JPS6091984A - 新規プラスミドベクタ− - Google Patents
新規プラスミドベクタ−Info
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- JPS6091984A JPS6091984A JP58198043A JP19804383A JPS6091984A JP S6091984 A JPS6091984 A JP S6091984A JP 58198043 A JP58198043 A JP 58198043A JP 19804383 A JP19804383 A JP 19804383A JP S6091984 A JPS6091984 A JP S6091984A
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- Japan
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- phage
- plasmid
- plasmid vector
- promoter
- dna
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
さらに詳しくは、本発明はへルパーファージの重感染に
より一本釦ファーシ様粒子としてパノケージされるプラ
スミドベクターに関する。本発明の新規ベクターは所望
の遺伝子を容易に組込むことができ、さらに一旦挿入し
た遺伝子を所望により容易に再配置することができると
いう利点を有すクローン化した遺伝子を発現させるため
には、ベクターのもつ遺伝子発現の為の情報に係るＤＮ
Ａ配列を最適の位置で連結させる必要がある。たとえば
、ベクター側の翻訳開始コドンやシフナル配列への連結
に際しては、これらとの読取り枠（ｒｅａｄｉｎｇ ｆ
ｒａｍｅ ）を一致させねばならない。
より一本釦ファーシ様粒子としてパノケージされるプラ
スミドベクターに関する。本発明の新規ベクターは所望
の遺伝子を容易に組込むことができ、さらに一旦挿入し
た遺伝子を所望により容易に再配置することができると
いう利点を有すクローン化した遺伝子を発現させるため
には、ベクターのもつ遺伝子発現の為の情報に係るＤＮ
Ａ配列を最適の位置で連結させる必要がある。たとえば
、ベクター側の翻訳開始コドンやシフナル配列への連結
に際しては、これらとの読取り枠（ｒｅａｄｉｎｇ ｆ
ｒａｍｅ ）を一致させねばならない。
本出願人の先の出願（特願昭５７−１４７７２６＞に係
る発明の場合は、３通りの読取り枠で制限酵素切断配列
を有する３つ１組のベクター（Ｐｓｉベクター）を提供
した。このようなベクターを用いる方法では、連結に用
いる制限酵素に制約があり、また制限酵素部位を作るた
めに、たとえばシフナル配列Ｃ末端とクローン化した遺
伝子のＮ末端との間に、リンカ−由来のアミノ酸が挿入
される場合がある。
る発明の場合は、３通りの読取り枠で制限酵素切断配列
を有する３つ１組のベクター（Ｐｓｉベクター）を提供
した。このようなベクターを用いる方法では、連結に用
いる制限酵素に制約があり、また制限酵素部位を作るた
めに、たとえばシフナル配列Ｃ末端とクローン化した遺
伝子のＮ末端との間に、リンカ−由来のアミノ酸が挿入
される場合がある。
これらの難点を解消するために、構造遺伝子内部にある
制限酵素部位で切断してＮ末端領域に相当する部位を除
去後、合成りＮＡを用いて発現情報と構造遺伝子との間
を埋めて連結する方法が開発され、ヒト生長ホルモンや
α−インターフェロンの生産に利用さている〔米国特許
４，３４２，８３２ ］。
制限酵素部位で切断してＮ末端領域に相当する部位を除
去後、合成りＮＡを用いて発現情報と構造遺伝子との間
を埋めて連結する方法が開発され、ヒト生長ホルモンや
α−インターフェロンの生産に利用さている〔米国特許
４，３４２，８３２ ］。
しかし、この方法では、少ｆｉくとも２本以上のオリゴ
ヌクレオチドを合成する必要があり、しかも切断する酵
素部位がＮ末端部位から離れるにつれてより長いオリゴ
ヌクレオチドを合成しなければならない。
ヌクレオチドを合成する必要があり、しかも切断する酵
素部位がＮ末端部位から離れるにつれてより長いオリゴ
ヌクレオチドを合成しなければならない。
上記方法に代わる方法としては、Ｗａｌｌａｃｅ らの
方法［Ｒ，Ｂ、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ、、５ｃｉ
ｅｎｃｅ ２０９ 。
方法［Ｒ，Ｂ、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ、、５ｃｉ
ｅｎｃｅ ２０９ 。
１３９６−１４００．（１９８０）：］がある。この方
法は、オリゴヌクレオチドによる部位特異的欠失法（Ｄ
Ｉ ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ
５ｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆ １ｃｄｅｌｅｔｉｏｎ ）と
して知られており、上記文献には、酵母ｔＲＮ△のｃＤ
ＮΔがら介在配列を欠失させた例が開示されている。す
なわち、まずプラスミドのｃｃｃＤＮΔ （ｃｏｖａｌ
ｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒＤＮＡ）
をエチジウムブロマイド存在下で制限酵素により部分分
解し−Ｃニック（ｎｉｃｋ）を入れ、エキソヌクレアー
ゼＩＩ＋で一本鎖環状ＤＮＡを調製する。これを鋳型に
して欠失を起こさせたい部分の両側と相補的な２１−ｍ
ａｒの合成オリゴヌクレオチドを合成し、これをプライ
マーとするインビトロ（ｉｎ ｖｉＬｒｏ ） ｆ）Ｎ
Δ合成と連結（ｌ ｉｇａｔ ｉｏｎ ）によりヘテロ
デュプレックスとする。これを大腸菌に形質転換し、複
製による変異の分離を行わせた後、プラスミドＤＮＡ混
合物を抽出し、再形質転換により変異プラスミドを純化
して、３２Ｐ標識したプライマーと会合するクローンと
して変異プラスミド保有株を選択する。
法は、オリゴヌクレオチドによる部位特異的欠失法（Ｄ
Ｉ ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ
５ｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆ １ｃｄｅｌｅｔｉｏｎ ）と
して知られており、上記文献には、酵母ｔＲＮ△のｃＤ
ＮΔがら介在配列を欠失させた例が開示されている。す
なわち、まずプラスミドのｃｃｃＤＮΔ （ｃｏｖａｌ
ｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒＤＮＡ）
をエチジウムブロマイド存在下で制限酵素により部分分
解し−Ｃニック（ｎｉｃｋ）を入れ、エキソヌクレアー
ゼＩＩ＋で一本鎖環状ＤＮＡを調製する。これを鋳型に
して欠失を起こさせたい部分の両側と相補的な２１−ｍ
ａｒの合成オリゴヌクレオチドを合成し、これをプライ
マーとするインビトロ（ｉｎ ｖｉＬｒｏ ） ｆ）Ｎ
Δ合成と連結（ｌ ｉｇａｔ ｉｏｎ ）によりヘテロ
デュプレックスとする。これを大腸菌に形質転換し、複
製による変異の分離を行わせた後、プラスミドＤＮＡ混
合物を抽出し、再形質転換により変異プラスミドを純化
して、３２Ｐ標識したプライマーと会合するクローンと
して変異プラスミド保有株を選択する。
この方法では、必要とする合成りＮＡは２０−ｍｅｒ前
後のオリゴヌクレオチドが一木でよく、これがプライマ
ーとしてもプローブとしても利用でき、また欠失の位置
は制限酵素部位などの制約をまったく受けないという利
点を有する。しかしこの方法のＩＩ点は、鋳型■）ＮＡ
の調製にある。すなわら、制限酵素による部分分解、エ
キソヌクレアー士ＩＩＩ処理、−木釦ＤＮ△精製などが
繁雑かつ微妙であるので、プラスミドが大型になるほど
調製が困難になる。−木用ファージベクターにタブクロ
ーン化後、−木ｔＩ！ＩＤＮへを調製することも可能で
あるが、大きなりＮＡ断片をクローン化した場合の自然
欠失の多発や、ファージのハーストザイズ（ｂｕｒｓｔ
、 ５ｉｚｅ）の低下などの障害がある。
後のオリゴヌクレオチドが一木でよく、これがプライマ
ーとしてもプローブとしても利用でき、また欠失の位置
は制限酵素部位などの制約をまったく受けないという利
点を有する。しかしこの方法のＩＩ点は、鋳型■）ＮＡ
の調製にある。すなわら、制限酵素による部分分解、エ
キソヌクレアー士ＩＩＩ処理、−木釦ＤＮ△精製などが
繁雑かつ微妙であるので、プラスミドが大型になるほど
調製が困難になる。−木用ファージベクターにタブクロ
ーン化後、−木ｔＩ！ＩＤＮへを調製することも可能で
あるが、大きなりＮＡ断片をクローン化した場合の自然
欠失の多発や、ファージのハーストザイズ（ｂｕｒｓｔ
、 ５ｉｚｅ）の低下などの障害がある。
本発明考らは、このガ（点を解決するために研究した結
果、ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ ｐｌ＋ａｇｅ
）の重感染により一本鎖ファージ様粒子としてパッケー
ジ（ｐａｃｋｄｇｅ ）されうるプラスミドベクターを
開発し本発明を冗成し、た。
果、ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ ｐｌ＋ａｇｅ
）の重感染により一本鎖ファージ様粒子としてパッケー
ジ（ｐａｃｋｄｇｅ ）されうるプラスミドベクターを
開発し本発明を冗成し、た。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明は、ヘルパーファージの重感染により一本鎖ファ
ージ様粒子としてパッケージされつるプラスミドベクタ
ーを提供する。
ージ様粒子としてパッケージされつるプラスミドベクタ
ーを提供する。
本発明のプラスミドベクターは、−木用線状ファージＤ
ＮＡに存在する、Ｃ−鎮（相補鎖）ＤＮＡＭＩ製のオリ
ジン（開始点）、Ｖｌｎ（ウィルス鎮）１）ＮΔ複製の
オリジンおよびパッケージングのオリジンの３つより成
る、−木用線状ファージの増殖に必須な塩基配列（この
領域を、ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｆｉｌａｍ
ｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅｎｃｓｓを略記し−Ｃ８ｆｐ
領域と命名する）を含む断片を発現ベクターに組込むこ
とにより造成することができる。
ＮＡに存在する、Ｃ−鎮（相補鎖）ＤＮＡＭＩ製のオリ
ジン（開始点）、Ｖｌｎ（ウィルス鎮）１）ＮΔ複製の
オリジンおよびパッケージングのオリジンの３つより成
る、−木用線状ファージの増殖に必須な塩基配列（この
領域を、ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｆｉｌａｍ
ｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅｎｃｓｓを略記し−Ｃ８ｆｐ
領域と命名する）を含む断片を発現ベクターに組込むこ
とにより造成することができる。
−木鎮線状ファージとしては、いがなるものも用い得る
が、具体的に好適な例としては、ｆｌ。
が、具体的に好適な例としては、ｆｌ。
ｆｃｌ、Ｍ１３などがあげられる。これらファーシンは
実質的に等価で、Ｍ１３とｆｄ、ｆｌｃ！：ｆ（１はい
ずれも９７％塩基配列が一致している。これらのファー
ジのｓｆｐ領域、ずなわら（ニー鎮１つＮ△複製〕；４
− ＩＪ シン、Ｖ−鎮ＤＮΔ複製のヌリシンＪりよび
パッケージングのオリジンは、ずべ−にれらのファージ
の遺伝子開領域（ｉｎＬｅｒｇｃｎｉｃ ｒｅｇｉｏｎ
）にまとまゲＣおり、部位５４８９−５８６８に含ま
れている［１１ｃｃｋ＆Ｚｉｎｋ、ｌ ９８１ 、 Ｇ
ｅｎｅ ｌ Ｇ 。
実質的に等価で、Ｍ１３とｆｄ、ｆｌｃ！：ｆ（１はい
ずれも９７％塩基配列が一致している。これらのファー
ジのｓｆｐ領域、ずなわら（ニー鎮１つＮ△複製〕；４
− ＩＪ シン、Ｖ−鎮ＤＮΔ複製のヌリシンＪりよび
パッケージングのオリジンは、ずべ−にれらのファージ
の遺伝子開領域（ｉｎＬｅｒｇｃｎｉｃ ｒｅｇｉｏｎ
）にまとまゲＣおり、部位５４８９−５８６８に含ま
れている［１１ｃｃｋ＆Ｚｉｎｋ、ｌ ９８１ 、 Ｇ
ｅｎｅ ｌ Ｇ 。
３５−３８］。
発現ベクターとしては、外来遺伝子の転写、翻訳１分泌
などの情報を含むベクターであればいがなるベクターら
用いることができる。さらに、これら情報の下流に所望
の外来遺伝子を挿入するた約の一部の制限酵素切断部位
を有するベクターであれば、なお有利に使うことができ
る。
などの情報を含むベクターであればいがなるベクターら
用いることができる。さらに、これら情報の下流に所望
の外来遺伝子を挿入するた約の一部の制限酵素切断部位
を有するベクターであれば、なお有利に使うことができ
る。
発現ベクターとしては、た２えば大腸菌のトリプトファ
ンオペロンのプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ラクトースオ
ペロンのプロモーター（Ｐｌａｃ） 、 Ｒｅｃへのプ
ロモーターなどを保有する発現ベクター〔中村研三、化
学と生物１世、４７〜５８（１９８２）］。
ンオペロンのプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ラクトースオ
ペロンのプロモーター（Ｐｌａｃ） 、 Ｒｅｃへのプ
ロモーターなどを保有する発現ベクター〔中村研三、化
学と生物１世、４７〜５８（１９８２）］。
大腸菌のリポプロティンのプロモーター（Ｐｌｐｐ ）
（同上文献）、アルカリホスファターゼのプロモーター
（ＰｐｈｏＡ ） 〔菊池ら、 Ａｇｒｉ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、。
（同上文献）、アルカリホスファターゼのプロモーター
（ＰｐｈｏＡ ） 〔菊池ら、 Ａｇｒｉ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、。
４５．２４０１〜２４０２（１９８１）’］などを保有
する発現１分泌ベクターが用いられる。
する発現１分泌ベクターが用いられる。
具体的に好適な発現ベクターとして、実施例においては
、ｐｈｏＡプロモーターを含む発現１分泌ベクターｐＴ
Δ５２９（特願昭５８−１４０７４８）を用いているが
、はぼ同様の方法でほかのベクターも用いることができ
る。
、ｐｈｏＡプロモーターを含む発現１分泌ベクターｐＴ
Δ５２９（特願昭５８−１４０７４８）を用いているが
、はぼ同様の方法でほかのベクターも用いることができ
る。
制限酵素切断部位を有するベクターとしては、制限部位
を有する既存の発現ベクターまたは発現ベクターにリン
カ−を導入して得られるベクターが用いられる。種々の
制限断片の挿入を可能にするためには、多くの制限部位
ゆ１らなる多リンカー配列（ｍｕｌｔｉｌｉｎｋｅｒ
５ｅｑｕｅｎｃｅ）を利用するのが好適である。具体的
に好適な例として、実施例においてはＭ１３ｍｐｌＯ複
製型（ＲＦ）ＤＮＡを用いるが、その他の多リンカー配
列も同様に用いることができる。
を有する既存の発現ベクターまたは発現ベクターにリン
カ−を導入して得られるベクターが用いられる。種々の
制限断片の挿入を可能にするためには、多くの制限部位
ゆ１らなる多リンカー配列（ｍｕｌｔｉｌｉｎｋｅｒ
５ｅｑｕｅｎｃｅ）を利用するのが好適である。具体的
に好適な例として、実施例においてはＭ１３ｍｐｌＯ複
製型（ＲＦ）ＤＮＡを用いるが、その他の多リンカー配
列も同様に用いることができる。
以下、本発明のプラスミドベクターの造成方法について
具体的に記載する。
具体的に記載する。
ｐＴＡ５２９のシグナル配列の直後へのＭ１３ｍρ１０
ＲＦ−１つＮＡの有する多リンカー配列導入。
ＲＦ−１つＮＡの有する多リンカー配列導入。
Ｍ １３ｍｐ １０ＲＦ−ＤＮＡを適当な制限酵素の組
合せで切断して多リンカー配列を切り出し、ｐＴ八へ
２９に導入する。例えば、Ｍ１３ｍｐｌＯＲＦ−ＤＮＡ
をＩ−１ｉ ｎ ｄ ＩＩＩとＥｃｏＲＩて二重消化す
ると、多リンカー配列を含んだ４５ベースペア（ｂｐ）
の断片が生ずる。これをポリアクリルアミドゲル電気泳
動により単離し、同様に二重消化したプラスミドｐＴＡ
５２９の大きい方の断片［２３６キロベース（ｋｂ）］
とＴ４リガーセで連結することによりプラスミドｐＹＫ
３１４を得る。第１図参照。
合せで切断して多リンカー配列を切り出し、ｐＴ八へ
２９に導入する。例えば、Ｍ１３ｍｐｌＯＲＦ−ＤＮＡ
をＩ−１ｉ ｎ ｄ ＩＩＩとＥｃｏＲＩて二重消化す
ると、多リンカー配列を含んだ４５ベースペア（ｂｐ）
の断片が生ずる。これをポリアクリルアミドゲル電気泳
動により単離し、同様に二重消化したプラスミドｐＴＡ
５２９の大きい方の断片［２３６キロベース（ｋｂ）］
とＴ４リガーセで連結することによりプラスミドｐＹＫ
３１４を得る。第１図参照。
プラスミドｐＹＫ３１４を直接以下の造成過程に用いる
こともできるが、２箇所ある制限部位の削除を兼ねてｐ
ＹＫ３１４の小さい方の［１ｃｏＲＩ −ＰＶｕ■断片
ＧｐＢＲ３２２由来のものと交換しプラスミドｐＹＫ３
３０を得る。第２図参照。
こともできるが、２箇所ある制限部位の削除を兼ねてｐ
ＹＫ３１４の小さい方の［１ｃｏＲＩ −ＰＶｕ■断片
ＧｐＢＲ３２２由来のものと交換しプラスミドｐＹＫ３
３０を得る。第２図参照。
ｐＹＫ３３０への一本鎖ファーシのｓｆｐ領域の導入：
ｐＹＫ３３０に一本鎖線状ファージのｓｆ、ｐ領域、す
なわちＣ−鎮ＤＮΔ複製のオリジン、ｖ−釦ＤＮΔ複製
のオリジンおよびパッケージングのオリジンを含むＲｓ
ａ ｌ断片を挿入する。これらオリジンは全て遺伝子開
領域にまとまって部位５４８９−５８６８に在り、５１
４ｂｐのＲｓ ａ １断片は部位５４８７−６００１の
間の断片であるから、ｓｆｐ領域はＲｓａ ｌ断片に全
て含まれている。
なわちＣ−鎮ＤＮΔ複製のオリジン、ｖ−釦ＤＮΔ複製
のオリジンおよびパッケージングのオリジンを含むＲｓ
ａ ｌ断片を挿入する。これらオリジンは全て遺伝子開
領域にまとまって部位５４８９−５８６８に在り、５１
４ｂｐのＲｓ ａ １断片は部位５４８７−６００１の
間の断片であるから、ｓｆｐ領域はＲｓａ ｌ断片に全
て含まれている。
Ｒｓａ ｌ断片のｐＹＫ３３０への挿入は、ｐＹＫ３３
０の適当な制限部位を利用して、プラントエンド（旧ｕ
ｎｔ−ｅｎｄ ）またはコヘンブエンド（ｃｏｈｅ−ｓ
ｉｖｅ−ｅｎｄ ）で行われる。
０の適当な制限部位を利用して、プラントエンド（旧ｕ
ｎｔ−ｅｎｄ ）またはコヘンブエンド（ｃｏｈｅ−ｓ
ｉｖｅ−ｅｎｄ ）で行われる。
Ｒｓａ ｌ断片をｐＹＫ３３０に挿入した組換え体ＤＮ
Ａで大腸菌ＹＫ６６０ （Ｆ１９６” ）を形質転換し
、得られた形質転換株に野性型ｆｄまたはｆ１ファージ
を感染させれば、目的の一本ｔｉＪ！ｌ環状のｐＹＫ３
３１．ｐＹＫ３３２．およびｐＹＫ３３３が得られる。
Ａで大腸菌ＹＫ６６０ （Ｆ１９６” ）を形質転換し
、得られた形質転換株に野性型ｆｄまたはｆ１ファージ
を感染させれば、目的の一本ｔｉＪ！ｌ環状のｐＹＫ３
３１．ｐＹＫ３３２．およびｐＹＫ３３３が得られる。
第３図参照。
ｐＹＫ３３１およびｐＹＫ３３２を制限酵素処理後、ア
ガロースゲル電気泳動で解析した結果、両者は異なるプ
ラスミドＤＮＡ鎮由来で互に一部を除き相補的であるこ
とがわかった。またｐＹＫ３３１とｐＹＫ３３３は同一
の構造であった。
ガロースゲル電気泳動で解析した結果、両者は異なるプ
ラスミドＤＮＡ鎮由来で互に一部を除き相補的であるこ
とがわかった。またｐＹＫ３３１とｐＹＫ３３３は同一
の構造であった。
ｐＹＫ３３１．ｐＹＫ３３２およびｐＹＫ３３３は本発
明の具体的プラスミドベクターの例である。これらのプ
ラスミドベクターに所望の遺伝子を挿入し、形質転換後
、−木調環状ＤＮＡとして回収したものは、適当な合成
オリゴヌクレオチドを用いる部位特異的欠失（ｓｉｔｅ
−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｌｅ−ｔｉｏｎ）法により転
写、翻訳１分泌に関与する配列に対し挿入遺伝子の位置
を再８周整するための鋳型として用いることができる。
明の具体的プラスミドベクターの例である。これらのプ
ラスミドベクターに所望の遺伝子を挿入し、形質転換後
、−木調環状ＤＮＡとして回収したものは、適当な合成
オリゴヌクレオチドを用いる部位特異的欠失（ｓｉｔｅ
−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｌｅ−ｔｉｏｎ）法により転
写、翻訳１分泌に関与する配列に対し挿入遺伝子の位置
を再８周整するための鋳型として用いることができる。
従って本発明のプラスミドベクターを用いれば、合成り
ＮＡの継ぎ手などを用いることなく所望の遺伝子を転写
、 Ｉ！＋］］訳。
ＮＡの継ぎ手などを用いることなく所望の遺伝子を転写
、 Ｉ！＋］］訳。
分泌プエとの諸機能が最大に発揮されるように再配置す
ることが可能である。再配置のための一般的方法は下記
のとおりである。
ることが可能である。再配置のための一般的方法は下記
のとおりである。
１、 目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、本発明プラスミ
ドベクターの多リンカー配列の適当な位置に挿入した組
換え体を宿主微生物に導入して形質転換株を得る。形質
転換株の一次選択にはアンピシリンｉ１性（ΔｐＲ）な
どを用いる。
ドベクターの多リンカー配列の適当な位置に挿入した組
換え体を宿主微生物に導入して形質転換株を得る。形質
転換株の一次選択にはアンピシリンｉ１性（ΔｐＲ）な
どを用いる。
２、形質転換株から組換え体を取り出して制限酵素地図
を作製し、目的遺伝子の挿入方向を確認する。
を作製し、目的遺伝子の挿入方向を確認する。
３、組換え体をＦｌの大腸菌に形質転換で導入する。形
質転換株はＡｐＲで選ぶ。
質転換株はＡｐＲで選ぶ。
４、形質転換株に野性型ｆｄ（または１１．Ｍ１３）フ
ァージを感染させ、増殖させる。
ァージを感染させ、増殖させる。
５、 培養土浦中のファージ粒子をポリエチレングリコ
ールにより沈殿せしめ、濃縮後、フェノール抽出で除蛋
白し、−木鎮ＤＮへを肖る。
ールにより沈殿せしめ、濃縮後、フェノール抽出で除蛋
白し、−木鎮ＤＮへを肖る。
ＣΔ ＢＤ
目的に応じ欠失の基点、終点く上図ではΔ。
Ｂ）を決め、それぞれに隣接する配列Ｃ−Δ。
Ｂ−Ｄ（６ｂｐ以上）に相捕的な一木の連結したｃＩ）
ＮΔを合成し、５′末端を△ｉ’ Ｐとポリヌクレオチ
ドキナ−セを用いてリン酸化してプライマーとする。
ＮΔを合成し、５′末端を△ｉ’ Ｐとポリヌクレオチ
ドキナ−セを用いてリン酸化してプライマーとする。
７、 目的遺伝子を含む組換え体を含む一本ｆｉｎ Ｄ
Ｎへの混合物に上記プライマーを加え、１００℃１分
間加熱し、放冷し、４つのチオキンリボヌクレオチド−
３−リン酸、Ａ Ｔ Ｐ 、ジチオスレイトール、大腸
菌ＤＮＡポ、リメラーセＩのＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍ
ｅｎｔ ＳＴ ４ 、Ｄ ＮＡリガ−セとともにポリマ
ー化緩衝液に加え、インキュベートして閉環二重鎖ＤＮ
Ａを形成せしめる。
Ｎへの混合物に上記プライマーを加え、１００℃１分
間加熱し、放冷し、４つのチオキンリボヌクレオチド−
３−リン酸、Ａ Ｔ Ｐ 、ジチオスレイトール、大腸
菌ＤＮＡポ、リメラーセＩのＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍ
ｅｎｔ ＳＴ ４ 、Ｄ ＮＡリガ−セとともにポリマ
ー化緩衝液に加え、インキュベートして閉環二重鎖ＤＮ
Ａを形成せしめる。
８、上記閉環二重鎖Ｄ Ｎ Ａを含む反応混合物を用い
て大腸菌Ｆ−株を形質転換し、Ａｐ Ｒ株を選択する。
て大腸菌Ｆ−株を形質転換し、Ａｐ Ｒ株を選択する。
９、適当数の形質転換株を混ぜて、プラスミドをラピッ
ドメソッド（ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ） ［１１０，
ＢｉｒｎｂｏｉｍｅＬａｌ、Ｎｕｃｌｃｉｃ 八ｃｉｄ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ？ ＋５１３ （１ｉ１７９）
〕で抽出する。これを欠失部分に存在する制限酵素で完
全分解し、元のプラスミドの混入を防いで欠失株の頻度
を高めるため再形質転換を行う。
ドメソッド（ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ） ［１１０，
ＢｉｒｎｂｏｉｍｅＬａｌ、Ｎｕｃｌｃｉｃ 八ｃｉｄ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ？ ＋５１３ （１ｉ１７９）
〕で抽出する。これを欠失部分に存在する制限酵素で完
全分解し、元のプラスミドの混入を防いで欠失株の頻度
を高めるため再形質転換を行う。
形質転換株は八■）ｌｌに−Ｃ選択する。
１０、上記合成プライマーを” Ｐ Ｏ，で標識したも
のをプロニブとして、欠失を有する夕Ｄ−ンをコロニー
ハイブリダイゼーション法で検出、分離、純化する。
のをプロニブとして、欠失を有する夕Ｄ−ンをコロニー
ハイブリダイゼーション法で検出、分離、純化する。
以上のごとくして得たプラスミドの性質を調べ目的どお
り再配置ができたかどうかを判定する。
り再配置ができたかどうかを判定する。
目的を達しなかった場合には、プライマーを造りかえ、
目的を達成するまで、」−記の操作を繰返せば良い。
目的を達成するまで、」−記の操作を繰返せば良い。
上述の操作は、ｐｈｏΔプロモーターを含むｐＹＫ３３
１．３３２および３３３を用いて行うことができるが、
またｐｈｏＡプロモーター、ｌａｃプロモーター両方を
含むプラスミドｐＹＫ３３５およびｐＹＫ３３６を用い
ても同様に実施することができる。
１．３３２および３３３を用いて行うことができるが、
またｐｈｏＡプロモーター、ｌａｃプロモーター両方を
含むプラスミドｐＹＫ３３５およびｐＹＫ３３６を用い
ても同様に実施することができる。
ｐＹＫ３３５は、ｐＹＫ３３１とｌａｃプロ％−ターを
含むプラスミドｐＢＨ２０をそれぞれＥｃｏＲＩとｐｖ
ｕｌで二重消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、
前者からのｐ ｈ ｏΔプロモーター含有断片と後者か
らのｌａｃプロモーター含有断片を１゛４リガーセ用い
て連結して得られる。ｐＹＫ３３１に替えてｐＹＫ３３
２を用いて同様に処理ずれば、ｐＹＫ３３６が得られる
。
含むプラスミドｐＢＨ２０をそれぞれＥｃｏＲＩとｐｖ
ｕｌで二重消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、
前者からのｐ ｈ ｏΔプロモーター含有断片と後者か
らのｌａｃプロモーター含有断片を１゛４リガーセ用い
て連結して得られる。ｐＹＫ３３１に替えてｐＹＫ３３
２を用いて同様に処理ずれば、ｐＹＫ３３６が得られる
。
ｒ＋ＹＫ３３５およびｐＹＫ３３６の造成ならびに制限
酵素地図を第４図に示す。
酵素地図を第４図に示す。
以下本発明の実施例を示す。
実施例１゜
（１）多リンカー配列（ｍｕｌｔｉｌｉｎｋｅｒ ５ｅ
ｑｕｅｎｃｅ）のψ−ベクターへの導入・ 多リンカー配列はＭ１３ｍｐｌ ０ＲＦ−ＩＮＮ／（和
光純薬工業社製）５０μｇをＨｉ ｎ ｄ ＩＩＩとＥ
ｃｏＲＩ （以上２酵素は宝酒造社製）により二重消化
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により４５ベース
ベア（ｂｐ）の断片を単離して調製した。消化反応は１
００単位の各酵素を含む緩衝液［７ｍＭ）リスヒドロキ
シメチルアミノメタ７ （Ｔｒ ｉ ５）−１−（Ｃ１
ｉ （ｐ１４７．４＞、７ ｍ Ｍ Ｍ ｇ ＣＲ２，
７ｍ Ｍ ２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｊ！］ ５００μＡ中３７℃で１時間行う。１００１
１ｆＶ、の反応停止液［５０ｍＭ ＥＤＴΔ、０．１％
ブｏモア、ノールブルー（ＢＰＢ）、５％フィコール（
１’１ｃｏｌｌ）４００ （ファルマシア・ファイン・
ケミカルズ社製）ｐ＋（７，６）を加え７０℃で５分間
加熱して反応を停止させた。電気泳動は、１０％ポリア
クリルアミドゲルを用い、４０ｍＭ）’Ｊスス−セテー
）（＋）Ｈ７，８）および１ｍＭ Ｆ、ＤＴΔを含む泳
動用緩衝液中で２０ｍＡ電流下、１５分間泳動した。泳
動後ゲルを０．５μｇ ／＋ｒ＋ｌのエチジウムブロマ
イドで１０分間染色し、先端のＢＰＢより少し上のバン
ドを切り出した。平坦なスパーチルを用いガラス板」二
で切り出したゲルを磨砕した後、５ｍｌのＤＮＡ溶出液
〔５００１ｍＭ酢酸アンモニウム、１０ｍＭ酢酸マグネ
シウム、（１，ｌ ＩＴＩ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ△、０１％
ドデシル硫酸ナトリウ１．（ＳＤＳ）］に懸濁し、３７
℃で２時間振盪しながら抽出した。−ヒ澄を０．２２μ
のメンブレンフィルター（ミリホモ′社製）で濾過し、
５ｅｃ−ブタノールで約０５ｍ１まで濃縮した。濃縮後
にエタノール液 （１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム、
０．１Ｍ酢酸マグネシウムおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを補
助剤として含む）を加え一４０℃で３０分間放置した。
ｑｕｅｎｃｅ）のψ−ベクターへの導入・ 多リンカー配列はＭ１３ｍｐｌ ０ＲＦ−ＩＮＮ／（和
光純薬工業社製）５０μｇをＨｉ ｎ ｄ ＩＩＩとＥ
ｃｏＲＩ （以上２酵素は宝酒造社製）により二重消化
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により４５ベース
ベア（ｂｐ）の断片を単離して調製した。消化反応は１
００単位の各酵素を含む緩衝液［７ｍＭ）リスヒドロキ
シメチルアミノメタ７ （Ｔｒ ｉ ５）−１−（Ｃ１
ｉ （ｐ１４７．４＞、７ ｍ Ｍ Ｍ ｇ ＣＲ２，
７ｍ Ｍ ２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｊ！］ ５００μＡ中３７℃で１時間行う。１００１
１ｆＶ、の反応停止液［５０ｍＭ ＥＤＴΔ、０．１％
ブｏモア、ノールブルー（ＢＰＢ）、５％フィコール（
１’１ｃｏｌｌ）４００ （ファルマシア・ファイン・
ケミカルズ社製）ｐ＋（７，６）を加え７０℃で５分間
加熱して反応を停止させた。電気泳動は、１０％ポリア
クリルアミドゲルを用い、４０ｍＭ）’Ｊスス−セテー
）（＋）Ｈ７，８）および１ｍＭ Ｆ、ＤＴΔを含む泳
動用緩衝液中で２０ｍＡ電流下、１５分間泳動した。泳
動後ゲルを０．５μｇ ／＋ｒ＋ｌのエチジウムブロマ
イドで１０分間染色し、先端のＢＰＢより少し上のバン
ドを切り出した。平坦なスパーチルを用いガラス板」二
で切り出したゲルを磨砕した後、５ｍｌのＤＮＡ溶出液
〔５００１ｍＭ酢酸アンモニウム、１０ｍＭ酢酸マグネ
シウム、（１，ｌ ＩＴＩ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ△、０１％
ドデシル硫酸ナトリウ１．（ＳＤＳ）］に懸濁し、３７
℃で２時間振盪しながら抽出した。−ヒ澄を０．２２μ
のメンブレンフィルター（ミリホモ′社製）で濾過し、
５ｅｃ−ブタノールで約０５ｍ１まで濃縮した。濃縮後
にエタノール液 （１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム、
０．１Ｍ酢酸マグネシウムおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを補
助剤として含む）を加え一４０℃で３０分間放置した。
生成したＤＮＡの沈殿を９５％エタノール次いでエチル
エーテルで洗い、室温で乾燥後、５０μｌの’ＦＥＳ緩
衝液［：０．０３Ｍ Ｔｒｉｓ、Ｏ，ｔｌ ０５ＭＥＤ
Ｔ Δ、 ０．０５Ｍ ＮａＣ，ｉ！ 、 ｐ ト］
８． Ｏ：］に溶解した。このＤＮＡはＭ１３ｍｐｌＯ
由来の４５ｂｐの断片を含む。
エーテルで洗い、室温で乾燥後、５０μｌの’ＦＥＳ緩
衝液［：０．０３Ｍ Ｔｒｉｓ、Ｏ，ｔｌ ０５ＭＥＤ
Ｔ Δ、 ０．０５Ｍ ＮａＣ，ｉ！ 、 ｐ ト］
８． Ｏ：］に溶解した。このＤＮＡはＭ１３ｍｐｌＯ
由来の４５ｂｐの断片を含む。
一方、ψベクターの一つであるプラスミドｐＴΔ５２９
をその保有菌株大腸菌（特願昭５８−１４０７４８＞か
らＡ、Ｃｏ ｌ ｅｍａｎらの方法ＣＢｕｒｏｐｅａｎ
Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９１．３０３−３
１０、（１９７８）：］に従って調製した。
をその保有菌株大腸菌（特願昭５８−１４０７４８＞か
らＡ、Ｃｏ ｌ ｅｍａｎらの方法ＣＢｕｒｏｐｅａｎ
Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９１．３０３−３
１０、（１９７８）：］に従って調製した。
ｐＴΔ５２９ ５０Ａ１ｇを上記と同様にＥｃｏＲＩと
ｌ（ｉ ｎ ｄ ＩＩＩにより二重消化し、２．３６キ
ロベースペア（Ｋｂ）の断片をアガロースゲル電気泳動
により単離した。アガロースゲル電気泳動は１．０％の
アガロースゲル（２０Ｘ１５ＸＯ，５ｃｍ ）を用い、
１５０ボルトで２時間電気泳動〔緩衝液 ４０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−酢酸（ｐ Ｈ７、８） ：Ｉにかけ、ついで０
．５μｇ ／ｍｌのエチジウムブロマイドで５〜１０分
間染色する。染色後、紫外線照射下で当該２．３６ Ｋ
ｂ断片を含む部分を切り出し、パラフィルムに包んで
一４０℃、３０分間凍らせた。指で軽く押さえ、浸み出
してきた液をパラフィルムの隙間からエッペンドルフチ
ューブ内に滴下せしめ回収した。この液を上記と同様に
エタノール処理し、ＤＮＡを沈殿として回収した。この
沈殿をエーテル処理後、風乾してＴ Ｅ Ｓ緩衝液０．
１ｍｌに溶解した。
ｌ（ｉ ｎ ｄ ＩＩＩにより二重消化し、２．３６キ
ロベースペア（Ｋｂ）の断片をアガロースゲル電気泳動
により単離した。アガロースゲル電気泳動は１．０％の
アガロースゲル（２０Ｘ１５ＸＯ，５ｃｍ ）を用い、
１５０ボルトで２時間電気泳動〔緩衝液 ４０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−酢酸（ｐ Ｈ７、８） ：Ｉにかけ、ついで０
．５μｇ ／ｍｌのエチジウムブロマイドで５〜１０分
間染色する。染色後、紫外線照射下で当該２．３６ Ｋ
ｂ断片を含む部分を切り出し、パラフィルムに包んで
一４０℃、３０分間凍らせた。指で軽く押さえ、浸み出
してきた液をパラフィルムの隙間からエッペンドルフチ
ューブ内に滴下せしめ回収した。この液を上記と同様に
エタノール処理し、ＤＮＡを沈殿として回収した。この
沈殿をエーテル処理後、風乾してＴ Ｅ Ｓ緩衝液０．
１ｍｌに溶解した。
次にＭ １３ ｍ ｐ １０由来の４５ｂｐのＤＮＡ断
片ｌμｇとｐＹＫ５２９由来の２．３ Ｋ ｂのＤＮＡ
断片２０μｇを共通の粘着末端を利用してＴ４１）ガー
ゼにより結合した。
片ｌμｇとｐＹＫ５２９由来の２．３ Ｋ ｂのＤＮＡ
断片２０μｇを共通の粘着末端を利用してＴ４１）ガー
ゼにより結合した。
連結反応は、Ｔ４リガ−セ（Ｎｅｗ ＩＥｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１０単位、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
Ｉ−１（、ｊ！ （ｐＨ７，６） 、 １０ｍＭ Ｍｇ
（、ｆ！ ２．１０ｍＭジチオスレイトールおよび０．
５ ｍ 、ＭＡＴＰの混液中２５℃で１時間反応させた
。反応後、大腸菌ＭＣ１０６１株（△ｌ１ａｃＺ）［Ｃ
ａ５ａｄａｂａｎ ｅｔ ａｔ、、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、、 １ ４ ３ 。
Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１０単位、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
Ｉ−１（、ｊ！ （ｐＨ７，６） 、 １０ｍＭ Ｍｇ
（、ｆ！ ２．１０ｍＭジチオスレイトールおよび０．
５ ｍ 、ＭＡＴＰの混液中２５℃で１時間反応させた
。反応後、大腸菌ＭＣ１０６１株（△ｌ１ａｃＺ）［Ｃ
ａ５ａｄａｂａｎ ｅｔ ａｔ、、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、、 １ ４ ３ 。
９７１−９８０ （１９８０）：ｌを連結反応混液を用
いて形質転換し、アンピシリン（Ａｐ）１００μｇ ／
ｍｌを含むブイヨン培地（栄研化学社製）でアンピシリ
ン抵抗性（ＡｐＲ）株を選択した。形質転換はＭａｎｄ
ｅｌとＨｉｇａの方法ＣＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．，５３
．１５９（１９７０）’］に準じて行った。
いて形質転換し、アンピシリン（Ａｐ）１００μｇ ／
ｍｌを含むブイヨン培地（栄研化学社製）でアンピシリ
ン抵抗性（ＡｐＲ）株を選択した。形質転換はＭａｎｄ
ｅｌとＨｉｇａの方法ＣＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．，５３
．１５９（１９７０）’］に準じて行った。
生じたＡｐ１１株を上記と同様に処理し−Ｃプラスミド
を調製し、該プラスミドを制限酵素処理後、アガロース
ゲル電気泳動により解析した。
を調製し、該プラスミドを制限酵素処理後、アガロース
ゲル電気泳動により解析した。
得られたΔｐＯ，株の一株は、第１図に示す目的の構造
のプラスミド（２，３６Ｋｂ）を含有し、このプラスミ
ドをｐＹＫ３１４とタイマ１けた。
のプラスミド（２，３６Ｋｂ）を含有し、このプラスミ
ドをｐＹＫ３１４とタイマ１けた。
（２） ｐ Ｙ Ｋ ３１４からｐＹＫ３３０の造成・
プラスミドｐＹＫ３１４は、制限酵素ＳｍａＩ切断部位
く以下単にＳｍａ１部位のように略称する）と）３μｍ
８１部位が２個所ずつあり、またｐｈｏ八由への配列と
β−ラクタマーセ遺伝子の間がプラスミドｐΔＣＹＣ１
７７由来であるので、両切断部位を１個所ずつにし、か
つｐΔＣＹＣ１７７由来のものをｐＢＲ３２２由来のも
のに変換するために以下の操作を行った。
プラスミドｐＹＫ３１４は、制限酵素ＳｍａＩ切断部位
く以下単にＳｍａ１部位のように略称する）と）３μｍ
８１部位が２個所ずつあり、またｐｈｏ八由への配列と
β−ラクタマーセ遺伝子の間がプラスミドｐΔＣＹＣ１
７７由来であるので、両切断部位を１個所ずつにし、か
つｐΔＣＹＣ１７７由来のものをｐＢＲ３２２由来のも
のに変換するために以下の操作を行った。
プラスミドｐＹＫ３１４は、その保有株より上記と同様
に調製した。得られたｐＹＫ３１４をＥＣ０ＲＩとｐｖ
ｕＩ（ベーリンガー・７ンハイム社製）で二重消化した
。消化反応は、ｐＹＫ３１４ＤＮＡ約ＩＯμｇを２００
μｐのＴＥＳ緩衡液に溶かし、２０μｌの制限反応液［
ニア０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆｌ（ｐＨ７，４）。
に調製した。得られたｐＹＫ３１４をＥＣ０ＲＩとｐｖ
ｕＩ（ベーリンガー・７ンハイム社製）で二重消化した
。消化反応は、ｐＹＫ３１４ＤＮＡ約ＩＯμｇを２００
μｐのＴＥＳ緩衡液に溶かし、２０μｌの制限反応液［
ニア０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆｌ（ｐＨ７，４）。
７０ ｍＭ ＭｇＣＲ２，７０ｍＭ ２−メルカプトエ
タノール゛〕を加え、ＮａＣｌ２を１００ｍＭになるよ
うに加え、さらに各制限酵素２５単位を加えて、３７℃
で６０分間反応させた。
タノール゛〕を加え、ＮａＣｌ２を１００ｍＭになるよ
うに加え、さらに各制限酵素２５単位を加えて、３７℃
で６０分間反応させた。
反応後、上記と同様にアガロースゲル電気泳動を行い、
大きい方の断片を単離した。
大きい方の断片を単離した。
一方ｐ ＢＲ３２２［：Ｂｏｌｉｖａｒ ｅｔ ａｌ、
、Ｇｅｎｅ、 ２ 。
、Ｇｅｎｅ、 ２ 。
９５ （１９７７）：］を同様に二重消化し、小さい方
の断片をアガロースゲル電気泳動により弔した。
の断片をアガロースゲル電気泳動により弔した。
ｐＹＫ３１４由来とｐＢＲ３２２山来の両断片を共通の
粘着末端を利用してｉ’ ４１Ｊガ−セを用いて連結し
た。大腸菌ＭＣ１０６１株を連結反応混液を用いて形質
転換し、Ａｐ１株を選択しゾこ。
粘着末端を利用してｉ’ ４１Ｊガ−セを用いて連結し
た。大腸菌ＭＣ１０６１株を連結反応混液を用いて形質
転換し、Ａｐ１株を選択しゾこ。
以上の操作は、全て前記と同様に行った。Ａｐ１株の保
有するプラスミドの構造を、適当な制限酵素を用い前記
と同様に調べ、目的の構造のプラスミドを冶する菌株を
得た。該プラスミドをｐＹＫ３３０と名イ（ｊけた（第
２図参照）。
有するプラスミドの構造を、適当な制限酵素を用い前記
と同様に調べ、目的の構造のプラスミドを冶する菌株を
得た。該プラスミドをｐＹＫ３３０と名イ（ｊけた（第
２図参照）。
ｐＹＫ３３０を含む大腸菌株はＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉＹＫ９６０（微工研条寄第３６８号）として
工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に昭和５８
年９月２６日付で寄託しである。
ｃｏｌｉＹＫ９６０（微工研条寄第３６８号）として
工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に昭和５８
年９月２６日付で寄託しである。
（３）−末鎖ＤＮＡファージ断片のｐＹＫ３３０へのク
ローニング： プラスミドｐＹＫ−３３０は、それを含有する菌株から
、上記と同様に調製した。得られたプラスミドをＰｖｕ
Ｉ［（ペーリンガー・マンハイム社製）で切断して線状
化した。反応は７ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，４）
、 ７ｍＭＭｇＣＬ 、１００ｍＭ ＮａＣｌ１および
７ｍＭメルカプトエタノールを含む２００μβの溶液中
でプラスミド約１０μｇを２５単位の酵素と３７℃で１
時間反応させることにより行った。
ローニング： プラスミドｐＹＫ−３３０は、それを含有する菌株から
、上記と同様に調製した。得られたプラスミドをＰｖｕ
Ｉ［（ペーリンガー・マンハイム社製）で切断して線状
化した。反応は７ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，４）
、 ７ｍＭＭｇＣＬ 、１００ｍＭ ＮａＣｌ１および
７ｍＭメルカプトエタノールを含む２００μβの溶液中
でプラスミド約１０μｇを２５単位の酵素と３７℃で１
時間反応させることにより行った。
一本領ＤＮＡファージｆ１の複製型ＤＮＡ（ｆｌＲＦ
ＤＮＡ）は以下のごとく調製した。
ＤＮＡ）は以下のごとく調製した。
大腸菌ＹＫ６６０ （Ｆ’）株を、ブイヨン培地ｌｆｌ
中、３７℃で振盪培養した。菌数が１０８７ｍ１に達し
たとき、ｆ１ファージをｏ、ｏｔ−ｏ、ｔｍ、ｏ、ｉ、
（ｉｎｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ １ｎｆｅｃｔ
ｉｏｎ ）でかけ、３７℃で一晩培養した。集菌後、プ
ラスミドの調製と同様の方法で７了−ジＤＮＡ （ｆ
ＩＲＦＤＮ八）を調製しｔこ。
中、３７℃で振盪培養した。菌数が１０８７ｍ１に達し
たとき、ｆ１ファージをｏ、ｏｔ−ｏ、ｔｍ、ｏ、ｉ、
（ｉｎｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ １ｎｆｅｃｔ
ｉｏｎ ）でかけ、３７℃で一晩培養した。集菌後、プ
ラスミドの調製と同様の方法で７了−ジＤＮＡ （ｆ
ＩＲＦＤＮ八）を調製しｔこ。
次にｆｌＲＦＤＮＡをＲｓａＩ（日本ジーン社製）で切
断し、５１４ＭのＤＮＡ断片をポリアクリル了ミドゲル
電気泳動により」１記と同様に分離した。Ｒｓａ Ｉの
反応は以下の条件で行った。すツマわち２５μｇのファ
ージＤＮＡを７ｍＭ Ｔｒｉｓ−１ｊｃβ（ｐＨ７，４
）、７ｍＭＭｇＣβ２．７ｍＭ２−メルカプトエタノー
ル中で５０単位のＲｓ ａ Ｉと３７℃で２時間反応さ
せ、反応液を上記と同様に停止させて５％ポリアクリル
アミドゲルを用い、５１４ｂｐの断片を単離した。
断し、５１４ＭのＤＮＡ断片をポリアクリル了ミドゲル
電気泳動により」１記と同様に分離した。Ｒｓａ Ｉの
反応は以下の条件で行った。すツマわち２５μｇのファ
ージＤＮＡを７ｍＭ Ｔｒｉｓ−１ｊｃβ（ｐＨ７，４
）、７ｍＭＭｇＣβ２．７ｍＭ２−メルカプトエタノー
ル中で５０単位のＲｓ ａ Ｉと３７℃で２時間反応さ
せ、反応液を上記と同様に停止させて５％ポリアクリル
アミドゲルを用い、５１４ｂｐの断片を単離した。
次に線状化したｐＹＫ３３０のＩＯμｇと−ｌニ記５
］ ４ ｂ ｐのｆｌＲＦＤＮΔ断片の１μｇとを２．
５単位の′１゛４リガーセを用い、２５℃で１時間反応
させて、プラントエンド結合で連結させた。反応を７０
℃、５分間の加熱で止めた後、ＰｖｕＩＩ処理により、
単に元のｐＹＫ３３０に戻ったものを破壊した。この反
応液を用い、大腸菌ＹＫ６６０ （Ｆ１９６）を形質転
換し、上記と同様にΔｐＲ形質転換株を選択した。連結
反応および形質転換は前記と同様に行い、Ｐｖｕ■処理
は、連結反応液にｐｖｕ１１２０単位を加え３７℃、６
０分間処理した。
］ ４ ｂ ｐのｆｌＲＦＤＮΔ断片の１μｇとを２．
５単位の′１゛４リガーセを用い、２５℃で１時間反応
させて、プラントエンド結合で連結させた。反応を７０
℃、５分間の加熱で止めた後、ＰｖｕＩＩ処理により、
単に元のｐＹＫ３３０に戻ったものを破壊した。この反
応液を用い、大腸菌ＹＫ６６０ （Ｆ１９６）を形質転
換し、上記と同様にΔｐＲ形質転換株を選択した。連結
反応および形質転換は前記と同様に行い、Ｐｖｕ■処理
は、連結反応液にｐｖｕ１１２０単位を加え３７℃、６
０分間処理した。
このΔｐ″形質転換株を約１０６個／ｍｌの［ｄ野性型
ウィルスと共に１ｍｌのブイヨン培地で３７℃、−晩培
養し、１５．００Ｏｒｐｍ、 ５分間遠心分離にかけ、
上清液を回収した。
ウィルスと共に１ｍｌのブイヨン培地で３７℃、−晩培
養し、１５．００Ｏｒｐｍ、 ５分間遠心分離にかけ、
上清液を回収した。
上清液に２．５Ｍ Ｎａ（１！および２０％ポリエチレ
ングリコール（Ｐ Ｅ’Ｇ ） ６．０００からなる水
溶液０．２ｍｌを加え、３０分間氷冷する。再び１５、
ＤＯ（ｌｒｐｍ、 ５分間遠心分離にかけ、沈殿部分
を回収して、１００μＢのＴＢＳ緩衝液に懸濁し、ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１％になるように
加え、２５℃で５分間放置後、１０倍容ｉｔのフェノー
ルで１回、１０倍容量のエーテルで２回抽出し、−木鎮
ファージＤＮＡ溶液を１舒だ。この溶液１０μｌをアガ
ロースゲル電気泳動にかけ、一本領ＤＮへの検出を行っ
た。
ングリコール（Ｐ Ｅ’Ｇ ） ６．０００からなる水
溶液０．２ｍｌを加え、３０分間氷冷する。再び１５、
ＤＯ（ｌｒｐｍ、 ５分間遠心分離にかけ、沈殿部分
を回収して、１００μＢのＴＢＳ緩衝液に懸濁し、ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１％になるように
加え、２５℃で５分間放置後、１０倍容ｉｔのフェノー
ルで１回、１０倍容量のエーテルで２回抽出し、−木鎮
ファージＤＮＡ溶液を１舒だ。この溶液１０μｌをアガ
ロースゲル電気泳動にかけ、一本領ＤＮへの検出を行っ
た。
ヘルパーとして加えた［ｄ野性型ウィルスの一本鎖１）
Ｎ Ａの他に小分子量のバンドを示した株を選択し、
さらにそれらが含むプラスミドを採取して構造の解析を
行った。こうして帰られた２つのプラスミドの構造は、
ｐＹＫ３３１およびｐＹＫ３３２として第３図に示した
とおりである。ｐＹＫ３３１とｐＹＫ３３２は、「１の
断片が逆向きに挿入された以外は同一の構造を有するも
のである。ｐＹＫ３３１．ｐＹＫ３３２を含む大腸菌菌
株は、それぞれＥｓｃｈｒ、ｒ １ｃｈｉａｃｏｌｉ
ＹＫ！Ｉ ６１ （微工研条寄第３６９号）。
Ｎ Ａの他に小分子量のバンドを示した株を選択し、
さらにそれらが含むプラスミドを採取して構造の解析を
行った。こうして帰られた２つのプラスミドの構造は、
ｐＹＫ３３１およびｐＹＫ３３２として第３図に示した
とおりである。ｐＹＫ３３１とｐＹＫ３３２は、「１の
断片が逆向きに挿入された以外は同一の構造を有するも
のである。ｐＹＫ３３１．ｐＹＫ３３２を含む大腸菌菌
株は、それぞれＥｓｃｈｒ、ｒ １ｃｈｉａｃｏｌｉ
ＹＫ！Ｉ ６１ （微工研条寄第３６９号）。
［４ｓｃｈｅｒｉｃｌ＋ｉａ ｃｏｌｉ Ｙ Ｋ ９６
２ （微工研第３７１号）とじで昭和５８年９月２６日
イ］で微工研に寄託しである。
２ （微工研第３７１号）とじで昭和５８年９月２６日
イ］で微工研に寄託しである。
ｐＹＫ３３１とｐＹＫ ３３２の一木用ＤＮΔが互いに
異なるプラスミドＤＮΔ鎖由来で互に相補的であること
が以下の実験で判った。
異なるプラスミドＤＮΔ鎖由来で互に相補的であること
が以下の実験で判った。
上記と同様に純化した各−木＃ＪＥＮＡ５μｌを両者い
っしょに２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！。
っしょに２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！。
７ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，１０ｍＭＮａＣＣ７＋
ｎＭ ２−メルカプトエタノール中で、１００ ｔ １
分間加熱後、放冷し、０８％アガロースゲル電気泳動に
かけた。この結果、ｐＹＫ３３１とｐＹＫ３３２を共存
させて加μも処理、放冷を行うと、分子量のより大きい
バンドの形成がみとめられ、その大きさから、２つのＤ
ＮＡの部分子ｆｉ？ｊ；ｔ （ｐａｒｔｉａｌ ｄｕｐ
ｌｅｘ）とその多重体（ｍｕｌｌ；ｉｍｅｒ ）が形成
されたと考えられる。
ｎＭ ２−メルカプトエタノール中で、１００ ｔ １
分間加熱後、放冷し、０８％アガロースゲル電気泳動に
かけた。この結果、ｐＹＫ３３１とｐＹＫ３３２を共存
させて加μも処理、放冷を行うと、分子量のより大きい
バンドの形成がみとめられ、その大きさから、２つのＤ
ＮＡの部分子ｆｉ？ｊ；ｔ （ｐａｒｔｉａｌ ｄｕｐ
ｌｅｘ）とその多重体（ｍｕｌｌ；ｉｍｅｒ ）が形成
されたと考えられる。
以」二の事実からｐＹＫ３３１どｐＹＫ３３２は互に異
なるｌｊＮΔ鎮由来の一本鎖ファージ様ＤＮＡであるこ
とがわかる。いずれのＤ Ｎ Ａ ｔｉｌｌを用いるの
が好ましいかは、欠失に必要な合成りＮＡの配列などに
より適宜決定される。
なるｌｊＮΔ鎮由来の一本鎖ファージ様ＤＮＡであるこ
とがわかる。いずれのＤ Ｎ Ａ ｔｉｌｌを用いるの
が好ましいかは、欠失に必要な合成りＮＡの配列などに
より適宜決定される。
（４） １．ａ ｃブロモ−ターを有する一本ｔａＤＮ
△ベクターの作成゛ ） 」１記プラスミドｐＹＫ３３］の１０μｇとｐＢＨ
２０［５ｃｉｅｎｃｅ 、１９８ 、１０５６−１０６
３１９７７＞ ］１０μｇをそれぞれ独立に制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ 、 ｒ’ｖｕ■で二重消化し、ｐＹＫ３３１
からは大きな方の断片を、ｐＢＩ（２０からは小さい方
の断片をアガロースゲル電気泳動で単離した。両断片を
Ｔ ４ Ｕガーセ２５単位を用いて連結し、連結反応液
を用いて大腸菌ＹＫ６６０を形質転換して上記と同様に
ＡｐＲ株を選択した。
△ベクターの作成゛ ） 」１記プラスミドｐＹＫ３３］の１０μｇとｐＢＨ
２０［５ｃｉｅｎｃｅ 、１９８ 、１０５６−１０６
３１９７７＞ ］１０μｇをそれぞれ独立に制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ 、 ｒ’ｖｕ■で二重消化し、ｐＹＫ３３１
からは大きな方の断片を、ｐＢＩ（２０からは小さい方
の断片をアガロースゲル電気泳動で単離した。両断片を
Ｔ ４ Ｕガーセ２５単位を用いて連結し、連結反応液
を用いて大腸菌ＹＫ６６０を形質転換して上記と同様に
ＡｐＲ株を選択した。
得られたＡｐＨ株のプラスミドを単離し、その構造をア
ガロースゲル電気泳動で解析し、第４図の如き構造を有
するプラスミドｐ Ｙ Ｋ ３３５を同定した。ｐＹＫ
３３５は、多リンカー配列を挟んでρｈｏ八プへモータ
ーとＩａｃプロモーターが互に逆向きに存在する発現ベ
クターで、この多リンカー配列の制限部位に挿入された
目的の遺伝子は、その挿入の方向によりｐｈｏΔプロモ
ーターまたはＩａｃプロモーターの支配下となる。
ガロースゲル電気泳動で解析し、第４図の如き構造を有
するプラスミドｐ Ｙ Ｋ ３３５を同定した。ｐＹＫ
３３５は、多リンカー配列を挟んでρｈｏ八プへモータ
ーとＩａｃプロモーターが互に逆向きに存在する発現ベ
クターで、この多リンカー配列の制限部位に挿入された
目的の遺伝子は、その挿入の方向によりｐｈｏΔプロモ
ーターまたはＩａｃプロモーターの支配下となる。
この挿入された一木用ＤＮΔを鋳型とし、これに目的の
修飾（読み取り枠の調節、不要な配列の除去１発現１分
泌の最適化）が達せられるように設馴された欠失用の合
成りＮＡプライマーをアニールさせた後、ＤＮＡポリメ
ラーゼを用い二重鎖Ｄ Ｎ Ａを合成し、プライマーを
プローブとして目的のクローンを選択すれば、挿入した
目的遺伝子の位置を発現１分泌、翻訳の制御配列に対し
て任意に調節することができる。
修飾（読み取り枠の調節、不要な配列の除去１発現１分
泌の最適化）が達せられるように設馴された欠失用の合
成りＮＡプライマーをアニールさせた後、ＤＮＡポリメ
ラーゼを用い二重鎖Ｄ Ｎ Ａを合成し、プライマーを
プローブとして目的のクローンを選択すれば、挿入した
目的遺伝子の位置を発現１分泌、翻訳の制御配列に対し
て任意に調節することができる。
プラスミドｐＹＫ３３１に替えてｐＹ、に３３２を用い
る以外は上記と同様に行って、ｓｆｐの方向が反対向き
に挿入されているプラスミドｐＹＫ３３６を得た。
る以外は上記と同様に行って、ｓｆｐの方向が反対向き
に挿入されているプラスミドｐＹＫ３３６を得た。
ｐＹＫ３３５．ｐＹＫ３３６を含む大腸閑閑株は、それ
ぞれ口５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ Ｋ ９６
５（微工研条寄第３７１号） 、 ｌ１ｓｃｌ＋ｅｒｉ
ｃｔ＋ｉａ ｃｏｌｉＹＫ９６６微工研条寄第３７２号
）として微王研に寄託さ−Ｃいる。
ぞれ口５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ Ｋ ９６
５（微工研条寄第３７１号） 、 ｌ１ｓｃｌ＋ｅｒｉ
ｃｔ＋ｉａ ｃｏｌｉＹＫ９６６微工研条寄第３７２号
）として微王研に寄託さ−Ｃいる。
第１図は、プラスミ）ｒ）Ｙ Ｋ ３１４の造成過程を
示す。 第２図は、プラスミドｐＹＫ３３０の造成過程を示す。 第３図は、プラスミドｐＹＫ３３１およびｐＹＫ３３２
の造成過程を示す。 第４図は、プラスミドｐＹＫ３３５およびｐＹＫ３３６
の造成過程を示す。 図り旧１はＨｉｎｄｌｆｌ、ＰはＰｓｔＩ、Ｓａｌは５
ａ１１．ＸはＸｂａｌ、ＢはＢａｍＨＩ、ＳｍａはＳｍ
ａｌ、Ｓｓｔは５ｓｔｌ、ＥはＥ ｃ’ｏ Ｒ１をそれ
ぞれ示す。ＭＣ３は多リンカー配列を示す。 特許出願人 １） 村 ・や 造 代理人（７２０１）戸村玄紀−！Σ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５８年特許願第１９８０４３号 ２、発明の名称 新規プラスミドベクター ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 東京都大田区山王２丁目１７−１２氏 名 １
） 村 畢 造 ４、代理人
示す。 第２図は、プラスミドｐＹＫ３３０の造成過程を示す。 第３図は、プラスミドｐＹＫ３３１およびｐＹＫ３３２
の造成過程を示す。 第４図は、プラスミドｐＹＫ３３５およびｐＹＫ３３６
の造成過程を示す。 図り旧１はＨｉｎｄｌｆｌ、ＰはＰｓｔＩ、Ｓａｌは５
ａ１１．ＸはＸｂａｌ、ＢはＢａｍＨＩ、ＳｍａはＳｍ
ａｌ、Ｓｓｔは５ｓｔｌ、ＥはＥ ｃ’ｏ Ｒ１をそれ
ぞれ示す。ＭＣ３は多リンカー配列を示す。 特許出願人 １） 村 ・や 造 代理人（７２０１）戸村玄紀−！Σ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５８年特許願第１９８０４３号 ２、発明の名称 新規プラスミドベクター ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 東京都大田区山王２丁目１７−１２氏 名 １
） 村 畢 造 ４、代理人
Claims (9)
- （１）へルバーファージの重感染により一本鎖ファージ
様粒子としてパッケージされうるプラスミドベクター。 - （２）一本鎖線状ファージの堆殖に必要な塩基配列（以
下ｓｆｐと記す）を含む断片を発現ベクターに組込むこ
とにより造成され、ヘルツぐ一ファージの重感染により
〜木鎖ファージ様粒子としてパソケ〜ジされうるプラス
ミドベクター。 - （３）一本鎖線状ファージがｆｌ、、ｆｄまたはＭ１３
である特許請求の範囲第２項のプラスミドベクター。 - （４）ｓｆｐが、一本鎖線状ファージのＣ−釦Ｄ Ｎ
Ａ複製のオリジン、ｖ−鎮ＤＮΔ複製のオリジンおよび
パソケージンクのオリジンを含む特許請求の範囲第２項
記載のプラスミドベクター。 - （５）発現ベクターがトリプトファンツペエコンのプロ
モーター、ラクトースツヘロンのプロモーター、Ｒｅｃ
△のプロモーター、リポプロディンのプロモーターまた
はアルカリ７オスフアターゼのプロモーターである特許
請求の範囲第２項のプラスミドベクター。 - （６）発現ベクターの下流に、さらに所望の外来遺伝子
を挿入するための一群の制限酵素切断部位を有する特許
請求の範囲第２項記載のプラスミドベクター。 - （７）特許請求の範囲第６項のプラスミドベクターに挿
入した所望の外来遺伝子を発現に関侮する調節配列に対
し任意に再配置すること特徴とする組変えＤＮＡの修飾
方法。 - （８）へルバーファージの重感染により一本鎮ファーン
様粒子としてパブケージされつるプラスミドベクターを
含む微生物。 - （９）大腸菌ＹＫ９６０．同ＹＫ９６１．同ＹＫ９６２
、同ＹＫ９６５および同ＹＫ９６６から選ばれる特許請
求の範囲第８項記載の微生物。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58198043A JPS6091984A (ja) | 1983-10-22 | 1983-10-22 | 新規プラスミドベクタ− |
| EP84112724A EP0141362A3 (en) | 1983-10-22 | 1984-10-22 | Novel plasmid vector |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58198043A JPS6091984A (ja) | 1983-10-22 | 1983-10-22 | 新規プラスミドベクタ− |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6091984A true JPS6091984A (ja) | 1985-05-23 |
Family
ID=16384580
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58198043A Pending JPS6091984A (ja) | 1983-10-22 | 1983-10-22 | 新規プラスミドベクタ− |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0141362A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6091984A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8502061A (nl) * | 1985-07-17 | 1987-02-16 | Stichting Katholieke Univ | Nieuwe vectorplasmiden, hun constructie en toepassing, en micro-organismen waarin ze zijn opgenomen. |
| DE3716957A1 (de) * | 1987-05-20 | 1988-12-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Expressionsvektor zur regulierbaren expression von fremdgenen in prokaryonten |
| EP0354727A3 (en) * | 1988-08-08 | 1990-11-22 | Eli Lilly And Company | Novel single stranded phasmid vectors and methods for transforming streptomyces and other actinomycetes |
| EP0356130A3 (en) * | 1988-08-22 | 1991-09-11 | Genencor International, Inc. | A mobile fl phage single-strand dna origin of replication |
-
1983
- 1983-10-22 JP JP58198043A patent/JPS6091984A/ja active Pending
-
1984
- 1984-10-22 EP EP84112724A patent/EP0141362A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0141362A3 (en) | 1987-01-21 |
| EP0141362A2 (en) | 1985-05-15 |
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