JPS62276A - 膵臓エラスタ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、膵臓エラスターゼをコードする塩基配列を含
有するＤＮＡで形質転換せしめた宿主を用いる膵臓エラ
スターゼの製造法に関する。

エラスターゼは、セリン・プロテアーゼの１種であり、
繊維状の不溶性蛋白質であるエラスチンを加水分解する
酵素である。エラスチンは、硬蛋白質の１ｆ！ｌ！で、
高等動物の結合組織、鍵、大動脈外皮、頚索を構成して
おり、ペプシン、トリプシンによりわずかに分解される
。

Ｂａ１ｏ’らは、動脈硬化症の研究途上で、血管壁のエ
ラスチン繊維の分解を認め、１９４９年、その分解酵素
の存在を推定した（　Ｂａ１ｏ’　、　Ｊ　、　ａｎｄ
　Ｂａｎｇａ　＋Ｌ　：Ｓｃｈｗａｉｚ　Ｚ、　Ｐａｔ
ｈｏｌ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１２．３５０（１
９４９））。

つづいて、　Ｂａｎｇａは、１９５２年、エラスチンを
特異的に分解する酵素を、膵臓のなかに発見し、結晶状
に取り出し、エラスターゼと命名した（　　ｎａｎｇａ
、　　１．　　：　　人ｅｔａ　　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　
　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｈｕｎｇ、＋　　３　　
。

３１７　（１９５２）　）。

エラスターゼは、ヒト、猿、猫、兎等はとんｒｖ／１１
、ラットが１０．２ｍ１ｊ／ｆｉ程度である。ヒトのエ
ラスターゼ活性と、年令との関係が認められており、男
４０才以上、女６０オ以上では膵臓および血漿中のエラ
スターゼ活性が著しく低下していた（　Ｌｏａｖｅｎ、
　Ｗ、　Ａ、　、　ａｎｄ　Ｍａｕｒｅａｎ　Ｍ、　Ｂ
ａｌｄｗｌｎ、　：Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｉａ、　一旦
、　１７０　（１９７１）　］。

動脈硬化症の患者の場合、膵臓のエラスターゼの活性は
、健常人のそれより著しく低下しているか、または、消
失していた（　Ｂａ１ｏ’　、　Ｊ、　ａｎｄＢａｎｇ
ａ、　Ｌ：　Ｎａｔｕｒｅ、　１７８　、３１０　（１
９５Ｂ）　）　。なお、エラスターゼはエラスチンを酵
素的に分解するだけでなく、その生合成９をも促進する
ことが、その後の研究で明らかとなってきた。

ラット、兎などを用いて、エラスターゼの薬理作用が研
究されており、以下のような効果が明らかとなった。

１）動脈壁への脂質およびカルシウムの沈着抑制作用 ２）　　動脈ＩＩノコレスチロールおよびカルシウムの
除去作用 ３）変性エラスチンに対する選択的分解作用４）動脈壁
弾力繊維の新生促進作用 ５）血清脂質低下作用 ６）リボ蛋白代謝改善作用 以上の研究をもとに行った臨床研究において、エラスタ
ーゼを経口投与した結果、以下のような効果が明らかと
なった。

１）動脈壁の弾力性・伸展性の回復作用２）血清脂質異
常の改善作用 ３）リボ蛋白代謝の改善作用 上記の研究には、ブタの膵臓より抽出精製したエラスタ
ーゼが用いられた。しかし、その抽出原料は、必ずしも
潤沢ではなく、比較的高価であり、十分量入手すること
が困難な場合も多い。そこで、本発明者らは組換えＤＮ
Ａ技術を用いて、ブタおよびヒトの膵臓のエラスターゼ
遺伝子をクローニングし、得られた組換えＤＮＡ分子を
宿主に移入して、膵臓エラスターゼ遺伝子を発現せしめ
、目的とするエラスターゼを得ることのできる技術の開
発研究を行った結果、本発明を完成するにいたった。

すなわち、本発明は、膵臓エラスターゼをコードする塩
基配列を含有するＤＮＡを用いて形質転換せしめた宿主
を培養することによるブタおよびヒトの膵臓エラスター
ゼの製造法を提供するものである。

現在、ブタ・膵臓エラスターゼについては２種の存在が
知られており、いずれも本発明者らによってそのアミノ
酸配列は明らかにされている。

すなわち、本発明は、ブタ・膵臓エラスターゼ−１をコ
ードする塩基配列を含有するＤＮＡを用いて形質転換せ
しめた宿主を培養することによるブタ・膵臓エラスター
ゼ−１の製造法を提供するものである。

本発明は一般式 ％式％ Ｌｅｕ　　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　　８ｅｒ　　Ｐｒ
ｏ　　Ｏｙｓ　　Ｔｙｒ　　ＩＩｓ　　ＴｈｒＧｌｙ　
　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　　Ｌｓｕ　　Ｔｈｒ　　Ａｒｇ　Ｔ
ｈｒ　　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＧｉｎＬｅｕ　　人１ａ　Ｇ
ｉｎ　　Ｔｈｒ　　Ｌｓｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　　Ａｌａ
　　Ｔｙｒ　　ＬａｕＰｒｏ　　Ｔｈｒ　　Ｍａｌ　　
Ａｓｐ　　Ｔｙｒ　Ａｌａ　　ｒｌｅ　　Ｏｙａ　　８
ｅｒ　　５ｅｒ８ｅｒ　　Ｂａｒ　　Ｔｙｒ　　Ｔｒｐ
　Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　Ｌｙｓ　
　Ａｓｎ５ｅｒ　Ｍｅｔ　Ｍａｌ　　Ｏｙｓ　Ａｌａ　
Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａ＋ｓｐ　Ｇｌｙ　ＭａｌＡｒｇ　Ｓ
ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｏｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　　Ｓ
ｅｒ　Ｇｌｙ　ＧｌｙＰｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ｈｌｓ　　
Ｏｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｔ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｙ　Ｇ
ｉｎ　　ＴｙｒＡｒｇ　　Ｖａｔ　　Ｈｉｓ　　Ｇｌｙ
　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　８ａｒ　　Ｐｈｅ　　Ｍａｌ　
　８ｅｒ人ｒｇ　　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　　Ｏｙｓ　　Ａａ
ｎ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　Ａｒｇ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒ
。

Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　Ｐｈｅ　　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｖａ
ｌ　　Ｓｉｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　　ｌ１ｅＳ＠ｒ　　Ｔ
ｒｐ　　ＩＩｓ　　人ｓｎ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　　Ｉｌ＠
　人１ａ　　８ｅｒ　　Ａｓｎで表わされるアミノ酸配
列で示されるブタ・膵臓エラスターゼ−１の製造法に関
する。そして式中、（Ｎ）−末端には水素原子、Ｍｅｔ
、またはＴｈｒ　Ｇｌｎ　人ｓｐ　　ｒｈｏ　　Ｐｒｏ
　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｒｇ　また
はＭｅｔ　　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　Ｍａ
ｌ　　Ｖａｌ　　Ａｌａ　　５ｅｒＬｅｕ　　Ｖａｔ　
　Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｈｌｓ　　Ｓｅｒ　　Ｔ
ｈｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ特に、一般式 ％式％ （式中、ＸはＴＡ人、　ＴＧＡまたはＴＡＧを示す）で
表わされる塩基配列またはそれと同効の塩基配列を含有
するＤＮＡを用いた製造法に関する。

上記ＤＮＡ　（ＩＮ）は、その５′末端にＡ’ｆ’Ｇ、
　　（５’）　−ＡＯＯＯＡＧ　　ＧＡＯＴＴＴ　　０
０人　ＧＡＡ　　人００　人ＡＯＧｏｏ　　ＯＧＧ　　
−（３′）または（５′）−人ＴＧ　ＯＴＧ　ＣＧＯＴ
ＴＧ　ＯＴＧ　Ｇ’ｌ’ＧＧＴＧ　　Ｇｏｏ　　Ｔｏｏ
　　ＯＴＧ　　ＧＴＯＯＴＴ　　ＴＡＴ　　ＧＧＡ　　
ＧＡＯＡＧＯＡＯＯＯＡＧ　　ＧＡＯＴＴＴ　　ＯＯＡ
　　ＧＡＡ　　ＡＯＯＡＡＯＧｏｏ　　ＯＧＧ　　−（
３′）を有してもよい。

ＤＮＡ　（ＩＩ）の５′末端にＡＴＧを有するときには
、ポリペプチド（１）に加えて、（１）の（Ｎ）−末端
にＭａｔを有するポリペプチドをコードする。

ＤＮＡ（ＩＩ）の５′末端に（５′）−人０００ＡＧ　
ＧＡＯＴＴ’ｒ　００人ＧＡＡ人００人人ＯＧｏｏ　Ｏ
ＧＧ　−（３’）を有するときには、ポリペプチド（１
）に加えて（Ｉ）の（Ｎ）−末端にＴｈｒ　Ｇｉｎ　　
Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　
Ａｓｎ　Ａｌａ　　Ａｒｇを有スるポリペプチドをコー
ドする。

ＤＮＡ　（ＩＩ）の５′末端に （５’）−ＡＴＧ　ＯＴＧ　ＯＧＯＴＴＧ　ＯＴＧ　Ｇ
ＴＧ　ＧＴＧ　Ｇｏｏ　ＴＯＯＯＴＧ　　ＧＴＯＯＴＴ
　　ＴＡＴ　　ＧＧＡ　　ＯＡＯＡＧＯＡＯＯＯＡＧ　
　ＧＡＯＴ’ｌ’Ｔ　ＯＯＡ　ＧＡＡ　ＡＯＯＡＡＯＧ
ｏｏ　ＯＧＧ　−（３’）を有するときには、ポリペプ
チド（１１に加えて（りの（Ｎｌ−末端にＭａｔ　　Ｌ
ｅｕ　　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　Ｖａ
ｌ　　Ａｌａ　　５ｅｒＬｅｕ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｔｙ
ｒ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ
Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａａｎ　Ａｌａ　Ａ
ｒｇを有するポリペプチドをコードする。

ブタ・膵臓エラスターゼ■については、七〇Ｎ末端から
１９個のアミノ酸配列が報告されている（Ｌａｍｙ、Ｆ
、、ｅｔ　ａｌ、：ｉｎ　Ｅｌａｓｔｉｎ　ａｎｄ　Ｅ
ｉｌａｓｔｉｃＴｉｓｓｕｓ　（Ｓａｎｄｂｅｒｇ、Ｌ
、　ｅｔ　ａｌ、、　ａｄｓ、）　、　ｐｐ、１６５−
１７５　、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒａａａ、　Ｎｅｗ　Ｙ
ｏｒｋ　（１９７７）　］のみで、その構造は現在まで
まったく不明であった。

ところが、本発明者らにより、そのアミノ酸配列のすべ
ておよびそのＤＮＡ配列のすべてが明らかにされるに至
った。上述の如く、わずかに明らかにされたアミノ酸配
列、すなわち○ｙｓ　ＧｌｙＶａｌ　　Ｐｒｏ　　Ａｌ
ａ　　ｒｌｅ　　Ｌｙｅ　　Ｐｒｏ　　Ａｌａ　　Ｌｅ
ｕ　　Ａｓｘ　　ＰｈｅＡ８Ｘ　ＧＩＸ　Ａｒｇ　ＩＩ
＠Ｍａｌ　Ａｓｘ　Ｇｌｙ　、　　とは異なり、本発明
がまったくの新規物質の製造法に係るものであることが
明らかである。

すなわち、本発明は、ブタ・膵臓エラスターゼ−２をコ
ードする塩基配列を含有するＤＮＡを用いて形質転換せ
しめた宿主を培賽することによるブタ・膵臓エラスター
ゼ−２の製造法を提供するものである。

本発明は一般式 ％式％ で表わされるアミノ酸配列で示されるブタ・膵臓エラス
ターゼ−２の製造法に関する。そして式中、（Ｎ）−末
端には水素原子、Ｍｅｔ、またはＭｅｔ　　ＩＩｓ　　
Ａｒｇ　人１ａ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｓ
ｅｒ　　Ｔｈｒ　　ＬｅｕＶａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａ
ｌａ　Ｌｅｕ　８ｅｒを有していてもよい。

特に、一般式 ％式％ （式中、ＸはＴＡ人、　ＴＧＡまたはＴＡＧを示す。）
で表わされる塩基配列またはそれと同効の塩基配列を含
有するＤＮＡを用いた製造法に関する。

上記ＤＮＡ　ＱＶ）は、その５′末端にＡＴＧ、または
（５’）−ＡＴＧ　ＡＴＯＡＧＧ　Ｇｏｏ　ＯＴＡ　Ｏ
ＴＧ　ＯＴＧ　ＴＯＴ　ＡＯＡＯＴＧ　ＧＴＧ　ＧＯＴ
　ＧＧＡ　ＧＯＴ　ＯＴＯＡＧＯ−（３’）を有してい
てもよい。

ＤＮＡ　（ＩＹ）の５′末端に人ＴＧを有するときには
、ポリペプチド値）に加えて、（１）の（Ｎ）−末端に
Ｍｅｔを有するポリペプチドをコードする。

ＤＮＡ　（ＩＴ）の５′末端に（５′）−人’Ｉ’Ｇ　
ＡＴＯ人ＧＧ　Ｇｏｏ　ＯＴ人ＯＴＧ　　ＯＴＧ　　Ｔ
ＯＴ　　人Ｃ人　０’ｒＧ　　ＧＴＧ　　ＧＯ’ｒ　　
ＧＧＡ　　ＧＯ’ｒ　　ＯＴＯ人ＧＯ−（３’）を有す
るときには、ポリペプチド（１）に力口えて（璽）の（
川−末端にＭｅｔ　ＩＩｓ人ｒｇ　Ａｌａ　ＬｅｕＬｅ
ｕ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｍａ
ｌ　　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　　ＬｅｕＳｅｔを有す
るポリペプチドをコードする。

また、現在、ヒト・膵臓エラスターゼについては２種の
存在が、すでに、知られているが、その特性付けは、い
まだ十分にはおこなわれておらず、そのうちの１種のア
ミノ酸配列は、そのプロ部分の１２個および本体のわず
か４個が明らかにされている（０．Ｌａｒｇｍａｎ　ｅ
ｔ　ａｌ：Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｌｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　６２３　、２０８　（１
９８０）　）のみで、その構造は、現在までまったく不
明であった。ところが、本発明者らにより、そのアミノ
酸配列のすべておよびそのＤＮＡ配列のすべてが明らか
にされるに至った。

すなわち、本発明は、ヒト・膵臓エラスターゼ−１をコ
ードする塩基配列を含有するＤＮＡを用いて形質転換せ
しめた宿主を培養することによるヒト・膵臓エラスター
ゼ−１の製造法を提供するものである。

本発明は一般式 ％式％ で表わされるアミノ酸配列で示されるヒト・膵臓エラス
ターゼ−１の製造法に関する。そして式中、的）−末端
には水素原子、Ｍｅｔ　、あるいはプロおよびプロ部分
として Ｍｅｔ　Ｍａｔ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓ
ａｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＬｅｕ　　Ｖａｔ　　Ａ
ｌａ　　Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ
　　Ｇｌｙ　　Ｐｒ。

Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｈｌｓ　　！１ｉａｒ
　　８ｅｒ　　８ｅｒ　　人ｒｇの一部または全部を有
していてもよい。

特に、一般式 ％式％ ＡＴＯＣｊＧＯＴｏｏ　　ＧＧＯＴＧＯＡＡＯＧＧＴ　
　ＧＡＯＴＯＴ　　ＧＧＡＧＧＡ　　Ｃｏｏ　　ＯＴＯ
ＡＡＯＴＧＯ０００ＡＯλ　ＧＡＧ　　ＧＡ’ｒ　　Ｇ
ＧＴＧＧ（ｌ　　ＴＧＧ　　ＯＡＧ　　ＧＴＯＯＡＯＧ
ＧＴ　　ＧＴＧ　　ＡＯＯＡＧＯＴＴＴＧＴＴ　　ＴＯ
Ｔ　　ＧＯＯＴＴＴ　　ＧＧＯＴＧＯＡＡＯＴＴＯＡＴ
ＯＴＧＧＡＡＧ　　０００　　ＡＯＧ　　ＧＴＧ　　Ｔ
ＴＯ人ＯＴ　　ＯＧＡ　　ＧＴＯＴｏｏ　　Ｇｏ。

ＴＴＯＡＴＯＧＡＯＴＧＧ　　ＡＴＴ　　ＧＡＧ　　Ｇ
ＡＧ　　ＡＯＯＡＴＡ　　Ｇｏ人ＡＧＯＯＡＯ−Ｘ　　
（３’） （式中、ＸはＴＡＡ　、　ＴＧＡまたはＴＡＧを示す）
で表わされる塩基配列またはそれと同効の塩基配列を含
有するＤＮ人を用いた製造法に関する。

上記ＤＮ人（Ｖｌｌは、その５′末端に人ＴＧ　、また
は（５′）−ＡＴＧ　　ＡＴＧ　　ＣＴＯＯＧＧ　　Ｃ
！ＴＧ　　ＯＴＯＡＧＴ　　Ｔｏｏ　　ＯＴＯＯＴＯ○
ＴＴ　　ＧＴＧ　　ＧＣＯＧＴＴ　　Ｇｏｏ　　ＴＯＡ
　　ＧＧＯＴＡＴ　　ＧＧＯ０ＯＡ００Ｔ　　Ｔｏｏ　
　ＴＯＴ　　ＯＡＯＴＯＴ　　Ｔｏｏ　　ＡＧＯＯＧＯ
−（３’）の一部または全部を有していてもよい。

ＤＮ人（ＶＴ）の５′末端にＡＴＧを有するときには、
ポリペプチド（Ｖ）に加えて、（Ｖ）の（Ｎ）−末端に
Ｍｅｔを有するポリペプチドをコードする。

ＤＮ人（Ｖｌ）の５′末端に （５’）−ＡＴＧ　　ＡＴＧ　　ＯＴＯＯＧＧ　　ＯＴ
Ｇ　　ＯＴＯＡＧＴ　　Ｔｏｏ　　ＯＴＯ０ＴＯＯＴＴ
　　ＧＴＧ　　Ｇｏｏ　　ＧＴＴ　　Ｇｏｏ　　ＴＯＡ
　　ＧＧＯＴＡＴ　　ＧＧＯ０ＯＡ００Ｔ　　Ｔｏｏ　
　ＴＯＴ　　ＯＡＯＴＯＴ　　Ｔｏｏ　　ＡＧＯＯＧＯ
−（３’）を有するときには、ポリペプチド（Ｖ）に加
えて（Ｖ）の（Ｎｌ−末端に （Ｎ）−Ｍｅｔ　Ｍｅｔ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌ
ｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＬｅｕ　Ｖａｌ
　Ａｌａ　Ｍａｌ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　
Ｇｌｙ　Ｐｒ。

Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　８ｅｒ　Ｈｌｓ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　８
ｅｒ　Ａｒｇ　−（０）を有するポリペプチドをコード
する。

また、ヒト・膵臓エラスターゼ−■のアミノ酸配列は、
Ｎ末端から１６個が明らかにされている［：　Ｌａｒｇ
ｍａｎ、　００ａｔ　ａｌ：１３ｉｏｃｈ１ｍ、　Ｂｌ
ｏｐｈｙａ、　Ａｃｔａ、６２３゜２０８　（１９８Ｇ
　）　］のみで、その構造は、現在までまったく不明で
あった。ところが、本発明者らにより、そのアミノ酸配
列のすべておよびそのＤＮＮ人動列すべてが明らかにさ
れるに至った。

すなわち、本発明は、ヒト・膵臓エラスターゼ−２をコ
ードする塩基配列を含有するＤＮ人を用いて形質転換せ
しめた宿主を培養することによるヒト・膵臓エラスター
ゼ−２の製造法を提供するものである。

本発明は一般式 ％式％ で表わされるアミノ酸配列で示されるヒト・膵臓エラス
ターゼ−２の製造法に関する。そして式中、（Ｎ）−末
端には水素原子、Ｍａｔ　、またはＭｅｔ　Ｉｌｅ　Ａ
ｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈ
ｒ　ＬｅｕＶａｌ　　人１ａ　Ｇｌｙ　人１ａ　　Ｌｅ
ｕ　　Ｓａｒを有していてもよい。

特に、一般式 ％式％ 人００　　ＴＧＯＧＧＡ　　ＧＧＧ　　Ｔｏｏ　　ＯＴ
Ｇ　　ＡＴＡ　　Ｇｏｏ　　人ＡＯＡＧＯＴＧＧ　ＧＴ
ＯＯ’ｒＧ　　ＡＯＧ　　ＧＯ’ｒ　　Ｇｏｏ　　ＯＡ
ＯＴＧＯＡＴＣ）ＡＧＯＴｏｏ　　Ｔｏｏ　　ＡＧＧ　
　人Ｔｏ　　ＴＡＯＣＧＯＧＴＧ　　ＡＴＧ　　ＯＴＧ
　　ＧＧＯＯＡＧ　　ＯＡＴ　ＡＡＯ０ＴＯＴＡＯＧＴ
’ｒ　　ＧＯＡ　　ＧＡＧ　　Ｔｏｏ　　ＧＧＯＴＯＧ
　　ＯＴＧ　　Ｇｏｏ　　ＧＴＯＡＧＴ　　Ｇ’ｒＯＴ
Ｏ’ｒ　　ＡＡＧ　　ＡＴＴ　　ＧＴＧＧＴＧ　　ＯＡ
ＯＡＡＧ　　ＧＡＯＴＧＧ　　ＡＡＧ　　Ｔｏｏ　　Ａ
ＡＧ　　ＯＡＧ　　ＧＴＯＴｏｏ　へ人人　ＧＧＧ　　
ＡＡＯＧＡＯＡＴＴ　　Ｇｏｏ　　ＯＴＧ　　ＯＴＯＡ
ＡＡＯＴＧ　　ＧＯＴ　　ＡＡＯ０００ＧＴＯＴｏｏ　
　ＯＴＯ人ＯＣ０人０　λＡＧＡＴＯＯＡＧ　　ＯＴＧ
　　Ｇｏｏ　　ＴＧＯＯＴＯＯＯＴ　　ＯＯＴ　　ＧＯ
ＯＧＧＯＡＯＯＡＴＴ　　ＯＴＡ　　０００　　ＡＡＯ
ＡＡＧ　　ＴＡＯ０００ＴＧＯＴＡＯＧＴＯ人ＯＡ　　
ＧＧＯＴ’ＧＧ　　ＧＧＡ　ＡＧＧ　　ＯＴＧ　　ＯＡ
Ｇ　　ＡＯＯ八人０ＧＧＧ　　ｅＯＴ　　ＯＴＯＯＯＴ
　　ＧＡＴ　、ＧＡＯＯＴＧ　　ＡＡＧ　　ＯＡＧ　　
ＧＧＯＯＧＧ　　ＴＴＧ　　ＯＴＧ　　ＧＴＴ　　ＧＴ
Ｇ　　ＧＡＯＴＡＴ　　ＧＯＯ人００　　ＴＧＯＴｏＯ
ＡＧＯＴＯＴ　　ＯＧＯ’ＦＯＧ　　ＴＧＧ　　ＧＧＯ
ＡＧＯＡＯＯＧＴＧＡＡＧ　　ＡＯＧ　　八人Ｔ　　Ａ
ＴＧ　　ＡＴＯ’ｒＧＴ　　ＧＯＴ　　ＧＧＧ　　ＧＧ
’ｒ　　ＧＡＴＧＧＯＧＴＧ　　Ａ’ｒＡ　　ＴＧＯ人
００　　’ｒＧｏ　　ＡＡＧ　　ＧＧＡ　　ＧＡＯＴＯ
ＯＧＧＴ　　ＧＧＧ　　ＯＯＧ　　ＯＴＧ　　ＡＡＯＴ
ＧＴ　　ＯＡＧ　　００人　ＴＯＴ　　ＧＡＯＧＧＯＯ
ＧＧ　　ＴＧＧ　　ＧＡＧ　　ＧＴＧ　　ＯＡＴ　　Ｇ
ＧＯＡＴＯＧＧＯＡＧＯＯＴＯＡＯＧ　　ＴＯＧ　　Ｇ
ＴＯＯＴＴ　　ＧＧＴ　　ＴＧＯＡＡＧ　ＴＡＯＴＡＯ
ＴＡＯＡＡＧ　　０００　　ＴｏＯＡＴＯ’Ｉ”Ｉ’Ｏ
ＡＯＧ　　ＯＧＧ　　ＧＴＯＴｏ。

人ＡＯＴＡＯＡＡＯＧＡＯＴＧＧ　　ＡＴＯ人Ａ’ｒ　
　ＴＯＧ　　Ｇ’ｒＧ　　ＡＴＴＧＯＡ　ＡＡＴ　ＡＡ
Ｏ−Ｘ　（３’λ（至） （式中、ＸはＴＡＡ　、　ＴＯＡまたはＴＡＧを示す。

）で表わされる塩基配列またはそれと同効の塩基配列を
含有するＤＮＡを用いた製造法に関する。

上記ＤＮＡ　＠は、その５′末端に人ＴＧ、または（５
’）ＡＴＧ　　ＡＴＴ　　ＡＧＧ　　ＡＯＯＯＴＧ　　
ＯＴＧ　　ＯＴＧ　　ＴＯＯ人ＯＴ　　ＴＴＧＧＴＧ　
ＧＯＴ　ＧＧＡ　Ｇｏｏ　ＯＴＯＡＧＴ　−（３’）を
有していてもよい。

ＤＮＡ　＠の５′末端に人ＴＧを有するときには、ポリ
ペプチド（至）に加えて、（至）の（Ｎ）−末端にＭｅ
ｔを有するポリペプチドをコードする。

ＤＮＡ　＠の５′末端に （５′）−人ＴＧ　　ＡＴＴ　　ＡＧＧ　　ＡＯＯＯＴ
Ｇ　　ＯＴＧ　　ＯＴＧ　　Ｔｏｏ　　ＡＯＴ　　ＴＴ
ＧＧＴＧ　　ＧＯＴ　　ＧＧＡ　　Ｇｏｏ　　ＯＴＯＡ
ＧＴ　　−（３’）を有するときには、ポリペプチド（
至）に加えて（旧の（Ｎ）−末端に Ｍｅｔ　　ＩＩｓ　　Ａｒｇ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　
Ｌｅｕ　　Ｌ＠ｕ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　ＬｅｕＶａ
ｌ　　Ａｌａ　Ｇｌｙ　人１ａ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒを
有するポリペプチドをコードする。

本発明の膵臓エラスターゼの製造法は以下に示すステッ
プによりなる。

（イ）　膵臓より、エラスターゼをコードするｍＲＮＡ
を分離する。

（ロ）　このｍ　ＲＮＡおよび逆転写酵素を用いて単鎖
のｃ　ＤＮＡを合成する。

（ハ）　このｃ　ＤＮＡをもとに、二重鎖ＤＮＡを合成
する。

に）得られた二重鎖ＤＮＡをベクターに組み込む。

（ホ）　この組換えプラスミドを、たとえば大腸菌、枯
草菌、酵母、動物細胞などの宿主に導入して形質転換さ
せる。

（へ）該宿主を培養して得られる菌体より、目的とする
ＤＮＡを含有するプラスミドを単離する。

（ト）　そのプラスミドから目的とするクローン化ＤＮ
Ａを切り出す。

（イ）　切り出したクローン化ＤＮＡを発現ベクターへ
組み込んだ後、適当な宿主細胞へ導入する。

（す）　　発現ベクターを導入した宿主細胞を培養し、
エラスターゼを生産させる。

ここで用いられる膵臓を生体より採取後、可急的速かに
、ｍ　ＲＮＡ分離に供することが望しい。

それができない場合には、それを液体窒素で凍結し、−
８０℃で保存することが望ましい。

膵臓のｒＬＮＡ抽出にあたっては、グアニジンチオシア
ネート・ホット・フェノール法、グアニジン　チオシア
ネート・塩化セシウム法なども採用しうるがグアニジン
　チオシアネート−グアニジン　塩酸塩法が以下の点で
、上述２法より優れている。（１）操作が簡単である。

（２）抽出・回収率が高い。（３）比較的大量の臓器か
らの抽出が可能である。（４）　ＤＮＡが混入してこな
い。（５）ＲＮＡの分解が少ない。

真核細胞の細胞質に存在するｍ　ＲＮＡの多くは、その
３′末端にポリ人配列をもつことが知られているので、
この特徴を利用して、オリゴ（ｄＴ）セルロースのカラ
ムにｍ　ＲＮＡを吸着せしめて、つぎに、これを溶出し
て精製する。

得られたｍ　ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて
相補的二重鎖ＤＮＡを合成するが、その方法としてはＳ
１ヌクレアーゼ法（ＢｆｓｔｒａｔｌａｄｌａＨＡ。

ｅｔａｌ、　：０ｓｌｌ、ユ、　２７９（１９７６））
、Ｌａｎｄ法（Ｌａｎｄ。

Ｈｌａｔ　　ａｌ、：Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　
　Ｒａｓ、、９．２２５１　（１９８１））、Ｏｋａｙ
ａｍａ−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ，ａｎｄ　Ｐ
＋Ｂｅｒｇ　：　Ｍｏｌ。

０ａ１１．Ｂｉｏｌ、、ユ、　１６１　（１９８２）］
　、　Ｏ，Ｊｏｏｎ　Ｙｏｏ法（０，Ｊｏｏｎ　Ｙｏｏ
　５ｔａ１．　：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、１ｌ
ｌｃ１．Ｕ８Ａ、７９゜１０４９（１９Ｂ２）　３など
採用しうる。

つづいて、得られたｃ　ＤＮＡに、ｄλ−ｄＴまたはｄ
Ｇ−ｄｏのホモポリマーのティリングを行い、これをプ
ラスミドの制限酵素切断部位に挿入する。

ティリングのホモポリマーとしては、その安定性からし
て、ｄＧ−ｄｏが好適である。

つぎに、得られた組換えプラスミドを大腸菌、たとえば
ｘ１７７Ｂ株、Ｉ、ｇ３９２株、ＲＲＩ株などに導入し
ズ形質転換させ、テトラサイクリン耐性あるいはアンピ
シリン耐性を、指標として、組換え体を選択することが
できる。本発明においては、例えばｃ　ＤＮＡが、ｐＢ
Ｒ３２２のアンピシリン層性遺伝子部位に挿入されてい
るときは、アンピシリン感受性、テトラサイクリン耐性
の大腸菌のコロニーを選択する。

得らねた組換え体のなかから、エラスターゼをコードす
るＤＮＡを含有するクローンを選択するためには、その
アミノ酸配列に対応する塩基配列をもったオリゴヌクレ
オチドを化学合成し、これを５２ｐでラベルしたプロー
ブを用いるコロニー・ハイブリダイゼーション法（Ｇｒ
ｕｎｓｔｅｉｎ。

Ｍ、ａｎｄ　Ｈｏｇｎｅｓｓ、　Ｄ、　８．　：　Ｐｒ
ｏｅ、　Ｎａｔｌ、λｃａｄ、　８ｅｉ。

ＵＳＡ　、　７２　、３９６１　（１９７５））が効果
的である。しかし、本発明においては、本方法を採用し
なくても目的を達しえた。

選択されたクローンに含有される塩基配列のＮｕｃｌｓ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｇ、、　９　、３０９　（１９
８１）　］およびＭａｘａｍ−ＧＩｌｂｅｒｔ法（Ｍａ
ｙａｍ、人、Ｍ、ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｗ、：　Ｐ
ｒｏｅ。

Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　８ｃ１．　Ｕ８Ａ、　７４　
、５６０　（１９７７）　）で実施しうる。本発明では
これらの方法を採用し、膵臓のエラスターゼを完全にコ
ードするＤＮＡを有するりａ−ンを決定した。

つぎに、得られたクローンからエラスターゼ遺伝子をき
り出し、これを適当な発現ベクターにつないで、適当な
宿主細胞に導入して発現せしめることができる。

なお、組換えＤＮＡ技術を用いて目的の有用蛋白質を多
量に生産せしめるのに、最も重要かつ影響の大きい要因
の１つとして発現ベクターの構造があげられる。特に、
プロモーターの種類であるといわれており、強し一プロ
モーターはど有用蛋白質の生産量が良好であるとされて
いる。ところが、本発明においては、今までの技術常識
に反して弱いプロモーターはど高い生産性を示すことを
見出して発明を完成した。

使用されるプロモーターとしては、弱いプロモーター、
即ち、ラクトース（ｌａｃ）プロモーターの強度を１と
したときに、比較強度１０以下の。

プロモーターが好適に使用しうる。このようなプロモー
ターとしては例えばラクトース（ＸａＣ）プロモーター
、　　　。

、ラクトースＵＶ５　（１ａｃ−ＵＶ５）プロモーター
（比較強度５）、β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモー
ター（比較強度３）、＝キ≠←＃件件≠井牛などを使用
しうる。特に好適にはラクトース（ｌａｃ）プロモータ
ーであった。

宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌などの細菌、酵母な
どの微生物のはか、動物細胞を採用即ち、同一の発現ベ
クターを多種類の大腸菌に形質転換して膵臓エラスター
ゼの発現生産量を比較検討した結果、宿主細胞によって
生産性が極めて大きく異なることおよび特に大腸菌ＹＡ
２１株において高い生産性を示すことを見出して本発明
を完成した。

本発明のＤＮＡを宿主細胞に、形質転換、導入する方法
としては、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ　、
　Ｄ。

：　ＪｏＭｏｌ、　Ｂｌｏｔ、、　１６６　、５５７（
１９８３）　）、塩化ルビジラム法（Ｋｕｓｈｎｅｒ、
　８．Ｒ１：　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ　（ａｄｓ。

Ｂｏｙｅｒ、Ｈ，Ｗ、　ａｎｄ　　Ｓ、　　ＮｉｓＮ１
５ｃｏ　　）　　、　　ｐ、　Ｈ、Ｅｌｓａｖｉａｒ（
１９７ｇ）　］　、塩化カルシウム法（Ｄａｇｅｒｔ、
Ｍ、ａｎｄＳ、Ｄ、Ｂｈｒｌｉｃｈ　：Ｇｅｎａ、　６
　、２３（１９７９）　）、低ｐＨ法〔高木康敬編著：
遺伝子操作マニュアル、　ｐ、４９゜講談社すイエンテ
イフイク（１９８２）　：ｌ　等を採用しつる。

このようにして得た宿主細胞（組換え体）を、公知の培
地で培養し、培養物の中に、前述のポリペプチドまたは
七〇同効物な生成蓄積せしめ、これを採取することによ
り本発明の目的を達することができる。

培地としては、グルコース、カザミノ酸などからなる培
地、例えば、Ｍ９培地（：Ｍｉｌｌｓｒ、　Ｊ、：Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ、　４３１〜４３３（Ｏａｌｄ　ｓｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　
（１９７２）　）　］が挙げられる。

組換え体の培養は、通常、１５〜４３℃で、３〜２４時
間行い、必要に応じて、通気や攪拌を加えることができ
る。なお、動物細胞を宿主細胞とする場合には、３〜１
０日間の培養を必要とする。

培養後は、組換え体細胞を、公知の方法、例えば遠心分
離等で集める。宿主細胞として、枯草菌、酵母、動物細
胞などを用いる場合、ベクターの選択によっては、生産
されたエラスターゼは細胞外に出て、上澄液に含まれる
。

一方、大腸菌を宿主細胞とした場合、生産されたエラス
ターゼは、不溶性の蛋白として、その細胞内の１ｎｃｌ
ｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ　Ｋ含まれる場合が多い。

この場合は、菌体を破壊して遠心分離することにより、
生産されたエラスターゼは沈澱物として得られる。

菌体の破壊の方法としては、超音波処理、リゾチーム処
理、凍結融解処理等を採用することができる。該上澄液
または沈澱物からのエラスターゼの単離は、通常知られ
ている蛋白質の精製方法により実施しつる。

本発明により製造されるエラスターゼは、ブタおよびヒ
ト膵液より抽出精製したエラスターゼと同等の生物学的
活性を示し、これと同様の目的に、同様の用法により使
用することができる。

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが
、こ４らは本発明の範囲を制限するものではない。

実施例１　ブタ・膵臓エラスターゼ−１１）ブタ膵臓よ
りのｍ　ＲＮＡの分離 ８〜９ｇのブタ膵臓をグアニジンチオシアネ−）溶液（
４Ｍのグアニジンチオシアネート、１％のサルコシル、
２０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＢＤＴ人）、２５
ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨｙ、ｏ）１００ｍＭの
２−メルカプトエタノール、０．１％のアンチフオーム
人）中でポリトロンによって破壊、変性した後、遠心し
て上澄を得た。これに０．０２５倍量の１Ｍ酢酸および
０．１５倍量のエタノールを加え、−２０℃で数時間冷
却した後、遠心処理によ（ｐＨｙ、ｏ）　、　５ｍＭの
ジチオスレイトール（ＤＴＴ））に懸濁し、０．０２５
倍量の１Ｍ酢酸および０．５倍量のエタノールを加え、
−２０℃で数時間冷却した後、酸、エタノールを加え、
−２０℃に冷却した後、遠心処理で沈澱を集めた。次に
、この沈澱な工後にエタノールでＲＮＡを沈澱させた。

遠心分離により沈澱を集め、５３．９．９のＲＮＡを得
た。

こうして得たＲＮＡを高塩溶液（０，５ＭのＭａｉｌ　
。

２０ｍＭのＴｒｉｍ　−ＨｏＩ　（ｐＨ７，５）　、　
１　ｍＭのＥＤＴＡ　、　０．１％のドデシル硫酸ナト
リウム（ｓｎｓ）　）中でオリゴ（ｄＴ）セルロースカ
ラムに吸着させた後、ポリ（Ａ）を含むｍ　ＲＮＡを低
塩溶液（１０ｍＭのＴｒｉｍ　−Ｈｏ１（ｐＨ７，５）
　、　１　ｍＭ　１７）　ＥＤＴＡ、ｏ、ｏｓ％のＳＤ
Ｓ　）で溶出させ、５４０μ９０ｍ　ＲＮＡを得た。

２）単鎖ｅ　ＤＮ人の合成 上記で得たｍ　ＲＮＡと逆転写酵素を用いて、５０゛μ
ｌの反応液（１ｏ　ｐｇのｍ　ＲＮＡ、１０／、ｌｐの
オリゴ（ｄＴ）１６＋５０ｍＭのＴｒｉｍ　−ＨｏＩ　
（ｐＨ８，３）　、　５０ｍＭのＫＯＩ　、　１０ｍＭ
のＭｇ０Ｚ２　＊　１０　ｍＭのＤＴＴ　、　１　ｍＭ
ずつのｄ　Ｏ’ｒＰ　、　ｄＧＴＰおよびｄ　ＴＴＰ　
、　０．６　ｍＭの、ｄ　ＡＴＰ　、　５０７ｊＯ１の
α−３２Ｐ−ｄＡＴＰ　、　５０ユニツトの逆転写酵素
）中で４２℃で１時間保温し、単鎖ｃ　ＤＮＡを合成し
た。

反応後、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２００カラムを用いて
低分子量の核酸を除き、次いで、０．３ＭのＮａＯＨお
よび２ｍＭのＩＴ人の溶液中で２３℃、１６時間保温し
て、ＲＮ人を分解除去した。

３）二重鎖ｃ　ＤＮＡの合成 合成した単鎖ｃ　ＤＮＡおよびターミナルトランスフェ
ラーゼを、５０μｌの反応液（０１Ｍのカコジル酸カリ
ウム（ｐＨ７，０）　、　１００μｇ〜のウシ血清アル
ブミン（Ｂ８Ａ）　、　０．１ｍＭのＤＴＴ　、　１ｍ
Ｍの０ａＯ１！２　＋　０−６ｍＭのｄＡ’ｌ’Ｐ　、
　５０ユニツトのターミナルトランスフェラーゼ）中で
３０℃で２０分間作用させ、その３′末端に２０個以上
のデオキシアデノシン鎖を付加させた。

次に、得られたデオキシアデノシン鎖をもったｅＤＮＡ
を採取し、これを逆転写酵素含有の、５０ａｔの反応液
（１０μｌｌのオリゴ（ｄＴ）１６．５０ｍＭのＴｒｉ
ｓ−Ｈｏｔ　（ｐＨ１１，３）　、　５０ｍＭのＫＯＩ
　＋　１０　ｍＭのＭｇＯ１２＋１０ｍＭのＤＴＴ　、
　１　ｍＭずつのｄＡＴＰ　、　ｄＯＴＰ　、　ｄＧＴ
ＰおよびｄＴＴＰ　、　５Ｇユニツトの逆転写酵素）中
で、３７℃で１０分間、つづいて、４２℃で５００分間
反応せた。

反応後、フェノールで除蛋白し、エタノールでｃ　ＤＮ
Ａを沈澱させた。次いで遠心でこれを集め、ＤＮＡポリ
メラーゼＩを５０μ！の反応液（５０ｍＭのリン酸緩衝
液（ｐＨ７，４）　、　６．６ｍＭのＭｇＯ１２、１，
５ｍＭのＤＴＴ　、　０．４ｍＭずつのｄＡＴＰ　、　
ｄｏ’ｒＰ　、　ｄＧ’ｒＰおよびｄＴＴＰ　、　７．
５ユニツトのＤＮＡポリメラーゼＩ）中で３７”Ｃで２
時間反応させ、二重鎖ｃ　ＤＮＡを合成した。５ｅｐｈ
ａｄｅｘ　Ｇ−２００カラムを用いて低分子量のｃ　Ｄ
ＮＡを除き、約６００　ｎｇの二重鎖ｃ　ＤＮＡを最終
的に得た。

４）デオキシシチジン鎖の付加 合成した二重鎖ｅ　ＤＮＡおよびターミナルトランスフ
ェラーゼを、５０μｌの反応液（０，１Ｍのカコジル酸
カリウム（ｐＨ７，０）　、　１００μｐ筆のＢ８Ａ　
、　０．１ｍＭのＤＴＴ　、　１ｍＭのＣｏｏ１２　、
０．２　ｍＭのｄ、ｏ’ｒＰ　、　３７．５ユニツトの
ターミナルトランスフェラーゼ）中で、３７℃で１分間
反応させ、両３′末端に約２０個のデオキシシチジン鎖
を付加させた。

５）ｅＤＮＡとベクターとの会合及び大腸菌の形質転換 デオキシシチジン鎖をもった二重鎖ｅ　ＤＮＡ１１００
ｎと、別に用意した制限酵素Ｐａｔ　１で開裂し約２０
個のデオキシグアノシン鎖を３′−末端にもったプラス
ミドｐＢＲ３２２５００ｎＮとを、０．１ＭのＮａ０Ａ
’　、　１０ｍＭのＴｒｌｇ−■Ｃ１（ｐＨ７，５）お
よび１　ｍＭのＥＤＴ人溶液溶液中５℃で５分間加熱し
た。その後、徐々に冷却して会合させ、Ｋｏｍｏｒｏｆ
ｆらの方法６）エラスターゼｃ　ＤＮＡ含有プラスミド
の分離４９個のテトラサイクリン耐性、アンピシリン感
受性の株から、Ｂｌｒｍｂｏｉｍ、　Ｈ，００ａｎｄ　
Ｄｏｌｙ、　Ｊ、の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅｓ、、ユ、１５１３（１９７９）　：］によって
プラスミドを分離し、制限酵素ＢａｍＨ１によって消化
した後に、アガロースゲル（ａｇａｒｏｇｅｇｅｌ）で
電気泳動し、８ｏｕｔｈａｒｎの方法（Ｊ、Ｍｏｌ、　
Ｂｉｏｌ、。

■、５０３（１９７５）　）に従ってニトロセルロース
フィルターに各々のＤＮＡを固着した。

−万、１ａｔｔ９のｍ　ＲＮ人及び１００　Ｍｏｌのα
−５２Ｐ−ｄＡＴＰを用いて、前述の逆転写酵素を用い
た反応液中で高比活性に５２ｐで標識された単鎖ｅ　Ｄ
ＮＡを合成した。合成したｃ　ＤＮＡをアガロースゲル
電気泳動で分画し、エラスターゼ等セリンプロテアーゼ
のｍ　ＲＮ人から合成されたｃ　ＤＮＡが多量に含まれ
ている、約１０００塩基の長さに対応した大きさのｃ　
ＤＮＡを回収した。

この前記１０００塩基長の標識されたｃ　ＤＮＡをプロ
ーブに用い、Ａｌｗｉｎｅ、　Ｊ、Ｏ，らの方法（Ｐｒ
ｏｅ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、、　Ｕ８Ａ、　７４　、５３５０
　（１９７７）　］　に従って上記のニトロセルロース
フィルター上に固着させたＤＮＡと会合させ、オートラ
ジオグラフィーによって前記１０００塩基長のｅ　ＤＮ
Ａと会合する組換えプラスミドを検出した。その結果、
前記１０００塩基長のｅ　ＤＮＡプローブと非常に強く
会合する組換えプラスミドを３個、中程度に会合するも
０２４個を検出した。

次に、これらのプラスミドに挿入されているｅ　ＤＮＡ
の一次構造（塩基配列）をＭａｘａｍ−Ｇｌｌｂａｒｔ
の方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、λｃａｄ、３ｃｉ、、Ｕ
ｓＡ、７４，５６０（１９γ７）〕によって決定した。

決定した塩基配列からそのコードするアミノ酸配列を推
定し、ブタ・膵臓エラスターゼのアミノ酸配列と比較し
て、一致するクローンを選択した。その結果、前記ｔｏ
ｏｏ塩基長のｃ　ＤＮλＮａ−ブと強く会合した、ｐＰ
Ｂ２２と名づけたプラスミドに、エラスターゼをコード
するｃ　ＤＮＡが挿入されていることが明らかとなった
。ｐｅｇ　２２に組みこまれているｃ　ＤＮＡの長さは
４８０塩基対で、エラスターゼのＮ末端に対応する領域
が欠けていた。

７）完全長ｃ　ＤＮＡ含有プラスミドの分離ｐＰＢ　２
２が完全な長さのエラスターゼｃ　ＤＮＡを保有してい
なかったので、完全長ｃ　ＤＮＡを得るために、まず、
前述の方法で３′−末端にデオキシシチジン鎖を付加し
たｃ　ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分画し、１０
００〜１２００塩基対のｃＤＮＡを回収した。次にプラ
スミドｐＢＲ３２２と会合ささせた。

こうして得た１６００株のＤＮＡをＧｒｕｎｓｔｅｉｎ
、　Ｍ、ａｎｄＨｏｇｎｅｓ＋ｓ、　Ｄ、Ｓ、の方法（
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ、　８ｅｉ　、、　
ＵＳＡ。

７２　、３９６１　（１９７５）　）によってニトロセ
ルロースフィルター上に固着した。一方、ｐＰＢ　２２
に含まれるエラスターゼｅ　ＤＮＡ断片を制限酵素Ｐａ
ｔ　１１／Ｃよって切り出し、ニックトランスレーショ
ン法（Ｒｌｇｂｙ、　Ｐ、Ｗ、　Ｊ、　ａｔ　ａｌ、　
：　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、υ３　、２３７（
１９７７）　）によって３２Ｐで標識した。このＤＮＡ
断片をプローブとして１．Ａｌｗｉｎｅらの方法に従っ
てフィルター上に固着させたＤＮＡと会合させ、オート
ラジオグラフィーによって、上記プローブと反応する６
５株の菌株を得た。

これらの菌株から、プラスミドＤＮＡをＢｉｒｍ７ｂａ
１ｍ　、　Ｈ，Ｏ，ａｎｄ　Ｄｏｌｙ、　Ｊ、の方法で
取り出し、制限酵素ＢａｍＨ１で消化した後、アガロー
スゲルで電気泳動することによって、最も長いｅ　ＤＮ
Ａを含んでいるプラスミドｐＰＢ　７７７を選んだ。

ｐＰＥ　７７７の制限酵素切断地図を第１図に示す。

ｐＰＢ　７７７は、１６個のアミノ酸からなるシグナル
ペプチドをコードする領域、１０個のアミノ酸からなる
アクチベーションペプチドをコードスル領域及び２４０
個のアミノ酸からなる成熟エラスターゼ蛋白質をコード
する領域の全てを持っていることがわかる。また、ｐＰ
Ｅ　７７７は５′及び３′非翻訳領域をも含んでいる。

アミノ酸配列は、８ｈｏｔｔｏｎ、　Ｄ８Ｍ、とＷａｔ
ｓｏｎ。

ＨｏＯ，によって報告されたブタ、膵臓エラスターゼの
アミノ酸配列（１９ｈｏｔｔｏｎ、　Ｄ、Ｍ、　ａｎｄ
　Ｗａｔａｏｎ、　Ｈ，Ｏ。

：Ｎａｔｕｒｓ、　２２５，８１１（１９７０）　）　
　とは二ケ所異なっていた。

以上のことから、ｐＰＢ　７７７に含まれているｃ　Ｄ
ＮＡ配列を適当な発現ベクターに移すことで、大腸菌、
酵母、動物細胞などを宿主細胞として、ブタエラスター
ゼを生産することができる。

ブタエフスターゼ−１のｃ　ＤＮＡを、外膜主要蛋白（
１ｐｐ）プロモータもしくばトリプトファン・ラクトー
ス（ｔａｃ）プロモーターを有する、強力な発現ベクタ
ーに組み込みエラスターゼの生産性を検討するも、その
生産性は低かった。そこで次にこのｃＤＮＡを、２クト
ース（ｌａｃ）プロモーターを有するＰｕＯ２（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒ
ｉｅ＋ｓ、　Ｉｎｃ、より購入）に、以下のごとく組み
入れる、プラスミドｐＰＥ　７７７には、制限酵素Ｘｍ
ａ　ｔとＨｌｎｄ　’ａの部位がそれぞれ１ケ所づつ存
在している。Ｘｍａ　１部位はエラスターゼのアクチペ
ーションベプチド中に存在する。

プラスミドｐＰＢ　７７７を制限酵素Ｘｍａ　１及びＨ
ｌｎｄ３で消化し、エラスターゼｃＤＮＡ及びｐＢ几３
２２の一部分を含む１．５５　ｋｂのＤＮＡ断片を分離
した。

別にプラスミドｐＵｏ　８　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｌｅａ、　ｆｎｃ
、より購入）を制限酵素Ｘｍａ　１及びＨｉｎｄ　３で
消化し、ラクトースオペロンのプロモー−ター、オペレ
ーター領域を含む２γｋｂの太きなりＮＡ断片を分離し
た。

上記二種類のＤＮＮ折断片Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む３
０μｌの溶液（６６ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｏｔ　（ｐＨ７
，６）　、　６．６ｍＭのＭｇＯ１２、１０ｍＭのＤＴ
Ｔ、１ｍＭのＡ’ｒＰ、２．５ユニツトのＴＪＤＮ人リ
ガーゼ）中で１２℃、１６時間保温し、両ＤＮＡ断片を
Ｘｍａ　１　、　Ｈｉｎｄ　３の位置で連結させた（第
２図）。こうして構築したエラスターゼ発現プラスミド
をｐｐ’ｚｘｒｒｒと名づけだ。ｐＰＦ！Ｘ７７７エラ
スターゼ発現プラスミドを含む菌株を得た。

ｐＰＢＸ　７７７によって発現されるエラスターゼは、
下記の如く成熟エラスターゼのＮ末端に８個のβ−ガラ
クトシダーゼ由来のアミノ酸が結合した融合蛋白になる
と推定される。

ｐＰＥＸ７７７のＸｍａ　１部位付近のＤＮ人塩基配列
とアミノ酸配列を下に示す。

Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　
８ｅｒ　Ａｒｇ　Ｍａｌ　　Ｖａｌ　Ｇｌｙ・・・・”
なお、β−ガラクトシダーゼ由来のペプチドは、トリプ
シンまたはクロストリパインによって切断しうるように
発現プラスミドを設計した。

このようにして構築したｐＰＥＸ７７７で、各種大腸菌
を前述のＨａｎａｈａｎの方法で形質転換した。こＨｏ
（ｅ、ａ、人（１９７５）　３７５．４４）に１Ｍ０４
１０へついては０１ｉｖｅｒ、　Ｄ、Ｂ、　、　ａｎｄ
　Ｂｅｅｋｖｉｔｈ、　Ｊ　（０ｅｌｌ　（１９８１）
ａｎｄ　０ｕｒｔｌｓｓ、　ｆＬ、　［０ｕｒｒ、　Ｔ
ｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ＋（１
９７５）旦、１〕 、　、　　　　　　　　　　に記載の通りである。

ここで得られた６ｓの形質転換株は２ＸＴＹ培地コを用
いて３７℃で１５時間応復振盪培養した。なおＪＭ１０
３および、７Ｍ１０５株の培養の際にはＩ　ＰＴＧ（イ
ソプロピルチオガラクトピラノ７ド）を２ｍＭ含む２Ｘ
ＴＹ培地を用いた。

ＪＭ１０３およびＪＭｌ　０５株はＲｈｏリプレッサー
を多量に作るｌａｃ　Ｉｑ変異を有するため、ｐＰＢＸ
７Ｔ７によるエラスターゼの生産には１ｎｄｕｃｅｒで
あるｒＰＴＧを加える必要がある。なお、残りの４株は
必λ０リプレッサーを１細胞あたり数分子しか作らない
ため、ｒＰＴＧを加えなくとも構成的にエラスターゼを
生産できる。

１５時間培養し、菌体を遠心分離にて集めた後、Ｓｎ２
−　ＰＡＧＥにて生産されている蛋白を解析した。

結果は、第３図のごとくエラスターゼ融合蛋白の生産量
は宿主によって著しく異なっていた。

６株の大腸菌のうちＹ人２１株においてのみ多量のエラ
スターゼ融合蛋白が生産されていた（Ｌｉｎｅ２）。

Ｙ人２１株においては大腸菌が生産している全蛋白のう
ち１１％がエラスターゼ融合蛋白でめった。

エラスターゼ融合蛋白は菌体内で不溶性の顆粒（１ｎｃ
ｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ　）を形成していた。ＹＡ２１
株以外の宿主や、ｐＰＢＸ７７７を導入していないＹ人
２１株では１ｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙは認められな
かった。

エラスターゼ融合蛋白はＹ人２１株の菌体内でｒｒｒの
培養液１１より、１ｎｃｌｕｓｌｏｎ　ｂｏｄｙを形成
している菌体が６．６１得られた。得られた菌体６．６
Ｉを、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ　Ｏ，２１Ｒ９７ｍｌおよびデ
オキシコール酸１ダ／！ｎｌを含む５０ｍＭのトリス緩
衝液（ｐＨ１Ｏ）中で処理して溶菌させた。未破壊の菌
体を、低速遠心分離（ｔｓｏｏｘｇ、　ｔｏ分間）にて
除いた後、高速遠心分離（１１０００Ｘｇ、　２０分間
）にて１ｎｃｌｕｓｌｏｎｂｏｄｙを沈澱として得た。

この１ｎｅｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙにはまだ菌体断片が
多量に含まれているので、ドライドｙ　Ｘ−１００５ｒ
ｖ／／ｎｔを含む５０ｍＭ）リス緩衝液に５ｕｓｐｅｎ
ｄ　した後、高速遠心分離（１１ｏｏｏｘｙ　、　２０
分間）により洗浄した。洗浄後、１ｎｃｌｕ＠ｉｏｎ　
ｂｏｄｙは少量のトリス緩衝液中にｓｕｍｐａｎｄ　Ｌ
、て４℃で保存した。

この様にして精製することにより８００りの１ｎｃｌｕ
ｓｉｏｎ　ｂｏｄｙが得られ、これは約５０％のエラス
ターゼ融合蛋白を含有している。またＹ人２１■≠−吐
μで生産された１ｎｃｌｕａｌｏｎ　ｂｏｄｙがエラス
ターゼ融合蛋白であることは、ｉｍｍｕｎｏ−ｂｌｏｔ
ｔｉｎｇ法にて確認した。

実施例２　ヒト・膵臓エラスターゼ−１（１）　　ヒト
膵臓よりのｍＲＮＡの分離５．５ｇのヒト膵臓（剖検試
料）をグアニジンチオシアネート溶液（４Ｍ、のグアニ
ジンチオシアネート、１％のサルコシル、　２０ｍＭの
エチレンジアミン四酢酸（ＢＤＴＡ）、　２５ｍＭのク
エン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、１００ｍＭの２−メ
ルカプトエタノール、０．１％のアンチ７オーム人）中
でポリトロンによって破壊、変性した後、遠心して上澄
を得た。これに０．０２５倍量の１Ｍ酢酸および０．７
５倍量のエタノールを加え、−２０℃で数時間冷却しエ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）　、５ｍＭのジチオスレ
イトール（ＤＴＴ）　）に懸濁し、０．０２５倍量の１
Ｍ酢酸および０．５倍量のエタノールを加え、−２０℃
で溶液に再懸濁し、酢酸、エタノールを加え、−２０℃
に冷却した後、遠心処理で沈澱を集めた。次蒸留水に溶
かした後にエタノールでＲＮＡを沈澱させた。遠心分離
により沈澱を集め、５３．９７７１ｐのＲＮＡを得た。

こうして得たＲＮＡを高塩溶液（０，５ＭのＮａＯ１＊
２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｏｄ　（ｐＨ７，５）　、　１
ｍＭのＦｔＤＴＡ　、　０．１％のドデシル硫酸ナトリ
ウム（ｓｎｓ）　）中でオリゴ１ｍＭのＥＤＴ’Ａ　、
　０．０５％のｓｎｓ　）で溶出させ、２５５ｔｔｌｌ
のｍＲＮＡを得た。

（２）　　ｅＤＮＡバンクの作製 ｃＤＮＡバンクの作製は、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法
に従って行った。すなわち、５μｇのｍＲＮＡ及び２４
ユニツトの逆転写酵素を２０μノの反応液（５０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＯｊｌ（ｐＨ８，３）、８ｍＭのＭｇ０Ｊ
２．３０ｍＭのＫＯＩ　、　０．３　ｍＭのＤＴＴ、　
２ｍＭのｄＡＴＰ、　２ｍＭのｄＧＴＰ、　２ｍＭのｄ
ＯＴＰ。

２ｍＭのｄＴ’ｒＰ　、　１０　／ｊｏｔのα−”Ｐ−
ｄｏ’ｒＰ、　１．４１４のベクター・ブライ−ｑ　−
ＤＮ人（ＰＬ−Ｐｈａｒｍａｃｉｍより購入）〕中で、
４２℃、６０分反応させた。

２ｐｌの０．２５Ｍ　ＦｆＤＴＡと１　ｐｉの１０％Ｓ
ＤＳを加えて反応を止めた後、２０μｌのフェノール・
クロロフォルムで除蛋白を行った。遠心した後、水層を
とり、２０μ１０４Ｍ酢酸アンモニウムと、、ＢｏＡｔ
のエタノ′−ルを加え、−７０℃、１５分間冷却した。

次いで、遠心して沈澱を集め１５％エタノールで沈澱を
洗った後、減圧乾燥した。

沈澱を１５μｌのターミナルトランスフェラーゼＤＴＴ
　１０．２μ、９のｐｏｌｙＡ　、　　１００ｍＭのａ
ｏＴｐ　）に溶かした。

３７℃で３分間反応液をあたためた後、１８ユニツトの
ターミナル　　　　　　　　　゛　トランスフェラーゼ
を加え、５分間反応させた。次に１μノの０．２５　Ｍ
　ＢＤＴＡ及び０．５μｌの１０％８ＤＳを加工反応を
とめた後、フェノール・クロロフォルムで除蛋白を行っ
た。反応液を遠心後、水層をとり、１５μノの４Ｍ酢酸
アンモニウム、６０μｌのエタノールを加えよく混合し
た。−１０℃に１５分間おいた後、遠心して沈澱を集め
た。

沈澱を１０μｌの制限酵素用緩衝液（５０ｍＭのＮａ０
Ｊ、１０ｍＭの’ｒｒｉｓ−Ｈｅｌ（ｐＨ７，５）、１
０ｍＭのＭｇＣｌ２．１ｍＭのＤＴＴ　）に溶かし、２
．５ユニツトの制限酵素Ｈ１ｎｄ　’３を加え、３７℃
で約１時間消化した。つぎに、フェノール・クロロフォ
ルムで除蛋白後、エタノール沈澱を行った。−７０℃で
１５分間冷却した後、遠心によって沈澱を集め、１０μ
ｌのＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＯｌ（ｐＨ７，５）
、１ｍＭのＥＤＴＡ　）に溶かした。

次に、上記試料の１μｌをオリゴｄＧ付きリンカ−（Ｐ
Ｌ−Ｐｈａｒｍａｅｉｍより購入）１０Ｈｇを加えた反
応液（１０ｍＭ　（７）　Ｔｒｉｓ　−Ｈ（Ｍ（ｐＨ７
，５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａ（Ｍ　）
に加え、６５℃で５分間加熱し、次いで４２℃で３０分
間保温した。

水中で反応液を冷却した後、１０μ１０１０倍リガーゼ
緩衝液（１０ｍＭのＡＴＰ、　６６０ｍＭのＴｒｉｍ　
−Ｈｏｌ（ｐＨ７，５）、６６ｍＭのＭｇ（Ｍｇ、１０
０ｍＭのＤＴＴ　）、１８ｐｌの蒸留水、８ユニツトの
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、１２℃で一晩保温した。

次に、１０μｌの１ＭのＫＯＡ！、　１ユニツトのりボ
ヌクレアーゼＨ１３３ユニットのＤＮ人ポリメラーゼ１
．４ユニツトのＴ　Ｊ　ＤＮＮソリガーゼ０．５μノの
ヌクレオチド溶液（２０ｍＭのｄＡＴＰ、　２０ｍＭの
ｄＧ’Ｉ’Ｐ　。

２０ｍＭのｄＯＴＰ、　２０ｍＭのｄＴＴＰ　）、０Ａ
ｔｔｌの５０Ｐｇ／μ！牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を
加え、１２℃で１時間、ついで２５℃で１時間保温した
。

この反応液を、５倍に希釈した後、ただちにＨａｎａｈ
ａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ、　Ｄ、：　ＪｏＭｏｌ、
　Ｂｉｏｌ、　、　１６６　。

５５７（１０３）］によって、大腸菌ＲＲＩ株を形質転
換し、ヒト膵臓ｃＤＮＡパンクを作製した。

（３）　　ヒト膵臓エラスターゼｃＤＮＡを含有する組
換え菌の分離 上述のヒト膵臓ｃ　ＤＮＡバンクのうち４７００株の組
換え菌のＤＮＡを、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、　Ｍ、ａｎｄ
　Ｈｏｇｎｅｓｓ、　Ｄ、Ｓ。

の方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、人ｃａｄ、　８ｃｉ、
、　ｔＪＳＡ、ユ、　３９６１（１９７５）　）によっ
てニトロセルロースフィルター上に固着した。

一方、ブタ・膵臓エラスターゼｌ　ｃＤＮＡ断片を制限
酵素Ｐａｔ　１によって切り出し、ニックトランスレー
ション法（Ｒｌｇｂｙ、　Ｐ、Ｗ、　ａｔ　ａｌ、：Ｊ
ｏＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ、。

Ｊ、　２３７　（１９７７）　）によって３２Ｐ、で標
識した。このＤＮＡ断片をプローブとして、４０％のホ
ルムアミド、５倍濃度の０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよ
び０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム溶液（８１０）　１
．０．１％ＢＳＡ、０．１％フィコール、０．１％ポリ
ビニルピロリドン、０．５％のＳｎ２　、１０ｍＭのリ
ン酸ナトリウム、１００μｇ〜のサケ精子ＤＮＡの溶液
中で、３５℃にて、フィルター上に固着させたＤＮＡと
会合させた。

その後、オートラジオグラフィーを行い、上記プローブ
と反応する１株の菌株を得た。

の これらの菌株のつ右η′株に含有さ４る組換えプラスミ
ドに挿入されているｃＤＮＡをＯ１２と命名した。

Ｏ１２の制限酵素切断地図を第４図に示す。

１４１　０Ｌ２のコードするアミノ酸配列とエラスター
ゼ Ｏ１２には、２７０アミノ酸をコードしつる唯一のオー
プンリーディングフレームが存在していた。その塩基配
列から確定したアミノ酸配列は、トリプシン、キモトリ
プシンとは３０％程度の相同性しか示さないが、ブタ・
膵臓エラスターゼとは５７％の高い相同性を示した。ま
た、トリプシン、キモトリプシン等のセリンプロテアー
ゼに共通して見出される活性中心付近のアミノ酸配列（
０１７−人１ｐ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ　）
が、同一領域に存在していた。

ＯＩ、２によってコードされる蛋白質のアミノ酸組成は
、Ｌａｒｇｍａｎらによって報告されているヒトー膵臓
エラスターゼＩのアミノ酸組成（Ｌａｒｇｍａｎ。

０、　ｅｔａｌ、；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１５　
、２４Ｈ（１９７６）　）　　と−見ノー― 類似しているが、詳細な点においては明らかに異なり、
また分子量も異なっていた。

また、そのアミノ酸配列より計算した等電点は７．５〜
乙８であった。この値は、８ｃｈｅｅｌｅ、　Ｇ、らに
よって報告されているヒト・膵臓プロエラスターゼＩの
等電点７．６　（５ｃｈｅｅｌｅ、　Ｇ、ａｔ　ａｌ、
；Ｇａｓｔｒｏｅｎ−ｔｓｒｏｌｏｇｙ、　Ｈ、４６１
（１９８１）　：ｌと同様な値を示した。

Ｎ末から２８番目のアルギニン残基の０末側でトリプシ
ンにより切断され、活性型のヒト・エラスターゼが生じ
る。

ヒトエラスターゼｃＤＮＡがクローン化されているプラ
スミドＯｆ、２を制限酵素ＢｅｏＲｔ及びＢｇｌ　＞で
切断し、ヒト・エラスターゼｃＤＮＡを含む１２１５ｂ
ｐのＤＮＡ断片を分離した。これを制限酵素Ｆｎｕ４Ｈ
ｆで部分切断し、つづいてＳ１ヌクレアーゼで処理して
、１本鎖部分を平滑末端として７８８ｂｐのＤＮＡ断片
を得た。別にプラスミドｐＵｏ　８を制限酵素８ｍａｌ
で切断し、ホスファターゼ処理してラクトースオペロン
のプロモーター、オペレーター領域と、β−ガラクトシ
ダーゼの一部を含むＤＮＡ断片を分離した。

上記二種類のＤＮＡ断片をＴ４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼを
含む３０ｐｌの溶液（６６ｍＭのＴｒｉｓ　−ＨｏＩ　
（ｐＨ７，６）、　６．６ｍＭのＭｇＯ１２＋　１０ｍ
ＭのＤＴＴ　、　１ｍＭの人ＴＰ　、　２．５ユニツト
のＴ４ＤＮＡリガーゼ）中で６℃、７２時間保温し、両
ＤＮＡ断片を連結させた（ｗｃＳ図）。

こうして構築したヒトエラスターゼ発現プラスミドをｐ
ＨＢＸｏ　０２と命名した。各種大腸菌をｐＨＥＸＯＯ
２にて形質転換して、ヒト・エラスターゼを生産しうる
菌株を得た。

この方法によって発現されるヒト・エラスターゼは、下
記の如く成熟ヒト・エラスターゼのＮ末端に８個のβ−
ガラクトシダーゼ由来のアミノ酸が結合した融合蛋白に
なると推定される。

ヒトエラスターゼ発現プラスミドｐＨ’ＥＸＱＱ２　中
のエラスターゼ遺伝子の５′末端付近のＤＮＡ塩基配列
とアミノ酸配列を下に示す。

マ Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓ
ｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　−−ＡＴＧ　ＡＯＯ人
ＴＧ　　ＡＴＴ　　ＡＣ！ＯＡＡＴ　　Ｔｏｏ　　ＯＧ
ＯＧＴＴ　ＧＴＯ・・・・・・・・・以上のようにして
得たエラスターゼ発現プラスミドを含む菌株を２Ｘ　Ｔ
Ｙ−アンピシリン培地（１，６％のバクトドリブトン、
１％のイーストエキストラクト、０．５％のＭａｉｌ　
、　５０μ９／ｒｎｌのアンピシリン）に接種し、３Ｆ
”Ｃ１１５時間培養した。

培養後、培養液を遠心して菌体を集め、２．４Ｘ１０８
細胞相当量の菌体を１５μｌのＳＤ８溶液（２％のｓＤ
ｓ、５％の２−メルカプトエタノール、１０％のグリセ
リン、６０ｍＭのＴｒｌｓ−ＨＯｊ　（ｐＩ（６，８）
　）に懸濁し、１００℃３分間加熱した後Ｌａｅｍｍｌ
ｉらの方法［Ｎａｔｕｒｓ、２２７６８Ｇ　（１９７Ｇ
）　）に従って５Ｄ８−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動し、生産されている蛋白を解析した。

結果は第６図に示すごとく、Ｙ人２１株において最も多
量にエラスターゼ融合蛋白が生産されていた。エラスタ
ーゼ融合蛋白の生産高はＹＡｎ株が生産している全蛋白
の３３％に相当していた。

１９８４株においても比較的多量のエラスターゼ融合蛋
白が生産されていたが、生産高はＹ人２１株の半分以下
（全菌体蛋白の１４％）でめった。その他２株の大腸菌
（Ｈ８１０１株およびＭＯ４１００株）におけるエラス
ターゼ融合蛋白の生産量は著しく低かった。

エラスターゼ融合蛋白は菌体内にて１ｎｃｌｕａｉｏｎ
ｂｏｄｙを形成していたことより、前述と同様の方法に
て精製しうる。

また、ＹＡＺｆ株において生産されたｆｎｃｌｕｇＩｏ
ｎｂｏｄｙがヒト・エラスターゼであることはｉｍｍｕ
ｎｏ　−ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて確認した。

実施例３ ブタ・膵臓エラスターゼ−２についても実施例１と同様
に実施した結果、エラスターゼ融合蛋白が生産された。

実施例４ ヒト・膵臓エラスターゼ−２についても実施例２と同様
に実施した結果、エラスターゼ融合蛋白が生産された。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＰ１７７７の制限酵素地図を示す。 第２図はブタ・エラスターゼ発現プラスミドｐＰＥＸ７
７７の構築法を示す。 第３図はｐＰｇＸ７７７を保持する各種大腸菌における
ブタ・エラスターゼの生産性を示す。図中の矢印はエラ
スターゼ融合蛋白を示す。 第４図はＯＬ２の制限酵素地図を示す。 第５図はヒト・エラスターゼ発現プラスミドｐＨＢＸ０
１２２の構築法を示す。 第６図はｐＨＥＸＯＯ２を保持する各種大腸菌における
ヒト・エラスターゼの生産性を示す。図中の矢印はエラ
スターゼ融合蛋白を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下に記述した（イ）〜（リ）を含むことを特徴と
   する膵臓エラスターゼの製造法。 （イ）膵臓より、エラスターゼをコードするｍＲＮＡを
   分離する。 （ロ）このｍＲＮＡおよび逆転写酵素を用いて単鎖のｃ
   ＤＮＡを合成する。 （ハ）このｃＤＮＡをもとに、二重鎖ＤＮＡを合成する
   。 （ニ）得られた二重鎖ＤＮＡをベクターに組み込む。 （ホ）この組換えプラスミドを宿主に導入して形質転換
   させる。 （ヘ）該宿主を培養して得られる菌体より、目的とする
   ＤＮＡを含有するプラスミドを単離する。 （ト）このプラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡ
   を切り出す。 （チ）切り出したクローン化ＤＮＡを発現ベクターへ組
   み込んだ後、宿主細胞へ導入する。 （リ）発現ベクターを導入した宿主細胞を培養し、エラ
   スターゼを生産させる。 ２、プロモーターがラクトース（ｌａｃ）プロモーター
   である特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ３、宿主細胞が大腸菌ＹＡ２１株である特許請求の範囲
   第１項記載の製造法。