＡＡ
ＡＡＴＧＧＴＴＣＴＴＡＧＡＴＣＴＧＣＡＡＣ臓エラス
ターゼＩはブタおよびラット膵臓エラスターゼ■とそれぞれ８８％および８チの相同性ＡＧＡＡＣＴＴＧＣＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＴＡＡＡＡＡ
ＡＣＡＴＴＣＴＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＧＡＩＣがある
ことが明らかとなった。

ｐＭＦＥ１　−　１　８は、サル膵臓エラスターゼｌ　ｍＲＮＡから逆転写酵素によって合成された完全長のｅＤＮＡを
含むものであるので、このｃＤＮＡを適当な発現ベクターに移すことで、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞などを宿主として、サル膵臓エラスターゼＩを大量生産できる．動物細胞を用いたサル膵臓エラスターゼ■の生産動物細胞を宿主にしてサル膵臓エラスターゼＩを生産さ
せるため、第２図に示す手順によってそのｅＤＮＡと発
現用ベクターとを連結した０発現用ベクターとしてＳＶ
４０のプロモーター、工／ノ１ンサー、４すＡシグナル
、Ｓｍａｌｌ　Ｔ　ａｎｔｉｇｅｎ遺伝子の介在配列（
イントロン）を含むｐＳＶ２グラスミドを使用した。

ベクターとｃＤＮＡが転写方向に関して順の向きに連結
されている発現プラスミド（ＰＳＶ２−ＭＦＥＩ）を、
制限酵素切断パターンを解析することＫより。

選択した。

入構築した発現プラスミドｐＳＶ２−ＭＦＥＩは、動物細
胞（ＣＯ８１細胞）へリン酸カルシウム法によシ導入（
トランスフェクション）した、リン酸カルシウム法によ
るトランスフェクションｌｄ、Ｇｒａｈａｍとｖａｎ　
ｄ＠ｒ　Ｅｂの方法に従った（　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　、
　５２　。

４５６（１９７３）Ｌトランスフェクションに使用するｃｏｓ　ｉ細胞は、直
径１０ｃＩｎのシャーレにＩ　Ｘ　１０’細胞をまき、
１０％牛脂児血清を含むダルベツコ変法イーグル培地で
一晩培養した。次に、３００μＩのｐＳＶ２−ＭＦＥ　
１プラスミドを１２．５５−の滅菌蒸留水に懸濁し、０
．７５−の２．５　Ｍ　ＣａＣｌ２を加えてよく混合し
た後に、ピペットを用いて溶液中に泡をたてながら、１
．５　ｒｎｔの１０　Ｘ　ＨｅＢｓ溶液（２１０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ　、　１．３７　ＭのＮａＣ４，４，７ｍＭ
のＫＣｌ　、１０．６ｍＭのＮ＆２ＨＰＯ４，５５，５
ｍＭのブドウ糖、ＰＨ７，０５）を滴下してＤＮＡとリ
ン酸カルシウムの沈澱を形成させた。３０分間室温で放
置して沈澱を熟成させた後、シャーレ１枚あたシ１ゴを
、予め１０チの牛胎児血清を含む新鮮な培地に置換した
ＣＯ８１細胞へ加えた。これを３７℃、５チのＣＯ２存
在下で１２時間培養した後、培養液を捨て、牛胎児血清
を含まない新しいダルベツコ変法イーグル培地に置換し
、さらに３７℃、５％のＣＯ２存在下にて４８時間培養
した。なお、ここで得られたトランスフェクションした
ＣＯ８１細胞は、サル膵臓エラスターゼｌ　ｒｒ＋ＲＮ
Ａの確認に用い、また培養上清はエラスターゼ活性の測
定に供された。

ＣＯ８１細胞からのｍＲＮＡの抽出トランスフェクションしたＣＯ８１細胞中に、発現シラ
スミドから転写されたサル膵臓エラスターゼＩ　ｍＲＮ
Ａが存在していることを確認するために。

以下のようにＣｏ５１細胞からｍＲＮＡを抽出してノー
ザン・プロ、ト晦ハイプリダイゼーションヲ行なった口４８時間培養後のＣＯ８１細胞に、シャーレ１枚ちたシ
、１ｔｎｔのグアニジンチオシアネート溶液（４Ｍのグ
アニジンチオシアネート、１％のサルコシル、２０ｍＭ
のＥＤＴＡ　、　２５　ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７，０）、１００　ｍＭの２−メルカグトエタノール
、０．１％のアンチフオームＡ）を加え、細胞を融解し
た。次に、この溶液を２１ｆｆ−ジの注射針に数回通し
て高分子ＤＮＡを低分子化した後、５．７Ｍの塩化セシ
ウムと０．１　ＭのＥＤＴＡを含む溶液の上に重層し、
日立ＲＰＳ４０スウィングローターを用いて、　３０．
００Ｏｒｐｍ、　２０℃、１７時間遠心した。ことで得
られたＲＮＡ沈澱を少量のエタノールで洗い、３００μ
ｔの蒸留水に溶解した。

抽出した全ＲＮＡをＡｖｉｖとＬｅｄｅｒの方法（Ｐｒ
ｏｅ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　６９．１４０８
（１９７２）　）に従ってオリが（ａＴ）セルロースカ
ラムにかけ、数μＩのｍＲＮＡを精製した。精製したｍ
ＲＮＡの半量を使用してＴｈ　ｏｍａ　ｍの方法〔Ｐｒ
ｏｃ　、Ｎａｔｌ　、Ａｅａｄ　、　Ｓｃｆ　。

ＵＳＡ、７７．５２０１（１９８０））に従って、ノー
ザン・プロット・ハイブリダイゼーションを行なった。

グローブには、ニックトランスレージ、ン法（Ｒｌｇｂ
ｙ、Ｐ、Ｗ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉ＊１．１
１３　。

２３７（１９７７））によって３２Ｐ標識したサル膵臓
エラスターゼｌ　ｃＤＮＡを用いた。その結果、ｐＳＶ
２−ＭＦＥＩを導入したＣＯ８１細胞のｍＲＮＡのみに
プローブとハイブリダイズする大きさ約１．８ｋｂのｍ
ＲＮＡが検出された。ｐＳＶ２−ＭＦＥＩが転写された
場合、ベクターに含まれるポリＡシグナルで転写が終結
すると１．８　ｋｂの大きさのｍＲＮＡが生じると推定
され、ノーザンブロットハイプリダイゼーシ、ンによっ
て得られた結果はその推定値と−致した。このことから
、導入したｐ　ＳＶ２−　ＭＦＥｌはｃｏｓ　ｉ細胞中
でＳＶ４０のプロモーターを使用して発現していると結
論された。

ｐＳＶ２に組み込んだサル膵、ｉ２エラスターゼＩｃＤ
ＮＡはシグナルペプチド領域を保持しているので、発現
されるエラスターゼは培地中ヘプロエラスターゼとして
分泌されることが期待される。そこで、４８時間培養後
の培養液中のエラスターゼ活性を測定した。エラスター
ゼ活性の測定は、Ｂｉｅｔｈらの合成基質を用いた方法
（Ｆｒｏｎｔ　＊Ｍａｔｒｉｘ、Ｂ１ｏ１．６，１（１
９７８）　）を用いた。

１−の培養上清に２００μｔのＩＭのＴｒｌｓ−ＨＣｔ
緩衝液（ｐＨ８，５）と５０　μＬの１０ｍ９／ｒｎｔ
のトリプシンを加え、２５℃で１５分間保温することに
よってグロエラスターゼの活性化処理を行った後、５０
７ｊＬの１０１ｎ９／ｒｎｔのダイズトリプシンインヒ
ビターを加えて添加トリプシンを不活化した。次に、Ｎ
−メチルピロリドンに溶解した１０．４μｔの１２５　
ｍＭスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ア
ラニン−ｐ−ニトロアニリド（Ｓｕｅ　−Ａｌａ　−Ａ
ｌａ−Ａｌａ　−ｐＮＡ　）を加えて、２５℃に１時間
保温した後、４１０　ｎｍの吸光度を測定した。

その結果、ＣＯ８１細胞のみの培養液では全くエラスタ
ーゼ活性が検出されなかったのに対し、ｐＳＶ２−ＭＦ
ＥＩをトランスフェクションしたｃｏｓｉ細胞の培養液
では培養液中にエラスターゼ活性が認められた。

次に、エラスターゼ活性を示した培養液にα１−アンチ
トリプシン、もしくはエラスターゼの特異的阻害剤であ
るエラスタチナールを砧加し、それらによって阻害され
るかを調べた。トリプシンにより活性化した試料にエラ
スタチナール、またはα１−アンチトリプシンを添加す
ると合成基質の分解活性は強く阻害され、発現されたサ
ル膵臓エラスターゼＩが、天然のブタ膵臓エラスターゼ
Ｉと同一の阻害様式を持つことが示された。また、トリ
プシン処理によシ活性化されることよシ、分泌されたエ
ラスターゼの多くはグロエラスターゼであることが示さ
れた。

ｐｓＶ２−ＭＦＥＩをＣＯＳ　Ｉ　ＩＩＢ　ｊ＠　ヘ導
入した本実す例においてはサル膵臓エラスターゼ夏の生
産は短期的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ　）であるが、ｐＳＶ２−ＭＦＥＩ　プラスミドに適
当な選択マーカー（例えば、ｎｅｏ遺伝子、ｄｉｈｙｄ
ｒｏｆｏｌａｔｅ　ｒｅｄｕｅｔａｓｅ遺伝子など）を
連結してＣＨＯ細胞等に導入すれば長期的にサル−エラ
スターゼ■を生産可能な細胞株を得ることが可能である
。

（５）枯草菌を用いたサル膵臓エラスターゼＩの生産発現ベクターの構築法は、第３図に示した。まず、サル
膵臓エラスターゼｌ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐ
ＭＦＥ１−１８を制限酵素ＥｃｏＲ１で切断し、成熟エ
ラスターゼＩのＮ末端から１０番目のアミノ酸よりＣ末
端側を含むＤＮＡ断片を分離した。このＤＮＡ断片に、
枯草菌α−アミラーゼのシグナルペプチドの一部ならび
にエラスターゼ■のアクチペーションイプテド（１０ア
ミノ酸）と成熟エラスターゼ■のＮ末端より９アミノ酸
をコードする合成オリゴヌクレオチド（第４図）をＴ４
　ＤＮＡリガーゼにて結合させた。次Ｋ、このＤＮＡを
制限酵素Ｂｇｔ２で切断し、ｅ　ＤＮＡを含むＤＮＡ断
片を分離した。

一方、枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子がクロー＝７グさ
れているプラスミドｐＴＵＢ２２８　（Ｏｈｍｕｒａ。

Ｋ、ａｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｌｏｃｈｅｍ、９５．８７（
１９８４）　）を制限酵素Ｈ１ｎｄ　３で切断して、α
−アミラーゼのプロモーターおよびシグナルペプチドの
一部を含む４２８塩基対のＤＮＡ断片、および複製開始
点を含む５．Ｚｏｏ塩基対のＤＮＡ断片を、それぞれ単
離した。

４２８塩基対のＤＮＡ断片はさらに制限酵素Ｈｐａ　２
にて、また５、１００塩基対のＤＮＡ断片は制限酵素Ｓ
ｍａ　ｌにて切断した後、それぞれより３８５塩基対、
４５６６塩基対のＤＮＡ断片を単離した。上記３種のＤ
ＮＡ断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼにて結合させた後、Ｓ
１ヌクレアーゼによシ制限酵素Ｂ　ｇｔ２部位を平滑末
端化した。これを、再びＴ４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼで処
理することによりｍ状化した。

このＤＮＡを常法によシ枯草菌２０７−２５株（ｍＴ６
３ｈａｒＭ　ｒｅｃＥ４ａｍｙＥＯ７ａｒｏ１９０６　
１ｅｕＡ８１ｙｓ２１　：Ｍａｒｂｕｒｇ株由来）のプ
ロトプラスト中に取シ込ませ、再生させた後、１０μｙ
／−のカナマイシンを含む培地で培養し、本培地上にて
生育可能な形質転換株を得た。いくつかの形質転換株か
ら目的のプラスミドを選択するために、第４図に示した
合成オリゴヌクレオチドをプローブに用いて、コロニー
ハイツリダイゼーションを行なった。

得られた陽性のクローンよシブラスミドを分離し、その
塩基配列を決定することによシ目的のものであることを
確認した。このようにして得られた発現プラスミドをｐ
ＢＳＢＸ−ＭＦＥＩと命名した。

前述のサル膵臓エラスターゼＩ発現プラスミドｐＢＳＥ
Ｘ−ＭＦＥＩを導入した枯草菌２０７−２５株を、５０
μｇ／−のカナマイシンを含むＬＧ培地１ｔ（１％のバ
クトドリプトン（Ｄｉｆｅｏ　）、０．５％のイースト
エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ　）、０．５チのＮａＣ２
，０，２％のブドウ糖、ｐ！−１７，０）にて３５℃、
４８時間往復振盪培養した。この培養上清の１ｍ／！に
、２００　μＬのＩＭのＴｒｉｓ−ＨＣｔ緩衝液、（ｐ
Ｈ８，５）と５０μｔの１０ｍ９／ｒｎｔのトリプシン
を加え、２５℃で１５分間保温することによって、グロ
エラスターゼの活性化を行った後、５０μｔの１０ｍ９
／−のダイズトリプシンインヒビターを加えて添加トリ
プシンを不活性化した。次に、　１０．４μｔの１２５
　ｍＭのＳｕｅ　−Ａｌａ　−Ａｌａ　−Ａｌａ　−ｐ
ＮＡを加えて、２５℃に１時間保温したのち、４１０ｎ
ｍの吸光度を測定した。

その結果、２０７−２５株のみの培養液では全くエラス
ターゼ活性が検出されなかったのに対し、ｐＢＳＥＸ−
ＭＦＥＩを導入した２０７−２５株の培養液では、培養
液中にエラスターゼ活性が認められた。

次に、エラスターゼ活性を示した培養液に、Ｃ１−アン
チトリプシン、もしくはエラスターゼの特異的阻害剤で
あるエラスタチナールを添加し、それらによって阻害さ
れるかを調べた。トリプシンによって活性化した試料に
、エラスタチナールまたはＣ１−アンチトリプシンを添
加すると、動物細胞にて生産したエラスターゼと同様に
、合成基質の分解活性は強く阻害された。また、活性化
にトリプシン処理が必要であったことより、生産された
エラスターゼは、グロエラスターゼであることが示され
た。

（６）　　大腸菌を用いたサル膵臓エラスターゼＩの生
産大腸菌を宿主とした発現ベクターｐＦ、ｃＥＸ−ＭＦ
Ｅ１の構築法を第５図に示した。発現ベクターにはラク
トースプロモーターを含むｐＵＣ８（Ｐｈａｒｍａｅｉ
ａ社よシ購入）を使用した。サルエラスターゼ■ｃＤＮ
Ａを含有するシラスミドｐＭＦＥ１−１８を制限酵素Ｂ
ｇｔｌで切断して直鎖状にした後、制限酵素Ａｃｅ３で
部分切断し、エラスターゼｌ　ｃＤＮＡを含む断片を分
離した。これを８１ヌクレアーゼ−事理することによシ
、両末端を平滑末端にした。得られたＤＮＡ断片をプラ
スミドｐｔｙｃｓのＳｍａ　１切断部位に、Ｔ４　ＤＮ
Ａ　＋７ガーゼを用いて組込んだ。

このようＫして構築したプラスミドを用いて、大腸菌Ｊ
Ｍ１０３株を形質転換した。、いくつかの形質転換株か
らプラスミドを抽出し、ｃＤＮＡの転写の方向がラクト
ースオペロンのプロモーターの向きと一致しているもの
を制限酵素マツピングにより選択した。このエラスター
ゼＩ発現プラスミドをｐＥＣＥＸ　−ＭＦＥ　１と命名
した（第５図）。

ｐＥＣＥＸ−ＭＦＥＩ中のエラスターゼｃ　ＤＮＡの５
′末端付近の塩基配列とアミノ酸配列は１次のようにし
たがって、ｐＥＣＥＸ　−ＭＦＥ　１によシ発現される
サル膵臓エラスターゼ■は、そのアクチペーション被プ
チドのＮ末端側にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子との結合
により生じる７個のアミノ酸が付加した融合蛋白になる
。

次に、ｐＥＣＥＸ　−ＭＦＥ　１で大腸菌のいくつかの
株を形質転換し、サル膵臓エラスターゼＩを生産しうる
菌株を得た。得られた発現プラスミドを含む菌株を、２
ｘＴＹ−アンピシリン培ｍ（１，６％のバクトドリプト
ン、１％のイーストエキストラクト、０．５％のＮａＣ
ｔ、５０　μｌｌ／ｍｌのアンピシリン）に接種し、３
７℃、１５時間培％した。培養後、培養液を遠心して菌
体を集め、２．４Ｘ１０８細胞相当量の菌体を１５μｔ
のＳＤＳ溶液（２チのＳＤＳ、５チの２−メルカプトエ
タノール、１０％のグリセリン、６０　ｍＭのＴｒｉｍ
−ＨＣｔ（ｐＨ６，８）　）に懸濁し、１００℃、３分
間加熱した後、　Ｌａｅｍｍｌｉらの方法［Ｎａｔｕｒ
ｅ　、２２７．６８０（１９７０）：ｌに従って５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、生産されている
蛋白を解析した。

その結果、ＹＡ２１株において多量なエラスターゼの生
産が認められた。エラスターゼ融合蛋白の生産高はＹＡ
２１株が生産している全蛋白の２０％に相当していた。

Ｚ９８４株においても、比較的多量のエラスターゼ融合
蛋白が生産されていたが。

生産高はＹＡ２１株の半分以下であった。その他２株の
大腸菌（Ｈ８１０１株およびＭＣ４１００株）における
エラスターゼ融合蛋白の生産量は、著しく低かった。

エラスターゼ融合蛋白は菌体内でインクルージヨンボデ
ィを形成しているので比較的容易に精製することができ
た。すなわち、ｐＥＣＥＸ−ＭＦＥＩで形質転換したＹ
Ａ２１株の培養液ＩＬよシ、インクルージ、ンゴディを
形成している菌体が６．０ｇ得られた。得られた菌体６
．Ｏｇをリゾチーム０．２　ｍｃＩ／ｒｎｔおよびデオ
キシコール酸１■／−を含む５０ｒｎＭのＴｒｉｍ−Ｈ
Ｃｔ緩衝１（ｐＨ８，０）中で処理して溶菌させた。未
破壊の菌体を、低速遠心分離（１，５００ｘｇ、１０分
間）にて除去した後、高速遠心分離（１１，０００ｘ＆
、２０分間）にてインクルージヨンボディを沈澱として
回収した。このインクルージヨンボディにはまだ菌体断
片が多量に含まれているので、トライトンＸ−１００を
５　ｍ９７ｒｄ含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ２緩衝液
に懸濁した後、高速遠心分離（１１，０００ｘ、９．２
０分間）にて洗浄した。

洗浄したインクルージ、ンデディは、少量のＴｒｉｓ−
ＨＣ１緩衝液に懸濁して４℃で保存した。

このようにして精製することにより２７０　ｍ９のイン
クルージヨンボディが得られ、これには約５０％のサル
膵臓エラスターゼ融合蛋白が含有されていた。また、ｐ
ＥＣＥＸ−ＭＦｌｍｌで形質転換したＹＡ２１株により
生産されたインクルージヨン鱈ζデイがエラスターゼ融
合蛋白であることは、イムノブロッティング（ｉｍｍｕ
ｎｏ　−ｂｌｏｔｔｉｎｇ　）法にて確認した。

上述のように、大腸菌にて生産されたエラスターゼの大
部分は、インクルージヨンボディとなり菌体の不溶性画
分に存在しているが、一部は可溶性であり酵素活性をも
保持した状態で存在している。そこで、本酵素活性の検
出は以下のようにして行なった。

ｐＥＣＥＸ−ＭＦＥＩで形質転換したＹＡ２１株を２　
ＸＴＹ−アンピシリン培地１ｔで３７℃、１５時間振盪
培養した。培養終了後、菌体を３，０００ｘ、９．５分
間の遠心分離にて集め、２０−の緩衝液Ａ（５０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ８，０）　、　１　ｍＭのＦｊ
ＤＴＡ　、　５０　ｍＭのＮａＣ１）に懸濁し、リゾチ
ームを１０ｍｇ加えたのち５℃で２０分間保温した。次
に、デオキシコール酸を最終６度１ｍ９／−となるよう
に加え、２０℃に加温し、さらにデオキシリ−ヌクレア
ーゼを最終濃度０．１　ｍ９／−となるように加えたの
ちポリトロン破砕機で菌体を破砕した。得られた溶菌液
を８０，０ＯＯｘＪ？、４０分間遠心分離し、菌体断片
を除いたのち、セファデックスＧ−７５カラムクロマト
グラフイーにかけた。エラスターゼ活性画分は、さらに
抗体アフィニティークロマトグラフィーにて精製し、こ
れをサル膵臓エラスターゼ活性画分として以下の検定に
用いた。

試料のエラスターゼ活性は、下記の方法で測定した。ま
ず、試料液をトリプシンで処理することにより、プロエ
ラスターゼを活性化した０次に。

合成基質５ｕｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐ−ｎｌｔ
ｒｏａｎｉ　１１ｄａと反応させ、遊離したｐ−ｎ１ｔ
ｒｏａｎｉｌｉｄｅを４１０　ｎｍの吸光度を測定する
ことにより定量した０反応は、合成基質を含む０．２　
ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｔｉ衝液（ｐＨ８，０）中で２５℃
に保温することにより行なわれた。その結果、ｐＥＣＥ
Ｘ　−ＭＦＥ　１で形質転換したＹＡ２１株の試料液に
おいて、明らかな活性が検出され、大腸菌における活性
サル膵臓エラスターゼＩの生産が示された。

同時に、試料液にエラスターゼの阻害剤であるエラスタ
ーゼールもしくはＣ１−アンチトリプシンを終濃度０．
１ｍ９／ｒｎｔとなるように加えたところ、その活性が
、これらによシ阻害されることも確認した。

（７）酵母を用いたサル膵臓エラスターゼ■の生産酵母
を宿主とする場合にも動物細胞、枯草菌および大腸菌の
場合と同様に、サル膵臓エラスターゼＩのＤＮＡを、常
法にて、適描なる発現ペクタに連結して、宿主１細胞に
移入し、それを発現させることができ、その培養液中に
エラスターゼ活性の存在を確認することができた。

宿主シこは、「組換えＤＮＡ実験指針」に記載されが具
体的には同８２８８Ｃ株などが好適であった。

またプロモーターとしては、アルコール脱水見酵素遺伝
子をコードするＡＤＨＩ遺伝子などが好適であった。

【図面の簡単な説明】

紀１区は、実施例で得られたプラスミドｐＭＦＥ１−１
８　の制限酵素地図を表わし、２４部分は、シグナルペ
プチドと考えられるペプチドをコードする部分を示す。また、冒部分は、アクチペーション被プチドと考えられ
るペプチドをコードし、画部分は、成熟エラスターゼ蛋
白質をコードする部分を示す。第２図は、ｐＳＶ２−ＭＦＥＩプラスミドの構築の手順
を示すｅ　ｐ　Ｓ　Ｖ　２−βグロビンは、　ｐＳＶ２
ベクターにβ−グロビンのｃＤＮＡが挿入されているグ
ラスミドである。一方、ｐＭＦＥ　１−１８はＯｋａｙ
ａｍａ　−Ｂｅｒｇベクターにサルｊ屋、微エラスター
ゼＩ　ｃＤＮＡが挿入されているプラスミドである。Ｓ
１ヌクレアーゼ等の反応は、゛モレキュラー・クローニ
ング［Ｍａｎｌａｔｌｓ　、　Ｔ　＊　ｅｔ　ａｌ　ａ
　（ｅｄ、　）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｌｎｇ　’
　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、　
（１９８２））に記載の方法に従った。太矢印はＳＶ４
０由来のプロモーターを示し、細矢印は転写の方向を示
す。図中、Ｂ、Ｈ，Ｐは、それぞれ制限酵素Ｂｇｔ２゜Ｈｌ
ｎｄ　３　、　Ｐｓｔ　１を表わす。第３図は、ｐＢＳＥＸ−ＭＦＥＩプラスミドの構築の手
順を示す。ｐＴＵＢ　２２８は、枯草菌の複製開始点を
持ったベクターに、枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子がク
ローン化されているプラスミドである。太矢印はα−アミラーゼのプロモーターを示し、細矢印
は転写の方向を示す０図中、Ｂ、Ｅ、Ｈ。ｐ、ｓはそれぞれ制限酵素Ｂｇｔ２　、　ＥｃｏＲｌ　
、　Ｈｌｎｄ３゜Ｈｐａ　２　、　Ｓｍａ　１を表わす
。第４図は、枯草菌α−アミラーゼ遺伝子のシグナル被プ
テド領域の一部およびエラスターゼＩのアクチペーショ
ン（プチドとそれに続く９アミノ酸をコードする合成り
ＮＡリンカ−を示す。第５図は、ｐＥＣＥＸ　−ＭＦＥ１プラスミド構築の手
順を示す、斜線の領域は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子
を示す、太矢印は、ラクトース・プロモーター・オペレ
ーターを示し細矢印は転写の方向を示す。図中、Ａ、Ｂ
、Ｉ（、Ｓはそれぞれ制限酵緊Ａｃｅ　３　、　Ｂｇｔ
２　、　Ｈｉｎｄ　３　、　Ｓｍａ　１を表わす。

Claims

【特許請求の範囲】１、一般式（ I ）：【遺伝子配列があります】【遺伝子配列があります】で表わされるアミノ酸配列から成る、サル膵臓エラスタ
ーゼＩ又はその同効物。２、請求項１記載の一般式（ I ）において、サル膵臓
エラスターゼＩ又はその同効物の（Ｎ）末端が、水素原
子、Ｍｅｔ、あるいは【遺伝子配列があります】もしく
は【遺伝子配列があります】のいずれかひとつで表わされるポリペプチドの、一部又は全部を有するサ
ル膵臓エラスターゼＩ又はその同効物。３、請求項１記載のサル膵臓エラスターゼＩ又はその同
効物をコードするＤＮＡ。４、請求項２記載の、サル膵臓エラスターゼＩ又はその
同効物をコードするＤＮＡ。５、一般式（II）：【遺伝子配列があります】【遺伝子配列があります】（式中、ＸはＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧを示す。）で表
わされる塩基配列又はそれと同効の塩基配列を含有する
ことを特徴とする請求項３又は４記載のＤＮＡ。６、請求項５記載の一般式（II）において、ＤＮＡの５
′末端に、ＡＴＧ、あるいは【遺伝子配列があります】【遺伝子配列があります】のいずれかひとつで表わされるポリヌクレオチドの、一
部又は全部を有することを特徴とするＤＮＡ。７、請求項３記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ発現
ベクター。８、請求項４記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ発現
ベクター。９、請求項５記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ発現
ベクター。１０、請求項６記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ発
現ベクター。１１、組換えＤＮＡ発現ベクターがプラスミドである、
請求項７、８、９又は１０記載の組換えＤＮＡ発現ベク
ター。１２、プラスミドが、ｐＳＶ２−ＭＦＥ１である、請求
項１１記載の組換えＤＮＡ発現ベクター。１３、プラスミドが、ｐＢＳＥＸ−ＭＦＥ１である、請
求項１１記載の組換えＤＮＡ発現ベクター。１４、プラスミドが、ｐＥＣＥＸ−ＭＦＥ１である、請
求項１１記載の組換えＤＮＡ発現ベクター。１５、請求項７記載の組換えＤＮＡ発現ベクターで形質
転換せしめた宿主。１６、請求項８記載の組換えＤＮＡ発現ベクターで形質
転換せしめた宿主。１７、請求項９記載の組換えＤＮＡ発現ベクターで形質
転換せしめた宿主。１８、請求項１０記載の組換えＤＮＡ発現ベクターで形
質転換せしめた宿主。１９、請求項１１記載の組換えＤＮＡ発現ベクターで形
質転換せしめた宿主。２０、請求項１２、１３又は１４記載の組換えＤＮＡ発
現ベクターで形質転換せしめた宿主。２１、請求項１５、１６、１７、１８、１９又は２０記
載の宿主が、大腸菌、枯草菌、酵母又は動物細胞のいず
れかひとつである宿主。２２、ＣＯＳ１細胞である請求項２１記載の宿主。２３、枯草菌２０７−２５株である請求項２１記載の宿
主。２４、大腸菌ＹＡ２１株である請求項２１記載の宿主。