JPH028713B2

JPH028713B2 -

Info

Publication number: JPH028713B2
Application number: JP56157529A
Authority: JP
Inventors: Rintaro Nakatani; Sankichi Horiuchi
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1981-10-05
Filing date: 1981-10-05
Publication date: 1990-02-26
Also published as: JPS5860000A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、微生物細胞内できわめて大量のコピ
ーを得ることのできるプラスミドpNR333又は
pNR334に関するものである。更に詳細には、本発明は、新規なベクターとし
てのプラスミドpNR333又はpNR334に関するも
のである。更に、本発明は、プラスミドpNR333又は
pNR334とプロテウス・ミラビリスからなる宿
主・ベクター系からなり、これにより新たなる遺
伝子操作の一技術を提供することを目的とするも
のである。現在、遺伝子操作技術は急激な展開をみせ、近
い将来に多くの有効物質が遺伝子操作微生物によ
つて生産されるようになるものと期待されてい
る。現在の遺伝子操作技術は、特定のプラスミドを
ベクターとして、これに有効物質の生産をコード
する遺伝子を組み入れて新たなプラスミドを作
り、これを宿主に移入し、この宿主を培養するこ
とによつて有効物質を生産させることにある。し
かし、新たなプラスミドを宿主に移入してこの宿
主を培養によつて増殖させても、新たなプラスミ
ドの宿主細胞当りのコピー数が少ないと、コピー
数に応じる有効物質生産量はコピー数に比例する
ため、有効物質生産性もきわめて低いので実用性
に乏しいということになる。現在のところ、宿主
に移入された新たなプラスミドのコピー数がきわ
めて少ないのが、大きな欠点となつている。本発明者らは、ベクターとしてのプラスミドで
コピー数の多いものを求め、かつその宿主を求め
て研究したところ、ここにプラスミドpNR333及
びプラスミドpNR334を得、そしてその宿主とし
てプロテウス・ミラビリスが最適であることを知
つたのである。本発明は、プラスミドpNR333又はpNR334で
あり、そしてプロテウス・ミラビリスとプラスミ
ドpNR333又はpNR334とからなる宿主・ベクタ
ー系に関するものである。一般に、細菌細胞内におけるプラスミドのコピ
ー数は、細菌の染色体当り１〜２個であるが、本
発明のプラスミドの場合には、宿主プロテウス・
ミラビリス中におけるコピー数はきわめて多数
で、pNR333は172〜625個、pNR334は114〜357
個であり、これが大きな特色となつている。多数コピーされたプラスミドpNR333又は
pNR334は培養菌体から分離され、次いで制限酵
素で切断し、切断部に有効物質を生産する情報が
コードされた遺伝子フラグメントをリガーゼによ
り結合させ新たなプラスミドとし、これを各種微
生物に移入し、培養によつて有効物質を生産させ
ることができるようになるものである。第１図及び第２図において、プラスミド
pNR333及びプラスミドpNR334を説明する。第
１図はプラスミドpNR333の遺伝子地図を示す
が、各種のDNA制限酵素の切断部位は次の略記
号で示されている。 Pst；制限酵素Pstの切断部位 Sal；制限酵素Salの切断部位 Bgl；制限酵素Bglの切断部位Ｐ−Ａ（白地部分）はカナマイシン耐性遺伝子
（Kam）がコードされたフラグメントで、Ｐ−Ｂ
（二重斜線部分）は不和合性遺伝子（inc）がコー
ドされたフラグメントで、Ｐ−Ｃ（斜線部分）は
複製開始遺伝子（ori）がコードされたフラグメ
ントで、Ｐ−ＢとＰ−Ｃは一緒になつて複製遺伝
子（rep）を構成する。また、第２図はプラスミドpNR334の遺伝子地
図を示すが、Pst，Sal，Bglは上記と同じ
意味を有し、次の切断部位のみ新たに付加されて
いる。 EcoR；制限酵素EcoRの切断部位Ｐ−Ａ，Ｐ−Ｂ，Ｐ−Ｃは上記と同様で、Ｐ−
Ｄ（Pst切断部位とPst切断部位の間の白地部
分）はＰ−Ｄフラグメント（実施例１において述
べるプラスミドpNR303のPst切断フラグメン
トの一つで、EcoR切断部位を有する遺伝子を
Ｐ−Ｄフラグメントとした。）で途中にEcoR切
断部位を有している。次に、プラスミドpNR333及びpNR334の理化
学的性質を示す。プラスミドpNR333： (1) 第１図の遺伝子地図を示す。 (2) λフアージDNAを対照として、アガロース
電気泳動で得た分子量は4.6Kbである。 (3) pBR322DNAを対照として、電子顕微鏡に
より求めた長さは1.3μｍ±0.05μｍである。 (4) 薬剤耐性はカナマイシン耐性（Kan）によつ
て特徴づけられる。 (5) 制限酵素Pstで処理すると、３つのフラグ
メントになる。各フラグメントの分子量は、Ｐ
−Ａ：1.8Kb、Ｐ−Ｂ：1.7Kb、Ｐ−Ｃ：1.1Kb
で、フラグメントＰ−Ａにはカナマイシン耐性
遺伝子が、Ｐ−Ｂにはプラスミドの複製に関与
する遺伝子がコードされている。複製はＰ−Ｂ
フラグメント上のいずれかの部位から開始す
る。Ｐ−Ｃフラグメントはプラスミドの不和合
性に関与する遺伝子がコードされており、互に
性質が類似するプラスミド同士は、同一細胞内
に共存し得ないという性質をプラスミドに与え
ている。 (6) 制限酵素Salで処理すると、２箇所で切断
され、２つのフラグメントを生ずる。 (7) 制限酵素Bglでは１ケ所が切断される。 (8) 異種DNAの組み込み： pNR333のこれまでに判明した制限酵素の切
断箇所は６箇所であるが、このうち以下の２箇
所を除いた残り４箇所は、異種DNAを組み込
むことが可能である。即ちＰ−Ｂフラグメント
とＰ−Ｃフラグメントに挾まれたPst切断箇
所、およびＰ−Ｃフラグメント上のSal切断
箇所はプラスミドの複製に関与する遺伝子が存
在するため、異種DNAを組み込むことはでき
ない。 (9) 浮上密度 ρ：1.706ｇ／ml プラスミドpNR334： (1) 第２図の遺伝子地図を示す。 (2) λフアージDNAを対照として、アガロース
電気泳動で得た分子量は7.6Kbである。 (3) 薬剤耐性はカナマイシン耐性（Kan）によつ
て特徴づけられる。 (4) pNR304（コピー変異pNR300由来、分子量は
23.2Kb、Ap、Km、Sm耐性）のPst切断フ
ラグメント（3.0Kb）をpNR333に組み入れた
プラスミドである。この組み入れたフラグメン
トをpNR334のＰ−Ｄフラグメントとする。こ
のフラグメントの上には制限酵素EcoR切断
箇所が１つある。EcoRは現在最も良く用い
られている制限酵素であるので、pNR334は
pNR333よりも遺伝子操作のベクターとしての
利用範囲を更に拡げたものといえる。 (5) 浮上密度 ρ＝1.708ｇ／ml 本発明における宿主としては、プロテウス・ミ
ラビリスが好ましい。プロテウス・ミラビリスは
エシエリヒア・コリ（大腸菌）と同様にヒトの腸
管内に生息しており、正常細菌叢を形成している
細菌のメンバーの１つで、病原性細菌の腸管内で
の増殖を妨げる作用があり、ヒトにビタミン等も
供給している菌でもあり、使用に際してもきわめ
て安全である。本発明においては、その例示菌株
としてプロテウス・ミラビリスPm171をあげる
ことができる。プロテウス・ミラビリスPm171
は、本発明者らがヒトの腸管の細菌叢由来の実験
室保存株から新たに分離した変異菌株であつて、
この菌株を使用することによつて、本発明のプラ
スミドpNR333及びpNR334の製造が適確に行え、
また、その多量コピーが容易となるもので、本菌
株とプラスミドpNR333又はpNR334を組合せる
ことによつて新たなる宿主・ベクター系を提出す
ることを可能としたのである。プラスミドpNR333及びプラスミドpNR334を
含む本菌株は微工研にプロテウス・ミラビリス
Pm171、FERMP−6169として寄託されている。プロテウス・ミラビリスPm171の菌学的性質
はバーギーズ・マニアル・オブ、デターミネイテ
ブ・バクテリオロジイ第８版327−329頁に記載さ
れたプロテウス・ミラビリスの菌学的性質とよく
一致し、それ以外は次の変異した性質において同
定されるものである。（lac^- gal^- nic trp thy ura Tc^S） lac^-；lactose非分解 gal^-；galactose非分解 nic；nicotinic acid要求 trp；tryptophan要求 thy；thymine要求 ura；uracil要求 Tc^S；tetracyclinc感受性本菌株は上記の遺伝的変異を有しているので、
各種の遺伝学的実験には扱いやすい菌菌株であ
り、また外界や人体では死滅しやすい特性を有し
ている。次に、実施例において本発明のプラスミド
pNR333及びpNR334の一製造例を示すが、本発
明はこれに限定されるものではない。実施例１プラスミドpNR333の製造；ヒト由来、薬剤耐性（少くとも、アンピシリ
ン、クロラムフエニコール、カナマイシン、水
銀、ストレプトマイシン、スルフオンアミド、テ
トラサイクリン耐性）エシエリヒア・コリを培養
し、接合伝達により教室保存実験株、エシエリヒ
ア・コリＫ−12CSH−２に薬剤耐性プラスミド
（pNR113と命名）を伝達し、これをエシエリヒ
ア・コリＫ−12CSH−2RFP^r（pNR113）（FERM
Ｐ−6170）とした。プラスミドpNR113は不和合群Ｆに属すもの
で、アンピシリン（Ap）、クロラムフエニコール
（Cm）、カナマイシン（Km）、水銀（Hg）、スト
レプトマイシン（Sm）、スルフオンアミド
（Su）、テトラサイクリン（Tc）耐性を発現し、
接合伝達性を有し、分子量は102Kb（キロベース）
であつた。更にプラスミドpNR113を接合伝達法により、
プロテウス・ミラビリスPm171、FERM Ｐ−
6169に伝達した。これをアンピシリン（Ap）を
1000μｇ／mlの濃度に含む液体培地（Ｌブロス）
に接種し、37℃で５回継代培養を行い、その0.1
mlをAp含有培地に塗布し薬剤高度耐性プラスミ
ドpNR300を得た。

【表】表１に各種のプラスミドの性状を示すが、
pNR113からおよそ１／10^9-10の頻度で薬剤高度
耐性プラスミドが出現するため、以上の方法によ
りpNR300様の性状を備えたプラスミドが容易に
得られる。この菌株のβ−ラクタマーゼ活性（ペニシリン
不活性酵素）はもとの菌株の10〜20倍に上昇し、
プラスミドDNA量も宿主菌染色体DNAの30〜
50.6％にも達した（第３図参照）。第３図Ａの密
度1.700のピークは宿主菌の染色体DNAを、ま
た、密度1.711のピークは野生型プラスミド
pNR113のDNA量を示したものである。第３図
Ｂの密度1.711のピークは薬剤高度耐性プラスミ
ドpNR300のDNA量を示したものであるが、そ
のDNA量は野生型pNR113に比べて著しく多く
23倍にも増加している。この薬剤高度耐性プラス
ミドについて、分子遺伝学的性状を調べた結果、
pNR113のコピー変異体であることが判明した。
コピー数は23個であつた。 pNR300は挿入配列（IS1、インサーシヨン
シークエンスとも言い、DNAの組換え体を作り
易い特殊な塩基配列）を保持しているため高頻度
に欠失変異体を生じる。そのため、pNR300を保
有する菌をAp存在下で継代培養すると、欠失変
異体がおよそ１／10^7-8の頻度で得られる。この
培養菌よりプラスミドDNAを精製しこれを再び
Pm171に形質転換法により移入すると、欠失変
異体DNAは親プラスミドpNR300に比べ分子量
が小さいため高頻度にPm171に移入される。Ap
を含む平板培地を用い、形質転換体を選択して欠
失変異体pNR303を得た。pNR303はAp、Km耐
性で、分子量は30.5Kb、コピー数は36〜52個で
あつた。以上のことは遺伝子工学の分野で今日し
ばしば行われている手法であるため、pNR303の
取得は容易であり、かつ再現性はきわめて高い。更にpNR303のDNAを制限酵素Pstで切断
し、これをリガーゼ（連結酵素）でつなぎ、プロ
テウス・ミラビリスPm171に形質転換法により
移入した。この操作で複製遺伝子、およびKm耐
性遺伝子を備え、他の不要遺伝子が除去されたミ
ニプラスミドが得られ、これをpNR333と命名し
た。pNR333のプラスミドDNAは宿主菌染色体
の24.5％にも達した（第３図Ｃ）。コピー数は少
ない場合でも172個、多い時は625個にも達し、現
在までに知られているプラスミドに比べて著しく
多い。また、プラスミドDNA量も染色体の70〜
80％にも達するきわめて異例のプラスミドである
ことが分つた。プラスミドpNR333の多数コピーの機構：一般に、プラスミドの複製の制御はプラスミド
複製に対するレプレツサー蛋白によつて行なわれ
ている。このレプレツサー蛋白はプラスミド自身
がコードする遺伝情報に従つてつくられる物質
で、プラスミドが複製を開始する部位に結合し
て、複製の開始を抑制する。このレプレツサー蛋
白に変異が生じると複製を抑えることが不確実と
なり、プラスミドは異常複製するようになる。こ
のようなレプレツサー蛋白の変異に基づくプラス
ミドも、正常なレプレツサー蛋白の存在下では多
数コピーを作ることができないと考えられてい
る。プラスミドpNR333と由来を同じくするプラス
ミドpNR308（Ap耐性、コピー数は42−68個）に
正常なレプレツサー蛋白をつくることができる
pNR1140（Km耐性、コピー数は１〜２個、野生
型プラスミドpNR113からクローニングして得た
もので分子量はpNR333と同じく4.6Kb）を連結
して、混成プラスミドpNR308：1140を製造し
た。このプラスミドは変異したレプレツサー蛋白
と正常なレプレツサー蛋白の両方を産生するが、
コピー数は10〜12個でpNR308のコピー数の1/5
〜1/6であつた。このコピー数の低下は、
pNR1140によつてつくられた正常なレプレツサ
ー蛋白の制御を受けた結果であろうと推定され、
pNR308の変異はレプレツサー蛋白の変異に基づ
くことが示唆された。このことからプラスミドpNR308と由来を同じ
くするプラスミドpNR333は、変異したレプレツ
サー蛋白をコードする変異遺伝子を担つていると
考えられる。更に、プラスミドpNR333のコピー
数が異常に多いのは、レプレツサー蛋白の変異の
他に、この蛋白が結合する複製遺伝子の部位にも
変異が生じているためと考えられる。現在までに、いくつかの有用なベクタープラス
ミドが報告されているが、Col EI、pBR322の例
に見られるように、コピー数は多くても10〜20個
である。これに対して、本発明のプラスミド
pNR333はコピー数が625個にも及ぶもので、従
来のプラスミドに比べて著しく効率がよいことが
分る。実施例２プラスミドpNR334の製造；実施例１で得たプラスミドpNR333をプロテウ
ス・ミラビリスPm171、FERM Ｐ−6169中で多
数コピーし、これを溶菌して単離し、得られたプ
ラスミドpNR333に制限酵素Pstを作用させて
切断し、これに実施例１で得たプラスミド
pNR303を制限酵素Pstで切断して得たPstフ
ラグメント（このフラグメントには制限酵素
EcoR切断部位が１ケ所存在する。）を添加し、
更にリガーゼを加えて連結させた。得られた連結処理DNAを形質転換法によりプ
ロテウス・ミラビリスPm171、FERM Ｐ−6169
に移入し、増殖した菌からプラスミドが異常に複
製した菌株を単離し、この菌株の培養物からプラ
スミドを単離し、これをプラスミドpNR334と命
名した。このプラスミドpNR334はコピー数が114〜357
個であつた。そしてこのプラスミドpNR334は第
２図の遺伝子地図を示すことが確認された。プラ
スミドpNR334は制限酵素EcoR切断部位を１
ケ所のみもつているので、制限酵素EcoRで切
断し、ここに別の遺伝子を連結させることができ
るので、遺伝子運搬体DNAとしてきわめて有用
である。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドpNR333の遺伝子地図を示
す図であり、第２図はプラスミドpNR334の遺伝
子地図を示す図であり、第３図は、野生型プラス
ミドpNR113を含む宿主菌のDNA量(A)、薬剤高
度耐性プラスミドpNR300を挿入した宿主菌の
DNA量(B)及びpNR333を挿入した宿主菌のDNA
量(C)を、それぞれCsCl平衡密度超遠心にかけ紫
外線による吸光度で測定した図である。Ｐ−Ａ（白地部分）……カナマイシン耐性遺伝
子（Kan）をコードするフラグメント、Ｐ−Ｂ
（二重斜線部分）……不和合性遺伝子（inc）をコ
ードするフラグメント、Ｐ−Ｃ（斜線部分）……
複製開始遺伝子（ori）をコードするフラグメン
ト、Ｐ−Ｄ（Pst切断部位とPst切断部位の間
の白地部分）……Ｐ−Ｄフラグメント、Pst…
…制限酵素Pstの切断部位、Sal……制限酵素
Salの切断部位、Bgl……制限酵素Bglの切
断部位、EcoR……制限酵素EcoRの切断部
位。

Claims

【特許請求の範囲】１下記に示される遺伝子地図を持つプラスミド
pNR333又はプラスミドpNR334。２プラスミドpNR333及び／又はプラスミド
pNR334を含むプロテウス・ミラビリスPm171。