JPH0771494B2 - Ｄｎａ物質伝達のためのベクター - Google Patents
Ｄｎａ物質伝達のためのベクターInfo
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- JPH0771494B2 JPH0771494B2 JP3096573A JP9657391A JPH0771494B2 JP H0771494 B2 JPH0771494 B2 JP H0771494B2 JP 3096573 A JP3096573 A JP 3096573A JP 9657391 A JP9657391 A JP 9657391A JP H0771494 B2 JPH0771494 B2 JP H0771494B2
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- JP
- Japan
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- plasmid
- dna
- transposon
- vector
- bacterium
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は広い宿主域を有する転位
可能なクローニングベクター、該ベクターを用いてのＤ
ＮＡ挿入方法、該方法で作られた新規微生物、ならびに
それらにおいて用いる新規プラスミドに関する。
可能なクローニングベクター、該ベクターを用いてのＤ
ＮＡ挿入方法、該方法で作られた新規微生物、ならびに
それらにおいて用いる新規プラスミドに関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、改善された有用な性質を有する新
しい微生物を作り出すための微生物の遺伝子操作法を開
発することに多大な関心が寄せられている。そのような
遺伝子操作法はここ１０年のうちに工業的に次第に重要
になって来ると信じられる。遺伝子操作法においては、
普通、ある微生物（場合によっては何か別の源）からＤ
ＮＡ物質を採り、そしてそれを別の微生物中へ伝達する
ことが必要である。ＤＮＡ物質を伝達するのに用いられ
る担体は、「ベクター」と称される。現在、広い宿主域
の転位可能ベクターの開発に対する要求がある。
しい微生物を作り出すための微生物の遺伝子操作法を開
発することに多大な関心が寄せられている。そのような
遺伝子操作法はここ１０年のうちに工業的に次第に重要
になって来ると信じられる。遺伝子操作法においては、
普通、ある微生物（場合によっては何か別の源）からＤ
ＮＡ物質を採り、そしてそれを別の微生物中へ伝達する
ことが必要である。ＤＮＡ物質を伝達するのに用いられ
る担体は、「ベクター」と称される。現在、広い宿主域
の転位可能ベクターの開発に対する要求がある。
【０００３】最近、細菌のプラスミドおよびフアージか
ら誘導した多くの特殊ベクターが開発されてきておりこ
れによりクローン化ＤＮＡ断片の表現の研究およびコン
トロールが可能となってきている。しかしこれらの公知
ベクタは、限定された宿主域を有し、また充分な安定性
を欠くので、潜在的に有用な微生物の生化学において永
久的な変性を行うのには適当でないことが判明してい
る。これらの変性は、受容体微生物の染色体中へ必要な
遺伝子（ＤＮＡ物質）を導入することにより最も良く達
成される。
ら誘導した多くの特殊ベクターが開発されてきておりこ
れによりクローン化ＤＮＡ断片の表現の研究およびコン
トロールが可能となってきている。しかしこれらの公知
ベクタは、限定された宿主域を有し、また充分な安定性
を欠くので、潜在的に有用な微生物の生化学において永
久的な変性を行うのには適当でないことが判明してい
る。これらの変性は、受容体微生物の染色体中へ必要な
遺伝子（ＤＮＡ物質）を導入することにより最も良く達
成される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】トランスポソンは、プ
ラスミド、その他の（微生物性）粒子および微生物間で
の遺伝子（ＤＮＡ）物質の伝達に非常に有用なＤＮＡ配
列である。トランスポソンは、相異なる微生物、プラス
ミド等の間で容易に移動しうる能力を有している。その
能力は、トランスポソンの全体の配列の中に含まれるＤ
ＮＡ配列によって暗号化（コード化）されているもので
あり、そのようなＤＮＡ配列はトランスポソン中の転位
機能規定配列と称される。従って、ＤＮＡ中にトランス
ポソンを含んでいるプラスミドは、ある微生物から他の
微生物へ遺伝子を運ぶための有用なベクターを形成する
（その際に当該遺伝子はトランスポソンのＤＮＡ中へ導
入される）。しかし、そのようなベクターの有用性は、
安定性の欠如のために制限されてきた。すなわち、トラ
ンスポソンの移動性は、トランスポソンが、受容体微生
物における有害な遺伝的変化をもたらしうることあるい
はそのような変化によって喪失されうることを意味する
のである。さらには、従前のトランスポソンの使用によ
っては、受容体微生物中への遺伝子の導入についての選
択が可能でなかった。
ラスミド、その他の（微生物性）粒子および微生物間で
の遺伝子（ＤＮＡ）物質の伝達に非常に有用なＤＮＡ配
列である。トランスポソンは、相異なる微生物、プラス
ミド等の間で容易に移動しうる能力を有している。その
能力は、トランスポソンの全体の配列の中に含まれるＤ
ＮＡ配列によって暗号化（コード化）されているもので
あり、そのようなＤＮＡ配列はトランスポソン中の転位
機能規定配列と称される。従って、ＤＮＡ中にトランス
ポソンを含んでいるプラスミドは、ある微生物から他の
微生物へ遺伝子を運ぶための有用なベクターを形成する
（その際に当該遺伝子はトランスポソンのＤＮＡ中へ導
入される）。しかし、そのようなベクターの有用性は、
安定性の欠如のために制限されてきた。すなわち、トラ
ンスポソンの移動性は、トランスポソンが、受容体微生
物における有害な遺伝的変化をもたらしうることあるい
はそのような変化によって喪失されうることを意味する
のである。さらには、従前のトランスポソンの使用によ
っては、受容体微生物中への遺伝子の導入についての選
択が可能でなかった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、グラム
陰性細菌同志間でのＤＮＡ物質の伝達のための、第１の
プラスミドおよび第２のプラスミドを含むベクターであ
って：転位機能を規定する配列を含むＤＮＡ部分が取り
除かれているトランスポソン（Ａ）を、該第１のプラス
ミドが有し；トランスポソン（Ａ）の転位機能を規定す
る配列を含むトランスポソン（Ａ）からのＤＮＡ断片
を、該第２のプラスミドが有する；ことを特徴とするベ
クターが提供される。
陰性細菌同志間でのＤＮＡ物質の伝達のための、第１の
プラスミドおよび第２のプラスミドを含むベクターであ
って：転位機能を規定する配列を含むＤＮＡ部分が取り
除かれているトランスポソン（Ａ）を、該第１のプラス
ミドが有し；トランスポソン（Ａ）の転位機能を規定す
る配列を含むトランスポソン（Ａ）からのＤＮＡ断片
を、該第２のプラスミドが有する；ことを特徴とするベ
クターが提供される。
【０００６】さらに本発明のベクターは、ある受容体グ
ラム陰性細菌の染色体中へ該細菌が本来有しない外来Ｄ
ＮＡ物質（Ｂ）を挿入するに際して： （i) キャリヤープラスミドとヘルパープラスミドとを
含むベクターを含有する微生物を構成する工程、〔ただ
し、受容体細菌中へ挿入されるべき外来ＤＮＡ物質
（Ｂ）がそのＤＮＡ中に既に含まれ、そして転位機能を
規定する配列を含むＤＮＡ部分が取り除かれている適宜
なトランスポソン（Ａ）を、該キャリヤープラスミドが
担持し；そしてトランスポソン（Ａ）の転位機能を規定
する配列を含む、トランスポソン（Ａ）からのＤＮＡ断
片を、該ヘルパープラスミドが担持している。〕 (ii) 該キャリヤーおよびヘルパー両プラスミドを、ベ
クター含有微生物から、直接または間接的に、受容体細
菌中へ伝達する工程、そして (iii) 挿入外来ＤＮＡ物質（Ｂ）が受容体細菌の染色
体中へ入り込むのに充分な世代にわたって適切な条件下
で該受容体細菌を増殖させる工程、を含むことを特徴と
する上記外来ＤＮＡ物質（Ｂ）の挿入方法において使用
されうる。
ラム陰性細菌の染色体中へ該細菌が本来有しない外来Ｄ
ＮＡ物質（Ｂ）を挿入するに際して： （i) キャリヤープラスミドとヘルパープラスミドとを
含むベクターを含有する微生物を構成する工程、〔ただ
し、受容体細菌中へ挿入されるべき外来ＤＮＡ物質
（Ｂ）がそのＤＮＡ中に既に含まれ、そして転位機能を
規定する配列を含むＤＮＡ部分が取り除かれている適宜
なトランスポソン（Ａ）を、該キャリヤープラスミドが
担持し；そしてトランスポソン（Ａ）の転位機能を規定
する配列を含む、トランスポソン（Ａ）からのＤＮＡ断
片を、該ヘルパープラスミドが担持している。〕 (ii) 該キャリヤーおよびヘルパー両プラスミドを、ベ
クター含有微生物から、直接または間接的に、受容体細
菌中へ伝達する工程、そして (iii) 挿入外来ＤＮＡ物質（Ｂ）が受容体細菌の染色
体中へ入り込むのに充分な世代にわたって適切な条件下
で該受容体細菌を増殖させる工程、を含むことを特徴と
する上記外来ＤＮＡ物質（Ｂ）の挿入方法において使用
されうる。
【０００７】ベクター含有微生物から受容体細菌へのキ
ャリヤープラスミドおよびヘルパープラスミドの「間接
的な伝達」とは、複数の工程を含むいずれかの伝達方式
を意味するものであり、例えばベクター含有微生物から
出したプラスミドを、一またはその以上の中間（媒介）
微生物中へ一端入れた後に受容体細菌中へ導入する伝達
方式がある。
ャリヤープラスミドおよびヘルパープラスミドの「間接
的な伝達」とは、複数の工程を含むいずれかの伝達方式
を意味するものであり、例えばベクター含有微生物から
出したプラスミドを、一またはその以上の中間（媒介）
微生物中へ一端入れた後に受容体細菌中へ導入する伝達
方式がある。
【０００８】適当には、上記の方法の工程（iii)中また
はその後に、受容体細菌からキャリヤープラスミドを喪
失させる。適当には、挿入外来ＤＮＡ物質（Ｂ）が受容
体細菌の染色体中へ入り込んだ後に、該受容体細菌中に
ヘルパープラスミドと非相容性のプラスミド（非相容性
プラスミド）を導入することによりヘルパープラスミド
を受容体細菌から排除する。
はその後に、受容体細菌からキャリヤープラスミドを喪
失させる。適当には、挿入外来ＤＮＡ物質（Ｂ）が受容
体細菌の染色体中へ入り込んだ後に、該受容体細菌中に
ヘルパープラスミドと非相容性のプラスミド（非相容性
プラスミド）を導入することによりヘルパープラスミド
を受容体細菌から排除する。
【０００９】さらに本発明によれば、本発明の前記ベク
ターおよび前記挿入方法により染色体中へ外来ＤＮＡ物
質を導入された新規なグラム陰性細菌；そのような変性
細菌を用いて実施する方法（例えば単細胞蛋白の生産方
法）；ならびに前記のベクターや挿入方法において用い
るための新規なプラスミドおよびトランスポソン（これ
らはこの明細書中に言及されている）；が提供される。
本発明の新規なプラスミドとしては、本発明のベクター
中の第１のプラスミドとして有用なもの；本発明のベク
ター中の第２のプラスミド（本発明の挿入方法における
ヘルパープラスミドに対応）として有用なもの；本発明
の挿入方法のキャリヤープラスミド〔すなわち、ＤＮＡ
物質（Ｂ）を含むトランスポソンを運ぶ第１のプラスミ
ド〕として有用なもの；および非相容性プラスミド（す
なわち、ヘルパープラスミドと非相容性）として使用す
るのに指示された新規なプラスミド；が包含される。本
発明が関連する特定なプラスミドの例としては、キャリ
ヤープラスミドｐＮＪ５０７３、該プラスミドの修飾
体、および該プラスミドまたは該修飾体から由来する第
１のプラスミド；第２すなわちヘルパープラスミドｐＮ
９２７９および該プラスミドの修飾体；ならびに非相容
性プラスミドｐＧＳＳ１５および該プスミドの修飾体；
がある。
ターおよび前記挿入方法により染色体中へ外来ＤＮＡ物
質を導入された新規なグラム陰性細菌；そのような変性
細菌を用いて実施する方法（例えば単細胞蛋白の生産方
法）；ならびに前記のベクターや挿入方法において用い
るための新規なプラスミドおよびトランスポソン（これ
らはこの明細書中に言及されている）；が提供される。
本発明の新規なプラスミドとしては、本発明のベクター
中の第１のプラスミドとして有用なもの；本発明のベク
ター中の第２のプラスミド（本発明の挿入方法における
ヘルパープラスミドに対応）として有用なもの；本発明
の挿入方法のキャリヤープラスミド〔すなわち、ＤＮＡ
物質（Ｂ）を含むトランスポソンを運ぶ第１のプラスミ
ド〕として有用なもの；および非相容性プラスミド（す
なわち、ヘルパープラスミドと非相容性）として使用す
るのに指示された新規なプラスミド；が包含される。本
発明が関連する特定なプラスミドの例としては、キャリ
ヤープラスミドｐＮＪ５０７３、該プラスミドの修飾
体、および該プラスミドまたは該修飾体から由来する第
１のプラスミド；第２すなわちヘルパープラスミドｐＮ
９２７９および該プラスミドの修飾体；ならびに非相容
性プラスミドｐＧＳＳ１５および該プスミドの修飾体；
がある。
【００１０】以下では、本発明を外来ＤＮＡ物質挿入方
法に関して説明することにする。本発明の挿入方法にお
いて、実際上は、使用トランスプソンは、部分部分に分
割されているように見做すことができる。トランスポソ
ンの転位機能を規定するＤＮＡ配列を含む一方の部分
は、ヘルパープラスミド上に位置しているが；本発明方
法を用いて伝達されるべきＤＮＡ物質によってその転位
機能規定配列が置換えされている他方の部分は、キャリ
ヤープラスミド上に位置している。ヘルパープラスミド
およびキャリヤープラスミドの両者が受容体細菌中へ伝
達される。キャリヤープラスミドは不安定なプラスミド
でそれが受容体細菌から容易に失なわれるものであるの
が適当である。受容体細菌が多数の世代（好ましくは少
なくとも５０世代）にわたって適当な条件下で増殖され
た場合、伝達された外来ＤＮＡ物質は、受容体細菌の染
色中へ入り込み、そしてもしキャリヤープラスミドが不
安定であるならばそれは該細菌から失われる。この段階
で、ヘルパープラスミドと非相容性のあるプラスミド
（非相容性プラスミド）を受容体細菌中へ導入して、ヘ
ルパープラスミドも該細菌から失なわれるようにするこ
とができる。もちろん、以上の記述においては、トラン
スポソンの該二つの部分は、必ずしも同一個のトランス
ポソン配列からのものではなく、あるいは同一個のトラ
ンスポソン配列からのものであることもある。ことは理
解されるべきである。転位機能を含むＤＮＡは、公知の
方法でトランスポソンの全ＤＮＡ配列から切り出すこと
ができる。理想的には、転位機能を規定するその配列の
みを切り出し、そしてヘルパープラスミド上に位置させ
る。しかし、これは達成され難いので、一般的には、ヘ
ルパープラスミドで運ばれるトランスポソンＤＮＡは、
転位機能規定配列以外のＤＮＡをも含むことになる。こ
のような余分のＤＮＡは出来る限り少なくするのが好ま
しい。
法に関して説明することにする。本発明の挿入方法にお
いて、実際上は、使用トランスプソンは、部分部分に分
割されているように見做すことができる。トランスポソ
ンの転位機能を規定するＤＮＡ配列を含む一方の部分
は、ヘルパープラスミド上に位置しているが；本発明方
法を用いて伝達されるべきＤＮＡ物質によってその転位
機能規定配列が置換えされている他方の部分は、キャリ
ヤープラスミド上に位置している。ヘルパープラスミド
およびキャリヤープラスミドの両者が受容体細菌中へ伝
達される。キャリヤープラスミドは不安定なプラスミド
でそれが受容体細菌から容易に失なわれるものであるの
が適当である。受容体細菌が多数の世代（好ましくは少
なくとも５０世代）にわたって適当な条件下で増殖され
た場合、伝達された外来ＤＮＡ物質は、受容体細菌の染
色中へ入り込み、そしてもしキャリヤープラスミドが不
安定であるならばそれは該細菌から失われる。この段階
で、ヘルパープラスミドと非相容性のあるプラスミド
（非相容性プラスミド）を受容体細菌中へ導入して、ヘ
ルパープラスミドも該細菌から失なわれるようにするこ
とができる。もちろん、以上の記述においては、トラン
スポソンの該二つの部分は、必ずしも同一個のトランス
ポソン配列からのものではなく、あるいは同一個のトラ
ンスポソン配列からのものであることもある。ことは理
解されるべきである。転位機能を含むＤＮＡは、公知の
方法でトランスポソンの全ＤＮＡ配列から切り出すこと
ができる。理想的には、転位機能を規定するその配列の
みを切り出し、そしてヘルパープラスミド上に位置させ
る。しかし、これは達成され難いので、一般的には、ヘ
ルパープラスミドで運ばれるトランスポソンＤＮＡは、
転位機能規定配列以外のＤＮＡをも含むことになる。こ
のような余分のＤＮＡは出来る限り少なくするのが好ま
しい。
【００１１】本発明のＤＮＡ挿入方法は、ある細菌中
へ、その細菌の一般的生化学特性を変性またはそれに別
の特性を付加する遺伝子物質を伝達したい場合に非常に
有用である。
へ、その細菌の一般的生化学特性を変性またはそれに別
の特性を付加する遺伝子物質を伝達したい場合に非常に
有用である。
【００１２】キャリヤープラスミドおよびヘルパープラ
スミドは、ペクター含有微生物（普通は、細菌）から受
容体細菌中へ一段階で接合により伝達されるのが好まし
い。キャリヤーおよびヘルパー両プラスミドは、広い宿
主域を有するプラスミドであるのが適当であり、そして
少なくともキャリヤープラスミドは、受容体細菌から容
易に失なわれる不安定プラスミドであるのが好ましい。
好ましいキャリヤープラスミドは、無差別プラスミドＲ
Ｐ４の誘導体であり、そして好ましいヘルパープラスミ
ドはプラスミドＲ３００Ｂの誘導体である。その他の好
ましいキャリヤープラスミドとしては、Ｒ７５１および
Ｒ７Ｋがあり、またその他の適当なヘルパープラスミド
としてはＲ６７８およびＰＢ１６５がある。適当な非相
容性プラスミドの例としてはｐＧＳＳ１５およびＡｐ２
０１がある。使用されるプラスミドは、それぞれに適当
なマーカー（標識）を有するべきであり、そのような標
準は、普通、特定な抗生物質に対する耐性、例えばカナ
マイシン耐性（ＫｍR ）、テラマイシン耐性（Ｔ
ｃR ）、トリメトプリン耐性（ＴｐR ）、およびストレ
プトマイシン耐性（ＳｍR ）を規定するＤＮＡ配列であ
り、このようにして細体中における特定のプラスミドの
存在、不存在が確認できるようにすべきである。本発明
のＤＮＡ挿入方法は、広範囲の有用な遺伝子操作を実施
するのに使用できる。実施しうる遺伝子操作の例として
は、ある細菌を新規なエネルギー源を使用しうるように
する遺伝情報またはエネルギー転換効率を改善する遺伝
情報を、その細菌の染色体中へ導入することがある。ベ
クター含有微生物として、あるいは受容体細菌として使
用しうる細菌の例としては、Ｅ、ｃｏｌｉの菌株および
メチルロフイルス・メチロトロフス（Methylophilus me
thylotrophus；従前はシュードモナス・メチロトロファ
Pseudomonas methylotropha と命名されていた）の菌株
がある。シュードモナス・メチロトロファ種の細菌につ
いては、我々の英国特許第１３７０８９２号明細書にそ
の諸性質が記載されており、また多くの特定な菌株、す
なわちＮＣＩＢ寄託第１０５０８〜１０５１５号、およ
び同第１０５９２〜１０５９６号菌株も記載されてい
る。
スミドは、ペクター含有微生物（普通は、細菌）から受
容体細菌中へ一段階で接合により伝達されるのが好まし
い。キャリヤーおよびヘルパー両プラスミドは、広い宿
主域を有するプラスミドであるのが適当であり、そして
少なくともキャリヤープラスミドは、受容体細菌から容
易に失なわれる不安定プラスミドであるのが好ましい。
好ましいキャリヤープラスミドは、無差別プラスミドＲ
Ｐ４の誘導体であり、そして好ましいヘルパープラスミ
ドはプラスミドＲ３００Ｂの誘導体である。その他の好
ましいキャリヤープラスミドとしては、Ｒ７５１および
Ｒ７Ｋがあり、またその他の適当なヘルパープラスミド
としてはＲ６７８およびＰＢ１６５がある。適当な非相
容性プラスミドの例としてはｐＧＳＳ１５およびＡｐ２
０１がある。使用されるプラスミドは、それぞれに適当
なマーカー（標識）を有するべきであり、そのような標
準は、普通、特定な抗生物質に対する耐性、例えばカナ
マイシン耐性（ＫｍR ）、テラマイシン耐性（Ｔ
ｃR ）、トリメトプリン耐性（ＴｐR ）、およびストレ
プトマイシン耐性（ＳｍR ）を規定するＤＮＡ配列であ
り、このようにして細体中における特定のプラスミドの
存在、不存在が確認できるようにすべきである。本発明
のＤＮＡ挿入方法は、広範囲の有用な遺伝子操作を実施
するのに使用できる。実施しうる遺伝子操作の例として
は、ある細菌を新規なエネルギー源を使用しうるように
する遺伝情報またはエネルギー転換効率を改善する遺伝
情報を、その細菌の染色体中へ導入することがある。ベ
クター含有微生物として、あるいは受容体細菌として使
用しうる細菌の例としては、Ｅ、ｃｏｌｉの菌株および
メチルロフイルス・メチロトロフス（Methylophilus me
thylotrophus；従前はシュードモナス・メチロトロファ
Pseudomonas methylotropha と命名されていた）の菌株
がある。シュードモナス・メチロトロファ種の細菌につ
いては、我々の英国特許第１３７０８９２号明細書にそ
の諸性質が記載されており、また多くの特定な菌株、す
なわちＮＣＩＢ寄託第１０５０８〜１０５１５号、およ
び同第１０５９２〜１０５９６号菌株も記載されてい
る。
【００１３】本発明の実施例では、Ｅ．coliおよびメチ
ロフイルス・メチロトロフス種に本発明の挿入方法を使
用したものが例示されている。変性された菌株の培養物
は、ＮＣＩＢすなわちザ・ナショナル・コレクション・
オブ・インダストリアル・バクテリア（英国スコットラ
ンド、アバーティーン、トーリイ・リサーチ・ステーシ
ョン）に寄託されており、ＮＣＩＢ寄託第１１７１４号
および同第１１７１５号（変性Ｅ．coli菌株）の寄託番
号が付与されている。
ロフイルス・メチロトロフス種に本発明の挿入方法を使
用したものが例示されている。変性された菌株の培養物
は、ＮＣＩＢすなわちザ・ナショナル・コレクション・
オブ・インダストリアル・バクテリア（英国スコットラ
ンド、アバーティーン、トーリイ・リサーチ・ステーシ
ョン）に寄託されており、ＮＣＩＢ寄託第１１７１４号
および同第１１７１５号（変性Ｅ．coli菌株）の寄託番
号が付与されている。
【００１４】トランスポソンのほとんどのものは（例え
ばＴｎ１からＴｎ７までのいずれのものも）、本発明の
挿入方法において使用できる（我々はトランスポソンＴ
ｎ８またはＴｎ１０については関知してない）。しか
し、トランスポソンＴｎ７が好ましい。制限酵素Ｈind
III またはＢam ＨＩによって発生されたいずれのＤＮ
Ａ断片も、Ｔｈ７のＤＮＡ中へ（例えば実施例２および
第１図に示すようなプラスミドｐＮＪ５０７０で）直接
に挿入できる。
ばＴｎ１からＴｎ７までのいずれのものも）、本発明の
挿入方法において使用できる（我々はトランスポソンＴ
ｎ８またはＴｎ１０については関知してない）。しか
し、トランスポソンＴｎ７が好ましい。制限酵素Ｈind
III またはＢam ＨＩによって発生されたいずれのＤＮ
Ａ断片も、Ｔｈ７のＤＮＡ中へ（例えば実施例２および
第１図に示すようなプラスミドｐＮＪ５０７０で）直接
に挿入できる。
【００１５】本発明の添付図によって説明する。
【００１６】図１〜２は、以下の実施例１の（ａ）に記
載されているキャリヤープラスミドｐＮＪ５０７３の誘
導操作を示す。図３は実施例１の（ｂ）に記載されてい
るヘルパープラスミドの誘導操作を示す。
載されているキャリヤープラスミドｐＮＪ５０７３の誘
導操作を示す。図３は実施例１の（ｂ）に記載されてい
るヘルパープラスミドの誘導操作を示す。
【００１７】本発明を以下の実施例で説明する。実施例
１はベクターの成分プラスミドであるキャリヤープラス
ミドｐＮＪ５０７３およびヘルパープラスミドｐＮＪ９
２７９の誘導を示すものであり、実施例２および３Ｅ．
coliおよびメチロトフイラス・メチロトロフスにおける
上記ベクターの使用を示す。
１はベクターの成分プラスミドであるキャリヤープラス
ミドｐＮＪ５０７３およびヘルパープラスミドｐＮＪ９
２７９の誘導を示すものであり、実施例２および３Ｅ．
coliおよびメチロトフイラス・メチロトロフスにおける
上記ベクターの使用を示す。
【００１８】
【実施例】実施例１ 転位可能ベクター系で使用されるプラスミドの調製 （ａ）プラスミドｐＮＪ５０７３ 出発点プライミドＲＰ４であり、このものは非相容性グ
ループＰ（Ｉ nep）に属し、そして抗生物質アンピシリ
ン（Ａｐ）、テトラサイクリン（Ｔｅ）およびカナマイ
シン（（Ｋｍ）に対する耐性を暗号化する天然プラスミ
ドである。このプラスミドは、広範囲のグラム陰性細菌
中へ接合により自身を伝達する能力を決定する遺伝子を
も有している。その分子寸法はほぼ５６キロベース（ｋ
ｂ）であり、ＤＮＡ分子上における遺伝子の配置は図１
に示される通りである。図１は接合伝達に関与する領域
（Ｔra１、Ｔra２およびＴra３）の位置と、その細菌宿
主内での該プラスミドの復製および維持に必須な機能の
位置（ trfＡ trfＢおよびori Ｖ）とを示している。
ループＰ（Ｉ nep）に属し、そして抗生物質アンピシリ
ン（Ａｐ）、テトラサイクリン（Ｔｅ）およびカナマイ
シン（（Ｋｍ）に対する耐性を暗号化する天然プラスミ
ドである。このプラスミドは、広範囲のグラム陰性細菌
中へ接合により自身を伝達する能力を決定する遺伝子を
も有している。その分子寸法はほぼ５６キロベース（ｋ
ｂ）であり、ＤＮＡ分子上における遺伝子の配置は図１
に示される通りである。図１は接合伝達に関与する領域
（Ｔra１、Ｔra２およびＴra３）の位置と、その細菌宿
主内での該プラスミドの復製および維持に必須な機能の
位置（ trfＡ trfＢおよびori Ｖ）とを示している。
【００１９】次の段階は、図示した部位において前記の
１３Ｋｂ（キロベース）ＤＮＡ配列のトランスポソン７
（Ｔｎ７）を挿入して、誘導体ｐＲＰ１を与えることで
ある。このような挿入を行なうための標準的な方法は、
トランスポソン７（Ｔｎ７）を含むプラスミドからの転
位であり、かかる方法操作の詳細は、例えば「Molecula
r and General Genetics」（１８３，２，１９８１年第
３８０〜３８７頁）に記載されている。Ｔｎ７は、抗生
物質トリメトプリン（Ｔｐ）およびストレプトマイシン
（Ｓｍ）に対する抗性を暗号化する遺伝子、ならびに、
この１３ＫｂＤＮＡ配列が自身を一方のＤＮＡ分子から
他方のＤＮＡ分子へ転位する能力を授与する遺伝子を有
している。図１には、ｐＲＰ１のマップも示されてい
る。ｐＲＰ１ＤＮＡ分子の周囲に文字Ｐで印を付けられ
ている８個の部位は、制限酵素ＰｓｔＩがそのプラスミ
ド分子を開裂する位置を示している。試験管内Ｐｓｔ１
切断の後に、ｐＲＰ１の各断片は酵素ＤＮＡリガーゼを
用いて種々の組合せでアニールされ（接合され）、次い
でトランスフォーメーションにより、細菌エシエリキア
・コリ（Escherichiacoli ）Ｋ１２中へ再導入される。
この方法により得られた新規なタイプのプラスミドの一
つを次の工程のために使用した。
１３Ｋｂ（キロベース）ＤＮＡ配列のトランスポソン７
（Ｔｎ７）を挿入して、誘導体ｐＲＰ１を与えることで
ある。このような挿入を行なうための標準的な方法は、
トランスポソン７（Ｔｎ７）を含むプラスミドからの転
位であり、かかる方法操作の詳細は、例えば「Molecula
r and General Genetics」（１８３，２，１９８１年第
３８０〜３８７頁）に記載されている。Ｔｎ７は、抗生
物質トリメトプリン（Ｔｐ）およびストレプトマイシン
（Ｓｍ）に対する抗性を暗号化する遺伝子、ならびに、
この１３ＫｂＤＮＡ配列が自身を一方のＤＮＡ分子から
他方のＤＮＡ分子へ転位する能力を授与する遺伝子を有
している。図１には、ｐＲＰ１のマップも示されてい
る。ｐＲＰ１ＤＮＡ分子の周囲に文字Ｐで印を付けられ
ている８個の部位は、制限酵素ＰｓｔＩがそのプラスミ
ド分子を開裂する位置を示している。試験管内Ｐｓｔ１
切断の後に、ｐＲＰ１の各断片は酵素ＤＮＡリガーゼを
用いて種々の組合せでアニールされ（接合され）、次い
でトランスフォーメーションにより、細菌エシエリキア
・コリ（Escherichiacoli ）Ｋ１２中へ再導入される。
この方法により得られた新規なタイプのプラスミドの一
つを次の工程のために使用した。
【００２０】ｐＲＰ１上に存在してＡｐR 、ＫｍR 、Ｔ
ｐR およびＳｍR を決定する遺伝子を、ｐＮＪ５０００
は失なっているが、そのｐＮＪ５０００はＴｃR ならび
に複製、維持および、接合による伝達に関するすべての
遺伝子を保持している。ｐＮＪ５０００増殖媒地中にテ
ラマイシンの存在により選択されないと、一世代につき
約５％の細胞ポピュレーションを喪失されて、高度に不
安定になってもいる。トランスポソン７（Ｔｎ７）はこ
の段階で、図示のように再挿入されてプラスミドｐＮＪ
５０７０を発生させる。
ｐR およびＳｍR を決定する遺伝子を、ｐＮＪ５０００
は失なっているが、そのｐＮＪ５０００はＴｃR ならび
に複製、維持および、接合による伝達に関するすべての
遺伝子を保持している。ｐＮＪ５０００増殖媒地中にテ
ラマイシンの存在により選択されないと、一世代につき
約５％の細胞ポピュレーションを喪失されて、高度に不
安定になってもいる。トランスポソン７（Ｔｎ７）はこ
の段階で、図示のように再挿入されてプラスミドｐＮＪ
５０７０を発生させる。
【００２１】ｐＮＪ５０００の形成の際にｐＲＰ１から
削除されるＤＮＡ配列は、該プラスミド上に、制限酵素
Ｈind III およびＢamＨ１によって認識されるすべての
部位を含んでいる。従って、Ｔｎ７をｐＮＪ５０００に
挿入してｐＮＪ５０７０を発生させるときに、ｐＮＪ５
０７０上のＨindIII およびＢamＨ１部位のみがＴｎ７
内のものである（図２参照）。
削除されるＤＮＡ配列は、該プラスミド上に、制限酵素
Ｈind III およびＢamＨ１によって認識されるすべての
部位を含んでいる。従って、Ｔｎ７をｐＮＪ５０００に
挿入してｐＮＪ５０７０を発生させるときに、ｐＮＪ５
０７０上のＨindIII およびＢamＨ１部位のみがＴｎ７
内のものである（図２参照）。
【００２２】ｐＮＪ５０７０はＨind III で切断し（そ
れによってＴｎ７の大きな中央部を除き）、次いで、エ
シエリキア・コリＫ１２のtrpＥ遺伝子を含むＨind III
発生ＤＮＡ断片と結合させてｐＮＪ５０７３を発生さ
せた（図２）。
れによってＴｎ７の大きな中央部を除き）、次いで、エ
シエリキア・コリＫ１２のtrpＥ遺伝子を含むＨind III
発生ＤＮＡ断片と結合させてｐＮＪ５０７３を発生さ
せた（図２）。
【００２３】（ｂ） プラスミドｐＮＪ９２７９ ｐＮＪ９２７９は、プラスミドｐＴＢ９２から誘導し
た。ｐＴＢ９２自体は、天然の広宿主域プラスミドのＲ
３００Ｂの誘導体である。ｐＴＢ９２は、非相容性グル
ープＱ（ＩｎｃＱ）に属し、抗生物質スルフォンアミド
（Ｓｕ）およびカナマイシン（Ｋｍ）に対する耐性を与
える。それは接合による伝達についての機能をエンコー
ドしないが、接合系を決定する別のプラスミド（例：Ｒ
Ｐ４）が同一細菌細胞中に存在すれば、容易に伝達（可
動化）される。
た。ｐＴＢ９２自体は、天然の広宿主域プラスミドのＲ
３００Ｂの誘導体である。ｐＴＢ９２は、非相容性グル
ープＱ（ＩｎｃＱ）に属し、抗生物質スルフォンアミド
（Ｓｕ）およびカナマイシン（Ｋｍ）に対する耐性を与
える。それは接合による伝達についての機能をエンコー
ドしないが、接合系を決定する別のプラスミド（例：Ｒ
Ｐ４）が同一細菌細胞中に存在すれば、容易に伝達（可
動化）される。
【００２４】ｐＴＢ９２は、制限酵素ＰstＩにより認識
される二つのＤＮＡ配列を含んでいる（図３）。これら
の配列はＳｕ耐性を規定する遺伝子の両端にある。ｐＴ
Ｂ９２ＤＮＡをＰstＩで切断し（それによりＳｕ耐性遺
伝子を除き）、Ｔｎ７のほとんどを含むＰstＩ断片（ｐ
ＲＰＩの）と、ＤＮＡリガーゼにより、結合させた。こ
の断片は、ｐＮＪ５０７３から除かれた抗生物質耐性遺
伝子および領域を含んでいる。しかし、これは転位がで
きない、なんとなればトランスポソンの一端部からのＤ
ＮＡ配列を欠くからである。かくして得られるプラスミ
ドｐＮＪ９２７０はトランスフォーメーションによりエ
シエリキア・コリＫ１２中へ再導入された。
される二つのＤＮＡ配列を含んでいる（図３）。これら
の配列はＳｕ耐性を規定する遺伝子の両端にある。ｐＴ
Ｂ９２ＤＮＡをＰstＩで切断し（それによりＳｕ耐性遺
伝子を除き）、Ｔｎ７のほとんどを含むＰstＩ断片（ｐ
ＲＰＩの）と、ＤＮＡリガーゼにより、結合させた。こ
の断片は、ｐＮＪ５０７３から除かれた抗生物質耐性遺
伝子および領域を含んでいる。しかし、これは転位がで
きない、なんとなればトランスポソンの一端部からのＤ
ＮＡ配列を欠くからである。かくして得られるプラスミ
ドｐＮＪ９２７０はトランスフォーメーションによりエ
シエリキア・コリＫ１２中へ再導入された。
【００２５】最終の段階として、もはやＴｐ耐性を与え
ない突然変異株を選択した。これをｐＮＪ９２７９と指
称することにした。
ない突然変異株を選択した。これをｐＮＪ９２７９と指
称することにした。
【００２６】実施例２ Ｅ．coliにおける転位可能ベクター系の使用 ここにおけ
る実験はすべて、ｔｒｐＥ遺伝子における突然変異のた
めにアミノ酸トリプトファンの不存在下で増殖しえない
細菌細胞について実施した。特に言及するもの以外のす
べての段階はトリプトファンの存在下に実施した。
る実験はすべて、ｔｒｐＥ遺伝子における突然変異のた
めにアミノ酸トリプトファンの不存在下で増殖しえない
細菌細胞について実施した。特に言及するもの以外のす
べての段階はトリプトファンの存在下に実施した。
【００２７】プラスミドｐＴＢ９２およびｐＮＪ９２７
９を、カナマイシン耐性（ＫｍR ）についての選択によ
るトランスフォーメーションで導入した。ｐＮＪ５０７
０およびｐＮＪ５０７３は、テトラサイクリン耐性（Ｔ
ｃR ）についての選択を行い、接合により伝達した。そ
して下記の組合せが確立された。
９を、カナマイシン耐性（ＫｍR ）についての選択によ
るトランスフォーメーションで導入した。ｐＮＪ５０７
０およびｐＮＪ５０７３は、テトラサイクリン耐性（Ｔ
ｃR ）についての選択を行い、接合により伝達した。そ
して下記の組合せが確立された。
【００２８】１． ｐＮＪ ５０７０ ２． ｐＮＪ ５０７３ ３． ｐＮＪ ５０７３＋ｐＴＢ９２ ４． ｐＮＪ ５０７３＋ｐＮＪ９２７９ 各プラスミド組合せの代表を、トリプトファンなしでの
増殖能力につき試験した。ｐＮＪ５０７３（これはＴｎ
７中へ挿入されたｔｒｐＥ遺伝子を有する）を取込んだ
細菌のみがトリプトファンなしで増殖できた。
増殖能力につき試験した。ｐＮＪ５０７３（これはＴｎ
７中へ挿入されたｔｒｐＥ遺伝子を有する）を取込んだ
細菌のみがトリプトファンなしで増殖できた。
【００２９】各プラスミド組合せを有する細菌の代表例
を、次いで、トリプトファンおよびＴｐ（Ｔｎ７につい
て選択のため）を含む培地中で増殖させた。ｐＴＢ９２
またはｐＮＪ９２７９が存在した場合にはＫｍも添加し
た。そのときに、培養物はその培地中に細菌生育の約５
０世代の間保持した。このような時間によって、不安定
プラスミド（ｐＮＪ５０７０またはｐＮＪ５０７３）は
喪失されうるようになる（ただし、それがまずＴｎ７の
コピイを細菌染色体に与え得ることを条件とする）。こ
の不安定プラスミドの喪失によって、細菌はＴｃに対し
感受性となる。前記の四つのプラスミド組合せのそれぞ
れからの３０の別々の単離物をＴｃに対する感受性、Ｔ
ｐR 、およびトリプトファンなしでの増殖能力について
試験し、下記の結果を得た。
を、次いで、トリプトファンおよびＴｐ（Ｔｎ７につい
て選択のため）を含む培地中で増殖させた。ｐＴＢ９２
またはｐＮＪ９２７９が存在した場合にはＫｍも添加し
た。そのときに、培養物はその培地中に細菌生育の約５
０世代の間保持した。このような時間によって、不安定
プラスミド（ｐＮＪ５０７０またはｐＮＪ５０７３）は
喪失されうるようになる（ただし、それがまずＴｎ７の
コピイを細菌染色体に与え得ることを条件とする）。こ
の不安定プラスミドの喪失によって、細菌はＴｃに対し
感受性となる。前記の四つのプラスミド組合せのそれぞ
れからの３０の別々の単離物をＴｃに対する感受性、Ｔ
ｐR 、およびトリプトファンなしでの増殖能力について
試験し、下記の結果を得た。
【００３０】 １． ３０／３０ＴｃS ＴｐR トリプトファン依存（Ｔｒｐ- ） ２． ３０／３０ＴｃR ＴｐR トリプトファン不依存（Ｔｒｐ+ ） ３． ３０／３０ＴｃR ＴｐR Ｔｒｐ+ ４． １６／３０ ＴｃR ＴｐR Ｔｒｐ+ ８／３０ ＴｃR ＴｐR Ｔｒｐ+ ６／３０ ＴｃR ＴｐR Ｔｒｐ- 上記の結果は、正常Ｔｎ７を含むｐＮＪ５０７０はトラ
ンスポソンを与えてから細菌宿主から失なわれうるこ
と；しかし中央域からのＤＮＡ除去を受けたＴｎ７を含
むｐＮＪ５０７３とトランスポソンを与えることができ
ず、従ってそのプラスミドは細菌によって保持されたま
まであること；を示している。さらには、ｐＴＢ９２の
存在はこれに何らの影響を与えない。しかし、No４にお
けるようにＴｎ７の中央域を有するｐＮＪ９２７９が存
在する場合には、試験した単離体の約１／２はそれらが
受けた転位と一致する特性を有する。これはNo４から二
つのＴｃS ＴｐR Ｔrp+ 単離体を採り、アンピシリン耐
性（ＡｐR ）について選択するプラスミドｐＧＳＳ１５
のＤＮＡでそれらをトランスフォーメーション（転換）
することにより、確認された。ｐＧＳＳ１５はｐＮＪ９
２７９と同じ非相容性グループ（ＩｎｅＱ）のプラスミ
ドであり、従ってそれを導入することによりｐＮＪ９２
７９が喪失されることになる（これはＫｍに対して細菌
が感受性となることによって示される）。しかし両方の
場合にｐＧＳＳ１５を含む細菌はＴｐR を維持し、また
トリプトファンなしでもなお増殖できた。このことはク
ローン化trp Ｅ遺伝子をもつＴｎ７の転位は細菌染色体
に対し起ったことを示している。Ｔｎ７およびtrp Ｅの
染色体への挿入が安定であることを示すために、それを
含む単離物中へＲＰ４を接合により導入し、また染色体
中に正常Ｔｎを含む単離物へもＲＰ４を接合により導入
した。両方のＲＰ４含有細菌を次いで、ＲＰ４（Ｔ
ｃR ）またはＴｎ７（ＴｐR ）のいずれかの伝達につい
ての選択をもつ区別しうるＥ．coliへの接合ドナーとし
て用いた。そのドナーが正常Ｔｎ７を含んだ場合には、
１０，０００個の細菌のうちのほぼ５個がＲＰ４を受け
取りまた遺伝性Ｔｎ７は転位によりＲＰ４へ伝達され次
いで接合中に伝達された。しかしドナーが、挿入ｔrpＥ
遺伝子をもつ欠陥Ｔｎ７を含んだ場合には、ＴｐR の伝
達は検出されなかった（すなわち少なくとも１０００倍
効率が劣る）。このことは、その能力化されたＴｎ７が
染色体の安定な部分であることを示している。
ンスポソンを与えてから細菌宿主から失なわれうるこ
と；しかし中央域からのＤＮＡ除去を受けたＴｎ７を含
むｐＮＪ５０７３とトランスポソンを与えることができ
ず、従ってそのプラスミドは細菌によって保持されたま
まであること；を示している。さらには、ｐＴＢ９２の
存在はこれに何らの影響を与えない。しかし、No４にお
けるようにＴｎ７の中央域を有するｐＮＪ９２７９が存
在する場合には、試験した単離体の約１／２はそれらが
受けた転位と一致する特性を有する。これはNo４から二
つのＴｃS ＴｐR Ｔrp+ 単離体を採り、アンピシリン耐
性（ＡｐR ）について選択するプラスミドｐＧＳＳ１５
のＤＮＡでそれらをトランスフォーメーション（転換）
することにより、確認された。ｐＧＳＳ１５はｐＮＪ９
２７９と同じ非相容性グループ（ＩｎｅＱ）のプラスミ
ドであり、従ってそれを導入することによりｐＮＪ９２
７９が喪失されることになる（これはＫｍに対して細菌
が感受性となることによって示される）。しかし両方の
場合にｐＧＳＳ１５を含む細菌はＴｐR を維持し、また
トリプトファンなしでもなお増殖できた。このことはク
ローン化trp Ｅ遺伝子をもつＴｎ７の転位は細菌染色体
に対し起ったことを示している。Ｔｎ７およびtrp Ｅの
染色体への挿入が安定であることを示すために、それを
含む単離物中へＲＰ４を接合により導入し、また染色体
中に正常Ｔｎを含む単離物へもＲＰ４を接合により導入
した。両方のＲＰ４含有細菌を次いで、ＲＰ４（Ｔ
ｃR ）またはＴｎ７（ＴｐR ）のいずれかの伝達につい
ての選択をもつ区別しうるＥ．coliへの接合ドナーとし
て用いた。そのドナーが正常Ｔｎ７を含んだ場合には、
１０，０００個の細菌のうちのほぼ５個がＲＰ４を受け
取りまた遺伝性Ｔｎ７は転位によりＲＰ４へ伝達され次
いで接合中に伝達された。しかしドナーが、挿入ｔrpＥ
遺伝子をもつ欠陥Ｔｎ７を含んだ場合には、ＴｐR の伝
達は検出されなかった（すなわち少なくとも１０００倍
効率が劣る）。このことは、その能力化されたＴｎ７が
染色体の安定な部分であることを示している。
【００３１】実施例３ メチロフイルス・メチロトロフスＮＣＩＢ第１０５１５
号菌株における転位可能 ベクター系の使用 ｐＮＪ５０７３およびｐＮＪ９２７９の両者を含むＥ．
coli菌株を用いて、接合により両プラスミドメチロフイ
ルス・メチロトロフス菌株へ伝達した（ＴｃR およびＫ
ｍR について選択）。この二重耐性メチロフイルス・メ
チロトロフス菌株の単離物をＴｐおよびＫｍ選択で約５
０世代にわたり増殖させた。この増殖時間の終了時に、
それぞれからの１０の単離物を、それらの抗生物質耐性
パターンについて試験した。すべてはＴｃS ＴｐR Ｋｍ
R であった。すなわち、それらはそれらが受けた転位と
一致する特性を有していた。染色体への転位が起ったこ
とを確認するために、ｐＧＳＳ１５を三つのＴｃS Ｔｐ
R ＫｍR 単離物中へ、ｐＮＪ５０５５での可動化により
導入した。（ｐＮＪ５０５５はＲＰ４から得られる不安
定な誘導体の１つである）。ＫｍSによって示されるよ
うに、ｐＮＪ９２７９は排除されたが、ＴｐR は三つの
場合のすべてにおいて保持された。このことは、メチロ
フイルス・メチロトロフス菌株染色体への転位が生じた
ことを確認するものである。さらには、約５０世代にわ
たりＴｐ選択なしで増殖させ、次いでＴｐR の喪失につ
いて試験することにより、挿入は安定であることが示さ
れた。試験した１００の単離物のうちの１００について
喪失が認められなかった。
号菌株における転位可能 ベクター系の使用 ｐＮＪ５０７３およびｐＮＪ９２７９の両者を含むＥ．
coli菌株を用いて、接合により両プラスミドメチロフイ
ルス・メチロトロフス菌株へ伝達した（ＴｃR およびＫ
ｍR について選択）。この二重耐性メチロフイルス・メ
チロトロフス菌株の単離物をＴｐおよびＫｍ選択で約５
０世代にわたり増殖させた。この増殖時間の終了時に、
それぞれからの１０の単離物を、それらの抗生物質耐性
パターンについて試験した。すべてはＴｃS ＴｐR Ｋｍ
R であった。すなわち、それらはそれらが受けた転位と
一致する特性を有していた。染色体への転位が起ったこ
とを確認するために、ｐＧＳＳ１５を三つのＴｃS Ｔｐ
R ＫｍR 単離物中へ、ｐＮＪ５０５５での可動化により
導入した。（ｐＮＪ５０５５はＲＰ４から得られる不安
定な誘導体の１つである）。ＫｍSによって示されるよ
うに、ｐＮＪ９２７９は排除されたが、ＴｐR は三つの
場合のすべてにおいて保持された。このことは、メチロ
フイルス・メチロトロフス菌株染色体への転位が生じた
ことを確認するものである。さらには、約５０世代にわ
たりＴｐ選択なしで増殖させ、次いでＴｐR の喪失につ
いて試験することにより、挿入は安定であることが示さ
れた。試験した１００の単離物のうちの１００について
喪失が認められなかった。
【００３２】Ｅ．coliの菌株中のプラスミドｐＮＪ５０
７３およびｐＮＪ９２７９は、英国スコットランド、ア
バーデイーン、トーリイ・リサーチ・ステーションのザ
・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル
・バクテリア（ＮＣＩＢ）において寄託番号第１１７１
４および１１７１５号でそれぞれ寄託されている（ブタ
ペスト条約に基く受託日：１９８２年１月２７日）。
７３およびｐＮＪ９２７９は、英国スコットランド、ア
バーデイーン、トーリイ・リサーチ・ステーションのザ
・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル
・バクテリア（ＮＣＩＢ）において寄託番号第１１７１
４および１１７１５号でそれぞれ寄託されている（ブタ
ペスト条約に基く受託日：１９８２年１月２７日）。
【００３３】プラスミドの接頭記号「ｐＮＪ」は米国コ
ネチカット州スタンフォード大学医学微生物学部のエス
サー・Ｍ・レーダーバーグ（Lederberg ）によって維持
されているザ・プラスミド・リファレンス。センターに
登録されている。
ネチカット州スタンフォード大学医学微生物学部のエス
サー・Ｍ・レーダーバーグ（Lederberg ）によって維持
されているザ・プラスミド・リファレンス。センターに
登録されている。
【００３４】
【００３５】
【図１】プラスミドＲＰ４からのプラスミドｐＮＪ５０
００の誘導操作の線図である。
００の誘導操作の線図である。
【００３６】
【図２】プラスミドｐＮＪ５０７０からのプラスミドｐ
ＮＪ５０７３の誘導操作の線図である。
ＮＪ５０７３の誘導操作の線図である。
【００３７】
【図３】プラスミドｐＴＢ９２からのプラスミドｐＮＪ
９２７９の誘導操作の線図である。
９２７９の誘導操作の線図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (4)
- 【請求項１】 グラム陰性細菌同志間でのＤＮＡ物質の
伝達のための、第１のプラスミドおよび第２のプラスミ
ドを含むベクターであって、トランスポソン（Ａ）に異
なるＤＮＡ分子間を移動する能力を授与するのに必要な
ファクターをコードする配列を含むＤＮＡ部分が取り除
かれているトランスポソン（Ａ）を該第１のプラスミド
が有し、トランスポソン（Ａ）に異なるＤＮＡ分子間を
移動する能力を授与するのに必要なファクターをコード
する配列を含むトランスポソン（Ａ）からのＤＮＡ断片
を該第２のプラスミドが有する、ことを特徴とする上記
ベクター。 - 【請求項２】 第１のプラスミドとしてプラスミドｐＮ
Ｊ５０７３が使用されている、請求項１に記載のベクタ
ー。 - 【請求項３】 第２のプラスミドとしてプラスミドｐＮ
Ｊ９２７９が使用されている、請求項１に記載のベクタ
ー。 - 【請求項４】 グラム陰性細菌同志間でのＤＮＡ物質の
伝達のための、第１のプラスミドおよび第２のプラスミ
ドを含むベクターであって、トランスポソン（Ａ）に異
なるＤＮＡ分子間を移動する能力を授与するのに必要な
ファクターをコードする配列を含むＤＮＡ部分が取り除
かれているトランスポソン（Ａ）を該第１のプラスミド
が有し、トランスポソン（Ａ）に異なるＤＮＡ分子間を
移動する能力を授与するのに必要なファクターをコード
する配列を含むトランスポソン（Ａ）からのＤＮＡ断片
を該第２のプラスミドが有する、ことを特徴とする上記
ベクター、を含むグラム陰性細菌。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8204573 | 1982-02-17 | ||
| GB8204573 | 1982-02-17 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58025446A Division JPH0771500B2 (ja) | 1982-02-17 | 1983-02-17 | グラム陰性細菌の染色体に外来ｄｎａ物質を挿入する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04228081A JPH04228081A (ja) | 1992-08-18 |
| JPH0771494B2 true JPH0771494B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=10528384
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58025446A Expired - Lifetime JPH0771500B2 (ja) | 1982-02-17 | 1983-02-17 | グラム陰性細菌の染色体に外来ｄｎａ物質を挿入する方法 |
| JP3096573A Expired - Lifetime JPH0771494B2 (ja) | 1982-02-17 | 1991-04-26 | Ｄｎａ物質伝達のためのベクター |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58025446A Expired - Lifetime JPH0771500B2 (ja) | 1982-02-17 | 1983-02-17 | グラム陰性細菌の染色体に外来ｄｎａ物質を挿入する方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4590162A (ja) |
| EP (1) | EP0091723B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0771500B2 (ja) |
| DE (1) | DE3380261D1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4663285A (en) * | 1981-01-06 | 1987-05-05 | The Public Health Laboratory Service Board | Chimeric plasmids |
| EP0091723B1 (en) * | 1982-02-17 | 1989-07-26 | Imperial Chemical Industries Plc | Vector system |
| JPS59205983A (ja) * | 1983-04-28 | 1984-11-21 | ジエネツクス・コ−ポレイシヨン | 異種遺伝子を原核微生物で発現させる方法 |
| US4830965A (en) * | 1983-12-12 | 1989-05-16 | Canadian Patents And Development Ltd. | Transposable linkers to transfer genetic information |
| EP0174096A3 (en) * | 1984-08-02 | 1987-11-04 | Biotechnica International, Inc. | Vectors for introducing dna into bacterial chromosomes or for deleting it therefrom and for the production of protein |
| WO1988001646A1 (en) * | 1986-08-26 | 1988-03-10 | Allelix Inc. | Universal system for transposon mutagenesis |
| US4966841A (en) * | 1987-05-22 | 1990-10-30 | The Board Of Regents Of The University Of Washington | Enhanced vector production and expression of recombinant DNA products |
| FR2627508B1 (fr) * | 1988-02-22 | 1990-10-05 | Eurolysine | Procede pour l'integration d'un gene choisi sur le chromosome d'une bacterie et bacterie obtenue par ledit procede |
| WO1999005295A1 (en) * | 1997-07-25 | 1999-02-04 | Thomas Jefferson University | Composition and method for targeted integration into cells |
| US6793095B1 (en) * | 1998-02-04 | 2004-09-21 | Essef Corporation | Blow-molded pressure tank with spin-welded connector |
Family Cites Families (1)
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|---|---|---|---|---|
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