JPH0286781A - 新規な一本鎖ファスミドベクターおよびストレプトマイセスおよび他のアクチノマイセス類を形質転換する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ ストレプトマイセス（Ｓ　Ｌｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）お
よび近縁のアクチノマイセス（ａｃｔ　ｉｎｏｍｙｃｅ
ｔｅ）１ｍの菌のような産業上有用な微生物に組換えＤ
ＮＡ技術を適用するには有効な遺伝子クローニング法と
形質転換法か必要である。プラスミドによるプロトプラ
ストのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導形質転換
により、幾つかのストレプトマイセス種および近縁属の
種の遺伝子クローニング法が発達した。

即ち、アセパルら（Ａｃｅｂａｌ、　　ＦＥＭＳ　Ｍｉ
ｃｒｏｂｉ。

１、Ｌｅｔｔ、３５ニア９　８２，１９８６）はラクタ
ム系抗生物質産生菌Ｓ、ワタヤメンシス（Ｓ、ｗａｄａ
ｙａｍｅｎｓ　ｉｓ）の形質転換法について記載し、ビ
ブら（Ｂｉｂｂ）、ネイチャー（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、２
７４　：　３９８−４００（１９７８）はストレプトマ
イセスをプラスミドＤ　Ｎ　Ａで高頻度に形質転換する
ことについて記載し、ランペル（Ｌａｍｐｅｌ）および
ストロール（Ｓｔｒｏｈｌ）ら、アプライド・アンド・
エンピロメンタル・マイクロハイオロ’；　−（Ａ　ｐ
ｐｌ、　Ｅ　ｎｖｉｒｏｎ、　Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏ１．
　）、５１：　１２６−１３１（１９８６）はアントラ
サイクリン産生ストレプトマイセスの形質転換およびト
ランスフェクションについて記載し、マツ／マ（Ｍａｔ
ｓｕｓｈｉｍａ）およびバルゾ（Ｂ　ａｌｔｚ）ら、ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、　）、＋６３　：　１８０−１８５（１９８５
）はＳアンホフｙ’ｙエンス（ａｍｂｏｒａｃｉｅｎｃ
ｅ）およびＳ、フラディエ（ｆｒａｄｉａｅ）の効率的
なプラスミドによる形質転換について記載し、ヤマモト
ら（Ｙ　ａｍａｍ。

ｔｏ）、Ｊ　、　Ａ　ｎｔ　１ｂｉｏｔ、、３９　：　
１３０４−１３１３（１９８６）はＳ、エリスレアス（
ｅｒｙｔｈｒａｅｕｓ）の形質転換について記載し、ビ
ドコソクら（Ｐ　１ｄｃｏｃｋ）、アプライド・アンド
・エンピロメンタル・マイクロバイオロジー（Δｐｐ１
．　Ｅ　ｎｖｉｒｏｎ、　Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏ１．　）
、５０　：　６９３−６９５（］　９８５）はサーモモ
ノスポーク０フスカ（Ｔ　ｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｕｐｏ
ｒａ　ｆｕｓｃａ）プロトプラストの形質転換について
記載し、マツシマら（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ）、ジャー
ナル・オブ・ハクテリオロシー（Ｊ　、　Ｂ　ａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、　）、１６９　：　２２９８２３００（１９
８７）はアミコラドブシス（ノカルデイア）・オリエン
タリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ（Ｎｏｃａｒｄｉ
ａ）ｏｒｉｅｎｔａｌ　ｉｓ）の形質転換について記載
している。このように、ストレプトマイセスの様々な種
、および株、並びに他のアクチ／マイセス属の菌の形質
転換が達成されているか、多くの場合、形質転換頻度が
かなり低い。形質転換頻度の低さには、ＤＮＡ取り込み
の効率の低さ、ＤＮＡ取り込み後の制限酵素消化、また
はプロトプラスト調製および／またはその再生の困難さ
なと、様々な理由がある。

しかしながら、上記した、二本鎖ＤＮＡを用いるプロト
プラスト形質転換法に関連した幾つかの困難が、ストレ
プトマイセスおよび近縁の属の多数の種への組換えＤＮ
Ａ法の適用を妨げていた。

大多数のストレプトマイセスはプラスミド形質転換およ
びファージ感染を著しく減少させ得る制限酵素を複数個
産生ずる［コックス（Ｃｏｘ）およびバルン（Ｂａｌｔ
ｚ）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ　、
　Ｂ　ａｃｔｅｒｉｏｌ、　）、１５９：４９９−５０
４（１９８４）；ロモプスカヤ（Ｌ　ｍｏｖｓｋａｙａ
）、マイクロバイオロジカル・レビューズ（Ｍ　１ｃｒ
ｏｂｉｏｌ。

Ｒｅｖ、）、４４：２０６　２２９（１９８０）：　マ
。

クヘ二一（ＭｃＨｅｎｎｅｙ）およびバルン（Ｂａｌｔ
ｚ）ら、ジャーナル・オブ・バタテリオロジ−（Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｔ、　）、１７０　：　２２７６−２２
８２（１９８８）；およびエンジェル（Ｅｎｇｅｌ）、
アプライド・アンド・エンピロメンタル・マイクロバイ
オロジー（Ａｐｐｌ、　ａｎｄ　Ｅ　ｎｖｉｒｏｎ、　
Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏ１．　）、５３　：　ｌ−３（１９
８７）］。マッンマ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ）およびバ
ルン（Ｂａｌｔｚ）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジー（ＪＢ　ａｃｔｅｒｉｏｌ、　）、１６３　：　
１８０−１８５（１９８５）、チャタ−（Ｃｈａｔｅｒ
）およびワイルド（Ｗｉｌｄｅ）ら、ジャーナル・オブ
・ジェネラル・マイクロジイオロジ−（Ｊ　、Ｇ　ｅｎ
、　Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏ１．　）、１１６：３２３−３
３４（１，９８０）；チャタ−（Ｃｈａｔｅｒ）および
ワイルド（Ｗｉｌｄｅ）ら、ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジ−（Ｊ　、　Ｂ　ａｃｔｅｒｉｏｌ、　）、１
２８：６４４−６８８（１９７６）；および、チャタ−
（Ｃｈａｔｅｒ）およびチャタ−（Ｃｈａｔｅｒ）ら、
ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロジイオロ）−
（Ｊ、Ｇｅｎ。

Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏ１．　）、１０９　：　１８１ｉ８
５（１９７８）参照。制限酵素に起因する問題の解決に
は、しばしば、プラスミドＤＮＡの効率的な取り込みお
よびプロトプラストの再生において厳格な工程が要求さ
れる。制限酵素の発現が最小となる細胞増殖の生理学的
条件下では、有効なりＮＡの取り込み、プラスミドの複
製およびプロトプラスとの再生が阻害されることが多い
。

これらの困難の解決に向けた幾つかの試みが報告されて
いる。１つの試みは欧州特許出願Ｎｏ、Ｑ２８１３５６
（１９８８年９月７日公開）に記載のごとく、遺伝子ク
ローニングおよび伝達（トランスファー）にファージの
形質導入系を用いて制限を部分的に阻害することである
。形質導入系では、形質導入ＤＮＡを包み込んだファー
ジ粒子が細胞に付着してＤＮＡを注入することにより、
プロトプラストを使用せずに無傷の細胞に形質を導入を
することができる。４！！（傷の細胞はプロトプラスト
よりも広範な培養条件、特にインキュベーション温度に
耐えることかできるであろう。多くの宿主の制限系は、
インキュベーション温度が増殖至適温度から変位するに
つれて低活性となるので、無傷の細胞を用いる形質導入
系を使用し、インキュベージコン温度を変化させること
により、宿主の制限酵素の影響を減少することができる
かもしれない。さらに、感染の多重度（ｍ、　ｏ、　ｉ
、　）を高め、細胞への形質導入ＤＮＡの導入量を増大
することを、宿主制限系の制圧に利用することかできる
であろう。しかしながら、この系には、そのようなファ
ージ感染を受は易い宿主細胞のみを有効に形質導入し得
るという制限がある。欧州特許出願Ｎｏ、０２８１３５
６に記載の形質導入系では、バクテリオファージＦＰ４
３　　ＤＮＡの１セグメント（高頻度形質導入（ｈｉｇ
ｈ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）
から、ｈｎと称する）をプラスミドｐｌＪ７０２にクロ
ーニングしている。得られたプラスミドｐＲＨＢ１０１
は線状コンカテマーとして効率的にＦＰ４３ファージの
頭部に詰め込まれ、有効な形質導入粒子を形成する。

マツシマら（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ）、モレキュラー・
アンド・ジェネラル・ジエネティクス（Ｍｏ１．　Ｇ　
ｅｎ。

Ｇ　ｅｎｅｔ、　）、２０６　：　３９３−４００（１
９８７）が用いたもう１つの制限問題の解決法は、形質
転換可能な幾つかの制限系を欠失したストレプトマイセ
ス・フラディエ突然変異体を開発する方法である。スト
レプトマイセス・フラディエは、マクロライド抗生物質
チロシンの生産に用いられる産業上重要な微生物である
。遺伝子クローニングの宿主としてＳ、フラディエを発
展させる過程で、コックス（Ｃｏｘ）およびバルン（Ｂ
ａｌｔｚ）、ジャーナル・オブ・バタテリオロジー（Ｊ
　、　Ｂ　ａｃｔｅｒｉｏｌ、　）、１５９：４９９−
５０４（１９８４）および、マツシマ（Ｍａｔｓｕｓｈ
ｉｍａ）およびバルン（Ｂａｌｔｚ）ら、ジャーナル・
オブ・バクテリオロシ−（Ｊ　、　Ｂ　ａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、　）、１６３：　１８０−１８５（１９８，５）は
Ｓ　フラディエが、バクテリオファージＤＮＡおよびプ
ラスミドＤＮＡの各々に対し、強力な制限系を発現する
ことを見いだした。他の産業上重要なストレプトマイセ
ス種についても同様に高度の制限性カ見イ出された。し
たかって、ヘテロローガスな供給源から得たＤＮＡをＳ
、フラディエのように高い制限株に有効にクローニング
するために、マツシマ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ）および
バルン（Ｂ　ａｌｔｚ）ら、モレキュラー・アンド・ジ
ェネラル・ジェネティクス（Ｍ。

１、　Ｇ　ｅｎ、　Ｇ　ｅｎｅｔ、　）、２０６　：　
３１３−４００（１９８７）は１またはそれ以上の制限
酵素系を欠く突然変異体を開発した。この方法に関連す
る重要な問題は、そのような突然変異体を株／株に基づ
いて開発しなければならず、そのような突然変異体の開
発および選択は簡単ではなく、非常に長期間を要し、多
くの選択工程が要求されるという点である。例えば、マ
ツシマら（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ）、モレキュラー・ア
ンド・ジェネラル・ジエネティクス（Ｍｏ１．　Ｇ　ｅ
ｎ、　Ｇ　ｅｎｅｔ、　）、２０６　＋　３９２−４０
０（Ｌ９８７）は１つの修飾系の喪失に伴い、４つの別
々の形質転換効率を増大させる、突然変異の４つの初期
ラウンド、３つの修飾系（およびおそらくは制限系）の
喪失をも°たらす、突然変異の第５ラウンド、および形
質転換効率を大きく増大させる突然変異の最終ラウンド
について記載している。

これらは野生型Ｓ、フラディエ株が５つ以上の機能的な
制限系を発現していることを示唆するものである。

１つの実施態様として、本発明は宿主細胞の制限系を迂
回するよう作用し、ストレプトマイセスの様々な種間、
および大腸菌とストレプトマイセスの種間でのＤＮＡ伝
達を可能ならしめる新規な一重鎖ＤＮＡベクターを含む
ものである。これらのベクターはファージ粒子に詰め込
まれ（パッケージングされ）、細胞膜に融合し、ＤＮＡ
を伝達させることもできる。これらのクローニングベク
ターは２機能性であり、ストレプトマイセスのｔｇ製製
産点例えば、５ＣＰ２宜−ｏｒｉまたはｐｌＪｌｏｌ　
−ｏｒｉ）と大腸菌の複製起点の両者を含有している。

このように、本発明によればストレプトマイセスの多く
の種間、またはその他の幾つかのアクチノマイセス属、
および大腸菌の間での遺１云子伝達が行える。

多くの１本鎖ＤＮＡベクターが報告されている。

これらのベクターを表１に総括する。

表１ ベクター　　　　　　　　文献または供給業者ｐＥＭＢ
Ｌシリーズ ｐＢ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ ｐＢ　１ｕｅｓｃｒｉｂｅ ｒＢＢｌｏｌ、　　ｒＢＢ１０３ ｐπ１８．ｐπ１９ ｐＫＩＪＮ９．　　ｐＫＵＮ１９ ｐＧＢＴ５１８．　ｐＧＢＴ５１９ ｐＧＢＴＴ１３ ｐＹＫ３３１．　　ｐＹＫ３３２ ｐＹＫ３３３．　ｐＹＫ３３５ ＹＫ３３６ デンテら（Ｄｅｎｔｅ）、ヌクレイ／り・ア／ノズ・リ
サーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　）、１
１　：　１６４５−５５（１９ストラタジーン（Ｓｔｒ
ａＬａｇｅｎｅ）、カリフォルニア９２０３７、う・ジ
コラ、ノース・トレイ・パインズ・ロード１１０９９番 バラニー（Ｂａｒａｎｙ）、マイクロバイオメジ−（Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、５１　：　１２５−１２９
（１９８２）メッドら（Ｍｅａｄ）、タンパク工学（Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、ｌ　：　６
７−７４　；ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、モ
レキュラー・バイオロジー・デイビジョン・ビス力タウ
ェイ、二ニー〇シャーシー０８８５４からｐＴＺ１８Ｒ
およびｐＴＺ１９Ｒとしても入手可。

コニングズら（Ｋｏｎｉｎｇｓ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１５３　：　１２−３４
　；欧州特許出願第８６２０１２５２゜３号 ゴールド・バイオテクノロジー（Ｇｏｌｄ　Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ミズーリ６３１１０、セント・ル
イス、オークランド・アベニュー５０５０！ 欧州特許出願第８４１１２７２４．４号表１に記載の１
本鎖ベクターは以下の使用のために構築された・クロー
ニングおよびジデオキシＤＮＡ配列決定Ｌサンガーら（
Ｓ　ａｎｇｅｒ）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１Ｂ　ｉｏｌ、　）、１４３　
：　１６１−１７８（１９８０）］、部位特異的突然変
異誘発［シラー（Ｚｏｌｌｅｒ）およびスミス（Ｓｍｉ
ｔｈ）ら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎ　ｕ
ｃｌ、　Ａ　ｃｉｄｓ、　Ｒｅｓ、　）、１０：６４８
７−６５００（１９８２）］、Ｓ１マツピング［シリバ
ートら（Ｃ１ｌｉｂｅｒｔｏ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、
２２：９５１１３（１９８３）］、ｍＲＮＡクローニン
グ［）−イデソカ−（Ｈｅｉｄｅｃｋｅｒ）およびメッ
シング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら、ヌクレイツク・アシッズ
・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａ　ｃｉｄｓ、　Ｒｅｓ、　
）、１１　：　４８９１−４９０６（１９８３）］、ク
ローニングしたｐ　Ｎ　Ａの大腸菌での発現［スロコン
ベら（Ｓ　ｌｏｃｏｍｂｅ）、７’ロシーデイングズ・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイー
ズＵＳＡ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ）、７９・５４５５−５４５９（１９８２）］、
１本鎖重鎖プリタイゼーションブローブの生産［ヒユー
（Ｈｕ）およびメツ７ング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、ジーン
（Ｇｅｎｅ）、１７　：　２７１−２７７（１９８２）
］、ＲＮＡのへテロ二重鎖分析およびインビトロでの転
写［メノド（Ｍｅａｄ）ら、タンパク工学（Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒ　ｉｎｇ）、１　：　６７−７
４（１９８６）］。表１の一本鎖ベクターのどれを用い
てもストレプトマイセス、他のアクチノマデユラ属およ
び／または大腸菌を形質転換し、または、し得ることは
示唆されていない。バラニー［Ｂ　ａｒａｎｙ、マイク
ロバイオロジー（Ｍ　ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、５１
　：　１２５−１２９（１９８２）］によって記載され
たｒＢＢｌｏｌおよびｆＢＢ１０２ベクターをストレプ
トコッカス・ニューモニエを用いる形質転換実験に用い
た。しかしながら、ｆＢＢｌｏｌまたはｆＢＢ１０３ベ
クターの一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡの形質転換効
率を比較すると一本鎖ＤＮＡを用いて得られるストレプ
トコッカス・ニューモニエ形質転換効率は、二本鎖ＤＮ
Ａを用いて得られるそれより、５０１００倍低かった。

即ち、ｆＢＢｌｏｌおよびｆＢＢ１０３を用いてバラニ
ーが示した結果は、形質転換において、一本鎖ＤＮＡベ
クターは二本鎖ＤＮＡベクターよりも有用性が低いこと
を示唆するものである。

これら、従来の一本鎖ベクターおよびその用途と対照的
に本発明のベクターは、ストレプトマイセスのプラスミ
ドベクター、大腸菌のプラスミドベクター、および大腸
菌のバクテリオファージの新規なハイブリッドである。

これらのベクターはストレプトマイセスおよび大腸菌の
両方の複製起点を含有するので、ストレプトマイセスお
よび大腸菌について２機能性を有している。最後に、本
発明の一本鎖ベクターは、ストレプトマイセス宿主細胞
の制限システムを迂回し、他の方法では有用な形質転換
頻度で形質転換され得ないストレプトマイセスの高度の
制限株および池の生物に有効にＤＮＡを伝達すると思わ
れる。これらの一本鎖ベクターはストレプトマイセスを
、二本鎖ＤＮＡを用いて得られる頻度よりも高頻度で、
または少なくとも同等の頻度で形質転換することができ
る。

［課題を解決するための手段］ 本発明はストレプトマイセスのみならずアクチノマイセ
ス科全体の様々な微生物並びに大腸菌に用いられる、一
本鎖ＤＮＡによる形質転換または形質導入を介する遺伝
子伝達系のための新規なベクターおよび方法を提供する
ものである。アクチノマデユラ科の微生物は、例えばス
トレプトスボランギウム（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａ
ｎｇｉｕｍ）、アクチップラン（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎ
ｅｓ）、ノカルデイア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アミコラ
ドブシス（Ａ　ｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）、サツカロ
ポリスポラ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）
、アルスロバクタ−（Ａ　ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、
チャイニア（Ｃｈａｉｎｉａ）、ストレプトバーチシリ
ウム（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、
マイクロビスボラ（Ｍ　１ｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ）、マ
イクロコツカス（Ｍ　１ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、マイク
ロテトラスポラ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ）、
コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）、アクチノマデユラ（Ａ　ａｔ　ｉｎｏｍａｄｕｒａ
）およびマイクロモノスポラ（Ｍ　ｉｃｒｏｍｏｎｏｓ
ｐｏｒａ）を包含するがそれらに限定されない。この一
本鎖ＤＮＡで仲介される遺伝子伝達系は宿主細胞の制限
系を迂回し、遺伝子伝達に有効であると思われる。

本発明はストレプトマイセスおよび曲の宿主１１１１胞
内で使用するクローニングベクターを提供するものであ
る。ストレプトマイセスおよび他のアクチ／マイセスを
も含む他の抗生物質産生性生物における組換えＤＮＡ法
の開発および利用は適当なりローニングベクターが手に
入るか否かにかかつている。この開発は、現在、利用可
能なストレプトマイセスおよび他の抗生物質産生性生物
の制限系を迂回し、有用な頻度で生物を形質転換し得る
ベクターの数か非常に少ないという理由からかなり遅れ
ている。本発明は、−本漬ブラスミドまたはファスミド
ベクターか宿主細胞の複数の制限系を回避することがで
き、ストレプトマイセスの高度の制限株をも含む、高度
に制限性の宿主細胞系への遺伝子伝達効率を増大し得る
ということを初めて証明した点で有用であり、とりわけ
重要である。本発明はそのような遺伝子の伝達に適した
ベクターおよび宿主の数を大幅に拡張した。

本発明のベクターは、小さく、多方面に利用可能であっ
て、多くのストレプトマイセス種およびこれまで形質転
換し得なかった多くの他の微生物を形質転換し、〕ｙ択
することができるので、特に有用である。ストレプトマ
イセスは、臨床上重要な抗生物質の半数以上を産生じて
おり、商業上重要な菌類である。本発明はこの工業上重
要なグループのための、新規で有用なりローニングシス
テムおよびベクターを提供し、既知の抗生物質の収率を
増大すると共に、新規な抗生物質、抗生物質誘導体、あ
るいは神々の哺乳類タンパク質産物など、その池の有用
な遺伝子産物を製造するための遺伝子クローニングを可
能にするものである。

本明細書で開示した本発明の目的に従い、以下のごとく
語句を定義する。

抗生物質：微生物によって産生され、天然のままで、あ
るいは制限された１疹飾の下で、他の微生物または真核
細胞の成長を阻害するか死滅させる物質。

抗生物質生合成遺伝子ニー次代謝産物を抗生物質に変換
する工程に必要な酵素活性または池の活性をコードして
いるＤ　Ｎ　Ａセグメンｊ・。

抗生物質生合成経路ニー次代謝産物を抗生物質に変換す
る工程に必要な抗生物質生合成遺伝子の完全な１組。

抗生物質耐性付与遺伝子゛ある抗生物質に対する耐性を
付与する酵素活性または他の活性をコードしているＤＮ
Ａセグメント。

ＡｍＲ・アブラマインン耐性表現型またはそれを付与す
る遺伝子。

ＡｐＲ：アンビシリン耐性付与表現型またはそれを付与
する遺伝子。

ＣＯＳ　：ファージＤＮＡの詰め込み（パッケージング
）中に切断される特殊なファージの粘着末端。

コスミド：ファージλＣＯＳ部位が挿入されており、イ
ンビトロでプラスミドＤＮＡをファージカプシドに詰め
込むことができるプラスミド。

コ轟１云子ライフ゛ラリ−またはゲノムライフ゛ラリー
特定の生物またはファージの実質上、全てのＤＮＡを含
むＤＮＡセグメントがクローニングされている１組の組
換えＤＮＡクローニングベクターｈｎ：高頻度形質導入
、ベクターに高頻度形質導入性を付与するファー／ＤＮ
Ａセグメントをも敬味する。

感染（インフェクンヨン）・ファー／の複製工程であっ
て、ファージか宿主細胞に付善し、そのＤＮＡを注入す
る、宿主細物はファージの復製および成熟を助け、つい
には溶解してファージ粒子を放出する工程。

ｏｒｉニブラスミドの？ＱｉＪ起点。

ファージ・細菌のウィルス、バクテリオファージともい
う。

ファスミド：ファージ、またはプラスミドとして作用す
る組換えＤＮＡベクター プラスミド・自律的に自己′ｆＳｆ製可能な細胞外環状
ＤＮＡ０ 組換えＤＮＡクローニングベクター：１またはそれ以上
の付加的なりＮＡセグメントを付加し得る、または既に
付加されているＤＮＡ分子からなる自律的に複製可能ま
たは組み込み可能な物質であって、プラスミドを含むか
それに限定されない。

レプリコン　ＤＮＡか復製されるケ／ム弔位であって、
複製開始の起点を含有する。

制限断片＝１またはそれ以上の制限酵素の作用によって
生成される線状ＤＮＡ分子。

選択マーカー：自由に複製可能または組み込み可能な組
換えＤＮΔベクターに挿入され、該ベクターを含有する
宿主細胞を同定するのに役立つＤＮＡセグメント。選択
マーカーには、抗生物質耐性付与遺伝子のほか、β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子などが含まれる。

感受性宿主細胞：特定の抗生物質に対する耐性を付与す
るＤＮＡセグメントの存在なしには該抗生物質の存在下
に増殖し得ない宿主細胞。

シャトルヘクター・２ｆｌ類の宿主（例えば、大腸菌と
ストレプトマイセス）のための′ｆｑ製開始部位を３有
するように構築されており、いずれの宿主内でも外来の
配列を担持することができるブラスミ　ド。

形質導入：ファージを介して受容宿主細胞にＤＮＡを導
入し、遺伝型を変化させ、受容細胞に変化をもたらすこ
と。

（形質）導入完了体：形質導入された受容宿主細胞。

トランスフェクタント・ファージＤＮＡによって形質転
換された受容宿主細胞。

形質転換体ニブラスミドまたはファスミドＤＮＡによっ
て形質転換された受容宿主細胞。

形質転換：　ＤＮＡを受容宿主細胞に導入して遺伝子型
を変化させ、その結果受容宿主細胞に変化をもたらすこ
と。

ｔｓｒＲ：チオストレプトン耐性表現型またはそれを付
与する遺伝子。

第１図はプラスミドｐＯＪ１６０の制限部位および機能
地図である。

第２図はファスミドｐｏ　Ｊ　４０１の制限部位および
機能地図である。

第３図はコスミドｐＫＣ４６２ａの制限部位および機能
地図である。

第４図はプラスミドｐｌＪ７０２の制限部位および機能
地図である。

第５図はプラスミドｐＯＪ３２６の制限部位および機能
地図である。

第６図はプラスミドｐｏ　Ｊ　３４８の制限部位および
機能地図である。

第７図はプラスミドｐｌＪ３５２の制限部位および機能
地図である。

第８図はプラスミドｐＯＪ３５５の制限部位および機能
地図である。

第９図はプラスミドｐＯＪ３６１の制限部位および機能
地図である。

第１０図はファスミドｐＯＪ４０２の制限部位および機
能地図である。

第１１図はプラスミドｐＯＪ１９２の制限部位および機
能地図である。

第１２図はファスミドｐｏ　Ｊ　４０５の制限部位およ
び機能地図である。

本発明は、 ａ）大腸菌内で機能的なレプリコン、 ｂ）ストレプトマイセス内て機能的なレプリコン、 ｃ）　Ｆビリを有する大腸菌のフィラメント状バクテリ
オファージの複製起点および形態形成シグナルを含有す
るＤ　Ｎ　Ａセグメント、およびｄ）感受性宿主細胞に
導入されたとき、少なくとも１個の抗生物質に対する耐
性を伝達するｌまたはそれ以上のＤＮＡセグメントを含
有する組換えＤＮＡファスミドシャトルベクターに関す
るものである。

また、本発明は、上記ベクターによる形質転換体に関す
るものである。

本発明のベクターはストレプトマイセスベクター、大腸
菌ベクターおよび大腸菌バクテリオファージの新規なバ
イブリドである。例えば、ファスミドベクターｐｏ　Ｊ
　４０１またはｐＯＪ４０２はストレプトマイセスおよ
び大腸菌の両者に由来するレプリコンを含有しているの
で、ストレプトマイセスおよび大腸菌内で自律的に複製
可能である。

その上、両微生物のための２機能性マーカーが存在して
いる（例えば、大腸菌およびストレプトマイセスの両方
に対するＡｍＲ）ので、便利な選択手段が得られる。さ
らに、バクテリオファージｆｌの複製起点および形態形
成シグナルの存在により、この新規ベクターは一本鎖Ｄ
ＮＡとしてインビトロで詰め込まれ得る。次いで、組換
えファスミドを用いてストレプトマイセス宿主細胞を形
質転換またはトランスフェクトすることができる。

ファスミドシャトルベクターｐＯＪ４０１は約７ｋｂで
あって、プラスミドｐＢ　Ｉｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラ
タジーンから、カタログＮｏ、２１２２０１の下で入手
可能）から導かれ、とりわけ分子クローニングに好都合
な複数個の制限部位を有するポリリンカーを含有してい
る。ファスミドｐＯＪ４０１の構築出発物質は以下のよ
うにして得ることができる。

プラスミドｐＯＪ１６０は構築された株であって、ノー
ザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリーズ、イリ
ノイ６１６０４、ペオリアに寄託され、そのストック・
カルチュアー・コレクションの一部となっているＥ、ｃ
ｏｌｉ　Ｋ　１２　　Ｊ　Ｍ　１０９／ｐＯＪ１６０か
ら常法通り単離することができる。この株は受託番号Ｎ
ＲＲＬ　　Ｂ−１８０８８（受託日：１９８６年７月２
９日）の下、該プラスミドの供給源および保存体として
、何人も入手可能である。プラスミドｐＯＪ１６０の制
限部位および機能地図を添付の第１図に示す。本発明の
目的により、第１図および他の図面はすべて等尺で描か
れていない。ｒｌＦｕ製起点および形態形成シグナルは
、１ａｃＺ遺伝子およびポリリンカーと一緒にバクテリ
オファージＭ１３ｍｐ１９［インターナショナル・バイ
オチクノロシーズ・インコーポレイテノド（Ｉ　Ｂ　Ｉ
　）（［ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｂ　ｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ。

Ｉ　ｎｃ、　）、コ不チカット０６５３５、−’−、：
Ｌ−・ヘイブン、ウィンチエスタ−・アベニュー２フ５
番、Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ９５５８からカタログＮｏ、３３６
３０として入手可能コ、またはファゲミド（ｐｈａｇｅ
ｍｉｄｓ）ｐＴＺ１８およびｐＴＺ１９［メッドら（Ｍ
ｅａｄ）、タンパク工学（Ｐ　ｒｏｔｅｉｎ　Ｅ　ｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ）、１．６７７４（１９８６）］また
はファゲミドｐＢ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジー
ン）から導くことができる。

構築の便宜および容易さから、ｐＢ　１ｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＳＫ”由来の〜２．２５ｋｂ　ＡｈａＩＩＩ断片をプ
ラスミドｐＯＪ１６０の〜４．５ｋｂ　Ｘｍｎ［／５ａ
ｌＩ（フレノウ）断片と結合（ライゲート）させた。Ｅ
、ｃｏｌｉＫ１２　　ＸＬ−Ｉ　　ＢｌｕｅＳＥ、ｃｏ
ｌｊ　Ｋ１２　　ＪＭＩ０９および、ヤニッシュ・ペロ
ンらの表１（前掲）に記載されている他のＥ、ｃｏｌｉ
　Ｋ　ｌ　２誘導体をファスミドｐＯＪ４０１ＤＮＡで
形質転換した。

ファスミドｐＯＪ４０１は、直接的にはストレプトマイ
セス、他のアクチクマイセスおよび大腸菌のクローニン
グベクターとして有用であるが、本発明の範囲に含まれ
る誘導体ベクターの構築にも用いることができる。レプ
リコン、選択マーカーおよびその他の必要なプラスミド
機能を破壊しないことを条件として、ｐＯＪ１６０ポリ
リンカー内の部位をも含めて様々なファスミドｐＯＪ４
０１の制限部位をＤＮＡセグメントの挿入に用いること
ができる。当業者ならば、特定のＤＮＡの結合（ライゲ
ーション）および挿入にはどのような部位か有利である
かを理解し、容易に決定することができる。ファスミド
ｐＯＪ４０１を制限処理し、１またはそれ以上の抗生物
質耐性付与ＤＮＡ断片（実施例１６参照、ピクロマイシ
ン耐性をコードするＤＮＡ断片をｐＯＪ４０１に結合さ
せる）、または既知の抗生物質の遺１云子、新規な抗生
物質または抗生物質誘導体の遺伝子、あるいは哺乳類タ
ンパク質などのなんらかの有用な他の物質の遺伝子と結
合させることかできる。

本発明のベクターは特定の選択マーカーの使用に限定さ
れない。使用可能な選択マーカーとして、アミカ／ン、
アブラマインン、クロラムフェニコール、コリスチン、
ジペカシン、エリスロマインン、ゲンタマイシン、ハイ
グロマイノン、カナマイシン、ネオマイシン、パロモマ
イシン、ポリミキシンＢ１リボメタマイフン、リファン
ピシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、チオ
ストレプトン（サルフォマインン）、ツベラクチノマイ
シンおよびビオマイシン（カブレオマイシン）を挙げる
ことができる。

本発明のベクターはまた、大腸菌やストレプトマイセス
のプラスミドから得られる特定のレプリコンの使用に限
定されない。本発明のファスミドベクターで例示した大
腸菌の機能的レプリコンはプラスミドｐＢＲ３２２から
導かれたが、その他、％Ｍ１な三機能性ファスミドの生
産のための大腸菌レプリコン含有断片は、例えば、プラ
スミドｐＢＲ３２４［ポリバーら（Ｂｏｌｉｖａｒ）、
ジーン（Ｇ　ｅｎｅ）、４：１２１（１９７８）コ、Ｐ
ＢＲ３２５［ソベロンら（Ｓ　ｏｂｅｒｏｎ）、ジーン
（Ｇｅｎｅ）、９　：　２８７（１９８０）］等からも
得られる。

さらに、上記のベクターは、プラスミド５ＣＰ２宜から
導かれたストレプトマイセスのレプリコン５ＣＰ２束［
ビブ（Ｂｉｂｂ）およびホップウッド（ＨｏｐｗｏＯｄ
）う、ジャーナル・オフ゛・ジェネラル・マイクロバイ
オロジー（Ｊ　、　Ｇ　ｅｎ、　Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏ１
．　）、１２６・／１２７−４４２（１９８１）］また
はプラスミドｐ＋Ｊ７０２から導かれたストレプトマイ
セスレプリコンｐｚ７０２［キーサーら（Ｋ　１ｅｓｅ
ｒ）、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエ不テイ
クス（Ｍｏ１．　Ｇ　ｅｎ、　Ｇ　ｅｎｅｔ、　）、＋
　８５　：　２２３−２３８（１９８２）］を含有する
が種々の既知のストレプトマイセスレプリコンを用いて
同様のベクターを構築することができる。表２には、包
括的ではないか、その他の機能的なストレプトマイセス
レプリコンを得ることかできるストレプトマイセスプラ
スミドの例を示す［ホップウッドら（Ｈｏｐｗ。

ｏｄ）、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｅ、、　　１５３
　：　ｌ　ｌ　６−１６６（１９８７）］。当業者なら
ば、レプリコンの機能が破壊されない限り、全プラスミ
ドまたは一部を用いて本発明の例示ベクターを構築する
ことができるということを認めるであろう。表２には、
親レプリコンの供給株も示されている。

（以下余白） 表　２　ストレプトマイセスプラスミドプラスミド　　
　　　　１ノ（給源の株（親−レプリコン）ＳｅＦ６　
　　　　ストレプトマイセス・コエリカラーＡ３（２）
（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌ　１ｃｏｌｏ
ｒ）１）ＶＥＩ ＪＶＩ ｐＵｃ１？ ストしブトマイセス・へ不ス゛エラエＡＴＣＣ１４５８
５（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｅｎｅｚｕｃｌａ
ｅ）ストレプトマイセス・フエエクロモゲ不スＮＲＲＬ
−３５５９（Ｓ　ｔｒｃｐｔｏｍｙｃｃｓ　ｐｈａｅｏ
ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）ストレプトマイセス・ビオオ
ラセウスルーハー（Ｓ　Ｌｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉ
ｏｌａｃｅｕｓｒｕｂｅｒ）ＳＬＰｌ ストレプトマイセス噛りビタンス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　１ｉｖｉｄａｎｓ）ＳＬ
Ｐｌ、　２ ＢＴ１ ５ＶＩＩＩ ＦＪ１０３ ストレプトマイセス・リビダンス６６’″１（Ｓ　ｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌ　１ｖｉｄａｎｓ）ストレプト
マイセス・グリセオブル不ウス１Ｐｓ５５０６６（Ｓ　
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｃｓ　ｇｒｉｓｅｏｂｒｕｎｎｅｕ
ｓ）ストレプトマイセス・ベネス゛エラより５Ｍ４０７
５５（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｅｎｃｚｕｅｌ
ａｅ）ストレプトマイセス・グラニュロルーパーＡ３９
９１２．１３（Ｓ　ｔｒｅｐｊｏｍｙｃｅｓ　　ｇｒａ
ｎｕｌｏｒｕｂｅｒ）ｐＴ八へ００１ ストレプトマイセス・ラヘンデュラエ１０８０（Ｓ　ｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　１ａｖｅｎｄｕｌａｅ）表２（
続き）　ストレプトマイセスプラスミドプラスミド　　
　　　　供給源の株（親−レプリコン）ｐｓＲｃ＋　−
６ストレプトマイセス・ロセオクロモケ竿ス５２６４（
Ｓ　ｊｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｒｏｓｅｏｈｒｏｍｏ
）Ｈｅｎｅｓ）ｐｓＬｌ　　　　　ストレプトマイセス
・ラベンテユラエＫＣＣ５Ｏ９８５（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ　１ａｖｅｎｄｕｌａｅ）ｐＡＩＧ２００ ストレプトマイセス・クリツマラスＺ１ＮＩＥＴ　４３
６８６（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｈｒｙｓｏｍ
ａｌ　１ｕｓ）ｐｓ＋２７６５ ストレプトマイセス・フラディアエ５Ｆ７６５（Ｓ　ｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｒａｄｉａｅ）ＳＫ２ ＳＧ２ ＳＧ５ ＮＭｌｏ０ 不トレプトマイセス・カス力エンシス〜ｌＢ２７３（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ）ス
トレプトマイセス・ガンゲンシスＤＳＭ　２９３２（Ｓ
　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｈａｎｇｅｎｓｉｓ）ス
トレプトマイセス・ガンゲンシスＤＳＭ　２９３２（Ｓ
　Ｌｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｈａｎｇｅｎｓｉｓ）ス
トレプトマイセス・バージニアエ （Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｃｓ　ｖｉｒｇｉｎｉａｃ）
本発明の組換えＤＮＡファスミドシャトルベクターの使
用は、ストレプトマイセスまたは他のアクナノマイセス
類の単一の種または株に制限されるものではなく、アミ
ノサイクリトール、アンサマイシン、アントラサイクリ
ンおよびキノン、マクロライド、リンコサミドおよびス
トレプトグラミン、β−ラクタム、ポリエーテル等の抗
生物質、およびペプチド抗生物質または他の商業上重要
な生産物を産生ずる経済上重要な、制限性の、または非
制限性の多くのアクチクマイセス株宿主細胞の形質転換
にも用いることかできる。

アミンサイクリトール抗生物質を産生じ、本発明方法か
特に有用であって、本発明ベクターを導入することかで
きる好ましいストレプトマイセス煩宿主１１１１胞には
、例えば、ストレプトマイセス・カナマイセチカス（Ｓ
　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕ
ｓ）（カナマイシンｍ）、Ｓ、クレストマイセチカス（
Ｓｃｈｒｅｓｔｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）（アミノンジン
）、Ｓ、グリセオフラパス（Ｓｏｇｒｉｓｅｏｆｌａｖ
ｕｓ）（抗生物質ＭＡ１２６７）、Ｓ、ミクロスボレウ
ス（Ｓ　、　ｍ１ｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）（抗生物質５
Ｆ−７６７）、Ｓ、リホンフィカス（Ｓ、ｒｉｂｏｓｉ
ｄｉｆｉｃｕｓ）（抗生物質５Ｆ７３３）、Ｓ　フラホ
ペルンカス（Ｓ　、　Ｎａｖｏｐｅｒｉｓｉｃｕｓ）（
スペクチクマイシン）、Ｓ、スペクタビリス（Ｓ　、　
５ｐｅｃｔａｂｉｌ　１ｓ）（スペクチクマインン）、
Ｓ　リモサス・ホルマ・パロモマインナス（Ｓ、ｒｉｍ
ｏｓｕｓ　ｆｏｒｍａ　ｐａｒｏｍｏｍｙｃｉｎｕｓ）
（パロモマインン類、カテヌリン）、Ｓ、フラティエ・
バー、イタリカス（Ｓ　、　ｆｒａｄｉａｅ　ｖａｒ、
　１ｔａｌｉｃｕｓ）（アミノンジン）、Ｓ　フルエン
シス・バー・フルエンシス（Ｓ　、　ｂｌｕｅｎｓｉｓ
　ｖａｒ、　ｂｌｕｅｎｓｉｓ）（プルエンソマインン
）、Ｓ、カテニューレ（Ｓ　、　ｃａｔｅｎｕｌａｅ）
（ノノテヌリン）、Ｓ、オリポレティキュリ・バー・セ
ルロフイラス（Ｓ、ｏｌｉｖｏｒｅｔｉｃｕｌｉ　ｖａ
ｒ、ｃｅｌｌｕｌｏｐｈｉｌｕｓＸデストマインンＡ）
、Ｓ、ラベンテ゛ユーレ（Ｓａｖｅｎｄｕｌａｅ）　（
不オマインン）、Ｓ　アルホグリセオラス（Ｓ　、　ａ
ｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）（ネオマイシン頌）、Ｓア
ルプス・バー・メタマイシンス（Ｓ、ａｌｂｕｓ　ｖａ
ｒｍｅｔａｍｙｃｉｎｕｓ）（メタマイシン）、３　　
ハイグロスコビノノス・バー・サガミエンシス（Ｓ　、
　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　ｖａｒ、ｓａｇａｍｉ
ｅｎｓｉｓ）（スペクチクマイシン）、Ｓビキニエンシ
ス（Ｓ、ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ）（ストレプトマイシ
ン）、Ｓ、グリセウス（Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ）（ストレ
プトマイシン）、Ｓ、エリスロクロモゲナス・バー・ナ
ルトエンシス（Ｓ　、　ｅｒｙｅｈｒｏｃｈｒｏｍｏｇ
ｅｎｅｓ　ｖａｒ、　ｎａｒｕｔｏｅｎｓ　１ｓ）（ス
トレプトマイシン）、Ｓ、フルエンシス（Ｓ　、　ｐｏ
ｏｌｅｎｓｉｓ）（ストレプトマイシン）、Ｓガルブス
（Ｓ　、　ｇａｌｂｕｓ）（ストレプトマイシン）、Ｓ
ラメウス（Ｓ　、　ｒａｍｅｕｓ）　（ストレプトマイ
シン）、Ｓオリバセウス（Ｓ　、　ｏｌ　１ｖａｃｅｕ
ｓ）（ストレプトマイシン）、Ｓ、７　ンユｘンシス（
Ｓ、ｍａｓｈｕｅｎｓｉｓ）（ストレプトマイシン）、
Ｓ　バイグロスコピカス・バー・ノモ不ウス（Ｓ　、　
ｌ＋ｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　ｖａｒ、　Ｉｉｍｏｎ
ｅｕｓ）（）＼リタマインンｍ）、Ｓ、リモファシエン
ス（Ｓ、ｒｉｍ。

ｆａｃｉｅｎｓ）（テストマイシンＡ）、Ｓ、バイグロ
スコピカス・ホルマ・グレポサス（Ｓ　、　ｈｙｇｒｏ
ｓｃｏｐｉｃｕｓｆｏｒｍａ　ｇｌｅｂｏｓｕｓ）（グ
レポマイシン）、Ｓ　フラディエ（Ｓ、　ｆｒａｄｉａ
ｅ）（ハイフ゛リマインン類、ネオマイノン類）、Ｓ　
ニーロンジカス（Ｓ　、　ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ）（
抗生物質Ａ１６３１６−Ｃ）、Ｓ、アクアカナス（Ｓａ
ｑｕａｃａｎｕｓ）（Ｎ−メチルハイグＣｌフインンＢ
）、Ｓクリスタリヌス（Ｓ　、　ｃｒｙｓｔａｌ　ｌ　
１ｎｕｓ）（ハへグロマイノン八）、Ｓ　ノホリトエン
／ス（Ｓ　、　ｎｏｂｏｒ　ｉ　Ｌｏｅｎｓ　１ｓ）（
ハイグロマイシン）、Ｓ　バイグロスコピカス（Ｓ　、
　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）（）λイブ０フイ／ン
頌、ロイカニ／ノン、ハイグロリンン）、Ｓ　アトロフ
ァンエンス（Ｓ　、　ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ）（ハイ
グロマイノン）、Ｓカスカスビナス（Ｓ　、　ｋａｓｕ
ｇａｓｐｉｎｕｓ）（カスツノマイノン）、Ｓ、カスガ
エンンス（Ｓ　、　ｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ）（カナマ
イシン類）、Ｓ　ネトロブシス（Ｓ　、　ｎｅｔｒｏｐ
ｓｉｓ）（抗生物質ＬＬ−ＡＭ３１）、Ｓ　リビタス（
Ｓ、１ｉｖｉｄｕｓ）　（リビドマインン類）、Ｓ、ホ
フエン／ス（Ｓｈｏｆｕｅｎｓｉｓ）（セルドマイノン
複合体）、およびＳカナス（Ｓ　、　ｃａｎｕｓ）　（
リホシルパロマミン）の細胞か含まれる。これらの抗生
物質を産生じ、本発明に有用なアクナノマイセス類（ス
トレプトマイセス以外）および他の生物には、例えば、
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の様々な種（種々のアミ
ノグリコ７ド類）、ミクロモノスポーラ（Ｍ　ｉｃｒｏ
ｍｏｎｏｓｐｏｒａ）の様々な腫（ケンタマイソン類）
、サツカロポリスポーラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓ
ｐｏｒａ）のＬ・ｌ々な種（種々のアミングリコシド）
およびストレプトパーティシリウム・フラボベルンカス
（スペクチクマイシン）（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉ
ｃｉｌｌｉｕｍ　ｆｌａｖｏｐｅｒｓｉｃｕｓ（Ｓ　ｐ
ｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ））の細胞が含まれる。

アンサマイシン抗生物質を産生じ、本発明方法が特に有
用であって、本発明ベクターを導入するごとができる好
ましいストレプトマイセス類宿主細胞には、例えば、Ｓ
、コリンズ（Ｓ、ｃｏｌｌｉｎｕｓ）（アンサトリエン
Ｔ頁、ナブトマイ／ンｌ）、Ｓ　　シアストクロモケン
（Ｓ　、ｄｉａｓｔｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）（アン
サトリエン類、ナプトマイ／ン類）、Ｓ　ガルブス・亜
種・Ｓ　グリセオスポラス（Ｓ　、　ｇａｌｂｕｓ　５
ｕｂｓｐ、　Ｓ　、　ｇｒｉｓｅｏｓｐｏｒｅｕｓ）（
ナブトマインンＢ）、Ｓ、ノ飄イグロスコピカス（Ｓ　
、　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）　（ヘルビマイシン
）、Ｓ　バイグロスコピカス・バー・ゲルタヌス・バー
９ノーハ（Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　ｖａｒ、
ｇｅｌｄａｎｕｓ　　ｖａｒ、　ｎｏｖａ）　（ケルダ
マインン類）、Ｓ、＝ゲラス（Ｓ、ｎｉｇｅｌ　１ｕｓ
）（２１−ハイドロキシ−２５−デメチル２５−メチル
チオプロトストレブトバリンン）、Ｓ　リ７リエン／ス
（Ｓ　、　ｒｉｓｈｉｒｉｅｎｓｉｓ）（マイコトリエ
ン類）、ストレプトマイセスｓｐ、Ｅ／７８４（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｃｓ　ｓｐ、　Ｅ　／　７８４　）（ア
クタマイシン、マイコトリエン類）、ストレプトマイセ
スｓｐ、　Ｅ　８８　（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　
ｓｐ、　Ｅ　８８　）（マイコトリエン類）、Ｓ、スペ
タビリス（Ｓ　、　５ｐｅｃｔａｂｉ　１ｉｓ）　（ス
トレプトバリシン類）、ｓ、トリポフォラス（Ｓ　、ｔ
ｏｌｙｐ。

ｐｈｏｒｏｕｓ）　（トリポリマイシン）の細胞か含ま
れる。

これらの抗生物質を産生じ、本発明に有用なアクナノマ
イセス類（ストレプトマイセス以外）および他の生物に
は、例えば、ミクロモノスポーラの様々な種（アンサマ
イシン類）およびノカルデイア・メディトリアネ（リフ
ァマイシン）（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｍｅｄｉｔｅｒｒａ
ｎｅｉ（ｒｉｆａｍｙｃｉｎ））の細胞か含まれる。

アントラサイクリンおよびキノン抗生物質を産生じ、本
発明方法か特に有用であって、本発明ベクターを導入す
ることができる好ましいストレプトマイセス類宿主細胞
には、例えば、Ｓ　カスビトサス（Ｓ、ｃａｓｐｉｔｏ
ｓｕｓ）（ミドマイシンＡ、　Ｂ、およびＣ）、Ｓ　コ
エリカラー（Ｓ　、　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（アクチ
ノロディン）、Ｓ、コエルレオルビデイカス（Ｓ。

ｃｏｅｒｕｌｃｏｒｕｂｉｄｉｃｕｓ）（タウノマイ／
ン）、Ｓ　ンアヌス（Ｓ　、　ｃｙａｎｅｕｓ）（’；
　ｌ−リサルビンン）、Ｓ　フラホグリセウス（Ｓ　、
　ｆ　ｌａｖｏｇｒｉｓｅｕｓ）（ンアノサイクリンｌ
＼）、Ｓ　ノノリラウス（Ｓ　、　ｇａｌｉｌａｅｕｓ
）（アクラシノアイシンΔ、オーラマイ／ン、およびス
ルフルマイジン）、Ｓ　ランタヌス（Ｓ　、　１ｕｓｉ
Ｌａｎｕｓ）（ナプチリ／ノマイ／ン）、Ｓ、プセチカ
ス（Ｓ　、　ｐｅｕｃｅｔ　１ｃＵＳ）（クウ／マイン
ンおよびアトリアマイジン）、およびＳ　バイオロクロ
モケン（Ｓ　、　ｖｉｏｌｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）
（アルコマイジン）の細胞か含まれる。

マクロライド、リンコサミドおよびストレプトグラミン
抗生物質を産生じ、本発明方法が特に有用であって、本
発明ベクターを導入することができる好ましいストレプ
トマイセス類宿主細胞には、例えば、ストレプトマイセ
ス・ケレステイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｅ
ｌｅｓｊｉｓ）（抗生物質Ｍ１８８、セレスチセチン）
、Ｓ　プラテンンス（Ｓ　、　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）（
プラテノマインン）、Ｓ　ロノチェイ・バー・ホルビリ
ス（Ｓ、ｒｏｃｈｃｉ　ｖａｒ、ｖｏｌｕｂｉｌｉｓ）
（抗生物質′Ｆ２６３Ｇ）、８　へ不ズエラｘ　（Ｓ　
、　ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）（メチマイノン類）、Ｓ　
グリセオスポス（Ｓ　、ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）（
ハントリン）、Ｓ　ブールホ不ンシス（Ｓ　、　ｎａｒ
ｂｏｎｅｎｓ　ｉｓ）　（ジョサマイシン、ナルホマイ
シン）、Ｓフンシンジカス（Ｓ　、　ｆｕｎｇｉｃｉｄ
ｉｃｕｓ）（抗生物質ＮＡ１８１）、Ｓ　グリセオファ
フェンス（Ｓ、ｇｒｉｓｅ。

ｒａｃｉｅｎｓ）（抗生物質ＰＡ１３３Ａ、Ｂ）、Ｓ、
ロゼオシトレウス（Ｓ　、　ｒｏｓｅｏｃＨｒｅｕｓ）
（アルボサイクリン）、Ｓ　プルネオグリセウス（Ｓ　
、　ｂｒｕｎｅｏｇｒｉｓｅｕｓ）（アルボサイクリン
）、Ｓ、ロセオクロモゲネス（Ｓｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍ
ｏｇｅｎｅｓ）（アルボサイクリン）、Ｓ、シ不ロクロ
モゲネス（Ｓ　、　ｃ　ｉｎｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎ
ｅｓ）　（シネロマイシンＢ）、Ｓ　アルプス（Ｓ　、
　ａｌｂｕｓ）（アルボマイセチン）、Ｓ、コエルウス
（Ｓ　、　ｒｅｌ　１ｅｕｓ）（アルコマイ・シン、ピ
クロマイシン）、Ｓ、ロッチェイ（Ｓｒｏｃｈｅｉ）（
ランカシジン、ポレリジン）、Ｓ、ビオラセオニケル（
Ｓ、ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ）（ランカシジン、ホ
レリジン）、Ｓ、グリセウス（Ｓ　、　ｇｒｉｓｅｕｓ
Ｘホレリジン）、Ｓ　メゼウス（Ｓ　、　ｍａｉｚｅｕ
ｓ）（インゲラマイシン）、Ｓ、アルプス・バー・コイ
ルマイセチカス（Ｓ、ａｌｂｕｓ　　ｖａｒ、ｃｏｉｌ
ｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）（コレイマイシン）、Ｓ、ミカロ
ファシエンス（Ｓ　、　ｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ）
（アセチルロイコマイジン、エスピノマイジン）、Ｓ　
バイグロスコピカス（Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ
）（タイロシン）、Ｓ、グリセオスビラリス（Ｓ　、　
ｇｒｉｓｅｏｓｐｉｒａｌｉｓ）（レロマイシン）、Ｓ
、ラベンジュレ（Ｓ、１ａｖｅｎｄｕｌａｅ）（アルト
ガマイシン）、Ｓ　リモサス（Ｓ　、　ｒｉｍｏｓｕｓ
）（タイロシン、ニュートラマイシン）、Ｓデルタエ（
Ｓ　、　ｄｅｌｔａｅ）　（デルタマイシン類）、Ｓ、
ファンジンジカス・バー・エスピノマイセチカス（Ｓ。

ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ　　ｖａｒ、ｅｓｐｉｎｏｍ
ｙｃｅｔｉｃｕｓ）（ニスピノマイシン類）、Ｓ、フル
ジンジカス（Ｓ　、　ｆｕｒｄｉｃｉｄｉｃｕｓ）（ミ
デカマイシン）、Ｓ、アンホファ／エンス（Ｓａｍｏｂ
ｏｌ’ａｃｉｅｎｓ）（スピラマイジン、）７Ｃ７マン
ジンＤ）、Ｓ　エーロ／デイカス（Ｓ　、　ｅｕｒｏｃ
　ｉｄ　１ｃｕｓ）（メチマイシン）、Ｓ　グリセオラ
ス（Ｓ　、　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）（グリセオフラプス
）、Ｓ、フラポクロモゲ不ス（Ｓ　、　［１ａｖｏｃｈ
ｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）（アマロマイシン、シンコマイレ
ン類）、Ｓ　フィムブリアタス（Ｓ、ｆｉｍｂｒｉａｔ
ｕｓＸアマロマイシン）、Ｓ、ファシキュラス（Ｓ　、
　ｆａｓｃｉｃｕｌｕｓ）（ア？ＣＩフィシン）、Ｓ、
ｘリスレウス（Ｓ　、　ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ）（エリス
ロマイシンｆｆ１Ｕ、Ｓ　　アンチビオチカス（Ｓ　：
ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）（オレアンドマイシン）、
Ｓ、オリホクロモゲ不ス（Ｓ　、　ｏｆ　ｉｖｏｃｈｒ
ｏｍｏｇｅｎｅｓ）（オレアンドマイシン）、Ｓ　スピ
ニクロモゲネス・バー°スラガエンシス（Ｓ　、　ｓｐ
ｉｎｉｄｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ｖａｒ、　ｓｕｒａｇ
ａｏｅｎｓ　ｉｓ）　（クジマイシン類）、Ｓ、キタサ
トエンシス（Ｓ　、　ｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓ）（
ロイコマイシンＡ３およびジョサマイシン）、Ｓ、ナル
ボ不ジンス・バー・ジョサマイセチカス（Ｓ　、　ｎａ
ｒｂｏｎｅｎｓ　ｉｓ　ｖａｒ、　ｊｏｓａｍｙｃｅｔ
ｉｃｕｓ）（ロイコマイノンＡ３、ジョサマイシン）、
Ｓ　アルケンチオラス（Ｓ　、　ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏ
ｌｕｓ）（ミコノマイシン）、Ｓ　ビキニエン７ス（Ｓ
、ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ）（チャルコマイシン）、Ｓ
　サーラタス（Ｓ　、　ｃｉｒｒａｔｕｓ）（メチマイ
シン）、Ｓ　シャカルテンシス（Ｓ、ｄｊａｋａｒｔｅ
ｎｓｉｓ）にタマイジン）、Ｓ、ユーリーサーマス（Ｓ
　、　ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ）　（アンコラマイシン
）、Ｓフラディエ（Ｓ　、　ｆ　ｒａｄｉａｅ）　（タ
イロシン、ラクテノシン、マイクロジン）、Ｓ　ゴシキ
エンシス（Ｓ　、　ｇ。

５ｈｉｋｉｅｎｓｉｓ）（パンダマイジン）、Ｓ　グリ
セオフラプス（Ｓ　、　ｇｒｉｓｅｏｆ　１ａｖｕｓ）
（アキュマイシン）、Ｓ　ハルステシイＣ５、ｈａｌｓ
ｔｅｄｉｉ）（カルボマイシン）、Ｓテンダニ（Ｓ　、
　ｔｅｎｄａｅ）　（カルボマイシン）、Ｓ、？クロス
ポレウス（Ｓ　、　ｍａｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）（カル
ボマイシン）、Ｓ　サーモトレランス（Ｓ　、　ｔｈｅ
ｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）（カルボマイシン）、および
Ｓ、アルピレチキュリ（Ｓａｌｂｉｒｅｔｉｃｕｌｉ）
（カルボマイ／ノンの細胞が含まれる。これらの抗生物
質を産生し、本発明に有用なアクナノマイセス類（スト
レプトマイセス以外）および他の生物には、例えば、ミ
クロモノスボーラ・Ｏザリア（ロイコマイシン）（Ｍ　
ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｒｏｓａｒｉａ（ｒｏｓａ
ｒａｍｙｃｉｎ））の細胞か含まれる。

β−ラクタム抗生物質を産生じ、本発明方法が特に有用
であって、本発明ベクターを導入することができる好ま
しいストレプトマイセス類宿主細胞には、例えば、Ｓ、
リソブマニ（Ｓ　、　ｌｉｐｍａｎｉｉ）（ペニシリン
Ｎ１７−メドキシセフアロスポリンＣ３Ａ１６８８４、
ＭＭ４５５　Ｃ）、およびＭＭ　ｌ　３９０２）、Ｓ、
クラブリゲラス（Ｓ　、　ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）
（ＰＡ−３２４１３−１、セファマイシンＣ，Ａｌ６８
８６Ｂ、クラプラン酸および他のグラバム類）、Ｓ、グ
リセウス（Ｓ　、　ｇｒｉｓｅｕｓ）（セファマイシン
Ａ１Ｂ）、Ｓ　バイグロスコピカス（Ｓ　、　ｈｙｇｒ
ｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）（テアセトキンセファロスポリン
Ｃ）、Ｓ、ワタヤメン／ス（Ｓ、ｗａｄａｙａｍｅｎｓ
ｉｓ）　（ＷＳ　　３４４２Ｄ）、Ｓ、チャートレウシ
ス（Ｓ　、　ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｓ）（ＳＦ１６２３
セファマイシンＡおよびＢ）、Ｓ、ヘテロモルファス（
Ｓ　、　ｈｅｔｅｒｏｍｏｒｐｈｕｓ）、およびＳ　パ
ナＸ　７　シス（Ｓ、ｐａｎａｙｅｎｓｉｓ）（Ｃ２０
８１ＸセファマイシンＡおよびＢ）；Ｓ　　シナモ不ン
シス（Ｓ、ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓ　ｉｓ）、Ｓ、フィ
ンブリアタス（Ｓ　、　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ）、Ｓ、
ハルステジ（Ｓ　、　ｈａｌｓｔｅｄｉｉ）、Ｓ　ロノ
チェイ（Ｓ　、　ｒｏｃｈｅｉ）およびＳ、ピリドクロ
モゲネス（Ｓｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）（
セファマイシンＡＸＢ）；Ｓカトレヤ（Ｓ　、　ｃａｔ
　ｔ　１ｅｙａ）　（チェナマイ７７）；Ｓ、７ラボビ
レンス（Ｓ　、　Ｎａｖｏｖｉｒｅｎｓ）、Ｓ、コラハ
ス（Ｓｆｌａｖｕｓ）、Ｓ、フルホビリジス（Ｓ、　ｆ
ｕｌｖｏｖｉｒｉｄｉｓ）、およびＳ、ンオヤエンシス
（Ｓ　、　ｓｉｏｙａｅｎｓｉｓ）（ＭＭ４５５０およ
び！ｖ１Ｍ　１３９０２）、Ｓ、アルケンチオラス（Ｓ
　、　ａｒｇｅｎｔｃｏｌｕｓ）（アスパレノマイジン
Ａ、ＭＭ４５５０お、上ひＭＭ１３９０）；およびＳ、
オリバセウス（Ｓ　、ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）（エピチェ
ナマイシンＦ、ＭＭ１７８０、ＭＭ４４５０、およびＭ
ＭＩ３９０２）の細胞が含まれる。これらの抗生物質を
産生じ、本発明に有用なアクナノマイセス類（ストレプ
トマイセス以外）および他の生物には、例えば、セファ
０スポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｌ　ｉｕｍ）の様
々な種（種々のβ−ラクタム類）、ノカルデイア・ラク
タマジュランス（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｌａｃｔａｍａｄ
ｕｒａｎｓ）、セファマインＣ（ｃｅｐｈａｍｙｃｉｎ
　Ｃ）およびペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）
の様々な種（種々のβ−ラクタム類）の細胞が含まれる
。

ヌクレオチド抗生物質を産生じ、本発明方法が特に有用
であって、本発明ベクターを導入することかできる好ま
しいストレプトマイセス類または池のアクチクマイセス
宿主細胞には、例えば、コリネバクテリウム・ミシガネ
ーゼｐｖ、ラサイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
ｍｉｃｈｉｇａｎｅｓｅ　ｐｖ、　　ｒａｔｈａｉ）（
ツニカマイシン同族体）、ノカルデイア・カシジダス（
Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｃａｎｄｉｄｕｓ）（ビラシフリン
）、Ｓ、アンチバイオティカス（Ｓ　、　ａｎｔｉｂｉ
ｏｔｉｃｕｓ）（アラ−Ａ）、Ｓ。

チャートレウシス（Ｓ　、　ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｓ）
（ツニカマイシン）、Ｓ、グリセオフラバス・バー・ス
リンゲエジンス（Ｓ　、　ｑｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ　
ｖａｒ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（ストレプト
ビリダンス）、Ｓ、グリセオラス（Ｓ　、　ｇｒｉｓｅ
ｏｌｕｓＸシネフンギン）、およびＳ、リンスペリマイ
カス（Ｓ　、　１ｙｓｏｓｕｐｅｒｉｒｉｃｕｓ（ツニ
カマイシン）の細胞が含まれる。

ポリエーテル抗生物質を産生じ、本発明方法かを特に有
用であり、本発明ベクターを導入することができる好ま
しいストレプトマイセス類の好ましい宿主細胞には、例
えば、Ｓ、アルプス（Ｓ　、　ａｌｂｕｓ）（Ａ　２０
４、Ａ２８６９５ＡおよびＢ１サリノマイシン）、Ｓ　
バイグロスコピカス（Ｓ　、　ｈｙｇｒｏｓｃ。

ｐｉｃｕｓ）（Ａ　２１８、エメリシト、ＤＥ３９３６
、ＡＬ２０ＡＸＡ２９６９５Ａ　およびＢ、エテロマイ
シン、ジア不マイシン）、Ｓ、グリセウス（Ｓｇｒｉｓ
ｅｕｓ）（ギルソリキシン）、Ｓ、コングロバタス（Ｓ
ｃｏｎｇｌｏｂａｔｕｓ）（イオノマイシン）、Ｓ、ユ
ーロシンジカス・バー・アステロシジカス（Ｓ　、　ｅ
ｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ　ｖａｒ、ａｓｔｅｒｏｃｉｄｉ
ｃｕｓＸライドロマイシン）、Ｓラサリエンシス（Ｓ　
、　１ａｓａｌｉｅｎｓｉｓ）（ラサロシド）、Ｓ、リ
ボシジフイカス（Ｓ　、　ｒ　１ｂｏｓ　ｉｄ　１ｃｕ
ｓ）　（Ｃ’ノマイシン）、Ｓ、カカオ・バー・アラエ
ンシス（Ｓ　、　ｃａｃａｏｉ　ｖａｒ、ａｓｏｅｎｓ
ｉｓＸリソセリン）、Ｓ、シナモネンシス（Ｓ、ｃｉｎ
ａｍｏｎｅｎｓｉｓ）（モネンシン）、Ｓ　オーレオフ
ァンエンス（Ｓ　、　ａｕｒｅｏｆ　ａｃ　１ｅｎｓ）
　（ナラジン）、Ｓ、ガリナリウス（Ｓ、ｇａｌｌｉｎ
ａｒｉｕｓ）（ＲＰ　３０５０４）、Ｓ、ロングウソデ
ン／ス（Ｓ　、　ｌｏｎｇｗｏｏｄｅｎｓ　１ｓ）（リ
ソセリン）、Ｓ　フラベオラス（Ｓ　、　ｆｌａｖｅｏ
ｌｕｓ）（ＣＰ３８９３６）、Ｓ、ムタビリス（Ｓ、ｍ
ｕｔａｂｉｌｉｓ）（Ｓ１１７４３ａ）、およびＳ　ビ
オラセオニゲル（Ｓｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ）にゲ
リシン）の細胞が含まれる。

これらの抗生物質を産生じ、本発明に有用なアクナノマ
イセス類（ストレプトマイセスを除＜）オ・よひ池の微
生物には、種々のポリエーテルを産生ずるアクチ／マジ
ュラ（Ａ　ａｔ　ｉｎｏｍａｄｕｒａ）、タクチクスボ
ランギウム（Ｄａｃｔｉｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）、
ノカルデイアおよびストレプトベルチシリウム（Ｓ　ｔ
ｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）の細胞が含まれ
る。

ペプチド抗生物質を産生じ、本発明方法が特に有用であ
り、本発明ベクターを導入することかできる好ましいス
トレプトマイセス類、または近縁の属、例えば、バ／ル
ス、ノカルデイア、アミコラドブシスおよびアクチップ
ランの宿主細胞には、例えば以下のような微生物の細胞
が含まれる；アミコラドブシス、・オリエンタリフ、　
（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ
）およびＳ、ハラノシエンシス（Ｓ　、　ｈａｒａｎｏ
ｍｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）（バンコマイシン）、ノカルデ
イア・カンジダス（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｃａｎｄｉｄｕ
ｓ）（Ａ−３５５１２、アボパルジン）、ノカルデイア
・ルリタ（Ｎｏｃａｒｄｉａ　１ｕｒｉｄａ）（リスト
セチン）、Ｓ、アンチバイオティカス（Ｓ　、　ａｎｔ
　１ｂｉｏｔ　１ｃｕｓ）（アクチクマイシン）、Ｓ、
アクレウス（Ｓ　、　ａｕｒｅｕｓ）　（チオストレプ
トン）、Ｓ、カヌス（Ｓ　、　ｃａｎｕｓ）（アンフォ
マイシン）、Ｓ、プリスチナエスピラリス（Ｓ　、　ｐ
ｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｌｓ）（プリスタマイシ
ン）、Ｓ、ロゼオスポラス（Ｓ。

ｒｏｓｅｓｐｏｒｕｓＸＡ　２１９７８　Ｃの様なりボ
ペプチド）および３．エブロスボレウス（Ｓ　、　ｅｂ
ｕｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）（ＬＬ−ＡＭ３７４）、Ｓ、バ
ージニアｘ　（Ｓ　、　ｖｉｒｇｉｎｉａｅ）（Ａ４１
０３０）およびＳ　トヨ力エンシス（Ｓ、ｔｏｙｏｃａ
ｅｎｓｉｓ）（Ａ　４７９３４　）、アクチップラン・
ミソリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ　ｍ１ｓｓ
ｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）（Ａ４６９６、アクチプラン）、
およびアクチップラン・ティコマイセチカス（Ａｃｔｉ
ｎｏｐｌａｎｅｓ　ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔ　１ｃｕｓ
）（ティコマイシンあるいはティコプラニン）。

他のタイプの抗生物質を産生じ、本発明方法が特に有用
であって、本発明ベクターを導入することかできるスト
レプトマイセス類の株の好ましい宿主細胞には、以下の
微生物の細胞が含まれる。

様々な種のストレプトマイセス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ）（アミノ酸同族体、例えばサイクロセリン）、
Ｓ、コエリカラ−（Ｓ　、　ｃｏｅｌ　１ｃｏｌｏｒ）
　（シクロペンクン環を含有、例えばメチレノマイシン
Ａ）、Ｓ、エリスロクロモケン（Ｓ　、　ｅｒｙｔｈｒ
ｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）（シクロペンクン環を含有
、例えばサイコマイクン）、Ｓ、バイオラセオルーバ−
（Ｓ　、　ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）（シクロペン
タン環を含有、例えばメチレノマイシンＡ）、Ｓべ不ズ
エラｘ　（Ｓ　、　ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）　にトロ含
有、例えばクロラムフェニコール）、Ｓ、グリセウス（
Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ）（ポリエン類、例えばカンクンジ
ン）、Ｓノドサス（Ｓ　、　ｎｏｄｏｓｕｓ）（ポリエ
ン類、例えばアンファテリシンＢ）、Ｓ　ヌルセイ（Ｓ
　、　ｎｏｒｓｅｉ）　（ポリエンＬ例えばニスタチン
）、Ｓ、オーレオファシエン（Ｓ　、　ａｕｒｅｏｆａ
ｄｉｅｎｓ）（テトラサイクリン類、例えばテトラサイ
クリン、クロルテトラサイタリン、デメチルテトラサイ
クリン、およびデメチルクロルテトラサイクリン）およ
びＳ、リモサス（Ｓ　、　ｒｉｍ。

５ＵＳ（テトラサイクリン、例えばオキンテトラサイク
リン）。

本発明に係るベクターを特に有用に使用でき、形質転換
できる、その他の好ましいストレプトマイセスの好まし
い宿主細胞には、例えば以下のような微生物の細胞が含
まれる　、Ｓ、グラニュロルーバ−（Ｓ　、　ｇｒａｎ
ｕ　１ｏｒｕｂｅｒ）、Ｓ、リビタンス（Ｓ、１ｉｖｉ
ｄａｎｓ）、Ｓ、アクリマイシンス（Ｓ　、　ａｃｒｉ
ｍｙｃｉｓ）、Ｓ、グラウセッセンス（Ｓ　、　ｇｌａ
ｕｃｅｓｃｅｎｓ）、Ｓ、パルビリン（Ｓ　、　ｐａｒ
ｖｉｌｉｎ）、Ｓ、ビンセウス（Ｓ　、　ｖｉｎａｃｅ
ｕｓ）、Ｓ、ニスピノサス（Ｓ　、　ｅｓｐｉｎｏｓｕ
ｓ）およびＳアズレウス（Ｓ　、　ａｚｕｒｅｕｓ）。

上記の代表的なストレプトマイセス宿主細胞に加えて、
本発明に係るベクターは、上記の他の類の株の細胞を形
質転換するのにも有用である。そのような菌株は例えば
、ハシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス
（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、並びにストレプト
スボランキウム（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏ　　ｓｐｏｒａｎｇ
ｉｕｍ）、アクチノプラネス（Ａ　ｃｔｉｎｏｐｌａｎ
ｅｓ）、メカルティア（Ｎ　ｏｃａｒｄ　ｉａ）アミコ
ラドブシス（Ａ　ｍｙｃｏｌａｔ。

ｐｓｉｓ）、サツカロポリスポラ（ｓａｃｃｈａｒｏｐ
ｏｌｙｓｐｏｌａ）およびミクロモノスポーラ（Ｍ　ｉ
ｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｌａ）などのアクナノマイセス類
（Ａｃｔｉｍｙｃｅｔｅｓ）近縁株である。この様に、
本発明のベクターは広範囲に適用でき、有用であって、
様々な微生物の宿主細胞を形質転換することができる。

本発明のあらゆる態様が利用できるが、本発明の組換え
ＤＮＡクローニングベクターおよび形質転換体の内、幾
つかのものが好ましい。即ち、好適なベクターは、ファ
スミドｐｏ　Ｊ　４０１、ｐＯＪ４０２およびｐＯＪ４
０５であり、好ましい形質転換体は、ストレプトマイセ
ス・フラディエ／ｐＯＪ４０１．Ｓ　　コラディＩ／ｐ
ＯＪ４０２、Ｓフラディエ／ｐＯＪ４０５、Ｓ、グリセ
オフスカス／ｐｏ　Ｊ　４０１／Ｓ　　グリセオフスカ
ス／ｐＯＪ４０２、Ｓ、グリセオフスカス／ｐＯＪ４０
５、Ｓ。

トヨカエジンス／ｐｏ　Ｊ　４０　］、Ｓ　トヨ力エン
シス／ｐＯＪ４０２、Ｓ、トヨ力エンシス／ｐＯＪ４０
５、大腸菌に１２　ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ／ｐＯＪ４０１、
大腸菌Ｋ　１２　ＸＬ　１−Ｂｌｕｅ／ｐＯＪ　４０２
および大腸菌に１２　　ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ／ｐＯＪ４０
５である。これらの好ましい群の内、ファスミドｐｏ　
Ｊ　４０２並びに形質転換体Ｓ、グリセオフスカス（Ａ
ＴＣＣ２３９１６）／ｐＯＪ４０２が最も好ましい。

本発明に係る組換えＤＮＡクローニングベクターおよび
形質転換体は、広範囲な用途を有し、ストレプトマイセ
スおよび近縁微生物とりわけ、これまでは複数の制限酵
素系によって有効な形質転換か妨げられていた生物に使
用するための好適なりローニングビヒクルの必要性を満
たすものである。その上、非形質転換宿主細胞にとって
は宵毒な抗生物質に対する耐性を付与する本発明に係る
ベクターの能力は、形質転換体を選択する機能的手段を
提供することにもなる。このことは、ベクターＤＮＡを
獲得した特定の細胞を決定し選択することが実際上必要
であるが故に重要である。その存在を確認するための機
能的な試験法のない他のＤＮＡセグメントもまた、本発
明に係るベクター上に挿入することができ、この非選択
性ＤＮＡを含有する形質転換体を、適当な抗生物質選択
によって分離できる。そのような非選択性のＤ　Ｎ　Ａ
セグメントは、プラスミドの機能、維持、並ヒに複製に
必要な領域の内部以外ならどの部位へも挿入することが
できる。これには、抗生物質修飾酵素、抗生物質耐性、
抗生物質合成を特定する遺伝子およびあらゆる型の調節
または構造遺伝子か含まれるが、これらに限定される訳
ではない。

また、本発明は、■またはそれ以上の制限系を迂回する
ためにプラスミドまたはファスミドベクターを用いる新
規な方法に関するものであって、該方法は、 （ａ）ベクターの１本鎖ＤＮＡを大腸菌または他の適当
な生物内で調製し、 （ｂ）　（ａ）で得たＤＮＡでアクチノミセス宿主細胞
を形質転換することからなる。

形質転換に用いられるベクターの１本鎖ＤＮＡは常法通
り２本鎖ＤＮＡから調製するか、あるいは、ある種のベ
クターについては１本鎖ＤＮＡとして直接、合成しても
よい。アクチノミセスの大部分の株は形質転換に際して
アクチノミセス宿主細胞か取り込んだ外来性の２本鎖Ｄ
ＮＡを破壊することができる制限酵素を複数個、有する
ので、この方法は、ストレプトマイセスをも含むアクチ
ノミセスの制限性株にＤＮＡを導入する上で、特に重要
である。

また、本発明は、組換えＤＮＡ含有含有アンチノミセス
宿主細胞択する方法であって、該方法は、ｌ）抗生物質
感受性のアクチノミセス宿主細胞を、ある抗生物質に対
する耐性を付与するＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ
ファスミドシャトルヘクターで形質転換し、 ２）形質転換宿主細胞を、抗生物質耐性形質転換体の選
択に適した条件下で培養することからなる。

本発明は上記の方法を実施するために用いられるベクタ
ーおよび形質転換体を包含する。

アクチノミセス形質転換体を、それらによる抗生物質耐
性の発現に基ついて選択する本発明方法の最適例は、形
質転換するアクチノミセス宿主細胞に調和させてベクタ
ーを構築することである。

そのようなベクターの一例はファスミドｐＯＪ４０２で
ある。ファスミドｐｏ　Ｊ　４０２の構築出発物質は市
販品から入手するか、ノーザン・リージョナル・リサー
チ・ラボラトリ−、アグリカルチュラル・リサーチ・サ
ービス、１８１５ノース・ユニハーンイティー・ストリ
ート、米国農業省、ペオリア、１Ｌ６１６０４またはア
メリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション、１２
３０＋バークローン・ドライブ、ロックビレ、ＭＤ２０
８５２に寄託され、その永久（♀存株の一部となってい
る。ファスミドｐＯＪ４０２の構築に用いた出発物質を
含有する株の受託番号は、１）ＡＴＣＣ３９１５５−Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌ１ｖｉｄａｎｓ／ｐＩ　Ｊ
　７０２（寄託日、１９８２年７月６日）および２）Ｎ
ＲＲＬ　　Ｂ−１５９７３Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　Ｓ
Ｆ８／ｐＫＣ４６２ａ（寄託日、１９８５年６月３日）
である。プラスミドｐＵｃ１９およびｐＢ　１ｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ　ＳＫ゛はストラタジーン（Ｓ　ｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）から入手可能である。ファスミドｐｏ　Ｊ　４
０２の構築方法は実施例１３に記載されている。構築さ
れたファスミドｐｏ　Ｊ　４０２はアクチノミセス（ス
トレプトマイセスを含む）および大腸菌内で選択するた
めのアブラマイジン耐性遺伝子とストレプトマイセス内
で複製するためのｐｌＪ７０２？ｆｆ製起点から導かれ
たｐＩＪｌｏ］を含有する。これらの要素はプラスミド
ｐＯＪ３６１から〜４．５ｋｂ　Ｘｍｎ１　／　Ｅｃｏ
ＲＩ（フレノウ）断片として得ることかできる。

これらの要素は、これら要素の内ｌまたはそれ以上を含
有する種々のプラスミドから様々な断片として得てもよ
い。特に、他のストレプトマイセスレプリコンを用いて
もよい。さらにファスミドｐＯＪ４０２は１個のＭ１３
複製起点、１個ノｆｔ形態発生シグナル、１個の１ａＣ
２遺伝子、１個のポリリンカー、および大腸菌内で複製
するための複製起点をも含有している。これらの付加的
要素はプラスミドｐＢ　１ｌｅｓｃｒｉｐｔから、〜２
．２ｋｂ　Ａｈａ■断片として得るか、■またはそれ以
上のこれらの要素を含有する様々なプラスミドまたはフ
ァスミドベクターから、別々に得ることができる。

本発明の新規なベクターはストレプトマイセスのレプリ
コン、大腸菌のレプリコン、およびアブラマイジン耐性
付与制限断片を含有している。プラスミドの増幅および
操作はストレプトマイセスよりも大腸菌においてより迅
速かつ効率的に行われるのでベクターか大腸菌内でも複
製可能なように大腸レプリコンをコードしているＤＮＡ
配列を加えることが好ましい。従って、ｐＢＲ３２２、
ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２５、およびｐＢ　Ｒ３２
８などの大腸菌プラスミドから得た機能的なレプリコン
を含有する制限断片を付加することは極めて好都合であ
り、本発明の例示ベクターに一般的な有用性を与えるも
のである。

本発明方法に用いられるベクターは、大腸菌と同様、感
受性を有するストレプトマイセスや近縁のアクチノミセ
ス宿主細胞にアブラマイジン耐性を付与する。本発明の
アブラマイジン耐性付与ヘクターは結合した環状ＤＮＡ
セグメントが宿主細胞内で数世代に渡って安定に保持さ
れることを確実なものとする上で有用である。アプラマ
イジン耐性付与断片と共有結合し、ストレプトマイセス
内で増殖したこれらの遺伝子またはＤＮＡ断片は、非形
質転換体にとっては有毒な濃度のアブラマイシンに形質
転換体を暴露することにより維持される。従ってベクタ
ーを失い、結果的に共有結合したＤＮＡを失った形質転
換体は増殖することができず、培地から消滅してしまう
。このように、本発明ベクターによれば所望のＤＮＡ配
列を安定化し、維持することができる。

本発明の方法、クローニングベクター、および形質転換
体は現在ストレプトマイセスおよび近縁の細胞で産生さ
れている種々の産物の収率を改善するための遺伝子クロ
ーニングを与えるものである。そのような産物の例とし
て、ストレプトマイシン、タイロシン、セファロスポリ
ン、アクタプラニン、ナラジン、モネンシン、トフ゛ラ
マイジン、エリスロマイシン等が含まれるが、これらに
限定されない。本発明はまた、ヒトインシュリン、ヒト
プロインシュリン、グルカゴン、インターフェロン等の
商業上重要なタンパク質類、商業上重要な工程および化
合物に至る代謝経路における酵素機能、あるいは遺伝子
発現を改良する調節要素なとをコードするＤＮＡ配列の
クローニング、特性化および再ｔ＋Ｗ築に有用である。

これらの望ましいＤＮＡ配列には、例えば、ストレプト
マイシン、タイロシン、セファトスボリン、アクタブラ
ニン、ナラジン、モネンシンおよびエリスロマイシン誘
導体のような抗生物質誘導体の合成を触媒する酵素、抗
生物質または他の産物の生合成を仲介し、増大する酵素
をコートしているＤＮＡが含まれるがそれらに限定され
ない。これらのＤＮＡセグメントを挿入し、安定化する
能力により、ストレフトマイセスおよび近縁の株によっ
て産生されている抗生物質の収率と利用可能性を増大す
ることかできる。

ストレプトマイセスをも含むアクナノマイセス類は、幾
つかの異なる培地のどれかを用いて種々の方法で培養で
きる。培地中の好ましい炭水化物源としては、例えば、
糖みつ、グルコースデキストリンおよびグリセリンが含
まれる。窒素源としては例えば大豆粉、アミノ酸混合物
およびペプトン類か含まれる。栄養無機塩類もまた添加
され、これには、ナトリウム、カリウム、アンモニウム
、カルシウム、リン酸、塩素および硫酸イオンなどを放
出し得る通常の塩類が含まれる。曲の微生物の発育と増
殖に必要であるように、必要微量元素もまた添加する。

こうした微量元素は、通常、曲の培地成分の添加に付随
する不純物の形で供給される。

ストレプトマイセスをも含むアクナノマイセス類は、約
５〜９という比較的広いｐＨ領域に渡って約１５°Ｃ〜
４０°Ｃの温度範囲において好気的培養条件下に発育さ
せることができる。しかしながら、ファスミドまたはプ
ラスミドの安定性および維持のためには、培地のｐＨを
約７２として培養を開始し、約３０°Ｃの温度に維持す
るのが望ましい。

以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。

本発明の構築に関する説明および実際の方法を適宜、記
載した。

実施例１　大腸菌に１２　　ＪＭ１０９／ｐＯＪ　１６
０の培養、プラスミドｐＯＪ１６０の単離Ａ　大腸菌に
１２　　ＪＭ１０９／ｐＯＪ　１６０の培養 大腸菌に１２　　ＪＭ１０９／ｐＯＪ　１６０（ＮＲＲ
Ｌ　Ｂ−１８０８８、寄託臼、１９８６年７月２９日）
の培養物５ｍｆｆを、ＴＹ培地（１％トリプトン、０．
５％ＮａＣＣ，０，５％酵母エキス、ｐＨ７゜４）中、
アブラマイシン２００μ９／　ｍ（ｌの存在下、細胞が
定常相に到達するまで培養した。

次いで培養物５ｍＱを２００μ９／叶アプラマイシン含
有の２５０ｚ（！ＴＹ培地の入ったフラスコに接種し、
細胞が定常相に到達するまで培養した。

Ｂ　プラスミドｐＯＪ１６０の単離 培養物を遠心し、細胞ペレットをショ糖溶液（２５ｗ／
ｖ％シヨ糖、５０　ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣｆ２（ｐＨ
８０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）７ｍＱに再懸濁した。次１
．Ｖテ、再懸濁した細胞ペレットに０．５Ｍ　ＥＤＴＡ
　　０４ＲＱおよび０．２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ、（
ｐＨ８，０）中、５　ｙｒｑ／　ｍρリゾチーム溶液１
ｘｆ２を加え、得られた混合物を水上（４°Ｃ）で１５
分間インキユヘートした。１５分間のインキュベーショ
ンの後、リソチーム処理細胞に５０　ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ
−ＨＣＣ（ｐＨ８０）、６ｍＭ　ＥＤＴＡ、および０．
１％トリトンＸ１００の溶液０．７５ｉ１２を加えた。

次いで、溶解した細胞混合物をＳ　ｏｒｖａｌｌ（デュ
ボジンプロダクツ、Ｂ　ｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｄ　１ｖ
ｉｓｉｏｎ、　　Ｎ　ｅｗｔｏｎ、ＣＴ　０６４７０）
ＳＳ３４０−ターを用い、２０、ＯＯＯｒｐｍで４０分
間、細胞デブリス（片）が緩いペレットを形成するまで
遠心した。細胞デブリスのペレットを捨て、上清をＴＥ
バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣρ（ｐＨ８，０
）、１ｍＭＥＤＴＡ）で３０ＲＱに調節した。次いで、
塩化セシウム２８６ｇを加えると、密度１．５５９／＊
Ｑとなった。

ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ、　　５ｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ　Ｉ　ｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｄ　１ｖｉｓｉｏｎ、　
　Ｃａｍｐｕｓ　Ｄｒｉｖｅ　ａｔ　Ｊ　ａｍｂｏｒｅ
ｅ　Ｂｌｖｄ、、　　Ｉ　ｒｖｉｎｅ、　　ＣＡ　９２
７１３）Ｖｔｉ５０ローターを用い、臭化エチジウムに
よる塩化セシウム勾配遠心を行い（４５，ＯＯＯｒｐｍ
、　　１６時間、２０’Ｃ）、プラスミドＤＮＡを精製
した。遠心の後、所望のプラスミドｐＯＪ１６０ＤＮＡ
を収集し、２０Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（０，１５Ｍ　ＮａＣｌ
２、Ｏ，０１５Ｍクエン酸ナトリウム）で飽和したイソ
プロパツールで４回抽出することにより、臭化エチジウ
ムと塩化セシウムを除去した。抽出液をｌ　ＯＯＯｔ＠
容のＴＥバッファーに対して室温で一夜透析した後、エ
タノールで沈澱させた。この工程で得たプラスミドｐＯ
Ｊ　１６０　　ＤＮＡ約３００μ９をＴＥバッファー３
００μａに溶解し、−２０°Ｃで保存した。

プラスミドｐＯＪ１６０の制限部位および機能地図を添
付の第１図に示す。

実施例２　大腸菌Ｋ　１２　　Ｊ　Ｍ　１０９／ｐＢ　
１ｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋ　”の培養、プラスミドｐ
Ｂ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ゛の単離 Ａ、大腸菌Ｋ　１２　　Ｊ　Ｍ　Ｉ　Ｏ９／　ｐＢ　１
ｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ”の培養 選択マーカーとしてアブラマイシン２００μ９／靜では
なくアンピシリン１００μｇ／　ＩＩ（ｌを用いるほか
は実質上、実施例１記載の方法と同様にして大腸菌に１
２　　ＪＭ１０９／ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ゛を
培養した。まず、プラスミドｐＢ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ”をストラタジーン（１１０９９Ｎｏｒｔｈ　Ｔｏ
ｒｒｅｙ　Ｐｉｎｅｓ　Ｒｏａｄ、　　Ｌａ　Ｊ　ｏｌ
ｌａ、　　ＣＡ９２０３７）から得、実質上、実施例４
記載の形質転換法に従い、これを用いて大腸菌Ｋ１２　
　ＪＭ１０９細胞（これもストラタジーンまたはベセス
ダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢＲＬ）、Ｐ、　Ｏ，
Ｂｏｘ６００９、ガイザースバーグ、ＭＤ２０８７７か
ら入手可能である）を形質転換した。

Ｂ、プラスミドｐＢ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋ　’
の単離実買上、実施例ＩＢ記載の方法に従い、プラスミ
ドｐ　Ｂ　Ｉｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋ　’　Ｄ　Ｎ　
Ａを単離した。このようにして得たプラスミドｐＢ　１
ｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋ　”をＴＥバッファーに溶解
し、濃度〜ｌμ９／μＱで＝２０°Ｃで１呆存した。

実施例３　ファスミドｐｏ　Ｊ　４０１の構築Ａ、プラ
スミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ’　　ＤＮＡのＡ
ｈａＩＩ［消化 実施例２で単離したプラスミドｐＢ　Ｉｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ　ＳＫ゛約３μ９（３μのを１０ＸＡｈａｌｌｌバツ
フアー（１５Ｍ　ＮａＣ（Ｌ　６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃρ（ｐＨ７，５）、５　Ｑ　ｍＭ　ＭｇＣ１２，およ
び１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））２．ｃｌ、
制限酵素ＡｈａＩＩＩ　　ｌμＱ（約４０単位、本明細
書中、すべての酵素単位は、特に明記しない限り、酵素
の供給源が異なっていても、Ｎ　ｅｗ　Ｅ　ｎｇｌａｎ
ｄ　Ｂ　１ｏｌａｂｓ（Ｎ　Ｅ　Ｂ　）、３２Ｔｏｚｅ
ｒＲｏａｄ、　Ｂ　ｅｖｅｒｌｙ、　Ｍ　Ａ　Ｏｌ　９
１５の単位に関する定義に従うものとする）および水１
４μＱに加え、静かに撹拌した後、３７°Ｃで２時間反
応させた。

反応後、消化物をｐＨ８，０に緩衝化したフェノールで
１回、クロロホルム（ＣＨＣσ３）で１回抽出した。次
いで、酢酸ナトリウム濃度を０．３Ｍ、ｐＨ８，０に調
節し、２倍容のエタノールを加えた。

混合後、溶液を一７０°Ｃに冷却し、遠心した核酸をペ
レット化した。上清を捨て、ＤＮＡペレットを７０％エ
タノールで１回洗浄した後、乾燥した。

次いで、Ａｈａｎｌ消化プラスミドｐＢ　１ｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ　ＳＫｏをＴＥバ、ファー２０μＱに再懸濁した
。

Ｂ、プラスミドｐＯＪ１６０の〜４．５ｋｂレプリコン
含有Ｘｍｎｌ−３ａｌｌ（フレノウ）断片の単離実施例
１で単離したプラスミドｐＯＪ１６０ＤＮＡ約ＩＯμｇ
（ｌＯμ１２）を１０ＸＸｍｎｌバッファー（５００ｍ
Ｍ　ＮａＣｌ２．６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！（ｐＨ
７，５）、６ＱｍＭ　ＭｇＣＱ２および１０ｍＭＤＴＴ
）１０μｃ、制限酵素Ｘｍｎｒ　　２０μＩ２（約２０
単位）および水７８μＱに加え、３７°Ｃで２時間イン
キュベートした。次いで、１０×５ａｌＩバツフア（１
，５Ｍ　ＮａＣｌ２．６０　ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣｌ
！（ｐＨ７，５）、６０ｍＭＭｇＣＱ、２．２ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ）１１μＱ、制限酵素５ａｌｌ　　２μρ（約２
０単位）を加え、３７°Ｃで２時間インキュベートした
。

次いで、フレノウ酵素１μσ（約５単位）を溶液に加え
、４種類のｄＮＴＰ類（１０ｍＭづつ）を含有する溶液
１μＱを加え、反応混合物を３７°Ｃで１時間インキュ
ベートした。次いて、フレノウ処理した消（ヒ物を１％
アガロースケル電気泳動にかけた。次いで、ＤＥＡＥペ
ーパー［ワットマン・ラボラトリ−・ブロタクツ・イン
コーボレイテノド（Ｗｈａｔｍａｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　　Ｉ　ｎｃ、）、二ニー・シ
ャーシー０７０１４、クリフトン、ブリッジウェル・ブ
レイス９番］を用いる通常の電気泳動ゲルにより、所望
のプラスミドｐＯＪ１６０の〜４．５ｋｂ　Ｘｍｎｌ−
３ａｌｒ（フレノウ）断片を単離した。次いで、高鳴バ
ッファー（１，ＯＭ　ＮａＣρ含有ＴＥバッファー）中
、６０°Ｃで５分間インキュベートすることにより、Ｄ
ＥＡＥペーパーから該断片を溶離し、遠心してペーパー
断片をペレット化した。上清を取り、エタノールにより
上清からＤＮＡを沈澱させた。精製断片をＴＥハソファ
−２０μＱに懸濁した。

Ｃ，ＡｈａｌＩＩ切断プラスミドｐＢ　１ｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ　Ｓ　Ｋ　”のプラスミドｐＯＪ１６０の〜４．５
ｋｂＸｍｎｌＳａｌ＋（フレノウ）制限断片への結合本
実施例のＡで単離したＡｈａＩＩ［消化プラスミドｐＢ
　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋ　’　５１１Ｑを上記Ｂ
、で単離したプラスミドｐＯＪ１６０の〜４．５ｋｂ　
Ｘｍｎ１−３ａＩＩ（フレノウ）制限断片５μｇに加え
、このＤＮＡに１０ｘＴ４ＤＮＡリガーゼバッフ−ｒ−
（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ７，４）、ｌ
　Ｑ　Ｑ　ｍＭ　ＭｇＣ１２２，１００ｍＭＤＴＴおよ
び１０ｍＭ　ＡＴ　Ｐ）４１１Ｑ。

Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μＱ（約５００単位）および水２
５μＣを加えた。静かに撹拌した後、反応混合物を１６
°Ｃで１６時間インキュベートした。この反応でファス
ミドｐｏ　Ｊ　４０１が生成した。

Ｄ、ファスミドｐＯＪ４０１の単離 実質上、実施例ＩＢｉＥｌ’載の方法に従い、ファスミ
ドｐＯＪ４０１ＤＮＡを単離した。このようにして得た
ファスミドｐＯＪ４０１をＴＥバッファ−に溶解し、濃
度〜１μ９／μＱて一２０°Ｃで保存した。ファスミド
ｐＯＪ４０１の制限部位および機能地図を添イ」の第２
図に示す。

実施例４　ファスミドｐｏ　Ｊ　４０１による大腸菌Ｋ
　１２　ＸＬ　１−Ｂｌｕｅ細胞の形質転換Ａ　形質転
換用の細胞の調製のための培養物の培養 大腸菌Ｋ１２　ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ細胞（Ｂｕｌｌｏｃｋ
ら、１９８７、Ｂ　１ｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ５　：　
３７６−３７８、ストラタシーンから入手可能）を、Ｔ
Ｙ−寒天プレート上、ＴＹジブロス中培養した。テトラ
サイクリン２０μｇ／　１１＋１２を含有するＴＹ−寒
天プレートから大腸菌Ｋ　１２　ＸＬ　１−Ｂ−１ｕｅ
細胞の単一のコロニーを選択し、テトラサイクリン１０
０μ９／、ｌ？ｆ２含有ＴＹブロス１０肩σに接種した
。この１０ｍＱ培養物を３７°Ｃで一夜（１６時間）振
盪培養した。

この−夜培養物を５００ｍ１２のフラスコ中のテトラサ
イタリフ１０μ９／ に接種した。３７°Ｃで激しく撹拌しながらＯ，Ｄ。

５５０か０．５になるまでインキュベートした。次いで
、細胞培養物を水上で１５分間インキュベートし、この
インキュベーションの後、５ｏｒｖａｌｌ　５３３４０
ーターを用い、１０．００Ｏｒｐｍにおいて４°Ｃで１
０分間遠心した。上清を捨て、細胞ペレットを４°Ｃの
１０ｍＭモルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、
ｐＨ７．０およびｌＱｍＭ塩化ルビジウム（ＲｂＣ１２
）滅菌溶液５０ｍ（に静かに再懸濁した。上記のごとく
遠心して細胞をペッレト化した。上清を捨て、細胞ペレ
ットをＱ．１ＭＭ０ＰＳ，ｐＨ６．５、５０ｍＭ　Ｃａ
ＣＱｌ、１０ｍＭＲｂＣρの滅菌溶液５０ｘ（ｌに静か
に再懸濁した。細胞懸濁液を水上に１５分間置き、上記
のごとく遠心した。上清を除き、細胞ペレットをＯ．１
ＭＭ０ＰＳＳｐＨ６．５、５　０　ｍＭ　Ｃ　ａＣ　ｈ
、１０ｍＭＲｂＣＱおよび２０％グリセリンの滅菌溶液
２０ｍ（！に静かに再懸濁した。細胞懸濁液を２００μ
ρつつに分け、−７０’Ｃで急速凍結した。細胞はいっ
でも形質転換でき、これを凍結保存して本実施例の下記
Ｂにおける形質転換工程の為に解凍した。

Ｂ．形質転換工程 上記Ａ．で調製した大腸菌に１２　ＸＬＩ−Ｂｔｕｅ細
抱の一部２００μＱを解凍し、実施例３Ｄで調製した７
ｙスミｔ’ｐＯＪ４ＱＩＤＮＡ１１Ｚ１２（約１μｇ）
を加えた。混合物を氷上で３０分間インキュベートした
。次いで、混合物を４２°Ｃで２分間インキュベートし
た後、水上で５分間インキュベートすることにより熱衝
撃を与えた。次いで、細胞懸ｒ８液を３０分間マクロフ
ュージョン処理し、上清を捨てた。細胞ペツレトをＴＹ
ブロス５ＭＱに再懸濁し、ローラードラム上、３７°Ｃ
で２時間インキュベートした。約１００μσづつ、アブ
ラマインン２００μｇ／ｍＱ含有ＴＹ−寒天により平板
培養した。ＴＹ−寒天プレートを３７℃で一夜インキユ
ベートし、形質転換体を増殖させた。所望の形質転換体
は大腸菌Ｋ　１　２　ＸＬ　１　−Ｂｌｕｅ／ｐ。

Ｊ４０１である。アブラマイジン耐性形質転換体を制限
酵素分析に付し、大腸菌に１２　ＸＬＩ−Ｂ　ｌｕｅ／
ｐｏ　Ｊ　４　０　１形質転換体を同定した。分析のた
めに実施例１２記載の方法でプラスミドＤＮＡを調製し
た。

実施例５　大腸菌Ｋ　ｌ　２　ＸＬ　１　−Ｂｌｕｅ／
ｐ。

Ｊ４０１からの形質転換用１本鎖ＤＮＡの調製実質．上
、実施例４記載の方法で調製し、２００μ９／ｍＱアプ
ラマイシン含有ＴＹブロス中で３７°Ｃにおいて増殖さ
せた大腸菌に１２　ＸＬＩＢＩｕｅ／　ｐｏ　Ｊ　４　
０　１の一夜培養物ｌＲρを５００ｚρのフラスコ内の
ＴＹブロス１００ｘＣに加えた。次いで、ＶＣ８−Ｍ１
３ヘルパーファージ（ストラタジー７）５　０　μＱ（
　〜２．　Ｏ　Ｘ　１　０　７Ｐ　Ｆ　Ｕ）ヲ加エタ。

これにより感染の多重度（ＭＯ＋）〜０、■を得た。

この培養物１００Ｒ夕を３７°Ｃで一夜、激しく撹拌し
ながらインキュベートした。−夜培養した後、細胞培養
物１００ｍ（を遠心して細胞をベソレｊ・化した。）７
−ジ滲出液を含有する上清を得、０４μフイルターでろ
過した。

上清ろ液にｌ　Ｏｘｇ／ｘＱ　ＤＮＡ５ｅｌ　５　０　
μ（！（約５　０　０　Ｏ　１位）（ヘセスタ・リサー
チ・ラボラトリーズＩ　ｎｃ．　（Ｂ　Ｒ　Ｌ）、８２
１７グローブモント・サークル、ガイザースバーグ、Ｍ
Ｄ２０８７７）および２　ｍ９／　ｍＱ　Ｒ　Ｎ　Ａ　
ｓｅＡ　（ヘーリンガー・マンハイム・バイオケミカル
ス、７９４１キヤツスルウエイ・ドライヴ、インデイア
ナポリス、ｌＮ４６２５０）５０μＱ（約５単位）を加
え、３７°Ｃで２時間インキュベートした。インキュベ
ーションの後、２０％ＰＥＧ−８０００（シグマ、私書
箱１４５０８、セントルイス、ＭＯ６３１７８）および
１４．６％ＮａＣ＋２溶液７５Ｊ１１２をＤＮＡ５ｅお
よびＲＮＡ５ｅ処理した上清に加え、得られた溶液を充
分混合し、−８０°Ｃで約１時間インキュベートした。

冷却後、Ｓ　ｏｒｖａｌｌ　Ｇ　Ｓ　Ａローターで４°
Ｃにおいて１５分間、１０．ＯＯＯｒｐｍにおいて遠心
し、溶液からファージを沈澱させた。上演を捨て、ファ
−ンペ、レトをＴＥバッファー８００μρに再懸濁した
。次いで、１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆ（ｐＨ８，０）２
００μσ、０．５Ｍ　ＥＤ′ＦＡ　　２００μＱおよび
２０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１０μＱをこ
のファージ懸濁液に加えた。混合物を７０°Ｃで１５分
間加熱し、室温まで冷却した後、室温で、３Ｍ酢酸ナト
リウム１４０μＱを等容量のイソプロパツールと一緒に
加えた。この溶液を室温で１５分間マイクロフュージョ
ン処理することによって１本鎖ＤＮＡを沈澱させた。１
本鎖ＤＮＡのベルトをＴＥバッファー１００μＱに再懸
濁した。

１本鎖ＤＮＡ溶液の○、Ｄ、２１１０を測定したところ
、１本鎖ＤＮＡ−１８μｇが得られていた。

実施例６　大腸菌Ｋ　ｌ　２　ＸＬ　１−Ｂｌｕｅ／ｐ
。

Ｊ４０１からの形質転換用２本鎖ＤＮＡの調製実質上、
実施例ＩＡ記載の方法で大腸菌Ｋ１２ＸＬ　１−Ｂｌｕ
ｅ／ｐＯＪ　４０１を培養した。実質上、実施例ＩＢ記
載の方法に従い、ファスミドｐＯＪ４０１ＤＮＡを単離
した。このようにして得られた２本漬ファスミドＤＮＡ
をＴＥバッファーに溶解し、濃度〜１μ９／μＱで保存
した。

実施例７　ファスミドｐｏ　Ｊ　４０１およびｐＯＪ４
０２の１本鎖ＤＮＡおよび２本鎖ＤＮＡによる大腸菌に
１２　　ＪＭ１０９の形質転換大腸菌に１２　　ＪＭ１
０９細胞（Ｙ　ａｎｉｓｃｈ　−Ｐ　ｅｒｒｏｎら、１
９８５、Ｇｅｎｅ３３：１０３　　１１９、ストラタジ
ーンから入手可能）を、テトラサイクリンを加えないこ
とを除いて、実質上、実施例４Ａ記載の方法に従い、培
養した。実質上、実施例４Ａ記載の方法に従い、形質転
換にコンピテントな細胞とし、実質上、実施例４Ｂの方
法と同様にして１本鎖または２本鎖のフ１スミドｐｏ　
Ｊ　４０１あるいはｐＯＪ４０２ＤＮＡによって形質転
換した。形質転換体を以下のようにして平板培養した　
ＴＹジブロス中培養物５＋（ｊの内、１００μＱをＴＡ
ＸＩ（ＴＹブロス、２００μ９／肩Ｑアブラマイ／ン、
４０　ｕ　９／　ｄＸ−Ｇ　ａｌ、および１ｍＭＩＰＴ
Ｇ）−寒天にプレートする。ＴＡＸＩ−寒天プレートを
３７°Ｃで一夜培養し、翌日、コロニーを計数した。

代表的な実験結果を表３に示す。結果は、形質転換効率
（ＤＮＡμりあたりの、形質転換されたコロニーの数）
で表３に示されている。表３の結果は、１本鎖ＤＮＡが
、２本鎖ＤＮＡと同様、大腸菌に１２ＪＭ１０９細胞の
形質転換に有効であることを示唆するものである。

表３ ＪＭ１０９／ｐＯＪ　４０１ ｄｓ ＪＭ１０９／ｐＯＪ４０２ ｄｓ １．２Ｘ１０５／μ９ ２．３ｘ１０３／μｙ” １、ｌＸ１０５／μ９ １．１Ｘ１０’／μ９ ”ｄｓ　：二本鎖ＤＮＡ ５Ｓニ一本鎖ＤＮＡ 末Ｘ　形質転換に用いた一本鎖ｐＯＪ４０１ＤＮＡは〜
５０−８０％のへルバーファージＤＮＡ不純物を含んで
いた。

実施例８　ファスミドｐＯＪ４０１およびｐＯＪ４０２
の１本鎖および２本鎖ＤＮＡによるストレプトマイセス
・グリセオフスカスの形質転換ストレプトマイセス・グ
リセオフスカス（ＡＴＣＣ２３９１６）の凍結培養物（
菌糸フラグメント）をトリブチカーゼ・ソイブロス（Ｔ
　Ｓ　Ｂ）（Ｄ　ｉｆｃ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉ　ｎｃ、私書箱１０５８
Ａ、テトロイト、Ｍ１４８２３２）中で〜７０’Ｃにお
いて保存した。菌糸フラグメントの凍結培養物を解凍し
ＴＳＢＩＱｘ（に接種した。１０ｍ（ｌの初期培養物を
３０°Ｃで一夜、培養した。この−夜培養物をホモジナ
イズして菌糸フラグメントを分解し、得られたホモジネ
ート０．５１１１＆を０，４％グリシン含有ＴＳＢＩＣ
）＋１２に接種した。得られたｌ０ＪＩ７２の第２培養
物を３０’Ｃで一夜培養した。この培養物をホモジナイ
ズし、その０．５ｔＩＱを用いて０．４％グリシン含有
ＴＳＢＩＱｚＱに接種し、この第３培養物を３０°Ｃで
一夜培養した。この培養物を同様にホモジナイズし、細
胞を２．００Ｏｒｐｍで１０分間テーブル・トップ遠心
機により、遠心してペレット化した。得られたベレット
をＰ（プロトプラスト）培地１０ｆｆ（！に再懸濁した
。Ｐ培地（〜１００１のは以下のようにして調製された
。

國−分　　　　　　　　　　　　量 シヨ糖　　　　　　　　　　１０．３０９に、Ｓｏ、　
　　　　　　　　　　　　　０．２５９ＭｇＣ（ｈ　・
６　Ｈ２０２、０２９ 微量元素溶液ＩＱに対して ４０ｒｎｇ　ＺｎＣ（１゜ ２００１１９ＦｅＣＱ３・６Ｈ２゜ １０ＴＲ９ＣｕＣＱ２・２Ｈ２０ １０Ｍｇ　ＭｎＣＱｔ　’　４　Ｈ２０１ｏｎｇ　Ｎａ
ｔＢ、Ｏｖ・ｌ　０ＨｔＯ１０ｍｇ（ＮＨａ）ａＭｏ７
０２＊”　４Ｈ２００，２ｆｆＱ蒸留水を加えて８０．
０ｆｆｉａとする。

オートクレーブした後、以下を加える Ｋ）１２ＰＯ，（０，５％）　　　　　　　　　　　　
１．ｏｘ＆ＣａＣ（２２・２Ｈ，０（３，６８％）　　
　１０．ＯｍＣ［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）　　
１０．０ｉＱ。

−メチル−２−アミノエタン スルホン酸］“ＴＢＳ”バッファー ０、２５Ｍ、　ｐＨ７，２ 細胞懸濁液を上記のようにして遠心し、上清を捨て、細
胞ペレットをリゾチーム５ａ９／ｍσを含有するＰ培地
１０ｍ９／ｍＱ、に再懸濁した。リゾチーム処理した細
胞懸濁液を１５分おきに静かに振盪しながら、３０°Ｃ
で１時間インキュベートしてプロトプラストを形成させ
た。このようにして形成されたプロトプラストを上記の
ごとくにして遠心してペレット化し、Ｐ培地１０ｆｆ１
２に再懸濁した。この工程を繰り返し、洗浄したプロト
プラストをＰ培地３酎に懸濁して形質転換に備えた。

形質転換に際しては、Ｐ培地１０００＋Ｃ中のプロトプ
ラスト１５０μＱおよび５５％ＰＥＧＩＯ００（１００
μ１２）に、１本鎖（実施例５）または２本鎖（実施例
６）のファスミドｐＯＪ４０１またはｐＯＪ４０２ＤＮ
Ａいずれか３μσを加えた。このＤＮＡ−プロトプラス
ト−ＰＥＧ懸濁液を室諷で３０秒間維持してから、該懸
濁液をＲ２重層（オーバーレイ、０．４１％寒天を含有
するＲ２培地）に加え、これをＲ２寒天プレートに流し
た。改良Ｒ２（再生）培地（〜ｌのは下記のごとくにし
て調製された。

成分 ショ糖 に２Ｓ○４ 微■元素溶液 量 １０３、　ＯＯ１？ ０．２５ｇ ２、ＯＯａｏ２ ＭｇＣＬ・６　Ｒ２０１０，１２１７ グルコース　　　　　　　　　　１０．０（ｈＬ−７ス
ハラキンー　Ｒ２０２，Ｏ０ｇカザミノ酸（Ｄｉｒｃｏ
）　　　　　　　　Ｏ，ｌ　Ｏ９寒天　　　　　　　　
　　　　２２．　Ｏ０ｇ蒸留水を加えて、７００　ｍ（
ｌとする。

オートクレーブした後、以下を加える ＫＨ，Ｐｏ、　　　　　　　　　　１００ｆｆ１２（０
，０５ｇ／１００次の ＣａＣ１２ｔ（２，２２９／　１００ｆｆ１２）　　１
００！Ｉ（Ｑ“Ｔ　Ｅ　Ｓ　”バッファー　　　　　１
００肩Ｑ（５，７３９／１００ｍＱ、ｐＨ７，２）Ｎａ
ＯＨ（５Ｎ）　　　　　　　　　　　ｌｘ（！形質転換
されたプロトプラストを含有するＲ２重層を有するＲ２
寒天プレートを３０°Ｃで一夜インキユベートした。翌
日、アブラマイシンを含有する第２のＲ２重層４ｍＱを
プレートに注ぎ、プレートのアブラマイシン終濃度を２
５μｇ／ｍＱとした。再度、プレートを３０°Ｃで５日
間インキュベートした。５日ｊ用のインキュベートの後
、形質転換コロニーの数を計数した。形質転換効率を算
出して表４に示した。制限酵素分析のために、実施例１
２記載のミニブレブ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）法で形質転換
体のプラスミドＤＮＡを調製した。あるいは、制限酵素
分析のために、プラスミドＤＮＡを大腸ＭＫ１２　　Ｊ
Ｍ１０９に戻しくシャトルバック）でもよい（実施例９
）。

代表的な形質転換実験の結果を表４に示す。表の結果か
ら１重鎖ファスミドｐｏ　Ｊ　４０１またはｐＯＪ４０
２ＤＮＡがＳ、グリセオフスカスを高頻度に形質転換し
、その頻度は２本鎖ＤＮＡにおけるそれと同等であるこ
とが分かる。

表４ 細胞／ＤＮＡ　　　　　　　鎖 形質転換効率 Ｓ　グリセオフスカス／ｐＯＪ４０１　　　ｄｓ（Ｓ　
、　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）　　　　　　　　ｓｓ
Ｓ、グリセオフスカス／ｐＯＪ４０２　　　ｄｓ（Ｓ　
、　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）　　　　　　　ｓｓ〉
１０５ 〜２ＸＩＯ’ ４．６Ｘ１０５ １．８Ｘｌｏ’ 実施例９　ストレプトマイセス・グリセオフスカスと大
腸菌に１２の株間でのファスミドｐＯＪ４０１またはｐ
ＯＪ４０２のシャトル作用（ンヤトリング） 実質上、実施例８記載の方法と同様にストレプトマイセ
ス・グリセオフスカスに導入したファスミ）’ｐＯＪ４
０１およびｐＯＪ４０２ＤＮＡはストレプトマイセス・
グリセオフスカスと、大腸［］Ｋ１２の様々な株、例え
ばＪＭ１０９やＲＲＩ株との間でシャトル作用を示した
。実施例８に従って調製した形質転換プレートから単一
のコロニーフラグ（ｐｌｕｇ）を得、これをアブラマイ
シン２５μ９／吋を含有するＴＳＢ５ｆｆ（に接種した
。この５ｍｇ培養物をホモジナイズし、３０°Ｃにおい
てローラー・ドラム上で一夜インキユベートした。−夜
インキユベートした後、培養物を再度ホモジナイズした
。実質上、実施例１２記載の方法に従ってこの培養物〜
１．５ｎ（！からＤＮＡを調製し、ＤＮＡをＴＥバッフ
１−２０μρに再懸濁した。この試料２０μｇの内５μ
σを用い、実質上、実施例４記載のごとくにして大腸Ｍ
Ｋ１２　　ＪＭ１０９を形質転換した。ＴＡＸ　Ｉ上で
３７°Ｃにおいて一夜培養することにより、形質転換体
を選択した。形質転換に用いたファスミドｐＯＪ４０１
やｐＯＪ４０２ＤＮＡか形質転換後も無傷であることを
確かめるために、実質上、実施例１２記載の方法により
ファスミドＤＮＡを調製し、制限酵素分析によって分析
した。

ファスミドＤ　Ｎ　Ａをストレプトマイセスでなく大腸
菌内で分析することの利点は幾つかある。まず第１に、
分析すべきＤＮＡかより多く存在する（大腸菌内の方が
コピー数が多い）、第２にミニフレプ法（ｍｉｎｉｐｒ
ｅｐｓ）によってより純粋で高純度のＤＮＡを得ること
ができる。

実施例ＩＯファスミドｐＯＪ４０１およびｐ。

Ｊ４０２の１本鎖および２本鎖ＤＮＡによるストレプト
マイセス・フラグィエの形質転換ストレプトマイセス・
フラグィエＰＭ７７［バルブ（Ｂ　ａｌｔｚ）およびセ
ノ（Ｓｅｎｏ）、Δｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍ　１ｃｒｏｂ
ｉｏ１．４２　：　５４７−５７４（１９８８）］を、
実質上、実施例８記載のストレプトマイセス・グリセオ
フスカスの形質転換法に従って形質転換した。形質転換
体のコロニーを計数した。形質転換効率を算出し、表５
に示した。形質転換体のファスミドＤＮＡを実施例８記
載のごとくにして分析した。

表５は代表的な形質転換実験の結果を示すものである。

この表の結果から１本箱ファスミドｐ○Ｊ４０１または
ｐＯＪ４０２ＤＮＡか高５１度に、２本鎖ＤＮＡにおけ
る頻度と同等、またはむしろそれ以上でＳ、フラグィエ
ＰＭ７７を形質転換することが示唆される。より制限性
の株であるスｉ・レプトマイセス・フラグィエ（ＧＳ６
２）を用いた他の実験の結果、１重鎖ｐｏ　Ｊ　４０ま
たはｐｏ　Ｊ　４０２ＤＮＡの形質転換効率は、２本鎖
ＤＮＡによるそれの約１０００倍高いことが分かった。

表−互 細胞／ＤＮＡ　　　　　　　鎖 Ｓ、フラディエ／ＰＭ７７　ｐＯＪ４０１　　　ｄｓ（
Ｓ　、　ｆｒａｄｉａｅ）　　　　　　　　　　ｓｓＳ
、フラディエ／ＰＭ７７　ｐＯＪ４０２　　　ｄｓ（Ｓ
　、　ｆｒａｄｉａｅ）　　　　　　　　　　ｓｓ形質
転換効率 ５．４Ｘ１０’ １．０Ｘ１０７ １．５ＸＩＯ５ １，８Ｘｌｏ６ 実施例１１　ファスミドｐｏ　Ｊ　４０１およびｐＯＪ
４０２の１本鎖および２本鎖ＤＮＡによるストレプトマ
イセス・トヨカエンシスの形質転換ストレプトマイセス
・トヨ力エンシス８０９３４（ＮＲＲＬ　　１８１１２
）またはＭ、Ｊｉ６［８０９３４の非制限性変異体であ
って、（マツシマらのＭｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、
２０６：３９３　４９９に従って調製された）細胞を以
下の点を除いて実質上、実施例８記載の形質転換法に従
い、形質転換した。形質転換に際しては、プロトプラス
ト１０ｍＱをペレット化し、上清をデカントし、５５％
ＰＥＧ１００Ｏ含有Ｐ培地０．５ｍＱ中のヘレット化プ
ロトプラストにファスミドｐＯＪ４０１またはｐＯＪ４
０２ＤＮＡ（１本鎖（実施例５）または２本鎖（実施例
６））〜５−１０μｇを加えた。

次いで、ＤＮＡ−プロトプラスト−Ｐ　Ｅ　Ｇ　％％　
７Ｆ５液をＲ２重層と一緒にＴＳＢ／Ｒ２（Ｒ２培地１
ｆ２あたりＴＳＢ１２０ｍ１２）寒天プレートにのせ、
３００Ｃで一夜インキユベートし、翌日、アブラマイシ
ン５μ９／ｍ（ｌを含有する第２のＲ２重層を重層した
。次いでプレートを３０℃で７日間インキュベートした
。７日間のインキュベーションの終了時に、形質転換コ
ロニーの数を計数し、形質転換効率を算出して表６に示
した。実施例８と同様にして形質転換体のプラスミドＤ
ＮＡを分析した。

表６の結果は代表的な形質転換実験の結果を示すもので
ある。表６は非制限変異株であるＳ、トヨ力エンシスＭ
Ｊ１６および制限活性を有するＳトヨ力エンシス８０９
３４に関する結果を示す。

表６ イ田胞／ＤＮＡ ５　トヨ力エンシス （Ｓ　、　ｔｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ） Ｓ　トヨ力エジンス （Ｓ　　ｔｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ） 鎖 形質転換効率 ＭＪ１６／　ｐＯＪ４０１　　　ｄｓ ＭＪ１６／　ｐＯＪ４０２　　　ｄｓ Ｓ　トヨ力エジンス８０９３４／　ｐＯＪ４０１　　ｄ
ｓ（Ｓ　、　ｔｏｙｏｃａｅｎｓ　ｉｓ）　　　　　　
　　　　　ｓｓＳ　トヨカエンシス８０９３４／　ｐＯ
Ｊ４０２　　ｄｓ（Ｓ　、　ｔｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ）
　　　　　　　　　　ｓｓＳ、０ＸＩＯ３ １，８Ｘ１０３ ９．０Ｘ１０’ （２，７ＸＩＯ３） １．５Ｘ１０３ （９，３ＸＩＯり １．２Ｘ１０’ ６．３Ｘ１０” ２．９Ｘ１０’ １．４Ｘ１０３ Ｓ　トヨカエンシス８０９３４に関する上記の結果は１
本漬ファスミドｐｏ　Ｊ　４０１またはｐＯＪ４０２Ｄ
ＮＡが２本鎖ＤＮＡの１−２ケタ（ｌｏｇ）高い効率で
形質転換することを示している。これは、１本漬ファス
ミドｐＯＪ４０１またはｐＯＪ４０２ＤＮＡか、ｓ、ト
ヨカエンシス８０９３４のような高度の制限株において
、いくつかの制限系を迂回するのに有効であることを暗
示するものである。

実施例１２　ストレプトマイセスまたは大腸菌ミニプレ
ブ工程によるプラスミドＤＮＡの調製プラスミドＤＮＡ
を、キーサー［（Ｋ　１ｅｓｅｒ）、１９８４、Ｐｌａ
ｓｍｉｄ、　　１２　：　１９　３６］の方法を下記の
ごとくに１龜飾した方法で調製する。ストレプトマイセ
スまたは大腸菌の一夜培養物約１．５＋Ｑを遠心し、細
胞をリゾチーム溶液（ストレプトマイセス用の溶液は、
リゾチーム（シグマ）２πｙ／　ｗＱ、０．３Ｍショ糖
、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２　（ｐＨ８０）、およ
び２５ｍＭ　ＥＤＴＡＳｐ）（８，０を含有し、大腸菌
用の溶液は、リゾチーム以外の上記全成分を含有する）
５００　ｕ（ｌに再＃＆、濁し静かに撹拌しながら、ス
トレプトマイセスは３７°Ｃで、大腸菌は０°Ｃ（また
はインキュベーションせずに）で培養する。インキュベ
ーション後、アルカリ／ＳＤＳ溶を夜（０，３Ｍ　　Ｎ
ａＯＨ；　　２％５ＤＳ）２５０　μｃを加え、得られ
た１誤濁液をポルテックス・ミキサーで混合し、即座に
、完全な混合を確実に行う。

次いで、懸濁液を７０°Ｃで１０分間インキュベートし
て室ｔＩＳに冷却する。次に、ポルテックス・ミキサ−
上で撹拌しなから、フェノール−クロロホルム８０μＱ
を加え、相が完全に混合するまで（〜１０秒間）混合し
た後、エッペンドルフ遠心機で２分間遠心する。上清を
とり、３Ｍ非緩衝化酢酸ナトリウム７０μｇを含有する
別のエッベンドルフ遠心管に入れる。ここに撹拌下、イ
ンプロパツール７００μＱを加え、溶液を室温で５分間
インキ二ベートスる。インキュベーンコン後、溶液ヲ５
分間遠心し、上清をデカントし、２秒間、第２の遠心処
理をし、全液体成分を除く。ＤＮＡペレットをＴＥバッ
ファー５００μＱに溶解し、１００ｍＭスペルミン−Ｈ
ＣＱ（２５μのを加える。混合後、ＤＮＡ溶液を室温で
５分間インキュベートし、上記のごとく遠心し、完全に
上清を除く。ＤＮＡペレットを０．３Ｍ酢酸ナトリウム
とｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣＣ３３００μＱに再溶解する。次
いで、混合しながら冷エタノール７００μＱを加え、室
温で５分間インキュベートする。ＤＮＡ溶液を再度遠心
し、上記のごとく上清を完全に除去する。ＤＮＡペレッ
トをＴＥバッファー２０μＱに再溶解する。このように
して得られたＤＮＡは制限酵素分析または形質転換に用
いることができる。

（以下余白） 実施例１３　ファスミドｐＯＪ４０２の構築Ａ、中間体
プラスミドｐＯＪ１０７の構築１、プラスミドｐＵｃ１
９のＢ　ａｍＨＩ／　Ｐ　ｓｔ　Ｉ消化 実質上、実施例２記載の方法に従って単離したプラスミ
ドｐＵｃ１９ＤＮＡ約ｌμｇ（３μのを１０Ｘ１０ＸＢ
ａバツフア　　（５００ｍＭ　ＮａＣ（，５００ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ８，０）、ｌＱＱｍＭＭｇＣ
ＩＬおよび１０ｍＭ　ＤＴＴ）１μＣ１制限酵素Ｐｓｔ
＋　　１ｌｉ（２（約２０単位）および水４μＱに加え
、静かに撹拌した後、３７°Ｃて１時間反応させた。反
応後、ＢａｍＨＩ　／　Ｐｓｔ　Ｉ消化ｐＵｃ１９ＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させ、ＴＥバッファーに懸濁した
。

２　コスミドｐＫＣ４６２ａＤＮＡのＢａｍＨＩ／Ｐｓ
ｔｌ消化 大腸菌に１２　　ＳＦ８／ｐＫＣ４６２ａ（ＮＲＲＬＢ
−１５９７３Ｍ寄託日、１９８５年６月３日）の培養お
よび以後のコスミドｐＫＣ４６２ａＤＮＡの単離は実質
上、実施例１の教示に従って行われた。コスミド１）Ｋ
Ｃ４６２ａの制限部位および機能地図を添付の第３図に
示す。この工程で得られたコスミドｐＫＣ４６２ａＤＮ
Ａ約１０μ９（１０μＱ）を１ＯＸＰｓｔｌバツフｙ　
　（５００ｍＭ　ＮａＣＱ。

５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（！（ｐＨ８，０）、１０
０ｍＭＭ　ｇ　ＣＱ　ｘおよび１０ｍＭ　ＤＴＴ）５０
μＱ、制限酵素Ｐｓｔ■　５μ１２（約１００単位）お
よび水４２０μＱに加え、静かに撹拌した後、３７°Ｃ
で３時間反応させた。反応後、消化物をエタノール沈澱
に付し、ＴＥバッファー１００μｇおよびゲル−ローデ
ィング・バッファー（水中、０．２５％プロムファノー
ルブルー、０．２５％キシレンシアツール、１５％フィ
コールくタイプ４００））２０μＱに再懸訓した。次い
で、Ｐｓｔｌ消化ＤＮＡを１％アカロースゲル電気泳動
にかけた。コスミドｐＫＣ４６２ａの所望の〜２．Ｏｋ
ｂ　Ｐｓｔｌ断片を実質上、実施例３Ｂ記載の方法と同
様にして単離した。精製断片をＴＥバッファー５０μρ
に懸濁した。次いで、１０Ｘ１０ＸＢａバツフアー１０
μＣ１制限酵素ＢａｍＨＴ　５　μｃ（約１００単位）
および水３５μ（！を加えた。３７°Ｃで２時間のイン
キュベーションの後、エタノール沈澱に付した。Ｂａｍ
ＨＩ消化ＤＮＡ断片をＴＥバッファー２０μｇに再懸濁
し、コスミドｐＫＣ４６２ａの〜１．７ｋｂ　ＢａｍＨ
１／Ｐｓｔ１断片を得た。

３、ＢａｍＨＩ／Ｐｓｔｌ消化プラスミドｐＵｃ１９と
コスミドｐＫＣ４６２ａの〜１．７　ｋｂ　ＢａｍＨｌ
／Ｐｓｔｌ断片との結合 上で調製したＢａｍＨｒ　／　Ｐｓｔ　Ｉ消化プラスミ
ドｐＵｃ１９約０．１μｇ（２μＱ）を上記のようにし
て単離したコスミドｐＫＣ４，６２ａの〜１．７ｋｂＢ
ａｍＨ１／Ｐｓｔｌ断片１μｇ（約ｌＯμのに加え、こ
のＤＮＡに１０ＸＴ４ＤＮＡリガ一ゼバツフアー２μＬ
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｍ２（約５００単位）および水
５μＱを加えた。静かに撹拌した後、ライゲーション混
合物を１６°Ｃで一夜（〜１６時間）インキュベートし
た。このライゲーションによって中間体プラスミドｐＯ
Ｊ１０７が生成した。このライゲーション反応混合物約
５μσを用い、実質上、実施例４記載の方法と同様にし
て大腸菌Ｋ１２　　ＪＭ１０９を形質転換し、実質上、
実施例ＩＢ記載の方法に従い、プラスミドＤＮＡを調製
した。

Ｂ　中間体プラスミドｐＯＪ３２６の構築１、ｐＯＪ１
０７のＢａｍＨＩ　／　Ｐｓｔ　Ｉ　？肖化本実施例の
Ａに記載のごとくにして単離したプラスミドｐＯＪ１０
７約５　Ｒ９（５ｔｔのをｌＯＸ１０ＸＢａバッファー
２μＣ１制限酵素ＢａｍＨＩ　　１μｃ（約２０単位）
、制限酵素Ｐｓｔ［ｌ１ｌ（約２０単位）および水１１
μＣに加え、３７°Ｃで１時間反応させた。ＤＮＡをエ
タノール沈澱させ、ＴＥバ。

ファー２０μＱに再懸濁した。

２、　ｐｌ　Ｊ　７０２のＰｓｔ　Ｉ　／　Ｂｃｌ　Ｉ
　（部分）消化実質上、実施例ＩＢ記載の方法に従って
ストレプトマイセス・リビダンス／ｐｉ　Ｊ　７０２（
ＡＴＣＣ３９］、５５）を培養し、プラスミドｐＩＪ７
０２Ｄ　Ｎ　Ａを単離した。チオストレプトン（２５μ
９／ｆｆｃ）を用いてストレプトマイセス・リビタンス
／ｐｌＪ７０２細胞内でのプラスミドｐ［Ｊ７０２の選
択を確実にした。プラスミドｐｌＪ７０２の制限部位お
よび機能地図を添付の第４図に示す。

このようにして得られたプラスミドｐｌＪ７０２ＤＮＡ
約５μｇ（５μのをＩＯＸ制限酵素Ｐｓｔ■バッフｙ−
１０ｕ（１、制限酵素ＰｓｔＩ　　１μ１２（約２０単
位）および水８４μＱに加え、３７°Ｃて１時間反応さ
せた。反応後、制限酵素ＢｃｌＩ　　１μａ、（約１０
単位）を５０°Ｃにおいて２分間で加えた。等容退のフ
ェノールおよびＳ　ｅｖａｇ（クロロホルム：イソアミ
ルアルコール、２４：１混合物）で抽出して部分消化を
停止した後、エタノール沈澱に付した。ＤＮＡをＴＥバ
ッファー２０μＱに再懸濁した。

３、ＢａｍＨＩ／Ｐｓｔｌ消化プラスミドｐＯＪ１０７
とｐｌＪ７０２のＰｓＬＩ／Ｂｅ１ｌ（部分）消化物と
の結合 ＢａｍＨｒ　／　Ｐｓｔ　Ｔ消化プラスミドｐＯＪ１０
７杓１　μｙ（４ｔｔのをプラスミドｐｌＪ７０２のＰ
ｓｔＩ／ＢｃｌＩ（部分）消化物１μｇ（４μｇ）に加
え、このＤＮＡに１ＱｘＴ４ＤＮＡリガーゼバツフアー
、１μＱ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μρ（約５００単位）
および水２７μρを加えた。１６°Ｃで一夜インキュベ
ートシた。このライゲージ３フ反応によって中間体プラ
スミドｐＯＪ３２６か生成した。プラスミドｐＯＪ３２
６の制限部位および機能地図を添付の第５図に示す。こ
のライゲーション１昆合物約１０μＱを用い、実質上、
実施例８記載の形質転換法に準じてストレプトマイセス
・グリセオフスカスを形質転換した。Ｒ２−寒天プレー
トを終濃度か２５μｙ／ｍ（ｌとなるようにアブラマイ
ジンまたはチオストレプトンと一緒に重層した。アブラ
マイジンプレート上では増殖するがチオストレプトンプ
レート上では増殖しないことに基づいて形質転換体を選
択した。形質転換コロニーを選択し、アブラマイジン２
５μ９／　ｍ（ｌ含有ＴＳＢ培地で培養し、実施例１２
記載のｍ１ｎｉｐｒｅｐ法によってアブラマイシン２５
μｈ／＊Ｑ含有ＴＳＢ培地２５！ＱからプラスミドＤＮ
Ａを調製した。ｍ１ｎｉｐｒｅｐＤ　ＮΔをＴＥバッフ
ァー１００μＱに再懸濁し、ＤＩ’ＪＡをＤＥＡＥセル
ロースカラム（Ｅｌｕｔｉｐ　Ｄ、　　５ｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ　＆　Ｓ　ｃｈｕｅｌｌ、　Ｉ　ｎｃ、、５４３
ワンントン・ストリート、ケーン、Ｎ、Ｈ，０３４３１
）に通してさらに精製し、エタノール沈澱させ、ＴＥバ
ッファー１００μＱに再懸濁した。

Ｃ９中間体プラスミドｐＯＪ３２８の構築上記Ｂで得た
プラスミドｐＯＪ３２６ＤＮＡ約５μｇ（４０μのを１
０ＸＥｃｏＲＴバツフアー（５００ｍＭＮａＣ１２、Ｉ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ？！（Ｐ）１７．５）、１００ｍＭ
　ＭｇＣ（ｈおよび１０ｍＭ　ＤＴＴ）ｌ　０ｔｔＱ、
制限酵素ＥｃｏＲＩ　　１　μ（（約３２単位）および
水５１μＱに加え、静かに撹拌した後、３７°Ｃで１時
間反応させた。次いて、フレノウ１μＱ（約５単位）と
４種のｄＮＴＰ含有溶液１μＱ（各１０ｍＭ）を加え、
３７°Ｃで３０分間インキュベートした。

ＥｃｏＲＩ？ＦＩ化し、フレノウ処理したＤＮＡをフェ
ノール：Ｓｅｖａｇ抽出し、エタノール沈澱してＴＥバ
ッファー５０μｇに再腎濁した。

このようにして得られたＥｃｏＲＩ消化し、フレノウ処
理したＤＮＡ約４０μρをｌ０ＸＴ４ＤＮＡリガーゼバ
ツフアー５μｆ７．Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｇ（約５０
０単位）および水４μＱにより、１６°Ｃで一夜結合さ
せた。このライゲーション反応によってプラスミドに第
２のＸｍｎＴ部位が創製され、中間体プラスミドｐＯＪ
３２８が生成した。

ライゲートしたＤＮＡ溶液約４０μρを上記のごと＜Ｅ
ｃｏＲＩと反応させた後、エタノール沈澱に付し、ＴＥ
バッファー２０μＱに再懸濁した。フラスミドｐＯＪ３
２８ＤＮＡ約１０μＱを用い、実質上、実施例８記載の
方法に従いストレプトマイセス・グリセオフスカスを形
質転換し、アブラマイジン２５μ９／ｍ（ｌ含有ＴＳＢ
プレート上で選択した。実施例１２記載のｍ１ｎｉｐｒ
ｅｐ法に従い、分析用にプラスミドｐＯＪ３２８ＤＮＡ
を調製した。

Ｄ、中間体プラスミドｐｏ　Ｊ　３４７の構築１、プラ
スミドｐＯＪ１６０ＤＮＡのＰ　ｖｕ　ＩＩ　／Ｘｍｎ
［消化および〜９２５ｂｐ断片の単離実質上、実施例１
記載の方法に従い、大腸菌に１２　　ＪＭ１０９／ｐＯ
Ｊ　１６０（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８０８８）から単離し
たプラスミドｐＯＪＩ６０ＤＮＡ約ｌＯμｇ（ｌＯμの
を１０ＸＰｖｕＩＩバフ７７−（５００ｍＭ　ＮａＣＱ
、６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（！（ｐＨ７，５）、６０
　ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＱ　ｔおよびｌｏｍＭＤＴＴ）　１
０　ｔｔ（１、制限酵素Ｐｖｕｌｌ　　ＩＩ（！（約１
０単位）、制限酵素Ｘｍｎ１　１μｇ（約１０単位）お
よび水７８μＱに加え、３７°Ｃで１時間反応させた。

反応後、実質上、実施例３Ｂ記載の方法に従って消化物
を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、〜９００および
〜９２５ｂｐ断片をＤＥＡＥペーパー上で単離した。断
片を溶離し、エタノール沈澱に付し、ＴＥバッファー２
０μＱに再懸、蜀した。

２　プラスミドｐＯＪ３２８のＸｍｎ１消化上記Ｃて得
たプラスミドｐＯＪ３２８ＤＮＡ約１μｇ（ｌμＱ）を
１０ＸＸｍｎｌバッフｙ−（ＰｖｕＩ［バッファーと同
じ）１μ夕、制限酵素Ｘｍｎ１　　ｌμＱ（約１０単位
）および水７μＱに加え、３７°Ｃで１時間反応させた
。反応後、ＤＮＡをエタノール沈澱に付し、ＴＥバッフ
ァー１０ｍ＆に再懸濁した。

３、プラスミドｐＯＪ１６０のＰｖｕ［Ｉ／Ｘｍｎ１消
化断片とＸｍｎ１消化プラスミドｐｏ　Ｊ　３２８との
結合 上で１したＸｍｎ［消化プラスミドｐｏ　Ｊ　３２８Ｄ
ＮＡ約ｌμｙ（１０μρ）を上で調製したプラスミドｐ
ｌＪ１６０の〜９００および〜９２５ｂｐＰνｕｌｌ／
Ｘｍｎ１断片に加え、このＤＮＡに１０Ｘ′Ｆ４　ＤＮ
Ａリガーセハノファ−４μ（ｌ、Ｔ４．ＤＮＡリガーゼ
１μＱ（約５００単位）および水２０μＱを加えた。静
かに撹拌した後、このライヶーノヨン混合物を１６°Ｃ
で一夜（〜１６時間）インキュベートした。このライゲ
ーションによって中間体プラスミドｐＯＪ３４７か生成
した。ライゲーンヨン混合物約１０μＱを用い、実質上
、実施例４記４戊の方法に従い、大腸菌に１２ＪＭ１．
０９を形質転換した。ＴＡＸ　ｒ−フツート上、３７°
Ｃで一夜平板培養することにより形質転換体を選択した
。

実質上、実施例ＩＢ記載の方法に従い、プラスミドｐＯ
Ｊ３４７ＤＮＡを調製した。

Ｅ、中間体プラスミ）”ｐｏ　Ｊ　３４８　（Ｄ構築上
記りて調製したプラスミドｐＯＪ３４７ＤＮＡ約５μｇ
（５μのを１０ＸＮｄｅｌハノ７ア　（１゜５ＭＮａＣ
ｆ２．１６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１（（Ｊ（ｐＩ（７，５）
、６０ｍＭ　ＭｇＣＬおよびｌ　ＯｍＭ　ＤＴＴ）２　
μＱ、制限酵素Ｎｄｅｌ　　１μ１２（約５単位）、制
限酵素Ｎｒｕ１（ＮＥＢカタログによると、Ｎｒｕ＋は
エキソヌクレアーセ不純物を含有するので、Ｎｄｅｌ粘
着末端がエキソヌクレアーゼ除去される）１μρ（約５
単位）および水１１μＱに加え、３７°Ｃで２時間反応
させた。反応後、消化物をエタノール沈澱に付し、ＴＥ
バッファー２０μＱに再懸濁した。

ＮｄｅＩ／Ｎｒｕｌ消化プラスミドｐｏ　Ｊ　３４７　
ＤＮＡ２０μＱを１ＯＸＴ４ＤＮＡリガーゼノイ、ファ
ー４μＩＪ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μＱ（約５００単位
）、ｌ　ＱｍＭ　ＡＴ　Ｐ　４１１Ｑおよび水１１μＱ
に加えた。このライゲーション反応混合物を１６°Ｃで
−夜インキユヘートすると、中間体プラスミドｐＯＪ３
４８か生成した。プラスミドｐＯＪ３４８の制限部位お
よび機能地図を添付の第６図に示す。

この工程は、上記工程りでプラスミドｐＯＪ１６０由来
の所望の〜９２５断片と一緒に結合した、不要のチオス
トレプトン耐性遺伝子含有〜９００ｂｐＰｖｕＩＩ断片
から〜７００ｂｐを除去するのに必要であった。

ライゲーション反応混合物約１０μＱを用い、実質上、
実施例４記載の方法に従い、大腸菌に１２　　ＪＭ１０
９を形質転換した。形質転換体をアブラマイシン２００
μｇ／ｍ（ｌ含有ＴＹ−寒天プレート上、３７°Ｃで一
夜培養し、選択した。実質上、実施例ＩＢまたは実施例
１２記載の方法に従い、分析および使用用のプラスミド
ＤＮＡをｌした。

Ｆ　中間体プラスミドｐｏ　Ｊ　３５２の構築１、プラ
スミドｐＯＪ３４８ＤＮＡのＫｐｎｌ消化 上記Ｅで得たプラスミドｐＯＪ３４８ＤＮＡ約５μｙ（
５μＱ）を１ＯＸＫｐｎｌバツフアー（６０ｍＭＮａＣ
（！、６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＣ（ｐＨ７，５）、６
０ｍＭ　ＭｇＣｌ２２およびｌ　ＯｍＭ　ＤＴＴ）Ｉ　
ＯμＱ、制限酵素Ｋｐｎｌ　　ｌμρ（約１５単位）お
よび水８・１μＱに加え、３７°Ｃで１時間反応させた
。反応後、エタノール沈澱に付し、ＴＥバッファー２０
ｔｔＩ２に再懸濁した。

２、　Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎヌクレアーゼ処理Ｋｐｎｌ消
化プラスミドｐＯＪ３４８ＤＮＡ約１μｙ（５μ＆）を
ｌ　Ｑ　Ｘ　Ｍｕｎｇ　Ｂ　ｅａｎヌクレアーセバノフ
７−（３００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，６，５００
ｍＭＮａＣ（および１０ｍＭ　ＺｎＣＱ２）　１０１１
０．、Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎヌクレアーゼ１μ（２（約１
００単位、ｌ×バッファーにより、ｌ：１０に希釈した
ばかりのもの）および水８４μρに加え、３７°Ｃて１
０分間反応させた。反応後、ＴＥ飽和フェノールで２回
抽出し、エタノール沈澱に付し、ＴＥバッファー２０μ
Ｑに再懸濁した。

３、Ｋｐｎｌｉ肖化し、Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎヌクレアー
ゼ処理したプラスミドｐＯＪ３４８ＤＮＡの結合Ｋｐｎ
ｌ消化し、Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎヌクレアーゼ処理したプ
ラスミドｐＯＪ３４８ＤＮＡ約０．３μｇ（１０μσ）
を１ＯＸＴ４ＤＮＡリガーセパ、ファーｌＯμＬＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ１μσく約５００単位）および水７９μＱ
に加え、３７°Ｃで一夜インキュへ一トシて平滑床☆：
１ｊを結合させた。このライゲーションによって中間体
プラスミドｐｏ　Ｊ　３５２が生成した。プラスミドｐ
ｏ　Ｊ　３５２の制限部位および機能地図を添付の第７
図に示す。このライゲーション反応混合物約２０μＱを
用い、実質上、実施例４記４戊の方法に従い、大腸菌に
１２　　ＪＭ１０９を形質転換した。アブラマイシン２
００μ９／７ρ含有ＴＹ−寒天プレート上で形質転換体
を選択した。実質上、実施例ＩＢまたは実施例１２記・
抵の方法に従い、制限酵素分析および以後の使用のため
にプラスミドｐＯＪ３５２ＤＮＡを調製した。

Ｇ、中間体プラスミドｐｏ　Ｊ　３５４の構築１、プラ
スミドｐＯＪ３５２ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化 上記Ｆ記載のごと（にして調製されたプラスミドｐＯＪ
３５２ＤＮＡ約５μ９（５μのを１ＱｘＥｃｏＲＩバッ
ファー１０μＱ、制限酵素ＥｃｏＲＩｌμｇ（約２０単
位）および水８４μρに加え、３７°Ｃて２時間反応さ
せた。反応後、ＤＮＡをエタノール沈、殿させ、ＴＥバ
ッファー２０μρに再懸濁した。

２、　Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎヌクレアーゼ処理ＥｃｏＲ１
消化プラスミドｐＯＪ　３５２ＤＮＡ約１Ｍｇ（５μの
をインキュベーションを１０分間でなく２時間行う外は
実質上、上記Ｆ記載の方法に従い、Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ
ヌクレアーゼ処理した。

３、ＥｃｏＲＩ消化し、Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎヌクレアー
ゼ処理したプラスミドｐＯＪ３５２ＤＮＡの結合Ｅｃｏ
ＲＩ消化し、Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎヌクレアーゼ処理した
プラスミドｐＯＪ３５２ＤＮＡ約０．１μ９（１０μの
を実質上、上記Ｆ記載の方法で結合させた。

ライゲーションにより中間体プラスミドｐＯＪ３５４が
生成した。このライゲーション反応混合物４０ｆｆ１２
の内、約１０１１１２を用い、実質上、実施例４記載の
方法に従い、大腸菌に１２　　ＪＭ１０９を形質転換し
た。アブラマイシン２００μｇ／１１（ｌ含有ＴＹ−寒
天プレート上で形質転換体を選択した。

実質上、実施例ＩＢまたは実施例１２記載の方法に従い
、制限酵素分析および以後の使用のためにプラスミドｐ
ＯＪ３５４ＤＮＡを調製した。

Ｈ１中間体プラスミドｐＯＪ３５５の構築１、プラスミ
ドｐＯＪ３５４ＤＮＡのＰｓｔｌ消化 上記Ｇ記載のごとくにして調製されたプラスミドｐＯＪ
３５４ＤＮＡ約５μｇ（５μのをｌ０ＸＰｓｔｌバツフ
アー１０Ｘｆ２、制限酵素ＰｓｔｆｌμＩ２（約３０単
位）および水８４μＱに加え、３７°Ｃで２時間反応さ
せた。反応後、ＤＮＡをエタノール沈澱させ、ＴＥバッ
ファー２０μＱに再懸濁した。

２．７二−ルしたポリリンカーの調製 ポリリンカーの調製に用いた１本鎖ＤＮＡ断片は５ｙｓ
ｔｅｃ１４５０Ａ　ＤＮＡ合成装置（Ｓ　ｙｓｔｅｃ。

Ｔ　ｎｃ、、　　３８１５　Ｃｈａｎｄｌｅｒ　Ｄｒｉ
ｖｅ、　Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ　５５４０１）
またはＡＢＳ　　３８０．Ａ　ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ　Ｂ　ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｔ　ｎｃ、、　
　８５０　　Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｃｅｎｔｒｅ　Ｄｒｉｖ
ｅ、　　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙＣＡ　　９４４０４）
のいずれかを用いて化学合成された。当業者には多くの
ＤＮＡ合成装置が知られており、該断片の製造に用いる
ことができる。さらに、この断片は、実質上、イタクラ
ら［（ｒ　ｔａｋｕｒａ）、サイエフ　ス（Ｓ　ｃｉｅ
ｎｃｅ）、１９８　：　１０５６］およびフレアら［（
Ｃｒｅａ）、プロシイーディングズ・オブ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンシイ−ズＵＳ　Ａ（Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳ　Ａ）、７
５：５７６５］の方法に従い、常法通り合成することが
できる。

１本鎖を合成した後、以下のようにして鎖１（＃８０６
．２８．５８μＭ／μのと鎖２（＃８０７．１８．３９
μＭ／μのとをアニーリングした。エッペンドルフ管内
で鎖１（１８μＱ、〜５００ｐＭ）と鎖２（２８μＱ、
〜５００ｐＭ）とを混合し、１０×ＴＭバッフｙ　　（
０，５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ７，６）および０　
、１　Ｍ　ＭｇＣ１２２）　３μＱを加えた。管を沸騰
している水浴にいれ、沸騰水浴から取り出し、室温で徐
々に冷却させ、４°Ｃて一夜放置した。この工程で１本
鎖がアニーリングし、２本鎖ポリリンカーが形成された
。このようにして構築されたポリリンカーは式。

で示される構造を有し、以下の制限酵素切断部位を含有
する　Ｐｓｔｌ、　ＨｉｎｄｌＩ［、Ｓ　ｐｈ　Ｉ、Ｘ
ｂａＩ、Ｂｇｌ、■、Ｓ　ｃａ　Ｉ　ＳＫ　ｐｎ　Ｉ、
ＥｃｏＲＩ、Ｎ５ｉｌ。

３、　　Ｐｓｔｌ消化プラスミドｐＯＪ３５４ＤＮＡと
ポリリンカーとの結合 Ｐｓｔ［／ｌｊｌ化プラスミドｐＯＪ３５４ＤＮＡ約１
μ９（５μＱ）を上で調製した、アニーリングしたポリ
リンカー４μＬ　　ｌ０ＸＴ４ＤＮＡ’、Ｉガ−セ’４
μＱおよび水２・６μＱに加え、１６°Ｃで一夜インキ
ーヘートした。このライゲーションによってポリリンカ
ーの方向性に関してのみ異なるプラスミドｐＯＪ３５５
およびｐｏ　Ｊ　３５６が生成した。プラスミドｐｏ　
Ｊ　３５５の制限部位および機能地図を添付の第８図に
示す。ライゲーション反応混合物約１０μＱを用い、実
質上、実施例４記載の方法に従い、大腸菌に１２　　Ｊ
Ｍ１０９を形質転換した。アブラマイシン２００μ９／
　ｙ（ｌ含有ＴＹ−寒天プレート上で形質転換体を選択
した。実質上、実施例ＩＢまたは実施例１２記載の方法
に従い、制限酵素分析のおよび以後の使用のためにプラ
スミドｐＯＪ３５５およびプラスミドｐＯＪ３５６ＤＮ
Ａを１凋製した。

■　中間体プラスミドｐＯＪ３６１の構築プラスミドｐ
ｏ　Ｊ　３５５のＤ　ｒａ　Ｉ　〆肖化上記日記載のご
とくにして調製されたプラスミドｐＯＪ３５５ＤＮＡ約
５μｇ（５μのを１０ＸＤｒａｌバツフア　（６０ｍＭ
　　ＮａＣＱ！、６０ｍＭＴｒｉｓ１（Ｃ＆（ｐ）Ｉ　
７　、５　）、６０ｍＭ　ＭｇＣＬおよび１０ｍＭ　Ｄ
ＴＴ）１０μ（、制限酵素Ｄｒａｌ（Ａｈａｍのアイソ
ンゾマー）ｌμＱ（約２０単位）および水８４ａＱに加
え、３７°Ｃて１時間反応さけた。反応後、ＤＮＡをエ
タノール沈澱させ、ＴＥバッファー２０μＱ（こ再懸・
ン蜀した。

２　プラスミドｐｌＪ７０２＋）ＮＡのＢｃ目ｌ肖化お
よびフレノウ処理、および〜ｌｋｂ断片の’１１１’Ｍ
プラスミドｐｌ　Ｊ　７０２　ＤＮＡ（本実施例のＢ）
１′：Ｊ５μｙ（５μのを１ＯＸＢｃｌｌバッフｙ−（
５００ｍＭ　ＮａＣＱ、、５００　ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ　
−１（ＣＱ、（ｐＨ８０）、１００　ｍＭ　ＭｇＣ（１
，およびｌｏｍＭＤＴＴ）１０ｕＱ、制限酵素Ｂｃ１１
　１１１（約１０ｉ１位）および水８４μＱに加え、５
０’Ｃて１時間反応させた。７０’Ｃて１時間インキュ
ベートし熱的に反応を停止した。

実質上、実施例３Ｂ記載の方法に従い、Ｂｅ１ｌ消化プ
ラスミドｐＩ　Ｊ　７０２ＤＮＡをフレノウ酵素で処理
した。次いて、Ｂｃｌ■消化し、フレノウ処理したプラ
スミドｐｌ　Ｊ　７０２ＤＮＡを１％アガロースゲル電
気泳動にかけた。実質上、実施例３Ｂ記１１ｉ１ｉの方
法に従い、〜１ｋｂＢｃｌｌ（フレノウ）断片を単離し
た。この断片をＴＥバッファー２０μＱに再懸濁した。

３、Ｄｒａｌメ肖化プラスミドｐｏ　Ｊ　３５５とＢｃ
ｌＩ（フレノウ）消化ブラスミｌ’ｐ［Ｊ　７０２　Ｄ
ＮＡとの結合 Ｄ　ｒａ　Ｈ消化プラスミドｐｏ　Ｊ　３５５約１μｇ
（５μのをＤｅｌｌ（フレノウ）消化プラスミドｐｌＪ
７０２ＤＮＡ２μｅ（約０．Ｉμｇ）、ｌ０ＸＴ４ＤＮ
Ａリガーセ４μＬＴ４ＤＮＡリガーセｌμＱ（約５００
単位）および水３２μＱに加え、３７°Ｃて一夜インキ
ユベートして平滑末端を結合させた。このライゲーショ
ンによって中間体プラスミドｐＯＪ３６１か生成した。

プラスミドｐＯＪ３６１の制限部位および機能地図を添
付の第９図に示す。

このライゲー／ヨン反応混合物約１０μＱを用い、実質
上、実施例８記載の方法に従い、Ｓ　グリセオフスカス
を形質転換した。チオストレプトン２５μｇ／＊０含有
改良Ｒ２寒天プレート上で形質転換体を選択した。プレ
ートからコロニーを選択腰チオストレプトン２５　ｕ　
ｇ／ηＱ含？Ｔ　′「Ｓ　Ｂ培地で−（夕培養した。実
質上、実施例Ｉ２記載の方法に従い、制限酵素分析のお
よび以後の使用のためにプラスミｌ”ｐＯＪ　３６１　
ＤＮＡを調製した。

このようにして得たプラスミドｐＯＪ３６１ＤＮＡをＴ
Ｅバッファー２０μＱに再懸濁した。このＤＮＡ約５μ
Ｑを用い、実質上、実施例４記載のごとくにして大腸菌
Ｋ１２ＪＭ１０９を形質転換した。アブラマイシン２０
０μｇ７ｙρ含有ＴＹ寒天プレート上で形質転換体を選
択した。生成したコロニーを選択し、実質上、実施例１
２記械の方法に従い、プラスミドＤＮＡを稠ｆｆｌした
。

Ｊ　ファスミドｐＯＪ、１０２の１．′ｌ築１　プラス
ミドｐＢ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ　　Ｓ　Ｋ　’の、へｈ
ａｌｌＩ消プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ”
　ＤＮＡ（実施例１）約３μ９（３μ＋りをＩＯ×Ａｈ
ａ■バッファー１０μＱ１制限酵素ｌ＼ｈａｍ（Ｄｒａ
ｌのアイソシゾマー）１ｕＱ（約２０　ｔｊｘ位）およ
び水８６μ（１ｍ加え、３７°Ｃで２時間反応させた。

反応後、Ｄ　Ｎ　Ａをエタノール沈澱させ、ＴＥバッフ
ァー２０μＱに再懸濁した。

２　プラスミドｐＯＪ３６１ＤＮＡのＸｍｎ１／Ｅｃｏ
ＲＩ消化およびフレノウ処理、および〜４５ｋｂ断片の
単離 プラスミドｐＯＪ３６１ＤＮＡ（上記Ｉ）約１０μｇ（
１０μＱ）をｌＯＸＸｍｎｌバッファーｌＯμＱ、制限
酵素Ｘｍｎ！　　１μ０．（約１０単位）および水７９
μＱに加え、３７°Ｃて１時間反応させた。次いで、こ
のＸｍ口Ｉ消化物にＥｃｏＲ１バッファー１１μＱおよ
び制限酵素ＥｃｏＲ１１μＱ（約２０単位）を加え、３
７°Ｃで２時間インキュベートさせたＸｍｎ　Ｉ　／　
ＥｃｏＲｌ　ｉ白化プラスミドｐＯＪ３６］Ｄ　Ｎ　Ａ
を実質上、実施例３Ｂ記載の方法に従い、フレノウ酵素
で処理し、次いて、フレノウ処理した消化物を１％アガ
ロースケル電気泳動にかけた。

実質上、実施例３Ａ記載の方法に従い、〜４．５ｋｂＸ
ｍｎｌ　／　ＥｃｏＲＩ　（フレノウ）断片を単離し、
ＴＥバッファー２０ｔｔρに再懸濁シタ。

３、プラスミドｐＯＪ３６１ＤＮＡの〜４．５ｋｂＸｍ
ｎＩ／ＥｃｏＲＩ　（フレノウ）断片とＡｈａＩＩＩ消
化プラスミドｐＢ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋ　”　
Ｄ　Ｎ　Ａとの結合プラスミドｐＯＪ３６１ＤＮＡの〜
４．５ｋｂＸｍｎＩ／ＥｃｏＲＩ（フレノウ）断片約０
．５μ９（５μのをＡｈａＩＩ！消化プラスミドｐＢ　
１ｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋ　’　ＤＮＡ５μＱ（約０
．１５μｙ）、ＩＱｘＴ４ＤＮＡリカーセ４ａｃｉ、Ｔ
４ＤＮＡｌガーセｌμ（！（約５００単位）および水２
５μＱに加え、３７°Ｃて一丙イノキユヘートして平滑
末端を結合させた。このライゲーションによって所望の
ファスミトｐＯＪ４０２か生成した。ファスミドｐＯＪ
４０２の制限部位および機能地図を添付の第１０図に示
す。

このライケーンフン反応混合物約１０μＱを用い、実質
上、実施例・１記載のごとくにして大腸菌に１２　　Ｒ
ＲＩを形質転換した。ＴＡＸＩプレート上で形質転換体
を選択した。実質」二、実施例１２記載の方法に従い、
制限酵素分析および以後の大腸菌に１２ＪＭ１０９の形
質転換のためにファスミトｐＯＪ４０２ＤＮＡを；’Ｊ
、！］装した。

実施例１４　プラスミドｐＯＪ１９２の構築Ａ、中間体
プラスミドｐＯＪ１８９の構築ｌ　プラスミドｐＯＪ１
６０ＤＮＡのＸｍｎ１／１−１　ｉ　ｎｄ　ＩＩＩ　消
化および〜５９ｋｂ断片の単離プラスミドｐＯＪ１６０
ＤＮＡ（実施例１）約２０μ９（２０μのを１０ＸＸｍ
ｎｌバッフｙ　−１０ｔｉＱ、制限酵素Ｘｍｎ＋　　３
μＱ（約１８単位）および水６４μＱに加え、３７°Ｃ
て２時間反応させた。１肖化物を実質上、実施例３Ｂ記
載の方法に従って１％アカ狛−スゲル電気泳動にかけ、
〜５　、９　ｋｂｌＪ−ｒ片を単離した。この〜５．９
ｋｂ断片をＴＥバッファー２０μＱに再懸濁した。

２　　コスミ　ドｐＫＣ４６２ａＤＮＡのＥｃｏＲ＋／
１−１　ｉ　ｎｄ　’Ｈ消化およびフレノウ処理コスミ
ドｐＫＣ４６２ａ（実施例１３Ａ）約３０μｙ（１５μ
のを１０ＸＥｃｏＲＩバツフアー１０ｕＱ、制限酵素Ｅ
ｃｏＲ１３μＱ（約１５単位）および水７２１１Ｑに加
え、３７°Ｃて３時間反応させた。次いで、このＥｃｏ
ＲＩ消化物を実質上、実施例３Ｂ記、誠の方法に従い、
フレノウ酵素で処理した。フレノウ処理の後、ＤＮＡを
エタノール沈澱に付し、１ＸＨｉｎｄｌＴＩバツフアー
１００μＱに再１面濁し、制限酵素１（ｉ　ｎｄ　ＩＩ
Ｉ　３７１１２（約６０単位）を加えた。反応混合物を
３７°Ｃで２時間インキユヘートし、１％アガロースケ
ル電気泳動にかけた。実質上、実施例３Ｂ記載の方法に
従い、〜５．７　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　（フレノウ）／Ｈ
ｉｎｄ［ＩＩ断片をケルから単離し、Ｔ　Ｅ　””　。

ファー２０μＱに再懸濁した。

３　プラスミドｐＯＪ１６０の〜５．９　ｋｂ　Ｘｍｎ
Ｉ／ト（ｉｎｄｌｌｌ断片とコスミドｐＫＣ４６２ａの
〜５７ｋｂ　ＥｃｏＲ［（フレノウ）／Ｈｉｎｄｌｌｌ
断片との結合プラスミドｐＯＪ１６０の〜５．９ｋｂＸ
ｍｎｌ／１（ｉｎｄＩ１１断片約２μｙ（４μＱ）とコ
スミドｐＫＣ４６２ａの〜５．７ｋｂＥｃｏＲｌ　（フ
レノウ）、／　ＩＩ　１ｎｄｌＩＩ断片杓２μ９（４μ
Ｑ）を１ＱＸＴｌＩＤＮＡリガーセノザノフアー４μＱ
、Ｔ＝ＩＤＮＡリカーセ１／１０．（約５００単位）お
よび水２７μρに加えた。このライケーンフン反応混合
物を１６°Ｃで一夜イノキュへ−！・した。このライゲ
ーションによって中間体プラスミｌ＝’ｐｏ　Ｊ　ｌ　
８９か生成した。

このライケーンフン反応混合物約１０μρを用い、実質
上、実施例４記載のごとくにして大腸菌Ｋ１２　　ＪＭ
１０９を形質転換した。ＴＡＸ　Ｉフレート上、３０’
Ｃで形質転換体を選択した。実質上、実施例ＩＢまたは
実施例１２記載の方法に従い、制限酵素分析および以後
の使用のためにプラスミドｐＯＪ１８９ＤＮＡを調製し
た。

Ｂ　プラスミドｐＯＪ１９２の構築 上記Ａ記載のごとくにして調製されたプラスミドｐＯＪ
１８９ＤＮＡ約２０μｇ（２０μのを１０ＸＡｈａｌＩ
Ｉバツフアー１０μ＆、制限酵素Ａ　ｈａ　ＩＩＩ　２
μＱ（約６巾位）および水６８μＱに加え、３７°Ｃて
８分間反応させた。Ａｈａ１部分消化の後、Ｄ　Ｎ　Ａ
をエタノール沈１殿さｌ゛、′Ｉ’　ＩＥノ＼７フアー
２０μＱ（こ再％％　ｉにＵシｔこ。

プラスミドｐＯＪ１８９ＤＮΔのＡｈａｌＩＩ（部分）
消化物約２μｇ（２μｇ）を１ＯＴ４ＤＮＡリガーセバ
ッファ−４μＮ！、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μＱ（約５０
０単位）および水３３μｇに加え、１６°Ｃで一夜イン
キユベートした。インキュベー７−３ン後、反応混合物
を７０°Ｃて２０分間熱処理して反応を不活化した。次
いで、このライゲーション反応混合物４０μ（ｌを１Ｏ
Ｘｓｃａｌ）’ノフｙ−（５００ｍＭ　Ｎａ（ｊｌ、　
６０ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ−１（Ｃｌ２（ｐＨ７，５）、６
０ｍＭ〜１ｇＣＬおよびｌ　ＯｍＭ　ＤＴＴ）　ｌ　Ｏ
ｔｔＱ、制限酵素５ｃａｌ　　３１１Ｑ＜約３０単位）
および水５０μＱに加え、３７°Ｃで２時間反応させた
。この５ｃａｌ処理したライケーションＣ昆合物は所望
のプラスミｌ’ｐｏ　Ｊ　ｌ　９２を含有していた。Ｓ
　ｃａ　ｌ処理したｉ（、ＤＮＡをエタノール沈、毀さ
せ、′Ｉ″Ｅバッファー・ｔｏＩｎに再ｌび濁１−だ。

Ａｈａｌ旧１電化しライケーノヨンしたＳ　ｃａ　ｌ処
理プラスミドｐＯＪ１８９ＤＮＡ約１０μｇを用い、実
質上、実施例・１記載の方法に従い、大腸菌ＫＩ２Ｊ　
Ｍ　１０９を形質転換した。アブラマイジン２００μ９
／１Ｑ含有′ＦＹ−寒天プレート上、３０°Ｃにおいて
大腸菌Ｋ　１２　　ＪＭ１０９／ｐＯＪ　１８９形質転
換体を選択した。アブラマイノン耐性大腸菌Ｋ　１２　
　ＪＭ１０９／ｐＯＪ　１８９形質転換体をアンピノリ
ン１００μｑ／ｙＱ含有ＴＹ−寒天プレート上で平板培
養し、所望のプラスミドｐＯＪ１９２の構築および選択
に際するプラスミドｐＯＪ１８９からのアンピシリン耐
性遺伝子の欠失によるアンピシリン感受性を確認した。

プラスミドｐＯＪ　１９２の制限部位および機能地図を
添付の第１１図に示す。

実ＩＡ例１５記載のストレプトマイセス・コエレウスの
ライブラリー構築に使用するために、実質上、実施例Ｉ
Ｂ記載の方法に従いプラスミドｐＯＪ１９２ＤＮＡを調
製した。

実施例１５　ストレプトマイセス・コエレウスのケノム
ライブラリーの構築 Ａ、ヘクターｐＯＪ１９２ＤＮＡの調製プラスミドｐｏ
　Ｊ　１９２　ＤＮＡ約３０μｇ（３０ｔｔ（１’）を
ｌ０ＸＨｐａｌバツフｙ　　（１００ｍＭＴｒｉｓＩＩ
　ＣＣ（ｐｉ（７，５）、　ｌ　Ｑ　□　ｍＭ　ＭｇＣ
Ｑ２、　ＪｏｎＭＫ（１！および１ｍＭ　ＤＴ′Ｔ’）
Ｉ　ＯμＱ、制限酵素Ｈｐａｌ　ｌ　ＯｕＱ（約５０中
位）および水５０／ｌ（２中で３７°Ｃにおいて３時間
消化した。ＢＡＰ（ｉ１１閑性アルカリホスファターセ
）約２　、５　ｊｌｉｆｉ（２５μＱ）［インターナシ
ョナル・バイオチクノロシーズ・インコーボレイテノド
（ｌ　ｎＬｃｒｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｂ　ｉｏｔ〔！ｃ
ｈｎｏｌ。

ｇｉｅｓ、　Ｉ　ｎｃ、　）、Ｐ、０．１３０Ｘ　ｌ　
５６５、Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、ＣＴ　　０６５０６］を
加え、６０°Ｃて２時間インキュベートした。ＤＮＡを
フェノール（２回）およびＳ　ｅｖａｇ（２回）抽出し
た後、エタノール化、＋８させた。次いで、ＤＮＡをＴ
Ｅバッファー１００μｇに再１市濁した。再！冒濁した
ＤＮＡ５Ｑμρを１０Ｘ１０ＸＢａバツフアー中、制限
酵素Ｂ　ａｍＨｌ　５　ｔｔ　（Ｉｃ約５０　’ｉｉ位
）および水３５１１Ｑにより、３７°Ｃで３時間消化し
た。再度、ＤＮＡを上記のごとくフェノールおよびＳ　
ｅｖａｇで抽出し、エタノール沈１毀させ、最後にＴＥ
バッファー５０μＱに再Ｕ濁した。

Ｂ　挿入体Ｄ　Ｎ　Ａの１７１制４ ストレフ！・マイセス・コエレウス（Ｎ１マＦ＜Ｌ２２
５１）をスピラマイ／ン（／グマ）１００μ９を袖先し
たＴ　Ｓ　＋３１’７＋也２５０　ｒｑ（ｌ中で３０°
Ｃにおいて１６時間培養した。遠心（８，０００で１０
分間）して細胞を収［Φし、ライメス（溶解）ミックス
（３０ＱｍＭ’／　ヨ糖、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
２（１）Ｈ８，Ｏ）および２５ｍＭ　ＥＤＴＡ）ｌ　Ｏ
ｚＧに再１ツ濁し、リソチームを終濃度１ｍ９／、ｗＱ
となるように加え、３７°Ｃで１０分間インキュベート
した。次いて、フロテイナーゼＫを終濃度２００μｇ／
ｙｔｔＱ、　Ｓ　Ｄ　Ｓ　（ｊ＋デンル硫酸ナトリウム
）を終濃度２％となるように加えた。得られた混合物を
７０’Ｃで１０分間インキュベートした後、水上で冷却
した。混合物を１Ｍ酢酸カリウムに調節し、水上に３０
分間放置した。この物質をフェノール飽和Ｔ　Ｅて抽出
して液層を分離させ、水層を静かにＳ　ｅｖａｇ抽出し
た。

再び液層か分離し、水層の核酸をエタノール沈澱させた
。沈澱を７０％エタノールで洗浄し、ＴＥバッファー５
１１ＩＱに溶かした。このＤＮＡ溶液にＲＮａｓｅＡを
終濃度５０μｔｉ／ｍ（ｌとなるように加えた。

次いて、この溶液を３７°Ｃで３０分間インキュヘ−ト
し、フェノール（２回）およびＳ　ｅｖａｇ（２回）抽
出したｉＬエタノール沈澱させた。次いで、ＤＮＡをＴ
Ｅバッファー１ｚ（（５４５μｙ／ｍのに再溶解し、λ
ＤＮＡＤＮＡ３μＱズ）標準と一緒に０゜３％アガロー
スケル電気泳動にかけて分子量を決めたところ、平均分
子量は７０ｋｂ以上であることが分かった。

次いで、ストレプトマイセス・コエレウスの染色体ＤＮ
Ａ約５０μｇ（ｌ　ＯＯμρ）をｌ　Ｘ　Ｍ　ｂｏ　Ｉ
バッファ　　（ｌ　００ｍＭ　ＮａＣ２，１０ｍＭ　Ｔ
　ｒｉｓ　−ＨＣｌ２（ｐＨ７、４）、１０ｍＭ　Ｍｇ
ＣＱ２およびｌ　ｍＭ　Ｄ　′ＰＴ）５００μρ中、制
限酵素Ｍｂｏｌ約３０単位）とｆＭに３７°Ｃで１５分
間インキュベートシた。この特定の条件によれば染色体
Ｄ　Ｎ　Ａの所望の部分断片（ヒを行い得ることか経験
的に見いたされた。

Ｄ　Ｎ　Ａをフェノール、Ｓ　ｅｖａｇ抽出し、′ＦＥ
バッファー１００μＱに溶解した。

次いで、ストレプトマイセス・コエレウスＭｂ。

１部分約２５μ９を１ｘＢＡＰハソファ−５００μσ中
、ＢＡＰ処理（２５単位、７０’Ｃて３０分間）した。

ＤＮＡをフェノールおよびＳ　ｅｖａｇで抽出し、ＴＥ
バッファー１．００μＱに１容解した。このＤＮＡの分
子量を０．３％アカロースケル上で見積ちり、３０　４
０ｋｂであることが分かった。

ＣベクターＤＮへと挿入体ＤＮＡの結合ｐＯＪ１９２（
本実施例の八で調製）約１．２５　ｎｇ（４μのをスト
レプトマイセス・コエレウスＭ　１３０１部分（本実施
例のＢで調’！２）　５００　Ｂ（４μのと混合し、１
ｍＭＡＴＰとしたｌ　Ｑ　Ｘ　Ｔ　、４　Ｄ　Ｎ　Ｉ〜
リカーセパソファ−４μＱ中てＴ　４：ｌ　Ｄ　Ｎ　ｔ
〜す７リーセ、杓、１００単位により結合させた。ライ
ケーン３フ反応は１６°Ｃで１６時間行った。

Ｄ　インビトロでのパッケージング（詰め込み）バノケ
ー／ングはライケー／ヨンｌ昆合物（ハイブリッドベク
ターＤ　Ｎ　、Ａ〜６２．５ｎｙ）約−１μｅをＧＩＧ
Δｒ）ＡＣＫバノケー／ノグキノト（ストラタジーン）
に入れて行われた。このビ昆合物にファージバッファー
（室温で２時間、ｌ　ＯｍＭ　′Ｔ’　ｒｉｓｌ−Ｉ　
ＣＣ（ｐＨ７、４）、ｌｏｍＭＭｇｓ○４および０，０
１％セラチン）を加えた。

Ｅ、大腸菌Ｋ１２　　ＳＦ３の形質導入パッケージング
したコスミド約２００μＱ、ＣヘクターＤ　Ｎ　Ａ　２
５　ｎｇ）を０２％マルトースおよび１０ｍＭ硫酸マグ
ネシウムを補充したトリプトン酵母エキス中で培養した
大腸菌ＫＩ２　５Ｆ８（５００μのに吸着させた。１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０）およびｌ　ＯｍＭ　Ｍｇ
Ｃ１２２中、３７°Ｃて１０分間、吸着させた。細胞を
ＴＹブロス５ησ中、３０°Ｃて２時間培養し、形質導
入完了体をアプラマイジン２００　ｔｔ　ｇ／　、ｗ（
ｌを補充したＴＹプレート上、３０°Ｃで選択した。形
質導入された細胞０．ｌｘσの平板培養で約６，０００
コロニーが得られ、形質導入効率は約２×１０°形質導
入完了体／μりであった。

Ｆ　ストレプトマイセス・グリセオフスカスの形質転換 所望の形質転換は、上記Ｅで得た全ての分取したＤＮＡ
３μＱ（約１５μ９）を用い、実質上、実施例８記載の
方法に従い、行われた。Ｓ　グリセオフスカス形質転換
体をアプラマイジン２５μ９／ｘＱ含４ＴＲ２寒天プレ
ート」−で、ザ択した。約６０ｏｏｏｔ囚の形質・１伝
換（本か得られた。ｌ（固のブレートから得た約７．０
００個の形質転換体コロニをホモジナイズし、アブラマ
インノ２５μｇｙ’ｙｔＱおよびスピラマイ／ン０．１
μ９／７ρ倉有’ＦＳＢ培１巾１．０！ｌｉＱ中、３０
°Ｃて一皮培存した。翌日、この−Ｖ培養物〜０　、５
　、ｗ（ｌをアブラマイノン２５μｇＺｐＱ＆有１’　
Ｓ　Ｂ寒天プレートて平（反培篠した。プレーＩ・を３
０℃で７日１川インキユヘートした。アフ。

ラマイシン１ｈ）１性かつスピラマイノン：ｆｊＪ　性
の形質転換体を得た。

上記で得た形質転換体の抗生物質耐性スペクトルを以下
のように、ティスフ分析法で１〕、１へた。スピラマイ
シン１耐性形質転換体クローンをアブラマイジン２５μ
ｙ／　ｍ（ｌ含有ＴＳＢ５ａｊ中て培養した。

−（り培養物をホモジナイズし、ホモジナイズした培谷
物０．２ｆｆＣを、栄篠寒天重層４．ｉＣを用い、アブ
ラマイノン２５μ９／１Ｑ含有］’　Ｓ　１３寒天プレ
ートに！ｎ層した。マクロライドティスクバノト（ディ
スクパッドあたリマクロライト抗生物質２０μ９）を固
化した重層に置き、３０°Ｃで３日間インキュベートし
た。得られたコロニーはＳ、コエレウスのようにピクロ
マイシンおよび他のマクロライド抗生物質、例えばエリ
スロマイシン、リンコマイシン、スピロマイシンおよび
ロサマイシンなどに対して耐性であったが、タイロジン
には感受性であった。実質上、実施例１２記載の方法に
従い、そのようなピクロマイジン耐性コロニー培養物４
１１１Ｑを培養してプラスミドを調製し、ＴＥバ、ファ
ー２０μＱに再懸濁した。このプラスミドＤＮＡ１０１
１Ｑを用い、実質上、実施例４の方法に従い、大腸菌Ｋ
Ｉ２　　ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体をアプ
ラマイシン２００μｇ／：ｒｒＱを補充したＴＹプレー
ト上、３７°Ｃで選択した。プラスミドｐＯＪ２０８を
含有する所望の形質転換体を得た。プラスミドｐＯＪ２
０８はＳ、コエレウスの〜３５ｋｂを含有していた。

実施例１６　ファスミドｐｏ　Ｊ　４０５の構築Ａ、中
間体プラスミドｐｏ　Ｊ　３０３の構築実施例１５で調
製したプラスミドｐＯＪ２０８Ｄ　Ｎ　Ａ約５μ！？（
５μのを１ＯＸＸｈｏｌバツフアー（５００ｍＭ　　Ｎ
ａＣＱ、５００　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ｆ（ＣＱ（ｐＨ
８、０）、］　０００ｍＭＭｇＣＱ２および１０ｍＭＤ
ＴＴ）１０μＱ、制限酵素Ｘｈｏｌ　　ｌμＱ（約１０
単位）および水８４μρに加え、３７°Ｃで２分間反応
させて部分消化した。７０’Ｃて１５分間インキュベー
トして熱不活化し、反応を止めた。ＤＮＡをエタノール
沈澱に付し、ＴＥバッファー２０μａに再懸濁した。

ｐＯＪ２０８ＤＮＡのＸｈｏＩ（部分）消化物約１μｙ
（４μρ）を１０ＸＴ４ＤＮＡリガーゼバツフアー４μ
（、Ｔ４ＤＮＡリガーゼｌμＱ（約５００単・・位）お
よび水３１μＱと一緒に１６°Ｃで一夜インキユヘート
することにより結合させた。ライゲーションにより所望
の中間体プラスミドｐＯＪ３０３か生成した。ライゲー
ション反応混合物４０μＱの内１０μＱを用い、実質上
、実施例４記載の方法に従い、大腸菌Ｋ１２　　ＪＭ１
０９を形質転換した。形質転換体をアブラマイジン２０
０μｇ／　ｗ（１含有ＴＹ−寒天プレート上、３７°Ｃ
で一夜培養し、選択した。

実質上、実施例１２記載の方法に従い、プラスミドｐＯ
Ｊ３０３ＤＮＡを調製し、実施例１５記載のごとく、こ
れを用いてマクロライド耐性を試験するためにＳ　グリ
セオフスカスの形質転換を行った。

Ｂ　中間体プラスミドｐｏ　Ｊ　３２１の溝築プラスミ
ドｐＯＪ３０３ＤＮＡ約５μｇ（５μのを１０ＸＮｃｏ
Ｔバツフア（１，５Ｍ　ＮａＣＱ、６０＋ｎＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＱ（ｐＨ７，５）、６０　ｍＭ　ＭｇＣＱ、お
よび１０ｍＭ　ＤＴ　Ｔ）ｌ　Ｏｕ（１、制限酵素Ｎｃ
。

１１μσ（約５単位）および水８４μρに加え、３７°
Ｃで１時間反応させた。反応後、エタノール沈澱に付し
、ＴＥパンファー２０μＱに再懸濁した。

Ｎｃｏｌｌ肖化プラスミドｐｏ　Ｊ　３０３（４μ０を
１ＱｘＴ４ＤＮＡリガーゼバツフアー４μρ、Ｔ４ＤＮ
ＡリガーセｌμＱ、（約５００単位）および水３１μ夕
中で１６°Ｃで一夜インキユベートすることにより結合
させた。このライゲーションによって中間体プラスミド
ｐＯＪ３２１が生成した。

このライゲーション反応混合物約１０μＱを用い、実質
上、実施例４記載の方法に従い、犬陽閑に１２　　ＪＭ
１０９を形質転換した。アブラマイジン２００μ９／ｍ
（ｌ含有ＴＹ−寒天プレート上、３７°Ｃで形質転換体
を選択した。大腸菌ＫＩ２ＪＭ１０９／ｐＯＪ３２１の
培養物はナショナル・Ｊ−ジョナル・リサーチ・ラボラ
トリ−ペオリア、イリノイに、受託爵号ＮＲＲＬ　　Ｂ
−１８３８９（受託日、１９８８年７月２２日）の下で
寄託されている。

実質上、実施例１２記載の方法に従ってプラス’Ｅ、　
ドｐＯＪ　３２１ＤＮＡを調製し、実施例１５記載の方
法に従ってマクロライド耐性を試験するためにＲ’Ａ　
Ｄ　Ｎ　Ａを用いてＳ、グリセオフスカスを形質転換し
た。

Ｇ、ファスミドｐｏ　Ｊ　４０のｈＷ築プラスミドｐＯ
Ｊ３２１ＤＮＡ約２０μｇ（２０ｕＱ）をＬＯＸＰｖｕ
ＨバッファーＸＯμσ、制限酵素Ｐｖｕｌｌ　　３μＲ
（約６０単位）および水６７μ＋Ｅ加え、３７°Ｃで２
時間反応させた。反応後、消化物を１％アガロースゲル
電気泳動にかけ、実質上、実施例３Ｂ記載の方法に従っ
て〜２．８ｋｂ　ＰｖｕＩＩ断片を単離した。この断片
をＴＥバ、ファー２０μＱに再懸濁した。

実施例３記載のごとくにして調製されたファスミ　ドｐ
ＯＪ４０１ＤＮＡ約５μｇ（５μり）をＩＯ×Ｓｍａｌ
バッフｙ　−（６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ２（ｐＨ７
゜５）、６０　ｍＭ　ＭｇＣ（ｌ、、２００ｍＭＫＣ（
および１０ｍＭ　ＤＴＴ）ｌｏμｃ、制限酵素Ｓｍａｌ
　　２ｕＱ（２０単位）および水８３μｇに加え、３７
°Ｃテ２時間反応させた。反応後、ＤＮＡをエタノール
沈澱させ、ＴＥバッファー２０μＱに再懸濁した。

プラスミドｐＯＪ３２１の〜２．８ｋｂＰｖｕｌｌ断片
”約１μｇ（５μＣ）とＳ　ｍａ　Ｉ　ｉＭ化プラスミ
ドｐＯＪ４０１　ＤＮＡ　１　μｇ（５ｔｔのとを１０
　Ｘ　′ｒ４　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼバッファー４μ
Ｑ、Ｔ４ＤＮＡリガーセｌμＱ（約５００単位）および
水２５μρと一緒に３７°Ｃて一夜インキユベートする
ことにより結合させた。このライゲー／ヨンによって所
望のファスミドｐｏ　Ｊ　４０５が生成した。ファスミ
ドｐｏ　Ｊ　４０５の制限部位および機能地図を添付の
第１２図に示す。

このライゲーション反応混合物約１０μρを用い、実質
上、実施例４記載の方法に従い、大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０
９を形質転換した。形質転換体をＴＡＸ　Ｉフレート上
で選択し、実質上、実施例ＩＢまたは実施例１２記載の
方法に従い、制限酵素分析および形質転換のためにプラ
スミドＤＮＡを調製した。このようにして得られたファ
スミドｐＯＪ４０５ＤＮＡを用いてＳ　グリセオフスカ
ス形質転換体し、アブラマイシン２５μ９／ｖｒＱ、含
有Ｒ２寒天プレート上で選択した。ファスミドｐＯＪ４
０５のＳ、グリセオフスカスへの導入（トランスファー
）により、ディスク・アッセイにおいてＳ　フェレシス
が示したと同様のマクロライド抗生物質耐性表現型か付
与された。このことは、ｐＯＪ４０１が、外来性ＤＮＡ
、この場合には、広範囲におよぶマクロライド抗生物質
に対する耐性を付与するＳ８フエレウス由来のピクロマ
イジン耐性遺伝子をクローニングする二とかでき、スト
レプトマイセス内で発現させるのに適切なベクターであ
ることを証明するものである。制限酵素分析の結果は、
形質転換されたＳ、グリセオフスカスが無傷のファスミ
ドｐｏ　Ｊ　４０５を含有していることを示していた。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＯＪ１６０の制限部位および機能
地図、第２図はファスミドｐＯＪ４０１の制限部位およ
び機能地図、第３図はコスミドｐＫＣ４６２ａの制限部
位および機能地図、第４図はプラスミドｐｌＪ７０２の
制限部位および機能地図、第５図はプラスミドｐｏ　Ｊ
　３２６の制限部位および機能地図、第６図はプラスミ
ドｐＯＪ３４８の制限部位および機能地図、第７図はプ
ラスミドｐ［Ｊ３５２の制限部位および機能地図、第８
図はプラスミドｐＯＪ３５５の制限部位および機能地図
、第９図はプラスミドｐＯＪ３６１の制限部位および機
能地図、第１０図はファスミトｐＯＪ４０２の制限部位
および機能地図、第１１図はプラスミドｐＯＪＩ９２の
制限部位および機能地図、第１２図はファスミｌ−’ｐ
ｏ　Ｊ　４０５の制限部位および機能地図の模式図であ
る。 特許出願人　イーライ・リリー・アンド・カンパニ代　
理　人　弁理士　青　山　　葆（外２名）ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、２ Ｆ　Ｉ　Ｇ、　４ ビＶｕ　１１ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、８ ＦＩＧ、９ ＦＩＧＩＩ ＦＩＧ、ｌｏ ＦＩＧ、＋２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ）大腸菌内で機能的なレプリコン、 ｂ）ストレプトマイセス内で機能的なレプリコン、 ｃ）Ｆピリを有する大腸菌のフィラメント状バクテリオ
   ファージの複製起点および形態形成シグナルを含有する
   ＤＮＡセグメント、および ｄ）感受性宿主細胞に導入されたとき、少なくとも１個
   の抗生物質に対する耐性を伝達する１またはそれ以上の
   ＤＮＡセグメントを含有する組換えＤＮＡファスミドシ
   ャトルベクター。 ２、ｐＯＪ４０１、ｐＯＪ４０２またはｐＯＪ４０５か
   らなる群から選択される請求項１記載の組換えＤＮＡフ
   ァスミドシャトルベクター。 ３、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡである請求項１記
   載の組換えＤＮＡファスミドシャトルベクター。 ４、大腸菌のレプリコンが、プラスミドｐＢＲ３２２、
   ｐＢＲ３２５またはｐＢＲ３２８のレプリコン含有断片
   からなる群から選択されるものである請求項１記載の組
   換えＤＮＡファスミドシャトルベクター。 ５、ストレプトマイセスのレプリコンがプラスミドｐＩ
   Ｊ１０１、ＳＣＰ２＾＊、ＳＣＰ２、ｐＶＥ１、ｐＪＶ
   １、ｐＵＣ１７、ＳＬＰ１、ＳＬＰ１．２、ｐＢＴ１、
   ｐＳＶＨ１、ｐＦＪ１０３、ｐＴＡ４００１、ｐＳＲＣ
   １−６、ｐＳＬ１、ｐＭＧ２００、ｐＳＦ７６５、ｐＳ
   Ｋ２、ｐＳＧ２、ｐＳＧ５、またはｐＮＭ１００のレプ
   リコン含有断片からなる群から選択されるものである請
   求項１記載の組換えＤＮＡファスミドシャトルベクター
   。 ６、アクチノマイセスおよび大腸菌からなる群から選択
   される、請求項１記載の組換えＤＮＡファスミドシャト
   ルベクターを含有する形質転換宿主細胞。 ７、ストレプトマイセス・アンボファシエンス、ストレ
   プトマイセス・アンチビオチカス、ストレプトマイセス
   ・アベルミチリス、ストレプトマイセス・クリセウス、
   ストレプトマイセス・シラタス、ストレプトマイセス・
   エウリサーマス、ストレプトマイセス・フェレウス、ス
   トレプトマイセス・フラディエ、ストレプトマイセス・
   フンジシジカス、ストレプトマイセス・グリセオフスカ
   ス、ストレプトマイセス・ハルステジ、ストレプトマイ
   セス・ハイグロスコピカス、ストレプトマイセス・マク
   ロスポレウス、ストレプトマイセス・ミカロファシエン
   ス、ストレプトマイセス・ナルボネンシス、ストレプト
   マイセス・プラテンシス、ストレプトマイセス・サーモ
   トレランス、ストレプトマイセス・トヨカエンシスまた
   はストレプトマイセス・ベネズエラエからなる群から選
   択される請求項６記載の形質転換宿主細胞。 ８、ストレプトマイセス・フラディエ／ｐＯＪ４０１、
   ストレプトマイセス・フラディエ／ｐＯＪ４Ｏ２、スト
   レプトマイセス・フラディエ／ｐＯＪ４０５、ストレプ
   トマイセス・グリセオフスカス／ｐＯＪ４０１、ストレ
   プトマイセス・グリセオフスカス／ｐＯＪ４０２、スト
   レプトマイセス・グリセオフスカス／ｐＯＪ４０５、ス
   トレプトマイセス・トヨカエンシス／ｐＯＪ４０２、ま
   たはストレプトマイセス・トヨカエンシス／ｐＯＪ４０
   ５である請求項７記載の形質転換宿主細胞。 ９、大腸菌である請求項６記載の形質転換宿主細胞。 １０、大腸菌に１２ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＯＪ４０１、
   大腸菌に１２ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＯＪ４０２、または
   大腸菌Ｋ１２ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＯＪ４０５である請
   求項９記載の形質転換宿主細胞。 １１、１またはそれ以上の宿主細胞制限系を迂回するた
   めにベクターを用いる方法であって、ａ）該ベクターの
   一本鎖ＤＮＡを調製し、 ｂ）工程ａ）で調製したＤＮＡでアクチノマイセス宿主
   細胞を形質転換することからなる方法。 １２、該ベクターがｐＯＪ４０１、ｐＯＪ４０２または
   ｐＯＪ４０５からなる群から選択されるファスミドシャ
   トルベクターである請求項１１記載の方法。