JPH0288968A - ユーロピウムキレートを用いた多重蛍光標識 - Google Patents
ユーロピウムキレートを用いた多重蛍光標識Info
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
Ｃ産業上の利用分野］
本発明は適切な標識を用いた定量法における多重標識に
関するものであり、その標識はこれまでに知られている
そのような多重標識に起因する濃度消光の効果を避ける
ことができる。
関するものであり、その標識はこれまでに知られている
そのような多重標識に起因する濃度消光の効果を避ける
ことができる。
［従来の技術］
フルオレセイン、ローダミン、ダンジルクロライド、フ
ルオレスカミン、新標識テキサスレッドおよびフィコビ
リンタンパク質のような在来の標識プローブを用いる蛍
光標識は定量及び定量以外の適用分野に広く用いられて
いる。又、蛍光性標識は現在、放射性活性標識に代わる
ものとして蛍光免疫検定法の分野において幅広く使用さ
れている。しかしながら定量の限界は主として機械での
高いバックグランドの蛍光の判読（ｈｉｇｈ ｂａｃｋ
−ｇｒｏｕｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｄ
ｉｎｇｓ）と免疫反応体に結合されるのは限られた数の
標識という理由からミクロモーラ−とナノモーラ一の範
囲に限定される。
ルオレスカミン、新標識テキサスレッドおよびフィコビ
リンタンパク質のような在来の標識プローブを用いる蛍
光標識は定量及び定量以外の適用分野に広く用いられて
いる。又、蛍光性標識は現在、放射性活性標識に代わる
ものとして蛍光免疫検定法の分野において幅広く使用さ
れている。しかしながら定量の限界は主として機械での
高いバックグランドの蛍光の判読（ｈｉｇｈ ｂａｃｋ
−ｇｒｏｕｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｄ
ｉｎｇｓ）と免疫反応体に結合されるのは限られた数の
標識という理由からミクロモーラ−とナノモーラ一の範
囲に限定される。
原則として蛍光免疫検定法の感度は、標識された試薬に
多数の蛍光性物質を付けることによって改良することが
できる。
多数の蛍光性物質を付けることによって改良することが
できる。
これは（巨大分子の試薬に対して）直接的にあるいは間
接的に、蛍光性分子で標識された担体巨大分子に対しそ
の試薬を複合することによって達成される。しかし、あ
いにくこれらの方法はうまくいかない、すなわちその増
加した付加物のレベルがまず最初に量子効率を減じ、そ
れから全体の蛍光の発光を減少するという濃度消光をす
ぐに生じるからである。
接的に、蛍光性分子で標識された担体巨大分子に対しそ
の試薬を複合することによって達成される。しかし、あ
いにくこれらの方法はうまくいかない、すなわちその増
加した付加物のレベルがまず最初に量子効率を減じ、そ
れから全体の蛍光の発光を減少するという濃度消光をす
ぐに生じるからである。
これらの問題についてはＡｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍｓ
。
。
□ （１９６９：１３３ ：２６３−２７６）の中でＣ
ｈｅｎ、 Ｒ，Ｆ、によって、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、
（１９７，１０３： ３３９−３４１）の中でＨａｓｓ
ａｎ Ｍ、 Ｌａｎｄｏｎ Ｊ、 Ｓｍ１ｔｈ Ｄ、Ｓ
、によって、Ａ １．Ｏｔｉｃｓ、（１９７６； １
５； ３１３５−９）の中でＨｉｒｓｃｈｆｅｌｄ Ｔ
、によってさらに詳細に述べられている。
ｈｅｎ、 Ｒ，Ｆ、によって、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、
（１９７，１０３： ３３９−３４１）の中でＨａｓｓ
ａｎ Ｍ、 Ｌａｎｄｏｎ Ｊ、 Ｓｍ１ｔｈ Ｄ、Ｓ
、によって、Ａ １．Ｏｔｉｃｓ、（１９７６； １
５； ３１３５−９）の中でＨｉｒｓｃｈｆｅｌｄ Ｔ
、によってさらに詳細に述べられている。
例えば巨大分子が３２のフルオレセイン分子で標識され
た場合、ヒルシフェルト（旧ｒｓｃｈｆｅｌｄ）によっ
て前記文献の中で述べられているように、フリーのフル
オレセイン２分子のみに対応する蛍光強度が得られてい
る。
た場合、ヒルシフェルト（旧ｒｓｃｈｆｅｌｄ）によっ
て前記文献の中で述べられているように、フリーのフル
オレセイン２分子のみに対応する蛍光強度が得られてい
る。
さらに近年、抗原に共有結合する充填剤（ｂｕｌｋ−ｉ
ｎｇ ａｇｅｎｔ）がフルオレセイン標識を分散し、濃
度消光を最小にするために利用された。この技術を用い
ると、Ｒｏｗｌａｙ、Ｇ、Ｌ、、 Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏ
ｎ、Ｔ、、 Ｌｏｕｉｅ。
ｎｇ ａｇｅｎｔ）がフルオレセイン標識を分散し、濃
度消光を最小にするために利用された。この技術を用い
ると、Ｒｏｗｌａｙ、Ｇ、Ｌ、、 Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏ
ｎ、Ｔ、、 Ｌｏｕｉｅ。
Ａｏ、らによってＣｌ１ｎ、 Ｃｈｅｍ、 （１９８７
： ３３： １５３６）の中で明らかにされているよう
に、７．７のフルオレセイン分子に相当する蛍光強度が
生じるように最大８．８のフルオレセイン分子が結合さ
れた。
： ３３： １５３６）の中で明らかにされているよう
に、７．７のフルオレセイン分子に相当する蛍光強度が
生じるように最大８．８のフルオレセイン分子が結合さ
れた。
また別に、多重標識に濃度消光を受けない発蛍光団を用
いることができる。 Ｅｘｌｅｙ、Ｄ、、Ｅｋｅｋｅ。
いることができる。 Ｅｘｌｅｙ、Ｄ、、Ｅｋｅｋｅ。
Ｇ、１．によってＪ、 ５ｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 （１９８１，１４：１２９７−３０２）の中で報
告されているように、ポリリジンに置換された多重ウン
ベリフェロン標識がステロイドの蛍光免疫検定法に効果
的に用いられた。そのウンベリフェロン発蛍光団は１０
リジン残基に対しｌ蛍光のレベルで濃度消光をおこさな
かった。
ｍ、 （１９８１，１４：１２９７−３０２）の中で報
告されているように、ポリリジンに置換された多重ウン
ベリフェロン標識がステロイドの蛍光免疫検定法に効果
的に用いられた。そのウンベリフェロン発蛍光団は１０
リジン残基に対しｌ蛍光のレベルで濃度消光をおこさな
かった。
ヒルシフェルト（前出）は、フルオレセインの濃度消光
問題を克服するための手際のよい方法を呈示した。すな
わち試料を完全な光化学的漂白まで強力レーザーにて放
射した時、各発蛍光団が同一の最大量光子を放出するこ
とを紹介している。
問題を克服するための手際のよい方法を呈示した。すな
わち試料を完全な光化学的漂白まで強力レーザーにて放
射した時、各発蛍光団が同一の最大量光子を放出するこ
とを紹介している。
これによって彼は濃度消光にかかわらず、使用する標識
の総量に伴うシグナルの直線的増加を認めるに達した。
の総量に伴うシグナルの直線的増加を認めるに達した。
彼は、この技術が複雑で高価な器材のために実用的でな
いにもかかわらず、この技術を実施することによって多
量のフルオレセインで置換したポリエチレンイミン標識
の単体抗体分子を検出することができた。このことは Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ、Ｔ、の別の論文、Ａ １．Ｏ
ｔｉｅｓ、 （１９７６：１５： ２９６５−６１の中
で報告されている。
いにもかかわらず、この技術を実施することによって多
量のフルオレセインで置換したポリエチレンイミン標識
の単体抗体分子を検出することができた。このことは Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ、Ｔ、の別の論文、Ａ １．Ｏ
ｔｉｅｓ、 （１９７６：１５： ２９６５−６１の中
で報告されている。
［発明が解決しようとする課題］
本発明において多重標識システムに関する一般的に経験
される濃度消光の効果を避け、かわりに活性化した標識
が増強したシグナルを与えるという効果を提供しようと
するものである。
される濃度消光の効果を避け、かわりに活性化した標識
が増強したシグナルを与えるという効果を提供しようと
するものである。
［課題を解決するための手段］
本発明は、多重標識を利用する従来の蛍光試薬システム
における問題点を解決するために鋭意検討した結果、濃
度消光の影響を避けることができ、増強された発光強度
をもつ定量方法を達成したものである。
における問題点を解決するために鋭意検討した結果、濃
度消光の影響を避けることができ、増強された発光強度
をもつ定量方法を達成したものである。
すなわち、本発明は多重標識システムにおいてａ）用い
られる複合体が、担体粒子に連結（ｌ １ｎｋ）するア
ビジン、又はストレプトアビジンを含んでおり、その担
体粒子は表面上に独立に使用可能な標識で標識化するこ
とができるアミノ基を１５以上有し、又その担体粒子が
複合体形成のためにアビジンまたはストレプトアビジン
に連結可能であること ｂ）定量に用いられる蛍光試薬システムであり、アビジ
ン又はストレプトアビジンが適切にピオチンにより定量
成分と連結し、担体が少なくとも１５の標識を配するこ
とができる多数のアミノ基に付着する複数の配位子の部
分で標識されており、その各々の標識は選ばれたランタ
ニド金属の存在で蛍光性キレートを形成すること、また
、本蛍光試薬システムは蛍光を発するように刺激されて
、そのランタニド金属イオン配位子部分の多数が溶液で
発する蛍光放射強度に比べて増幅された強度で蛍光を放
射することによって蛍光試薬システムにおける多重標識
に基づく消光効果を無くすこと Ｃ） パインディングアッセイ（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓ
ｓａｙ）において上記の多数の複合体を有するバインダ
ー（ｂｉｎｄｅｒ）の使用は、対応する多数の物質をそ
こへ化学的に連結し、担体粒子は独立したアミノ基に付
された配位子部分から成る多数の標識によって標識化さ
れること また、各々の配位子部分は、蛍光性キレートを形成する
ために選出されたランタニド金属イオンをそこへ安定的
に保有し、それぞれの連結成分は化学的にバインダーに
連結し、アビジン又はストレプトアビジンに結合してい
るピオチン分子を含んでいること を特徴としている。
られる複合体が、担体粒子に連結（ｌ １ｎｋ）するア
ビジン、又はストレプトアビジンを含んでおり、その担
体粒子は表面上に独立に使用可能な標識で標識化するこ
とができるアミノ基を１５以上有し、又その担体粒子が
複合体形成のためにアビジンまたはストレプトアビジン
に連結可能であること ｂ）定量に用いられる蛍光試薬システムであり、アビジ
ン又はストレプトアビジンが適切にピオチンにより定量
成分と連結し、担体が少なくとも１５の標識を配するこ
とができる多数のアミノ基に付着する複数の配位子の部
分で標識されており、その各々の標識は選ばれたランタ
ニド金属の存在で蛍光性キレートを形成すること、また
、本蛍光試薬システムは蛍光を発するように刺激されて
、そのランタニド金属イオン配位子部分の多数が溶液で
発する蛍光放射強度に比べて増幅された強度で蛍光を放
射することによって蛍光試薬システムにおける多重標識
に基づく消光効果を無くすこと Ｃ） パインディングアッセイ（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓ
ｓａｙ）において上記の多数の複合体を有するバインダ
ー（ｂｉｎｄｅｒ）の使用は、対応する多数の物質をそ
こへ化学的に連結し、担体粒子は独立したアミノ基に付
された配位子部分から成る多数の標識によって標識化さ
れること また、各々の配位子部分は、蛍光性キレートを形成する
ために選出されたランタニド金属イオンをそこへ安定的
に保有し、それぞれの連結成分は化学的にバインダーに
連結し、アビジン又はストレプトアビジンに結合してい
るピオチン分子を含んでいること を特徴としている。
近年放射性免疫測定法に比べて蛍光に基づく定量法が大
変有効な手法であるといわれている。理論上、特にユー
ロピウムキレートを含む蛍光標識システムが放射性免疫
定量法で通常用いられる１１Ｊよりもさらに高感度であ
ると一般に理解されている。そのため蛍光標識を含む放
射性標識に代わる標識法は分析の分野で大きな評価を得
ている。
変有効な手法であるといわれている。理論上、特にユー
ロピウムキレートを含む蛍光標識システムが放射性免疫
定量法で通常用いられる１１Ｊよりもさらに高感度であ
ると一般に理解されている。そのため蛍光標識を含む放
射性標識に代わる標識法は分析の分野で大きな評価を得
ている。
蛍光標識以外で標識を付けるために用いられる他の成分
としては、アクリジニウムエステル、ルミノール誘導体
などの化学ルミネッセンスプローブ、西洋わさびペルオ
キシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスフ
ァターゼのような酵素プローブ、さらにユーロピウムを
含むランタニド金属イオンのような金属イオンプローブ
が含まれている。
としては、アクリジニウムエステル、ルミノール誘導体
などの化学ルミネッセンスプローブ、西洋わさびペルオ
キシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスフ
ァターゼのような酵素プローブ、さらにユーロピウムを
含むランタニド金属イオンのような金属イオンプローブ
が含まれている。
標識としての蛍光性ユーロピウムキレートにおいては、
２つの一般的定量法がある。まず、第１の方法として、
ＥＤＴＡ （エチレンジアミノ四酢酸）誘導体のような
ブリッジ（キレータ−）を介して抗体分子に結合するＥ
ｕ”を用いる手法がある。
２つの一般的定量法がある。まず、第１の方法として、
ＥＤＴＡ （エチレンジアミノ四酢酸）誘導体のような
ブリッジ（キレータ−）を介して抗体分子に結合するＥ
ｕ”を用いる手法がある。
本方法はＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓ
ａ ５（ｐｐ ２０３−２１７Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ：
Ｊ、Ｗｉｌｅｙ １９８５）の中でＬｏｖｇｒｅｎ、
Ｔ、。
ａ ５（ｐｐ ２０３−２１７Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ：
Ｊ、Ｗｉｌｅｙ １９８５）の中でＬｏｖｇｒｅｎ、
Ｔ、。
Ｈｅｍｍ１ ｌａ、 １． 、 Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎ、
に、、 Ｈａｌｏｎｅｎ、Ｐ、、らによって確認されて
いる。
に、、 Ｈａｌｏｎｅｎ、Ｐ、、らによって確認されて
いる。
すなわち免疫学的反応が完了したのち、ｐＨを下げるこ
とによってＥｕ”をＥＤＴＡから分離する。それからＥ
ｕ”はＮＴＡにトリロ三酢酸）、ＴＯＰＯ（）リオクチ
ルフォスファインオキサイド）のような適する配位子と
複合された後、蛍光が溶液中でリシルブトモード（ｒｅ
ｓｏｌｖｅｄ ｍｏｄｅ）の時に測定される。この２段
階に及ぶ方法は、ＥＤＴＡ−Ｅｕ３＋複合体が本質的に
蛍光性を持たないという理由から必要である。そのため
、この状態は幾つかの欠点を有しているが、そのうち最
も顕著な点は、付着するＥｕ”の混合に対して不安定で
あるということである。それにもかかわらずそのシステ
ムはＥｕ”の最適混合において非常に高感度の標識を呈
し、Ｅｕ’°−（ＮＴＡ） ｓ （ＴＯＰＯ） ｚ複合
体の形成はＥｕ”濃度的１０”ｍｏｌ／ｌの範囲内の非
常に低い検出限界を示す、この見解はＨｅｍｍ１ｌｌａ
、１．、 Ｄａｋｕｂｕ。
とによってＥｕ”をＥＤＴＡから分離する。それからＥ
ｕ”はＮＴＡにトリロ三酢酸）、ＴＯＰＯ（）リオクチ
ルフォスファインオキサイド）のような適する配位子と
複合された後、蛍光が溶液中でリシルブトモード（ｒｅ
ｓｏｌｖｅｄ ｍｏｄｅ）の時に測定される。この２段
階に及ぶ方法は、ＥＤＴＡ−Ｅｕ３＋複合体が本質的に
蛍光性を持たないという理由から必要である。そのため
、この状態は幾つかの欠点を有しているが、そのうち最
も顕著な点は、付着するＥｕ”の混合に対して不安定で
あるということである。それにもかかわらずそのシステ
ムはＥｕ”の最適混合において非常に高感度の標識を呈
し、Ｅｕ’°−（ＮＴＡ） ｓ （ＴＯＰＯ） ｚ複合
体の形成はＥｕ”濃度的１０”ｍｏｌ／ｌの範囲内の非
常に低い検出限界を示す、この見解はＨｅｍｍ１ｌｌａ
、１．、 Ｄａｋｕｂｕ。
Ｓ、、 Ｍｕｋｋａｌａ、Ｖ、Ｍ、、 ５ｉｉｔａｒ、
）１．、 Ｌｏｖｇｒｅｎ、Ｔ、、らによってＡｎａｌ
、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８４，＋３７：３７５−３
４３）の中で確かめられている。
）１．、 Ｌｏｖｇｒｅｎ、Ｔ、、らによってＡｎａｌ
、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８４，＋３７：３７５−３
４３）の中で確かめられている。
標識としてユーロピウムキレートを用いる第２の方法と
しては、蛍光性複合体形成のために過剰のＥｕ”を取り
入れるというものがある。この目的に適したキレートは
１．１０−フェナントロリン−２，９−カルボン酸の誘
導体として合成、確認されたものであり、特定の具体的
物質としては４．７−ビス（クロロスルフォフェニル）
−１，１０−フェナントロリン−２，９−ジカルボン酸
があり、下記においてはＢＣＰＯＡで表わされている。
しては、蛍光性複合体形成のために過剰のＥｕ”を取り
入れるというものがある。この目的に適したキレートは
１．１０−フェナントロリン−２，９−カルボン酸の誘
導体として合成、確認されたものであり、特定の具体的
物質としては４．７−ビス（クロロスルフォフェニル）
−１，１０−フェナントロリン−２，９−ジカルボン酸
があり、下記においてはＢＣＰＯＡで表わされている。
この化合物の合成については、Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａ
ＲＡ。
ＲＡ。
Ｐｏ１ｌａｋ Ａ、 Ａ１１ｏｒｅ Ｂ、Ｔｅｍｐｌｅ
ｔｏｎ、ＥＦ、Ｍｏｒｔｏｎ ＲＣ。
ｔｏｎ、ＥＦ、Ｍｏｒｔｏｎ ＲＣ。
Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰによってＣｌ１ｎ、 Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、（＋９８８：２１：１７３−１７８）中で明
らかにされている。
ｃｈｅｍ、（＋９８８：２１：１７３−１７８）中で明
らかにされている。
さらにこのキレート化合物に対する参考文献としてわれ
われのカナダ出願筒４８８．５１３号（１９８５年８月
１２日出＠）ともっと早いヨーロッパ出願筒８５３０５
４７７、３号（１９８５年７月３１日出願）がある。蛍
光性金属イオンキレート形成物中のそのような配位子は
、多数の生物学的化合物の免疫検定法に用いることがで
きるであろう、原則的に本定量法の条件においてはＥｕ
”の混合問題がなくなり、蛍光な固相上で直接側ること
ができるので有利である。
われのカナダ出願筒４８８．５１３号（１９８５年８月
１２日出＠）ともっと早いヨーロッパ出願筒８５３０５
４７７、３号（１９８５年７月３１日出願）がある。蛍
光性金属イオンキレート形成物中のそのような配位子は
、多数の生物学的化合物の免疫検定法に用いることがで
きるであろう、原則的に本定量法の条件においてはＥｕ
”の混合問題がなくなり、蛍光な固相上で直接側ること
ができるので有利である。
しかしながら、本方法にもＥｕ”を過剰に用いる必要が
あるという欠点が１つある。
あるという欠点が１つある。
もしＢＣＰＯＡとＥｕ”の比がｌ：１の複合体を形成す
るとき、それはＥ Ｌｌ”−（ＢＣＰＤＡ）。（ここで
いうｎは２又は３）の複合体よりも低い蛍光量である。
るとき、それはＥ Ｌｌ”−（ＢＣＰＤＡ）。（ここで
いうｎは２又は３）の複合体よりも低い蛍光量である。
このＢＣＰＤＡは約１０−”ｍｏｌ／ｌまで下げても検
出することが可能で、その濃度は過剰のキレートを用い
て測定されるＥ ｕ”の検出限界よりも２ランク（ｔｗ
ｏ ｏｒｄｅｒｓ）高い。
出することが可能で、その濃度は過剰のキレートを用い
て測定されるＥ ｕ”の検出限界よりも２ランク（ｔｗ
ｏ ｏｒｄｅｒｓ）高い。
１、１０−フェナントロリン−２，９−ジカルボン酸配
位子化合物として用いられる物質は化学式Ｉに示してい
る成分から成るグループから選出される。
位子化合物として用いられる物質は化学式Ｉに示してい
る成分から成るグループから選出される。
対する置換基である。すなわち（ａ）：３か６１２の炭
素を含むカルボン酸又は複素環式化合物の環、又は（ｂ
）：Ｘで置換される一般化学式Ｉａのカルボン酸又は複
素環式化合物の環 にに こで、Ｒ２からＲ６のグループはそれぞれ独立しテＨ、
Ｘ−（ｆｌＪ−又はＲｓテある。Ｘは−５０３−Ｍ”
テＭは金属イオン又はタンパク質に共有結合する官能基
のグループ、又はタンパク質に共有結合する官能基に容
易に変わるグループである。Ｒ７は１から１２の炭素を
もつ二価の脂肪族残基、又は３から１２の炭素をもつ二
価のカルボン酸、複素環式化合物の残基で、ｎは０また
はｌである。
素を含むカルボン酸又は複素環式化合物の環、又は（ｂ
）：Ｘで置換される一般化学式Ｉａのカルボン酸又は複
素環式化合物の環 にに こで、Ｒ２からＲ６のグループはそれぞれ独立しテＨ、
Ｘ−（ｆｌＪ−又はＲｓテある。Ｘは−５０３−Ｍ”
テＭは金属イオン又はタンパク質に共有結合する官能基
のグループ、又はタンパク質に共有結合する官能基に容
易に変わるグループである。Ｒ７は１から１２の炭素を
もつ二価の脂肪族残基、又は３から１２の炭素をもつ二
価のカルボン酸、複素環式化合物の残基で、ｎは０また
はｌである。
Ｒ６は１から１２の炭素をもつ脂肪族グループ、又は３
から１２の炭素をもつカルボン酸、複素環式化合物グル
ープ又はその有する炭素で互いに形成することができる
隣接するＲ３からＲ６グループのルボン酸の残基、Ｘは
上記に示す内容をもち、ｍは１から４の整数である。又
は（ｃ）オルトキノン環である。
から１２の炭素をもつカルボン酸、複素環式化合物グル
ープ又はその有する炭素で互いに形成することができる
隣接するＲ３からＲ６グループのルボン酸の残基、Ｘは
上記に示す内容をもち、ｍは１から４の整数である。又
は（ｃ）オルトキノン環である。
それらは少なくともＬからＲ６の１つがｘ−［１−。
である（ここでいうＸ、 Ｒｙ、 ｎは上記に示した
意味をもつ）かあるいは隣接するＲ１からＲ６の少なく
とも１つのペアが上記に示す化学式Ｉａの環、又はオル
トキノン環、トリへロメチル型（ｔｒｉｈａｌｏ−ｍｅ
ｔｈｙｌ ｆｏｒｍｓ） 、塩類、エステル類及び前記
ハロゲン化物で、それらは容易に加水分解して化学式ゲ
ン化物で、それらは容易に加水分解して化学式Ｉの酸を
形成する。
意味をもつ）かあるいは隣接するＲ１からＲ６の少なく
とも１つのペアが上記に示す化学式Ｉａの環、又はオル
トキノン環、トリへロメチル型（ｔｒｉｈａｌｏ−ｍｅ
ｔｈｙｌ ｆｏｒｍｓ） 、塩類、エステル類及び前記
ハロゲン化物で、それらは容易に加水分解して化学式ゲ
ン化物で、それらは容易に加水分解して化学式Ｉの酸を
形成する。
同時に出されている我々の他の出願の中の記載に示した
ように４．７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリ
ン−２，９−ジカルボン酸はランタニド金属イオン、好
ましくはユーロピウム金属イオンを用いた時安定性の高
い蛍光性キレート形成に特に有効であり、その金属イオ
ンは安定的に固相に付着し、固相に結合しているキレー
トの蛍光の測定によって判断される定量法を導くことが
明らかにされている。その好ましい配位子としては、４
．７−ビス（クロロスルフォニル）−１，１０−フェナ
ントロリン−２，９−ジカルボン酸がある。
ように４．７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリ
ン−２，９−ジカルボン酸はランタニド金属イオン、好
ましくはユーロピウム金属イオンを用いた時安定性の高
い蛍光性キレート形成に特に有効であり、その金属イオ
ンは安定的に固相に付着し、固相に結合しているキレー
トの蛍光の測定によって判断される定量法を導くことが
明らかにされている。その好ましい配位子としては、４
．７−ビス（クロロスルフォニル）−１，１０−フェナ
ントロリン−２，９−ジカルボン酸がある。
しかしながら本発明は、上記記載配位子化合物の使用に
限定される方法ではない、だが現在の方法の中で用いら
れる他の蛍光性キレートの適正は、上記の主要な及び詳
細な説明に関する試験や実験によって決定することがで
きる。
限定される方法ではない、だが現在の方法の中で用いら
れる他の蛍光性キレートの適正は、上記の主要な及び詳
細な説明に関する試験や実験によって決定することがで
きる。
パインディングアッセイの基本試薬作成のためによく要
求される免疫活性体、特に抗原・抗体は反応活性分子で
ある。
求される免疫活性体、特に抗原・抗体は反応活性分子で
ある。
反応活性分子の抗原・抗体は、配位子の残基の導入に対
して反応する時、免疫反応の特性を不活性化し消失させ
る傾向がある。しかしながら本発明によると、パインデ
ィングアッセイのための試薬、複合体、そしてそれらの
使用方法は、パインディング作用の持つ活性を維持して
いるという結果を示している。これは抗原・抗体使用の
場合、免疫活性の損失がないということである。
して反応する時、免疫反応の特性を不活性化し消失させ
る傾向がある。しかしながら本発明によると、パインデ
ィングアッセイのための試薬、複合体、そしてそれらの
使用方法は、パインディング作用の持つ活性を維持して
いるという結果を示している。これは抗原・抗体使用の
場合、免疫活性の損失がないということである。
本発明に従って行なわれる多重標識蛍光法は、濃度消光
をおこさず、その増強効果を達成した。
をおこさず、その増強効果を達成した。
本発明によって実施される方法のそのような増強効果は
、実験において本定量法の目的・平易さの利点をそこな
うことなしにその感度を改良した。
、実験において本定量法の目的・平易さの利点をそこな
うことなしにその感度を改良した。
アビジン又はストレプトアビジンは担体粒子に結合する
が、その粒子は１５以上のアミノ基を供給し、そのアミ
ノ基の存在が粒子の多重標識に関与する。これまでに用
いられてきたプローブとは反対に、アビジン又はストレ
プトアビジンが結合する担体粒子のＢＣＰＤＡを用いた
多重標識は、複合体において消失（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ
）の効果をうけないという結果を示している。
が、その粒子は１５以上のアミノ基を供給し、そのアミ
ノ基の存在が粒子の多重標識に関与する。これまでに用
いられてきたプローブとは反対に、アビジン又はストレ
プトアビジンが結合する担体粒子のＢＣＰＤＡを用いた
多重標識は、複合体において消失（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ
）の効果をうけないという結果を示している。
化学式１で示される他のいくつかの選出された化合物も
標識として有効であることが認められるが、本発明の説
明を容易にするために配位子（標識）としてＢＣＰＤＡ
を利用したものについて説明することにする。
標識として有効であることが認められるが、本発明の説
明を容易にするために配位子（標識）としてＢＣＰＤＡ
を利用したものについて説明することにする。
蛍光法において、例えばＢＣＰＤＡを用いた多重標識蛍
光を特に使用した場合、蛍光の増強は３２５ｎｍでの励
起と６１５ｎｍでのシャープな蛍光バンドをもつ複合体
に観察される特別のストークスシフトによるものと考え
られる。それによって、本質的に励起と発光スペクトル
の間に重複はない。
光を特に使用した場合、蛍光の増強は３２５ｎｍでの励
起と６１５ｎｍでのシャープな蛍光バンドをもつ複合体
に観察される特別のストークスシフトによるものと考え
られる。それによって、本質的に励起と発光スペクトル
の間に重複はない。
第１図は定量方法システムの４つのタイプのうち３つを
図示したものであり、そのうちの１つは本発明によって
考え出されたものである０図中、１は固相、・はＢＣＰ
ＤＡ （４，７−ビス（クロロスルフォフェニル）−１
，１０−フェナントロリン−２，９−ジカルボン酸）
、ＡＦＰはα−フェトプロティン、Ｂはピオチン、ＳＡ
はストレプトアビジン、ＴＧはサイログロブリンを示し
ている。
図示したものであり、そのうちの１つは本発明によって
考え出されたものである０図中、１は固相、・はＢＣＰ
ＤＡ （４，７−ビス（クロロスルフォフェニル）−１
，１０−フェナントロリン−２，９−ジカルボン酸）
、ＡＦＰはα−フェトプロティン、Ｂはピオチン、ＳＡ
はストレプトアビジン、ＴＧはサイログロブリンを示し
ている。
システム（ａ）とシステム（ｂ）は、従来のタイプの方
法を示したものであるが、システム（Ｃ）は標識効果の
高まった本発明の事例の１つを示したものである。第４
の方法は第５図に示しである。
法を示したものであるが、システム（Ｃ）は標識効果の
高まった本発明の事例の１つを示したものである。第４
の方法は第５図に示しである。
第１図（Ｃ）のシステムは、第５図の方法の詳細な説明
へ進める前にここで詳しく説明しようとするものである
。
へ進める前にここで詳しく説明しようとするものである
。
システム（ａ）ではα−フェトプロティン（ＡＦＰ）分
子に連結している抗体がユーロピウム化合物中の化学式
Ｉに示す配位子で直接的に標識されている。
子に連結している抗体がユーロピウム化合物中の化学式
Ｉに示す配位子で直接的に標識されている。
システム（ｂ）はピオチンが結合し、ストレプトアビジ
ン分子上のユーロピウム結合中の化学式Ｉに示す配位子
を含むストレプトアビジン又アビジン分子に結合してい
る抗体を持つ。
ン分子上のユーロピウム結合中の化学式Ｉに示す配位子
を含むストレプトアビジン又アビジン分子に結合してい
る抗体を持つ。
本発明によるシステム（Ｃ）は、化学式Ｉの配位子で何
度も順次多重に標識した担体プロティンのサイログロブ
リン（ＴＧ）に化学的に結合しているストレプトアビジ
ン（ＳＡ）を示している。
度も順次多重に標識した担体プロティンのサイログロブ
リン（ＴＧ）に化学的に結合しているストレプトアビジ
ン（ＳＡ）を示している。
システム（ａ）及びシステム（ｂ）にまさるシステム（
ｃ）の重要な利点は以下に示す実施例の中において示し
ている。そこでは本システムから導くことができる多重
標識とそれからの蛍光シグナルはシステム（ａ）及び（
ｂ）を用いた場合の可能性をはるかに越えており、その
ためパインディングアッセイにおいてα−フェトプロテ
ィンが１０アットモル（ａｔｔｏｍｏｌｅｓ）のような
微量の存在でも検出操作を実施することができる。
ｃ）の重要な利点は以下に示す実施例の中において示し
ている。そこでは本システムから導くことができる多重
標識とそれからの蛍光シグナルはシステム（ａ）及び（
ｂ）を用いた場合の可能性をはるかに越えており、その
ためパインディングアッセイにおいてα−フェトプロテ
ィンが１０アットモル（ａｔｔｏｍｏｌｅｓ）のような
微量の存在でも検出操作を実施することができる。
もちろん、本発明の複合体や標識法に類似していると考
えられる多くのシステムがある０例えば抗体を直接ＢＣ
ＰＤＡで標識するか又は抗体を標識された牛血清アルブ
ミンに共有結合し、コルチゾールの免疫分析の検出に用
いられたことがある。約ｌＯのＢＣＰＤＡ分子が抗体に
直接的に結合されるが、抗体に共有結合しているＢＳＡ
上には約４０のＢＣＰＯＡ分子が結合可能である。さら
に高度な技術として、約２０のアミノ基を持つストレプ
トアビジンを約１４８ＣＰＯＡ分子で直接標識すること
が可能であり、この時補足試薬として、ピオチンが結合
している抗体が好まれて使用される。その結果、抗体に
対して１０ピオチン分子結合していると仮定すると標識
されたストレプトアビジンは約１４０倍の多重効果を生
じることになり、それはすなわち、分析試料に対し全体
として約１４０のＢＣＰＤＡ分子が付着しているという
効果的な結果を示すものである。
えられる多くのシステムがある０例えば抗体を直接ＢＣ
ＰＤＡで標識するか又は抗体を標識された牛血清アルブ
ミンに共有結合し、コルチゾールの免疫分析の検出に用
いられたことがある。約ｌＯのＢＣＰＤＡ分子が抗体に
直接的に結合されるが、抗体に共有結合しているＢＳＡ
上には約４０のＢＣＰＯＡ分子が結合可能である。さら
に高度な技術として、約２０のアミノ基を持つストレプ
トアビジンを約１４８ＣＰＯＡ分子で直接標識すること
が可能であり、この時補足試薬として、ピオチンが結合
している抗体が好まれて使用される。その結果、抗体に
対して１０ピオチン分子結合していると仮定すると標識
されたストレプトアビジンは約１４０倍の多重効果を生
じることになり、それはすなわち、分析試料に対し全体
として約１４０のＢＣＰＤＡ分子が付着しているという
効果的な結果を示すものである。
上記に対し、本発明による複合体は、担体粒子に結合し
ているアビジン又はストレプトアビジンを包含する。そ
の担体粒子はラテックス（ｌａｔｅｘ）のようなサブミ
クロンサイズの合成物質かもしれない、又、その表面上
には少なくとも１５のアミノ基が備わっていなければな
らない、このためタンパク質や粒子上にかなり多くのＢ
ＣＰＤＡが付着されることになる。他のタイプのサポー
ト粒子は、タンパク質関連物質あるいはタンパク質分子
であろう担体粒子にコートされているはずである。
ているアビジン又はストレプトアビジンを包含する。そ
の担体粒子はラテックス（ｌａｔｅｘ）のようなサブミ
クロンサイズの合成物質かもしれない、又、その表面上
には少なくとも１５のアミノ基が備わっていなければな
らない、このためタンパク質や粒子上にかなり多くのＢ
ＣＰＤＡが付着されることになる。他のタイプのサポー
ト粒子は、タンパク質関連物質あるいはタンパク質分子
であろう担体粒子にコートされているはずである。
最適タンパク質分子は、サイログロブリン、牛血清アル
ブミン、ヘモシアニン、ミオシン、アボフェリチン、リ
ジンとアミノ酸割合が異なるポリリジンコポリマーのシ
リーズ、α２−マイクログロブリン、ロイシンアミノペ
プチダーゼ、重メロミオシン、ヒストン類を含むグルー
プから選ばれるであろう。
ブミン、ヘモシアニン、ミオシン、アボフェリチン、リ
ジンとアミノ酸割合が異なるポリリジンコポリマーのシ
リーズ、α２−マイクログロブリン、ロイシンアミノペ
プチダーゼ、重メロミオシン、ヒストン類を含むグルー
プから選ばれるであろう。
適切なタンパク質分子又は他のタイプの合成粒子を選出
するにあたり考慮する点は、その担体粒子が複合体形成
のためにアビジン又はストレプトアビジンに化学的に連
結することができるということである。
するにあたり考慮する点は、その担体粒子が複合体形成
のためにアビジン又はストレプトアビジンに化学的に連
結することができるということである。
本発明で有効であると認容される形態のラテックス粒子
は、インデイアナ州インデイアナポリスのＳｅｒａｇｅ
ｎ Ｄｉａｇｎｏｇｔｉｃｓ １０ｃ、から得ることが
できる。最適担体粒子の利用によって、担体粒子につき
１５以上、好ましくは１００以上の多重標識が担体表面
に速やかに付着される０例えば担体タンパク質の牛サイ
ログロブリンに結合しているストレプトアビジンを用い
ることによって、約１５０のＢＣＰＤＡ残基が付着され
るであろう、得られたストレプトアビジン・ＴＧ複合体
は、ピオチン結合の抗体に結合する能力を維持し、それ
を高感度の時間分解（ｔｉｍｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ）蛍
光免疫検定法に用いることができる。
は、インデイアナ州インデイアナポリスのＳｅｒａｇｅ
ｎ Ｄｉａｇｎｏｇｔｉｃｓ １０ｃ、から得ることが
できる。最適担体粒子の利用によって、担体粒子につき
１５以上、好ましくは１００以上の多重標識が担体表面
に速やかに付着される０例えば担体タンパク質の牛サイ
ログロブリンに結合しているストレプトアビジンを用い
ることによって、約１５０のＢＣＰＤＡ残基が付着され
るであろう、得られたストレプトアビジン・ＴＧ複合体
は、ピオチン結合の抗体に結合する能力を維持し、それ
を高感度の時間分解（ｔｉｍｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ）蛍
光免疫検定法に用いることができる。
このタイプの分子に関する理論的多重効果率は、多重標
識の多大なる効果を考えた時約１０’倍である０本発明
を実施する場合、この多重標識分子は濃度消失効果をひ
き起こさない、第５図を参照して説明する０図中、・は
ＢＣＰＯＡ 、 Ｔ Ｇはサイログロブリン、ＳＡはス
トレプトアビジンを示す、ストレプトアビジン又はアビ
ジンの巨大分子複合体は本発明に従って形成することが
できるが、その複合体には多数のＢＣＰＤＡ分子が付着
している。
識の多大なる効果を考えた時約１０’倍である０本発明
を実施する場合、この多重標識分子は濃度消失効果をひ
き起こさない、第５図を参照して説明する０図中、・は
ＢＣＰＯＡ 、 Ｔ Ｇはサイログロブリン、ＳＡはス
トレプトアビジンを示す、ストレプトアビジン又はアビ
ジンの巨大分子複合体は本発明に従って形成することが
できるが、その複合体には多数のＢＣＰＤＡ分子が付着
している。
又、本発明の他の見地によると、定量に用いられる蛍光
試薬システムは、定量成分に対しピオチンを介して安定
結合しているアビジン又はストレプトアビジンを有する
上記の複合体を含んでいる。その担体粒子は、蛍光キレ
ートのランタニド金属イオンで形成される複数の配位子
部分で標識されており、少なくとも１５の、好ましくは
１００以上の標識を配するために、その配位子部分は多
数のアミノ基に付着する。各蛍光キレート部分は、選出
されたランタニド金属イオンをそこに安定的に保持して
いた。
試薬システムは、定量成分に対しピオチンを介して安定
結合しているアビジン又はストレプトアビジンを有する
上記の複合体を含んでいる。その担体粒子は、蛍光キレ
ートのランタニド金属イオンで形成される複数の配位子
部分で標識されており、少なくとも１５の、好ましくは
１００以上の標識を配するために、その配位子部分は多
数のアミノ基に付着する。各蛍光キレート部分は、選出
されたランタニド金属イオンをそこに安定的に保持して
いた。
本発明によると、本蛍光システムは、蛍光が励起された
とき、溶液中の多数の蛍光性ランタニド金属イオンキレ
ート部分により発せられる蛍光放射強度に比べて増幅さ
れた強度の蛍光を発する。
とき、溶液中の多数の蛍光性ランタニド金属イオンキレ
ート部分により発せられる蛍光放射強度に比べて増幅さ
れた強度の蛍光を発する。
このとき、本蛍光試薬においては、過去における実験の
ような多重標識に起因する濃度消失の効果は見られない
、蛍光キレート中に結合されるべきランタニド金属イオ
ンはユーロピウム、テルビウム、ガドリニウム、サマリ
ウム、デスボロシウムから成るグループから用いられる
。
ような多重標識に起因する濃度消失の効果は見られない
、蛍光キレート中に結合されるべきランタニド金属イオ
ンはユーロピウム、テルビウム、ガドリニウム、サマリ
ウム、デスボロシウムから成るグループから用いられる
。
本発明における蛍光試薬システムはパインディングアッ
セイの中で用いることができる。そのバインダーは、対
応する多くの連結成分を介してそこへ化学的に連結する
多数の複合体を有している。前に述べたように、担体粒
子は蛍光性キレートのランタニド金属イオンで形成され
る複数の配位子部分で標識されている。各連結成分は、
バインダーに化学的に結合しており、アビジン又はスト
レプトアビジンの複合体に非共有結合的に順次結合して
いるピオチン分子から成っている。バインダーの種類は
、免疫検定法の分野で用いられるもののように、各種定
量に有効なものである。適するバインダーとしては、抗
体、タンパク質結合葉酸、内性因子、タンパク質結合サ
イロキシン、タンパク質結合ステロイドハブテン及び抗
原などを含む、特定の免疫検定においては、そのシステ
ムがポリクローナル抗体でも十分に等し〈実施されるに
もかかわらずモノクローナル抗体が好まれる。
セイの中で用いることができる。そのバインダーは、対
応する多くの連結成分を介してそこへ化学的に連結する
多数の複合体を有している。前に述べたように、担体粒
子は蛍光性キレートのランタニド金属イオンで形成され
る複数の配位子部分で標識されている。各連結成分は、
バインダーに化学的に結合しており、アビジン又はスト
レプトアビジンの複合体に非共有結合的に順次結合して
いるピオチン分子から成っている。バインダーの種類は
、免疫検定法の分野で用いられるもののように、各種定
量に有効なものである。適するバインダーとしては、抗
体、タンパク質結合葉酸、内性因子、タンパク質結合サ
イロキシン、タンパク質結合ステロイドハブテン及び抗
原などを含む、特定の免疫検定においては、そのシステ
ムがポリクローナル抗体でも十分に等し〈実施されるに
もかかわらずモノクローナル抗体が好まれる。
アビジンもまた有効であるということが認められている
が、ピオチンを用いた結合ではストレプトアビジン分子
の使用が好まれる。パインディングアッセイで用いられ
るストレプトアビジンは、スルフォスクシニミディル−
４−（Ｎ−マレイミドメチル）サイクロヘキサン−１−
カルボキシレート（ｓｕｌｆａ−３ＭＣＣ）で活性化す
ることができる。
が、ピオチンを用いた結合ではストレプトアビジン分子
の使用が好まれる。パインディングアッセイで用いられ
るストレプトアビジンは、スルフォスクシニミディル−
４−（Ｎ−マレイミドメチル）サイクロヘキサン−１−
カルボキシレート（ｓｕｌｆａ−３ＭＣＣ）で活性化す
ることができる。
その活性化は、担体粒子の一アミノ基に対するストレプ
トアビジンの共有結合に先立って行なわれる。
トアビジンの共有結合に先立って行なわれる。
次に、その担体粒子は、Ｎ−スクシニミディルＳ−アセ
チルチオアセテート（ＳＡＴＡ）で活性化されるが、活
性化したストレプトアビジンを用いた化学的反応に先立
ち、担体粒子はＢＣＰＯＡを用いて広く標識されなけれ
ばならない、これに係る化学事項を説明するために、こ
の複合反応の個々の段階を以下に図示している。
チルチオアセテート（ＳＡＴＡ）で活性化されるが、活
性化したストレプトアビジンを用いた化学的反応に先立
ち、担体粒子はＢＣＰＯＡを用いて広く標識されなけれ
ばならない、これに係る化学事項を説明するために、こ
の複合反応の個々の段階を以下に図示している。
＋
＋
ＳＩＪ Ｉ ｆｏ−ＳＭＣＣ
３ＡＴ＾
ＢＣＰＤＡ
この複合反応の開始は、ヒドロキシルアミノの添加によ
りおこる。ヒドロキシルアミノはチオールエステルを加
水分解してチオール基を生じさせ、その後チオール基は
タンパク質複合体を形成するストレプトアビジン上のマ
レイミドと反応する。この具体的例示によると本反応図
式は、以下に示す理由のためにｓｕ ｌｆｏ−ＳＭＣＣ
と５ＡＴＡを使用した複合体の形成に非常に有効である
。ＢＣＰＯＡ標識の反応はｐＨ９，１が最適である。一
方、マレイミドはｐ）Ｉ７以下でほとんど安定である。
りおこる。ヒドロキシルアミノはチオールエステルを加
水分解してチオール基を生じさせ、その後チオール基は
タンパク質複合体を形成するストレプトアビジン上のマ
レイミドと反応する。この具体的例示によると本反応図
式は、以下に示す理由のためにｓｕ ｌｆｏ−ＳＭＣＣ
と５ＡＴＡを使用した複合体の形成に非常に有効である
。ＢＣＰＯＡ標識の反応はｐＨ９，１が最適である。一
方、マレイミドはｐ）Ｉ７以下でほとんど安定である。
サイログロブリンが使われる場合はマレイミド基が加水
分解で変化するため、ｐＨ９，１で広く標識化する前に
、いくつかのアミノ基のマレイミド誘導体への転換によ
って最初に活性化することはできない。
分解で変化するため、ｐＨ９，１で広く標識化する前に
、いくつかのアミノ基のマレイミド誘導体への転換によ
って最初に活性化することはできない。
従って、まず５ＡＴＡが約５％のサイログロブリンのア
ミノ基なチオールエステルに変化するために用いられる
。
ミノ基なチオールエステルに変化するために用いられる
。
チオール化の程度はＧｒａｓｓｅｔｔｉ ＤＲ，Ｍｕｒ
ｒａｙ ＪＦの分析評価によって計ることができる（Ａ
ｒｃｈ、 Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、Ｂｉｏ ｈ ｓ、 １９
６７；１１９：４ｌ−９）、それは２．２゛−ジチオジ
ピリジンを使用する。ＢＣＰＤＡを使用して引き続いて
行なわれる反応は、３２５ｎｍの吸光度によって検出さ
れるように１６０の蛍光の結合を生じる。ＢＣＰＤＡで
標識されたサイログロブリンの５ＡＴＡ誘導体は、結合
しているチオールが保護されていることが確実であるよ
うに、２４時間以内に使われることが好ましい。時間の
経過に伴うアセチル誘導体の加水分解は、ジスルフィド
結合形成を通してサイログロブリンの単独重合を生じる
。
ｒａｙ ＪＦの分析評価によって計ることができる（Ａ
ｒｃｈ、 Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、Ｂｉｏ ｈ ｓ、 １９
６７；１１９：４ｌ−９）、それは２．２゛−ジチオジ
ピリジンを使用する。ＢＣＰＤＡを使用して引き続いて
行なわれる反応は、３２５ｎｍの吸光度によって検出さ
れるように１６０の蛍光の結合を生じる。ＢＣＰＤＡで
標識されたサイログロブリンの５ＡＴＡ誘導体は、結合
しているチオールが保護されていることが確実であるよ
うに、２４時間以内に使われることが好ましい。時間の
経過に伴うアセチル誘導体の加水分解は、ジスルフィド
結合形成を通してサイログロブリンの単独重合を生じる
。
アミノ基に対し一同等量のｓｕｌｆａ−ＳＭＣＣを使用
するＳＡの活性化状態は、２，２゛−ジチオジピリジン
法（Ｇｒａｓｓｅｔｔｉ ＤＲ，Ｍｕｒｒａｙ ＪＦ、
、 Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
するＳＡの活性化状態は、２，２゛−ジチオジピリジン
法（Ｇｒａｓｓｅｔｔｉ ＤＲ，Ｍｕｒｒａｙ ＪＦ、
、 Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
１蝕ｍ工１９６７．１１９：４ｌ−９）によって検出さ
れるように、ＳＡ分子当たり３ないし４のマレイミド基
の結合を導く。
れるように、ＳＡ分子当たり３ないし４のマレイミド基
の結合を導く。
結果として生じたＳＡ誘導体はｐＨ６，２のリン酸緩衝
液で比較的安定である。しかしながら、マレイミド基の
完全性は直接的な使用の時、保証される。
液で比較的安定である。しかしながら、マレイミド基の
完全性は直接的な使用の時、保証される。
複合反応は酸素の遊離した反応媒体の中で好ましく導か
れる。それからその反応は、マレイミド基と反応し、ジ
スルフィド結合の形成を極小化するフリーのチオール基
を与えるために下記の条件下で進行する。２時間の複合
反応の後メルカプトエタノールに添加し、サイログロブ
リン分子間に形成されたであろうジスルフィド結合の分
解及びストレプトアビジン上のマレイミド基残存を阻止
する作用をもつＮ−エチルマレイミドの添加は、反応混
合物中のフリーの全チオール基をブロックする。
れる。それからその反応は、マレイミド基と反応し、ジ
スルフィド結合の形成を極小化するフリーのチオール基
を与えるために下記の条件下で進行する。２時間の複合
反応の後メルカプトエタノールに添加し、サイログロブ
リン分子間に形成されたであろうジスルフィド結合の分
解及びストレプトアビジン上のマレイミド基残存を阻止
する作用をもつＮ−エチルマレイミドの添加は、反応混
合物中のフリーの全チオール基をブロックする。
他のシステムもストレプトアビジン又はアビジンへの複
合のための連結を活性化するために使用されるという真
価が認められている０例えば、使用のｓｕ ｌｆｏ−Ｓ
ＭＣＣのかわりにＮ−スクシニミディル−３−（２−ビ
ジリルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を使うこと
ができる。又、代わりにＳＡは同−三官能の（ｈｏｍｏ
ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）試薬ｐ−ベンゾキノンによ
って活性化され、ＢＣＰＯＡ−ＴＧ複合体がそれに直接
添加される。ＢＣＰＤＡ−ＴＧ複合体は過剰の過ヨウ素
酸ナトリウム（ＮａＩＯ３）で活性化され、それにＳＡ
を添加した後、その反応はグリセロールで停止される。
合のための連結を活性化するために使用されるという真
価が認められている０例えば、使用のｓｕ ｌｆｏ−Ｓ
ＭＣＣのかわりにＮ−スクシニミディル−３−（２−ビ
ジリルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を使うこと
ができる。又、代わりにＳＡは同−三官能の（ｈｏｍｏ
ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）試薬ｐ−ベンゾキノンによ
って活性化され、ＢＣＰＯＡ−ＴＧ複合体がそれに直接
添加される。ＢＣＰＤＡ−ＴＧ複合体は過剰の過ヨウ素
酸ナトリウム（ＮａＩＯ３）で活性化され、それにＳＡ
を添加した後、その反応はグリセロールで停止される。
それらの変化については以下の調製７において論じる。
第５図は調整した条件下でのＢＣＰＤＡ標識ストレプト
アビジン・サイログロブリン複合体、遊離のＢＣＰＤＡ
標識サイログロブリン、多数のＥｕ”をそれぞれ含む混
合物のインキュベーションに係る活性化過程を模式的に
示したものである０図中・はＢＣＰＤＡ％ＴＧはサイロ
グロブリン、ＳＡはストレプトアビジンを示している。
アビジン・サイログロブリン複合体、遊離のＢＣＰＤＡ
標識サイログロブリン、多数のＥｕ”をそれぞれ含む混
合物のインキュベーションに係る活性化過程を模式的に
示したものである０図中・はＢＣＰＤＡ％ＴＧはサイロ
グロブリン、ＳＡはストレプトアビジンを示している。
インキュベーションの後、ストレプトアビジンをベース
とした新しい巨大分子複合体（ＳＢＭＧ）が形成される
が、それは分離可能であり、又、ＢＣＰＯＡ標識ストレ
ブトアビジンーサイログロプリン複合体と全く同様の方
法において免疫検定のために用いることができる。しか
しながらその検知限界に関する重要な改良はＢＣＰＤＡ
標識ストレブトアビジンーサイログロプリン複合体に比
較して達成することができ、第１図（ｂ）の直接標識さ
れたストレプトアビジンに比較すると、その検出限界に
おいて少なくとも３５倍の改良を達成することができた
。
とした新しい巨大分子複合体（ＳＢＭＧ）が形成される
が、それは分離可能であり、又、ＢＣＰＯＡ標識ストレ
ブトアビジンーサイログロプリン複合体と全く同様の方
法において免疫検定のために用いることができる。しか
しながらその検知限界に関する重要な改良はＢＣＰＤＡ
標識ストレブトアビジンーサイログロプリン複合体に比
較して達成することができ、第１図（ｂ）の直接標識さ
れたストレプトアビジンに比較すると、その検出限界に
おいて少なくとも３５倍の改良を達成することができた
。
その新しい巨大分子複合体に十分に理解されていないが
、ストレプトアビジンに結合していない又は、共有結合
的に結びついているサイログロブリンに存在するＢＣＰ
ＤＡと結合しているＥ ｕ”核から成っていると考えら
れる。
、ストレプトアビジンに結合していない又は、共有結合
的に結びついているサイログロブリンに存在するＢＣＰ
ＤＡと結合しているＥ ｕ”核から成っていると考えら
れる。
以下に示す実施例に、我々は検出限界６８αｍｏｌｅｓ
／キュベツトであるプロラクチンの高感度免疫検定法を
その新しい巨大分子を用いて検出できたことを報告して
いる。
／キュベツトであるプロラクチンの高感度免疫検定法を
その新しい巨大分子を用いて検出できたことを報告して
いる。
その巨大分子は、モル数（ａ ｍｏｌａｒ ａｍｏｕｎ
ｔ）に関してストレプトアビジンの５倍以上の過剰のＴ
Ｇ−（ＢＣＰＤＡ） ｌ Ｂ。の存在下で、５Ａ−ＴＧ
−（ＢＣＰＤＡ） ｔｓｏ複合体のインキュベーション
によって合成される。
ｔ）に関してストレプトアビジンの５倍以上の過剰のＴ
Ｇ−（ＢＣＰＤＡ） ｌ Ｂ。の存在下で、５Ａ−ＴＧ
−（ＢＣＰＤＡ） ｔｓｏ複合体のインキュベーション
によって合成される。
その分離された巨大分子（ＳＢＭＧ）は５Ａ−ＴＧ−（
ＢＣＰＯＡ） ＋ｓ。複合体とフリーの（結合していな
い）ＴＧＩＢＣＰＯＡ）＋ｉｏを含んでいるが、後者は
モル数についてみると５Ａ−ＴＧ−（ＢＣＰＤＡ） ＋
ｓ。複合体に比較して約２．３±０．２倍過剰に存在
している。その巨大分子は、ＴＧ分子上に存在するＢＣ
ＰＤＡのモル数に相対するＥｕ”の化学量論的な量より
も少ない分離５Ａ−ＴＧ−（ＢＣＰＤＡ）複合体へＥｕ
”を添加し、得られた混合物を３８ＭＣ形成のために約
３時間５０℃に保持した中でインキュベートして得られ
る Ｅ ｕ３ ＊の最適量はＢＣＰＯＡ分子の７０〜８
５％の範囲であることがわかっている。このことは実施
例の中でさらに詳しく述べている。
ＢＣＰＯＡ） ＋ｓ。複合体とフリーの（結合していな
い）ＴＧＩＢＣＰＯＡ）＋ｉｏを含んでいるが、後者は
モル数についてみると５Ａ−ＴＧ−（ＢＣＰＤＡ） ＋
ｓ。複合体に比較して約２．３±０．２倍過剰に存在
している。その巨大分子は、ＴＧ分子上に存在するＢＣ
ＰＤＡのモル数に相対するＥｕ”の化学量論的な量より
も少ない分離５Ａ−ＴＧ−（ＢＣＰＤＡ）複合体へＥｕ
”を添加し、得られた混合物を３８ＭＣ形成のために約
３時間５０℃に保持した中でインキュベートして得られ
る Ｅ ｕ３ ＊の最適量はＢＣＰＯＡ分子の７０〜８
５％の範囲であることがわかっている。このことは実施
例の中でさらに詳しく述べている。
希釈された巨大分子ＳＢＭＣの安定性はユーロピウムＥ
ｕ”の存在下で限定された保存性をもつ。
ｕ”の存在下で限定された保存性をもつ。
ＳＢＭＣの活性の損失は緩慢な沈殿形成過程を通してお
こると仮定される。しかしながら、Ｅ ｕ”が存在しな
い状態で、ＴＧ （ＢＣＰＯＡ） ＋ｓ。を用いた場合
の未希釈５Ａ４Ｇ−（ＢＣＰＯＡＩ ｒ ｓ ｏ複合体
の安定性は十分に確認され、少なくとも１年の間保存性
を持っている。
こると仮定される。しかしながら、Ｅ ｕ”が存在しな
い状態で、ＴＧ （ＢＣＰＯＡ） ＋ｓ。を用いた場合
の未希釈５Ａ４Ｇ−（ＢＣＰＯＡＩ ｒ ｓ ｏ複合体
の安定性は十分に確認され、少なくとも１年の間保存性
を持っている。
ＳＢＭＣの形成過程において、複合体を形成する溶液の
理想的なｐＨは５〜７の範囲で、最適ｐ）ｌは６である
。 ３８ＭＣ形成における複合化の割合は、ある程度ま
では時間と温度によって限定される。
理想的なｐＨは５〜７の範囲で、最適ｐ）ｌは６である
。 ３８ＭＣ形成における複合化の割合は、ある程度ま
では時間と温度によって限定される。
複合体形成中の溶液の温度は６０℃を超えてはならず、
室温を下まわってはならない、すなわち複合体形成に適
する温度は２５℃から５０℃の範囲である。この適した
温度範囲に対応する複合体形成の時間は２５℃の時の４
８時間から５０℃の時の３時間まで変化する。
室温を下まわってはならない、すなわち複合体形成に適
する温度は２５℃から５０℃の範囲である。この適した
温度範囲に対応する複合体形成の時間は２５℃の時の４
８時間から５０℃の時の３時間まで変化する。
以下の実施例中に報告されている発明に基づくと、ＳＢ
ＭＣの形成はＢＣＰＤＡで標識されたサイログロブリン
分子に対する単なるユーロピウムの結合過程よりも複雑
なもののように見える。そのＳＢＭＣは全く不一致のな
い（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ）分子組成を有し、Ｅ ｕ”
の過剰量の添加によって沈殿する。これはＳＢＭＣが非
増強の５Ａ−ＴＧ−（ＢＣＰＤＡ） ｔｓｏよりもスト
レプトアビジン又はアビジン分子に対して多数のＢＣＰ
ＤＡ分子を持っているということを示している。このた
め、それはその複合体よりも−１すぐれた感度の検出試
薬を提供することになるということを示している。
ＭＣの形成はＢＣＰＤＡで標識されたサイログロブリン
分子に対する単なるユーロピウムの結合過程よりも複雑
なもののように見える。そのＳＢＭＣは全く不一致のな
い（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ）分子組成を有し、Ｅ ｕ”
の過剰量の添加によって沈殿する。これはＳＢＭＣが非
増強の５Ａ−ＴＧ−（ＢＣＰＤＡ） ｔｓｏよりもスト
レプトアビジン又はアビジン分子に対して多数のＢＣＰ
ＤＡ分子を持っているということを示している。このた
め、それはその複合体よりも−１すぐれた感度の検出試
薬を提供することになるということを示している。
分離された複合体ＳＢＭＣの分子量は２．５〜３．０×
１０６の範囲であることが明らかであり、その複合体は
ほとんど又は全く未結合のＴＧ−（ＢＣＰＤＡ） ＋
ｓ。を有していないようである。ＳＢＭＣの組成は、Ｂ
ＣＰＯＡで標識したサイログロブリンに共有結合してい
るストレプトアビジン、ＢＣＰＤＡで標識したサイログ
ロブリン、Ｅ ｕ”に関してそれぞれの比が１ ： ２
．３ ： ４８０であることが明らかである。
１０６の範囲であることが明らかであり、その複合体は
ほとんど又は全く未結合のＴＧ−（ＢＣＰＤＡ） ＋
ｓ。を有していないようである。ＳＢＭＣの組成は、Ｂ
ＣＰＯＡで標識したサイログロブリンに共有結合してい
るストレプトアビジン、ＢＣＰＤＡで標識したサイログ
ロブリン、Ｅ ｕ”に関してそれぞれの比が１ ： ２
．３ ： ４８０であることが明らかである。
以下の実施例では、その混合物に過剰に存在するストレ
プトアビジン複合体、未結合（遊離の）ＴＧ−（ＢＣＰ
ＤＡ） ＋＠ｏ分子を増強するＥ ｕ”の添加は巨大分
子複合体形成のために複合体５Ａ−ＴＧ−（ＢＣＰＯＡ
）ｔｓｏを集め、結合することを示している。もしこの
複合体が適当な負電荷を保っていたならば、限定された
期間は溶液中で安定である。しかしもちろん、もしＥｕ
３＋濃度が適する範囲を越える場合は沈殿する。
プトアビジン複合体、未結合（遊離の）ＴＧ−（ＢＣＰ
ＤＡ） ＋＠ｏ分子を増強するＥ ｕ”の添加は巨大分
子複合体形成のために複合体５Ａ−ＴＧ−（ＢＣＰＯＡ
）ｔｓｏを集め、結合することを示している。もしこの
複合体が適当な負電荷を保っていたならば、限定された
期間は溶液中で安定である。しかしもちろん、もしＥｕ
３＋濃度が適する範囲を越える場合は沈殿する。
本発明の具体例によると、その巨大分子複合体は大変有
効な発蛍光団を与える。その調製は比較的簡単であり、
特別な処理を必要とせず、本発明の他のすべての具体的
事例と同様の手法で用いることが可能である。プロラク
チン定量に関する限りにおいて、ストレプトアビジンベ
ースの試薬の検出限界は以下の実施例中に述べられてい
るが、直接標識されたストレプトアビジン、５Ａ−ＴＧ
−（ＢＣＰＤＡ） ＋ ｓ。複合体、ＳＢＭＣのそれぞ
れの発蛍光団に対して３．１４．０．５０．０．０３μ
ｇ／ρであることが判明した。
効な発蛍光団を与える。その調製は比較的簡単であり、
特別な処理を必要とせず、本発明の他のすべての具体的
事例と同様の手法で用いることが可能である。プロラク
チン定量に関する限りにおいて、ストレプトアビジンベ
ースの試薬の検出限界は以下の実施例中に述べられてい
るが、直接標識されたストレプトアビジン、５Ａ−ＴＧ
−（ＢＣＰＤＡ） ＋ ｓ。複合体、ＳＢＭＣのそれぞ
れの発蛍光団に対して３．１４．０．５０．０．０３μ
ｇ／ρであることが判明した。
プロラクチン定量に関しては、ＳＢＭＣは補足試薬とし
て、特定のピオチン結合抗体を用いて高感度の免疫検定
（約６８αｍｏ１ｇ ）を行うことができる。
て、特定のピオチン結合抗体を用いて高感度の免疫検定
（約６８αｍｏ１ｇ ）を行うことができる。
本発明におけるバインディングアッセイシステムは様々
な生物学的反応現象の検出に応用することができる６例
えば様々なハブテン、抗原および抗体のタンパク質の検
出にはコルチゾール、サイロキシン、タイプキシン、ピ
オチン、α−フェトプロティン（ＡＦＰ） 、ヒトコリ
オニックゴナドトロピン（ｈＣＧ） 、フェリチン、サ
イロトロピン（ＴＳＨ）、フォリトロビン（ＦＳＨ）、
ルトロビン（Ｌｌ（）、サイロキシン結合グロブリン（
ＴＢＧ）、成長ホルモン又はプロラクチン、風疹ウィル
ス又は他の感染源に対しての特定の抗原・抗体を含んで
いる。
な生物学的反応現象の検出に応用することができる６例
えば様々なハブテン、抗原および抗体のタンパク質の検
出にはコルチゾール、サイロキシン、タイプキシン、ピ
オチン、α−フェトプロティン（ＡＦＰ） 、ヒトコリ
オニックゴナドトロピン（ｈＣＧ） 、フェリチン、サ
イロトロピン（ＴＳＨ）、フォリトロビン（ＦＳＨ）、
ルトロビン（Ｌｌ（）、サイロキシン結合グロブリン（
ＴＢＧ）、成長ホルモン又はプロラクチン、風疹ウィル
ス又は他の感染源に対しての特定の抗原・抗体を含んで
いる。
本発明の特徴は、パインデインゲタイブのものであるか
ないかにかかわらず、別のタイプの定量法にこの手法が
応用されることが可能であるということは明らかである
。
ないかにかかわらず、別のタイプの定量法にこの手法が
応用されることが可能であるということは明らかである
。
この技術は様々なレセプター測定法にも適用でき、レセ
プター測定法の結合成分が本発明の手法を用いて標識さ
れる。
プター測定法の結合成分が本発明の手法を用いて標識さ
れる。
検出に関する以下の物質、試薬は後述の実施例の中でも
用いられている。
用いられている。
４．７−ビス（クロロスル）オフェニル）−１，１０−
フェナンスロリン−２，９−ジカルボン酸（ＢＣＰＯＡ
）は過去に述べられているように合成される。 ［Ｅｖ
ａｎｇｅｌｉｓｔａ ＲＡ、 Ｐｏ１ｌａｋ Ａ、 Ａ
１１ｏｒｅ Ｂ。
フェナンスロリン−２，９−ジカルボン酸（ＢＣＰＯＡ
）は過去に述べられているように合成される。 ［Ｅｖ
ａｎｇｅｌｉｓｔａ ＲＡ、 Ｐｏ１ｌａｋ Ａ、 Ａ
１１ｏｒｅ Ｂ。
Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ＥＦ、 Ｍｏｒｔｏｎ ＲＣ，
Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ。
Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ。
Ｃｌ１ｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １９８８］、スルフォー
スクシニミディル−４−（ｎ−マレイドメチル）シクロ
ヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｕ Ｉｆｏ−ＳＭ
ＣＣ）はＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、、Ｒｏ
ｃｋｆｏｒｄ ｒＬ ６１１０５から購入した。
スクシニミディル−４−（ｎ−マレイドメチル）シクロ
ヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｕ Ｉｆｏ−ＳＭ
ＣＣ）はＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、、Ｒｏ
ｃｋｆｏｒｄ ｒＬ ６１１０５から購入した。
Ｎ−スクシニミディルＳ−アセチルチオアセテート（Ｓ
ＡＴＡ）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｄ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、 ＬａＪｏｌｌａ Ｃ＾９２０
３７から購入した。Ｎ−エチルマレイミドはＥａｓｔｍ
ａｎ Ｋｏｄａｋ株式会社（ロチェスタ一二ヨーヨーク
１４６５０）から得た。そのタンパク質濃縮は、Ｃｅ
ｎｔｒｉｐｒｅｐ”とｃｅｎｔｒ １ｃｏｎ”コンセン
トレイター（Ａｍｉｃｏｎ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ、、
オアクビル、オンタリオ、Ｌ６）１２８９）が用いられ
た。
ＡＴＡ）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｄ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、 ＬａＪｏｌｌａ Ｃ＾９２０
３７から購入した。Ｎ−エチルマレイミドはＥａｓｔｍ
ａｎ Ｋｏｄａｋ株式会社（ロチェスタ一二ヨーヨーク
１４６５０）から得た。そのタンパク質濃縮は、Ｃｅ
ｎｔｒｉｐｒｅｐ”とｃｅｎｔｒ １ｃｏｎ”コンセン
トレイター（Ａｍｉｃｏｎ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ、、
オアクビル、オンタリオ、Ｌ６）１２８９）が用いられ
た。
蛍光免疫検定法のマイクロタイトレージョンプレートと
してはＭｉｃｒｏｆｌｕｏｒ”と白色不透明９６−穴プ
レートはＤｙｎａｔａｃｈ Ｌａｂｓ、Ａｌｅｘａｎｄ
ｒｉａ ＶＡ ２２３１４から購入した。＾ｆｆｊｎｊ
ｔｙ ｒ）ｕｒｉｆｈ３ｄのストレプトアビジンと牛サ
イログロブリンは株式会社シグマ（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、
ＭＯ６３１７８）から得た。他に使った薬品は特記した
ものを除いてシグマからのものを用いた。
してはＭｉｃｒｏｆｌｕｏｒ”と白色不透明９６−穴プ
レートはＤｙｎａｔａｃｈ Ｌａｂｓ、Ａｌｅｘａｎｄ
ｒｉａ ＶＡ ２２３１４から購入した。＾ｆｆｊｎｊ
ｔｙ ｒ）ｕｒｉｆｈ３ｄのストレプトアビジンと牛サ
イログロブリンは株式会社シグマ（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、
ＭＯ６３１７８）から得た。他に使った薬品は特記した
ものを除いてシグマからのものを用いた。
α−フェトプロティンと他の免疫検定に用いたモノクロ
ーナル抗体はＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ １０ｃ、から手入
できた。
ーナル抗体はＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ １０ｃ、から手入
できた。
［使用機器］
固体相の蛍光の測定のために我々はＣｙｂｅｒＦｌｕｏ
ｒ６１５Ｔ′イムノアナライザーを使用した。溶液の蛍
光はタイムリゾルヴドフルオロメーター”Ａｒｃｕｓ”
（ＬＫＢ Ｗａｌｌａｃ、 Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎ
ｄ）にて測定した。スペクトルはｄｆｏｄｅ ａｒｒａ
ｙ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒＨＰＭｏｄｅｌ
８４５０Ａ （Ｈｅｗｌａｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｃａ
ｎａｄａ、 Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ ０ｎｔａｒｉｏ
）で記録した。セファデックスＧ−２５ゲル、セファク
リルＳ−４００、フィルターカラム、ポンプ、オプチカ
ルユニットとフラクションコレクターはファルマシア・
カナダからのものである（Ｄｏｒｖａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ
Ｈ４Ｆ １）１６） 、 Ｕｌｔｒｏｇｅｌ Ａ３４
はＦｉｓｈｅｒ ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｏｒｏｎｔ
、０ｎｔａｒｉｏ）から購入した。 Ｔｈｅ ５ｐｅｅ
ｄ Ｖａｃ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒは Ｅｍｅｒｓ
ｔｏｎ１０ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ （Ｓｃａｒｂｏｒｏｕ
ｇｈ、 ０ｎｔａｒｉｏ ＭＩＲＩＷ４）からのもので
ある。
ｒ６１５Ｔ′イムノアナライザーを使用した。溶液の蛍
光はタイムリゾルヴドフルオロメーター”Ａｒｃｕｓ”
（ＬＫＢ Ｗａｌｌａｃ、 Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎ
ｄ）にて測定した。スペクトルはｄｆｏｄｅ ａｒｒａ
ｙ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒＨＰＭｏｄｅｌ
８４５０Ａ （Ｈｅｗｌａｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｃａ
ｎａｄａ、 Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ ０ｎｔａｒｉｏ
）で記録した。セファデックスＧ−２５ゲル、セファク
リルＳ−４００、フィルターカラム、ポンプ、オプチカ
ルユニットとフラクションコレクターはファルマシア・
カナダからのものである（Ｄｏｒｖａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ
Ｈ４Ｆ １）１６） 、 Ｕｌｔｒｏｇｅｌ Ａ３４
はＦｉｓｈｅｒ ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｏｒｏｎｔ
、０ｎｔａｒｉｏ）から購入した。 Ｔｈｅ ５ｐｅｅ
ｄ Ｖａｃ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒは Ｅｍｅｒｓ
ｔｏｎ１０ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ （Ｓｃａｒｂｏｒｏｕ
ｇｈ、 ０ｎｔａｒｉｏ ＭＩＲＩＷ４）からのもので
ある。
以下に示す調製例と実施例で前に述べた本発明の内容に
ついて説明する。
ついて説明する。
く調製例１〉
−５ＡＴＡとＢＣＰＯＡで標識したサイログロブリン誘
導体の形成− 牛すイログロプリン５０ｍｇ（ＴＧ： Ｍ、Ｗ、 ６７
０，０００゜１分子あたり１５０アミノ基）を０．１Ｍ
炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，１） １２ ｍＱ中に溶解した
０次にＴＧはまず８０μρジメチルホルムアミドに溶解
した。
導体の形成− 牛すイログロプリン５０ｍｇ（ＴＧ： Ｍ、Ｗ、 ６７
０，０００゜１分子あたり１５０アミノ基）を０．１Ｍ
炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，１） １２ ｍＱ中に溶解した
０次にＴＧはまず８０μρジメチルホルムアミドに溶解
した。
Ｎ−スクシニミディルＳ−アセチルチオアセテート（Ｓ
ＡＴＡ） １．６ｍｇで誘導体を形成した。 ５ＡＴＡ
溶液（アミノ基あたり〜０．５等量）は攪拌されている
ＴＧ溶液中に４回に分けて滴下して加えた。室温にて１
時間反応を進めるために放置した。
ＡＴＡ） １．６ｍｇで誘導体を形成した。 ５ＡＴＡ
溶液（アミノ基あたり〜０．５等量）は攪拌されている
ＴＧ溶液中に４回に分けて滴下して加えた。室温にて１
時間反応を進めるために放置した。
さらに攪拌条件下で無水エタノール５００μ℃に溶解し
たＢＣＰＯＡ（５回滴下）を４０ｍｇ加え°ることによ
ってタンパク質がＢＣＰＯＡによって広く（６ｘｔｅｎ
ｓｉｖｅｌｙ）標識された。その混合液を室温にて１時
間攪拌した。その誘導体化された５ＡＴＡとＢＣＰＯＡ
で標識されたサイログロブリンをｐ）１６．２の０．１
Ｍリン酸緩衝液を用いた広範囲（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）
の透析（分子量ｃｕｔ ｏｆｆ、 １２−１４．０００
）によって未反応の５ＡＴＡとＢＣＰＯＡから分離した
。最終生成物はアミコン濃縮機によって約０．３ｍｇま
で濃縮された。
たＢＣＰＯＡ（５回滴下）を４０ｍｇ加え°ることによ
ってタンパク質がＢＣＰＯＡによって広く（６ｘｔｅｎ
ｓｉｖｅｌｙ）標識された。その混合液を室温にて１時
間攪拌した。その誘導体化された５ＡＴＡとＢＣＰＯＡ
で標識されたサイログロブリンをｐ）１６．２の０．１
Ｍリン酸緩衝液を用いた広範囲（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）
の透析（分子量ｃｕｔ ｏｆｆ、 １２−１４．０００
）によって未反応の５ＡＴＡとＢＣＰＯＡから分離した
。最終生成物はアミコン濃縮機によって約０．３ｍｇま
で濃縮された。
〈調製例２〉
−ＳｕｌｆＯ−５ＭＣＣを用いたストレプトアビジン活
性化− ストレプトアビジン［ＳＡ： Ｍ、Ｗ、６０，０００．
１分子あたり２０アミノ基］１ｍｇをｐ）１７．０の
０．１Ｍリン酸緩衝液２００μβ中に溶解した。この溶
液に対して微量の１２Ｊ−標識のストレプトアビジン（
〜５０．０００ｃｐｍ／ｍｇ、 Ａｍｅｒｓｈａｍ社製
、０ａｋｖｉｌｌｅ。
性化− ストレプトアビジン［ＳＡ： Ｍ、Ｗ、６０，０００．
１分子あたり２０アミノ基］１ｍｇをｐ）１７．０の
０．１Ｍリン酸緩衝液２００μβ中に溶解した。この溶
液に対して微量の１２Ｊ−標識のストレプトアビジン（
〜５０．０００ｃｐｍ／ｍｇ、 Ａｍｅｒｓｈａｍ社製
、０ａｋｖｉｌｌｅ。
０ｎｔａｒｉｏ、Ｌ６Ｈ２Ｒ３）を添加し、複合反応の
正確な定量分析のためにトレーサーとして取り扱うこと
とした。それから連続的に攪拌されているストレプトア
ビジン溶液にｐＨ７，０の０．１Ｍリン酸緩衝液５０μ
βに溶解されたｓｕｌｆｏ−３ＭＣＣ（アミノ基に対し
〜！、５等量） （１，２２ｍｇを添加し、ストレプト
アビジンを活性化した０反応を進めるために室温にて１
時間放置した。誘導体形成されたタンパク質は前もって
平衡された５ｅｐｈａｄｅｘ”Ｇ−２５カラム（ｌｘ１
５ｃ＋ｎ）にてｐＨ６，２の０．１Ｍリン酸緩衝液を用
いて溶出した。カラムのボイドボリューム付近に溶出し
たピークのタンパク質をプールし、アミコンセントリコ
ン濃縮機で約０、１０ｃまで濃縮した。
正確な定量分析のためにトレーサーとして取り扱うこと
とした。それから連続的に攪拌されているストレプトア
ビジン溶液にｐＨ７，０の０．１Ｍリン酸緩衝液５０μ
βに溶解されたｓｕｌｆｏ−３ＭＣＣ（アミノ基に対し
〜！、５等量） （１，２２ｍｇを添加し、ストレプト
アビジンを活性化した０反応を進めるために室温にて１
時間放置した。誘導体形成されたタンパク質は前もって
平衡された５ｅｐｈａｄｅｘ”Ｇ−２５カラム（ｌｘ１
５ｃ＋ｎ）にてｐＨ６，２の０．１Ｍリン酸緩衝液を用
いて溶出した。カラムのボイドボリューム付近に溶出し
たピークのタンパク質をプールし、アミコンセントリコ
ン濃縮機で約０、１０ｃまで濃縮した。
〈調製例３〉
一標識されたサイログロブリンに対する活性化ストレプ
トアビジンの複合− 誘導体化されたＴＧとストレプトアビジン溶液はパイレ
ックスのガラス製スクリューキャップ付試験管の中で混
合された。ＴＧ：ＳＡの分子量比は約５である。その全
体量を下記に示すサイクルを３回繰り返すことによって
２５０〜３００μβまで減する。すなわち３０秒間Ｎ、
ガスで処理したその溶液を減圧下にてスピード−バック
濃縮機を用いて３分間濃縮を行なった。バキュウムは窒
素下で開放した。結合反応は、少なくとも１５分間Ｎ、
で処理したｐＨ７，０の０．５Ｍ ＮＨ４０Ｈ５０μβ
の添加によって開始した。その反応混合液はＮ２下、３
７℃で２時間保温した。
トアビジンの複合− 誘導体化されたＴＧとストレプトアビジン溶液はパイレ
ックスのガラス製スクリューキャップ付試験管の中で混
合された。ＴＧ：ＳＡの分子量比は約５である。その全
体量を下記に示すサイクルを３回繰り返すことによって
２５０〜３００μβまで減する。すなわち３０秒間Ｎ、
ガスで処理したその溶液を減圧下にてスピード−バック
濃縮機を用いて３分間濃縮を行なった。バキュウムは窒
素下で開放した。結合反応は、少なくとも１５分間Ｎ、
で処理したｐＨ７，０の０．５Ｍ ＮＨ４０Ｈ５０μβ
の添加によって開始した。その反応混合液はＮ２下、３
７℃で２時間保温した。
インキュベーションの後０．１２Ｍ β−メルカプト
エタノール溶液１０μρを添加し、その混合液を室温で
１５分間保持した。続いて０．２４Ｍ Ｎ−エチルマ
レイミド溶液１０μβが添加し、１５分間インキエベー
トした。そのストレブトアビジン−サイログロプリンー
ＢＣＰＤＡ複合体は下に示すようにただちに分離するか
、又は４℃で保存後次の日分離することができる。
エタノール溶液１０μρを添加し、その混合液を室温で
１５分間保持した。続いて０．２４Ｍ Ｎ−エチルマ
レイミド溶液１０μβが添加し、１５分間インキエベー
トした。そのストレブトアビジン−サイログロプリンー
ＢＣＰＤＡ複合体は下に示すようにただちに分離するか
、又は４℃で保存後次の日分離することができる。
その複合体は以下引続く説明において５Ａ−ＴＧ−（Ｂ
ＣＰＯＡ）、で表わし、ここでいうｎは１５より大きく
、多重標識を示している。
ＣＰＯＡ）、で表わし、ここでいうｎは１５より大きく
、多重標識を示している。
く調製例４〉
一複合体分離一
その反応混合液は最終全体量が２ｍ℃になるまでｐｌ（
８劃の重炭酸塩溶液で希釈する。５Ａ２００μｇ、ＢＣ
ＰＤＡ標識されたＴＧｌｌｍｇを含む反応混合液のアリ
コートを０．１Ｍ ＮａＨＣＯｓ溶液を用い、ｐ）１
８、流速１ ｍＩ２／ｍｉｎの状態でクルトロゲルＡ
３４カラムに通し流出した。流出液の光学密度は２８０
ｎｍの波長で検出した。それぞれのフラクションの容量
は５ｍ℃であった。第２図に示す■。
８劃の重炭酸塩溶液で希釈する。５Ａ２００μｇ、ＢＣ
ＰＤＡ標識されたＴＧｌｌｍｇを含む反応混合液のアリ
コートを０．１Ｍ ＮａＨＣＯｓ溶液を用い、ｐ）１
８、流速１ ｍＩ２／ｍｉｎの状態でクルトロゲルＡ
３４カラムに通し流出した。流出液の光学密度は２８０
ｎｍの波長で検出した。それぞれのフラクションの容量
は５ｍ℃であった。第２図に示す■。
ＩＩの印は特定の条件下で二〇カラムから流出したＢＣ
ＰＯＡ標識のＴＧと未結合のＳＡの位置を示している。
ＰＯＡ標識のＴＧと未結合のＳＡの位置を示している。
５ ｍＩ２毎のフラクション集め、ガンマカウンター（
ＬＫＢ Ｗａｌｌａｃ）でカウントした。そのカラムの
ボイドボリューム付近で得られたフラクションは、再び
ピオチン結合の抗体でコートされたマイクロタイターウ
ェルにおいて（固相バインディングアッセイ）及びα−
フェトプロティン定量においてパインディング活性が調
べられた。
ＬＫＢ Ｗａｌｌａｃ）でカウントした。そのカラムの
ボイドボリューム付近で得られたフラクションは、再び
ピオチン結合の抗体でコートされたマイクロタイターウ
ェルにおいて（固相バインディングアッセイ）及びα−
フェトプロティン定量においてパインディング活性が調
べられた。
それらの定量では、使用した放射性活性カウントを参考
としてストレプトアビジン濃度を約０．３μｓ／ｍｇま
で希釈した。この希釈液はＥｕ” （４Ｘ１０−６Ｍ）
、ＢＳＡ （４０ｇ／ρ）、アジ化ナトリウム（０，５
ｇ／ｌ を含むｐ）ＩＴ、 ２０の５０ｍＭトリス緩衝
液を用いた。ピオチン結合の抗体への結合に関連する活
性化フラクションはプールして、前に述べた放射性活性
に用いるためストレプトアビジン濃度に関して１５ｕｇ
／ｌｌ１ｇまでｐｏａ、ｏの５０ｍＭアセテート緩衝液
あるいはｐ）１６．０の７５ｍＭ２−（Ｎ−モルフォリ
ノ）エタンスルフォン酸にて希釈した。この溶液は４℃
で保存され、定量に用いる時に、ユーロピウムを含む希
釈液で５０倍に希釈した。
としてストレプトアビジン濃度を約０．３μｓ／ｍｇま
で希釈した。この希釈液はＥｕ” （４Ｘ１０−６Ｍ）
、ＢＳＡ （４０ｇ／ρ）、アジ化ナトリウム（０，５
ｇ／ｌ を含むｐ）ＩＴ、 ２０の５０ｍＭトリス緩衝
液を用いた。ピオチン結合の抗体への結合に関連する活
性化フラクションはプールして、前に述べた放射性活性
に用いるためストレプトアビジン濃度に関して１５ｕｇ
／ｌｌ１ｇまでｐｏａ、ｏの５０ｍＭアセテート緩衝液
あるいはｐ）１６．０の７５ｍＭ２−（Ｎ−モルフォリ
ノ）エタンスルフォン酸にて希釈した。この溶液は４℃
で保存され、定量に用いる時に、ユーロピウムを含む希
釈液で５０倍に希釈した。
上記に記述の手順から約５０ｍ℃の濃縮液を得ることが
できた（約５０．０００回の定量に対する十分な量）。
できた（約５０．０００回の定量に対する十分な量）。
〈調製例５〉
一ストレプトアビジン複合体の蛍光増強のための方法−
クルトロゲルＡ３４カラムから分離された調製４のスト
レプトアビジン−サイログロブリン複合体は、７５ｍＭ
の２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルフォン酸（ＭＥ
Ｓ）又は３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルフォン
酸（ＭＯＰＳ）のいずれかを含むｐＨ６に調整された溶
液で１５μｇ／ ｍ１２まで希釈した。 ＮａＯＨを用
いてｐＨ５，０に調整した１０ｍＭＨＣｌ中に１ ｍＭ
ＥｕＣ１５を含む溶液を攪拌を行ないながら、上記複
合液に滴下して加えた。その溶液に加えられるＥｕ″４
量と最終的濃度は複合体ストレプトアビジン溶液中に存
在する複合されたＢＣＰＤＡの濃度に依存する。上記の
条件では、吸光度３２５ｎｍで測定の場合、要求される
Ｅｕ”濃度はＢＣＰＯＡ濃度の約８０％±５％である。
レプトアビジン−サイログロブリン複合体は、７５ｍＭ
の２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルフォン酸（ＭＥ
Ｓ）又は３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルフォン
酸（ＭＯＰＳ）のいずれかを含むｐＨ６に調整された溶
液で１５μｇ／ ｍ１２まで希釈した。 ＮａＯＨを用
いてｐＨ５，０に調整した１０ｍＭＨＣｌ中に１ ｍＭ
ＥｕＣ１５を含む溶液を攪拌を行ないながら、上記複
合液に滴下して加えた。その溶液に加えられるＥｕ″４
量と最終的濃度は複合体ストレプトアビジン溶液中に存
在する複合されたＢＣＰＤＡの濃度に依存する。上記の
条件では、吸光度３２５ｎｍで測定の場合、要求される
Ｅｕ”濃度はＢＣＰＯＡ濃度の約８０％±５％である。
Ｅｕ”添加の後、溶液は１６時間３７℃で保温される。
得られた混合溶液は、０．４５μｍのフィルターを通す
ことによってＢＣＰＤＡとＥｕ”が結合しているストレ
プトアビジン−サイログロブリンの保存溶液とすること
ができる。
ことによってＢＣＰＤＡとＥｕ”が結合しているストレ
プトアビジン−サイログロブリンの保存溶液とすること
ができる。
〈調製例６〉
一ストレプトアビジン複合体の蛍光増強のための方法の
別法− この方法は、Ｅｕ”の添加後のインキュベーション時間
を３時間、インキュベーション温度を５０℃とする以外
は調！！５において示しである同様の溶液、方法を利用
する。得られた溶液は０．４５μｍフィルターを通す前
に、少なくとも１時間４℃に冷却することで、これをＢ
ＣＰＤＡとＥｕ”を付したストレプトアビジン−サイロ
グロブリン複合体の保存溶液とする。すなわち高いイン
キュベーション温度はストレプトアビジンの非活性化と
複合体の沈殿をひきおこすため有利な条件ではない、得
られた蛍光増強複合体はストレプトアビジンをベースと
した巨大分子複合体（ＳＢＭＣ）である。
別法− この方法は、Ｅｕ”の添加後のインキュベーション時間
を３時間、インキュベーション温度を５０℃とする以外
は調！！５において示しである同様の溶液、方法を利用
する。得られた溶液は０．４５μｍフィルターを通す前
に、少なくとも１時間４℃に冷却することで、これをＢ
ＣＰＤＡとＥｕ”を付したストレプトアビジン−サイロ
グロブリン複合体の保存溶液とする。すなわち高いイン
キュベーション温度はストレプトアビジンの非活性化と
複合体の沈殿をひきおこすため有利な条件ではない、得
られた蛍光増強複合体はストレプトアビジンをベースと
した巨大分子複合体（ＳＢＭＣ）である。
く調製例７〉
下に示す表はＢＣＰＯＡで簡単に標識されるさまざまな
タンパク質の有効性を示したものである。
タンパク質の有効性を示したものである。
第 １ 表
ＢＳＡ ５９ ６６ ４０ ２６
０ ０．５ＴＧ １５０ ６６０ １
７５ １０００ ５Ｃａｔ １６９
２５０ １２２ ２６１ テス
ト無Ｆａｒ １９４ ４８０ １９０
２０８ ０．５Ｈｃ ＞３００ ＞６０
０ ３４０ ９００ ４上記のタンパク質は
可能なりＣＰＤＡ担体分子として研究された牛血清アル
ブミン（Ｂ！；Ａ） 、牛サイログロブリン（ＴＧ）、
牛肝臓カタラーゼ（Ｃａｔ） 、馬牌臓アポフェリチン
（Ｆｅｒ） 、かさかい（にｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｏｔ
）ヘモシアニン（ＨＣ）をそれぞれ示している。
０ ０．５ＴＧ １５０ ６６０ １
７５ １０００ ５Ｃａｔ １６９
２５０ １２２ ２６１ テス
ト無Ｆａｒ １９４ ４８０ １９０
２０８ ０．５Ｈｃ ＞３００ ＞６０
０ ３４０ ９００ ４上記のタンパク質は
可能なりＣＰＤＡ担体分子として研究された牛血清アル
ブミン（Ｂ！；Ａ） 、牛サイログロブリン（ＴＧ）、
牛肝臓カタラーゼ（Ｃａｔ） 、馬牌臓アポフェリチン
（Ｆｅｒ） 、かさかい（にｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｏｔ
）ヘモシアニン（ＨＣ）をそれぞれ示している。
アミノ基の数とタンパク質の分子量に関する文献的数値
は、ＢＳＡについてはＰｅｔｅｒ （１９７５）から、
ＴＧについてはＭｅｒｃｋｅｎら（１９８５）から、Ｃ
ａｔとＦｅｒについてはＴｒｉｓｔｒａｍとＳｍ１ｔ（
１９６３）から、ＨｃについてはＮａｋａｓｈｉｍａら
（１９８６）から得たものである。
は、ＢＳＡについてはＰｅｔｅｒ （１９７５）から、
ＴＧについてはＭｅｒｃｋｅｎら（１９８５）から、Ｃ
ａｔとＦｅｒについてはＴｒｉｓｔｒａｍとＳｍ１ｔ（
１９６３）から、ＨｃについてはＮａｋａｓｈｉｍａら
（１９８６）から得たものである。
■、タンパク質はｐ）１９．１．０．ＩＭ Ｎａ５Ｃ
Ｏｓ中でタンパク買上の遊離アミノ基に対して最大で５
等量のＢＣＰＯＡで標識される。修飾されたタンパク質
は５ｅｐｈａｄｅｘ” Ｇ−２５カラムによって分離さ
れ、標識の程度は３２５ｎｍにおける標識の吸光度と過
剰のＥｕ”存在下におけるその蛍光により測定する。
Ｏｓ中でタンパク買上の遊離アミノ基に対して最大で５
等量のＢＣＰＯＡで標識される。修飾されたタンパク質
は５ｅｐｈａｄｅｘ” Ｇ−２５カラムによって分離さ
れ、標識の程度は３２５ｎｍにおける標識の吸光度と過
剰のＥｕ”存在下におけるその蛍光により測定する。
２、それぞれの担体分子は個々にｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ
で活性化されたＳＡに結合し、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ Ａ
３４カラムにより分離された。その複合体の比活性は、
ｈＣＧのパインディングアッセイにより直接ＢＣＰＯＡ
で標識したＳＡの結果と比較することで求めた。
で活性化されたＳＡに結合し、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ Ａ
３４カラムにより分離された。その複合体の比活性は、
ｈＣＧのパインディングアッセイにより直接ＢＣＰＯＡ
で標識したＳＡの結果と比較することで求めた。
上記すべてのタンパク質は、“吸着”カラム下でＥ ｕ
”が存在しない８ＣＰＯＡ標識の標識値よりも蛍光の増
強を与えた。蛍光性標識としてのそれらのタンパク質の
比活性はすべて、試験しなかったカタラーゼを除いて蛍
光の増加を示している。その中でサイログロブリンとヘ
モシアニンは特に活性が認められた。
”が存在しない８ＣＰＯＡ標識の標識値よりも蛍光の増
強を与えた。蛍光性標識としてのそれらのタンパク質の
比活性はすべて、試験しなかったカタラーゼを除いて蛍
光の増加を示している。その中でサイログロブリンとヘ
モシアニンは特に活性が認められた。
く調製例８〉
標識されたサイログロブリンは異なったタイプの活性化
学物質を含む様々な手法でストレプトアビジンと結合す
ることができる。
学物質を含む様々な手法でストレプトアビジンと結合す
ることができる。
下記の第２表は使用できる様々な活性化学物質の例を示
している。
している。
第 ２ 表
ＳＡに対するＢＣＰＤＡ−丁Ｇの結合方法５ＰＤＰ／５
ＡＴＡ ０．８ 注１．複合体の比活性はｈＧＣに対するバインディング
アッセイによる。
ＡＴＡ ０．８ 注１．複合体の比活性はｈＧＣに対するバインディング
アッセイによる。
ＢＣＰＤＡ−ＴＧ複合体の形成は、下記に示す方法のう
ち１つを用いることによって達成される。
ち１つを用いることによって達成される。
１、ｉｌｌ何例１２で説明したようにＢＣＰＯＡで広く
標識する前にＳｕｌｆｏ−３ＭＣＣによってＳＡを活性
化しＴＧ上にチオールエステルを結合する。
標識する前にＳｕｌｆｏ−３ＭＣＣによってＳＡを活性
化しＴＧ上にチオールエステルを結合する。
２、ＳＡがＮ−（スクシニミディル−３−（２−ピリジ
ルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）で活性化される以
外１と類似の方法。
ルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）で活性化される以
外１と類似の方法。
３、同−二官能の（ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｌｏｎａｌ
）試薬ｐ−ベンゾキノンによりＳＡが活性化され、さら
にＢＣＰＤＡ−ＴＧがそれに添加される。
）試薬ｐ−ベンゾキノンによりＳＡが活性化され、さら
にＢＣＰＤＡ−ＴＧがそれに添加される。
４、 ＢＣＰＯＡ−ＴＧが過剰の過ヨウ素酸ナトリウム
で活性化した後ＳＡを添加し、その反応をグリセロール
によって停止する。その複合体はゲル濾過によって分離
した。その複合の程度は、トレーサーとしての１■Ｉ結
合ＳＡを利用することによって決定した。
で活性化した後ＳＡを添加し、その反応をグリセロール
によって停止する。その複合体はゲル濾過によって分離
した。その複合の程度は、トレーサーとしての１■Ｉ結
合ＳＡを利用することによって決定した。
［実施例１］ 方 法
α−フェトプロティンモノクローナル検出抗体はＢＣＰ
ＯＡで標識し、分離し、特徴化（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｚｅｄ） Ｌ／、５ＩＩＩｇ／Ｉ２に希釈した。α−フ
ェトプロティンモノクローナル抗体でマイクロタイトレ
ージョンストリップ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒａｔｉｏｎ
５ｔｒｉｐｓ）をコーティングし、第二抗体のピオチン
化過程を標準的な手法に従って行なった。
ＯＡで標識し、分離し、特徴化（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｚｅｄ） Ｌ／、５ＩＩＩｇ／Ｉ２に希釈した。α−フ
ェトプロティンモノクローナル抗体でマイクロタイトレ
ージョンストリップ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒａｔｉｏｎ
５ｔｒｉｐｓ）をコーティングし、第二抗体のピオチン
化過程を標準的な手法に従って行なった。
次にストレプトアビジンをＢＣＰＤＡで標識した。
この方法によって１４±１のＢＣＰＤ八分子へストレプ
トアビジン１分子に結合する。標識された実用ストレプ
トアビジン溶液は、ＩＩ２中に９ｇＮａＣｌ。
トアビジン１分子に結合する。標識された実用ストレプ
トアビジン溶液は、ＩＩ２中に９ｇＮａＣｌ。
４０ｇ ＢＳＡ、 ０．５ｇアジ化ナトリウム含有ｐ
Ｈ７，２０の５０ｍＭトリス緩衝液中に３ｍｇ／Ｉ２ス
トレプトアビジンと４ Ｘ １０−’ｍｏｌ／Ｉ２のＥ
ｕ”を含んでいる。
Ｈ７，２０の５０ｍＭトリス緩衝液中に３ｍｇ／Ｉ２ス
トレプトアビジンと４ Ｘ １０−’ｍｏｌ／Ｉ２のＥ
ｕ”を含んでいる。
すべてのケースで、標識されたＢＣＰＤＡの程度は３２
５ｎｍでの吸光度測定によって決定した。その吸光度で
はＢＣＰＯＡ （７）みが吸収される（１．５ｘ ＩＯ
’Ｍ−’ｃｍ−’の分子吸光係数）。
５ｎｍでの吸光度測定によって決定した。その吸光度で
はＢＣＰＯＡ （７）みが吸収される（１．５ｘ ＩＯ
’Ｍ−’ｃｍ−’の分子吸光係数）。
標識されたタンパク質の蛍光による特徴化（ｃｈａｒａ
ｃｔｅｒ １ｚｅｄ）は、以下のように実施された。
ｃｔｅｒ １ｚｅｄ）は、以下のように実施された。
すなわち、ＢＣＰＤＡをｐＨ９，５０の０．１Ｍ炭酸塩
緩衝液中で２時間４０℃でインキュベーションすること
により加水分解した。
緩衝液中で２時間４０℃でインキュベーションすること
により加水分解した。
この保存液（１０−’Ｍ）はおよそ１０−７〜３ Ｘ
１０−”Ｍの範囲になるように希釈した。希釈液は１０
−’ＭＥ ｕ”を含むｐＨ７，８０１０ｍＭ トリス緩
衝液であった。スタンダードカーブはスタンダードＢＣ
ＰＤＡ溶液の各濃度に対する蛍光測定（Ａｒｃｕｓ ｆ
ｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ２００μβ／ｗｅｌｌ）のプロッ
トにより作成した。
１０−”Ｍの範囲になるように希釈した。希釈液は１０
−’ＭＥ ｕ”を含むｐＨ７，８０１０ｍＭ トリス緩
衝液であった。スタンダードカーブはスタンダードＢＣ
ＰＤＡ溶液の各濃度に対する蛍光測定（Ａｒｃｕｓ ｆ
ｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ２００μβ／ｗｅｌｌ）のプロッ
トにより作成した。
ＢＣＰＤＡで標識したタンパク質は上記と同じ緩衝液で
希釈し同様に測定した。 ＢＣＰＤＡ濃度は検量線から
決定した。
希釈し同様に測定した。 ＢＣＰＤＡ濃度は検量線から
決定した。
［実施例２］ 固相バインディングアッセイ０、２５．
５０．１００．１５０．２００ｎｇのピオチン結合ヤギ
抗ヒトＩｇＭ抗体は、ウェルあたり１００μβの０．１
Ｍ重炭酸塩溶液を添加し、４℃で一夜インキユベーショ
ンすることによって白色不透明マイクロタイターウェル
にコートした。
５０．１００．１５０．２００ｎｇのピオチン結合ヤギ
抗ヒトＩｇＭ抗体は、ウェルあたり１００μβの０．１
Ｍ重炭酸塩溶液を添加し、４℃で一夜インキユベーショ
ンすることによって白色不透明マイクロタイターウェル
にコートした。
それからウェルをβあたり９ｇのＮａＣ１と０．５ｇの
Ｔｗｅｅｎ ２０を含む溶液で洗浄し、１０ｇ／Ｉ２牛
血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．１重炭酸塩溶液を
１００μＩ２／ｗｅｌｌ加えることにより室温に４時間
おいた。ウェルを再び洗浄し乾燥（ｓｈａｋｅｎ ｄｒ
ｙ）させた、 ＢＣＰＤＡ標識のＳＡ又は５Ａ−ＴＧ−
（ＢＣＰ［ｌＡ）、複合体は４％ＢＳＡ、 ０．９％
ＮａＣｌ、 ０．０５％ＮａＮ５．４０μＭＥ ｕ”を
含むｐＨ７，２の５０ｍＭトリス緩衝液で第３図に示さ
れているように、ストレプトアビジンに関して異なった
濃度に調製するよう希釈した。第３図におけるストレプ
トアビジン濃度は三角形が０．３３μｇ／ｍｎ、ダイヤ
モンドが０６５μｓ／ ｍβ、正方形が０．３３μｓ／
ｍ℃、円が３．０μｇ／ ｍβであり、白抜きの印が
ＢＣＰＯＡ−ＳＡ、黒い印が５Ａ−ＴＧ−（ＢＣＰＤＡ
）。
Ｔｗｅｅｎ ２０を含む溶液で洗浄し、１０ｇ／Ｉ２牛
血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．１重炭酸塩溶液を
１００μＩ２／ｗｅｌｌ加えることにより室温に４時間
おいた。ウェルを再び洗浄し乾燥（ｓｈａｋｅｎ ｄｒ
ｙ）させた、 ＢＣＰＤＡ標識のＳＡ又は５Ａ−ＴＧ−
（ＢＣＰ［ｌＡ）、複合体は４％ＢＳＡ、 ０．９％
ＮａＣｌ、 ０．０５％ＮａＮ５．４０μＭＥ ｕ”を
含むｐＨ７，２の５０ｍＭトリス緩衝液で第３図に示さ
れているように、ストレプトアビジンに関して異なった
濃度に調製するよう希釈した。第３図におけるストレプ
トアビジン濃度は三角形が０．３３μｇ／ｍｎ、ダイヤ
モンドが０６５μｓ／ ｍβ、正方形が０．３３μｓ／
ｍ℃、円が３．０μｇ／ ｍβであり、白抜きの印が
ＢＣＰＯＡ−ＳＡ、黒い印が５Ａ−ＴＧ−（ＢＣＰＤＡ
）。
を表わしている。そのＢＣＰＤ−３Ａと５Ａ−ＴＧ−（
ＢＣＰＯＡ）１１の各溶液１００ＩＬＩ２を、様々の容
量のピオチン結合抗体でコートされているそれぞれのマ
イクロタイトレートウェルに２度にわたって加え、３７
℃で１時間インキュベートした。プレートは洗浄乾燥さ
れ、蛍光をＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ ６１５”フルオロメ
ーターで測定した。蛍光値はウェル上に固定されている
ピオチン結合抗体量に対してプロットした。
ＢＣＰＯＡ）１１の各溶液１００ＩＬＩ２を、様々の容
量のピオチン結合抗体でコートされているそれぞれのマ
イクロタイトレートウェルに２度にわたって加え、３７
℃で１時間インキュベートした。プレートは洗浄乾燥さ
れ、蛍光をＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ ６１５”フルオロメ
ーターで測定した。蛍光値はウェル上に固定されている
ピオチン結合抗体量に対してプロットした。
［実施例３］ α−フェトプロティン定量ａ） 直接標
識された抗体用いた方法でα−フェトプロティンスタン
ダード２０μ２がマイクロタイトレージョンウェルにコ
ートされているＡＦＰ抗体に分注する。すなわち直接的
に標式された抗体の溶液１００μｓ／ ｍａｌ！ （Ｅ
ｕ” １０１Ｍを含む５μｇ／ｍＩ２の抗体含有）が加
えられ、３７℃で９０分間インキュベートされた。ウェ
ルは３回洗浄溶液で洗い、冷風を用いて３分間乾燥した
。
識された抗体用いた方法でα−フェトプロティンスタン
ダード２０μ２がマイクロタイトレージョンウェルにコ
ートされているＡＦＰ抗体に分注する。すなわち直接的
に標式された抗体の溶液１００μｓ／ ｍａｌ！ （Ｅ
ｕ” １０１Ｍを含む５μｇ／ｍＩ２の抗体含有）が加
えられ、３７℃で９０分間インキュベートされた。ウェ
ルは３回洗浄溶液で洗い、冷風を用いて３分間乾燥した
。
ＣｙｂｅｒＦＩｕｏｒ Ｍｏｄｅｌ ６１５Ｔ＆′イム
ノアナライザーによって蛍光を測定した。
ノアナライザーによって蛍光を測定した。
ｂ） ピオチンが結合している抗体を用いる０手法は上
記の通りであるが、直接標識された抗体の代わりに第２
の抗体としてピオチンが結合しているものを使用する。
記の通りであるが、直接標識された抗体の代わりに第２
の抗体としてピオチンが結合しているものを使用する。
洗浄のあとＥｕ”（４Ｘｌ０−’Ｍ）を含む直接ラベル
されたストレプトアビジン溶液（３μｓ／ ｍｌ）又は
上記のように希釈したＥ ｕ”（４Ｘ １０−’Ｍ）を
含むストレプトアビジン−サイログロブリン混合溶液１
００μ℃をウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベ
ートした。さらに３回洗浄ののち、ウェルを乾燥し上記
方法によってＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ Ｍｏｄｅｌ ６１
５”イムノアナライザによって測定した。α−フェトプ
ロティン定量の検量線は第４図に示すとおりである６図
中（Ａ）は直接標識化されたストレプトアビジン、（Ｂ
）は抗体とピオチンで結合し、直接標識化されたストレ
プトアビジン、（Ｃ）は標識化されたサイログロブリン
に複合されたストレプトアビジンを表わしている。
されたストレプトアビジン溶液（３μｓ／ ｍｌ）又は
上記のように希釈したＥ ｕ”（４Ｘ １０−’Ｍ）を
含むストレプトアビジン−サイログロブリン混合溶液１
００μ℃をウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベ
ートした。さらに３回洗浄ののち、ウェルを乾燥し上記
方法によってＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ Ｍｏｄｅｌ ６１
５”イムノアナライザによって測定した。α−フェトプ
ロティン定量の検量線は第４図に示すとおりである６図
中（Ａ）は直接標識化されたストレプトアビジン、（Ｂ
）は抗体とピオチンで結合し、直接標識化されたストレ
プトアビジン、（Ｃ）は標識化されたサイログロブリン
に複合されたストレプトアビジンを表わしている。
［実施例４］
ＢＣＰＤＡで標識されたストレプトアビジン、調製例４
のＢＣＰＤＡで標識されたストレプトアビジン−サイロ
グロブリン複合体、調製例５のＥｕ”＋付着複合体の検
出感度を決定するために実施例３の工程を引き続き行な
った。検出される反応物質はサイロトロピン（ＴＳＨ）
、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、及びα−フェ
トプロティン（ＡＦＰ）である。
のＢＣＰＤＡで標識されたストレプトアビジン−サイロ
グロブリン複合体、調製例５のＥｕ”＋付着複合体の検
出感度を決定するために実施例３の工程を引き続き行な
った。検出される反応物質はサイロトロピン（ＴＳＨ）
、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、及びα−フェ
トプロティン（ＡＦＰ）である。
その方法のポイントを第３表に詳細に示した。
第３表
サンプル容量
ビ杼ン結合抗体容量
インキュベート 時間
洗浄
定量手順
ＴＳＩＩ ｈＣＧ
２００μ４５０μ４
５０μｍ２５０μ４
４時間 １時間
ＡＦＰ
２０μ℃
１００μ４
１．５時間
第４表
ＢＣＰＤＡで標識された試薬を用いた到達感度検出限界
試薬” ＴＳ）ｌ（ｍＬＩ／Ｌ） ｈＣＧ（Ｕ
／Ｌ） ＡＰＦ（ｎｇ／ｍｌ）インキュベート 時間 洗浄 ３０分 ４５分 ４５分 上記方法にて検出される標識担体結合体の感度は以下の
第４表に示しである。
／Ｌ） ＡＰＦ（ｎｇ／ｍｌ）インキュベート 時間 洗浄 ３０分 ４５分 ４５分 上記方法にて検出される標識担体結合体の感度は以下の
第４表に示しである。
体が補助試薬として用いられた。
Ｓ Ａ −Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ｔｓｏ 複合
体の分離は、分子量Ｉ Ｘ １０’から７Ｘ１０’のタ
ンパク質を分画できるＵｌｔｒｏｇｅｌ Ａ ３４カラ
ムの分子篩特性によって行なわれる（第２図）０図中Ｘ
軸にカラムからの溶出量（ｍｌ） 、左Ｙ軸は２８０ｎ
ｍにおける吸光度を、右Ｙ軸には放射活性を示している
。このカラムは結合ＳＡと未結合ＳＡを大きく分けるこ
とができる。Ｓ Ａ −Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ｒ
ｓ。はＳＡの分子量６Ｘ１０’に対し、８Ｘ１０’以
上の分子量をもつ、この分離はＳＡにのみ係っている放
射性活性によって誘導した。このカラムのボイドボリュ
ーム付近の１２１１Ｉ放射性活性の存在はＳＡがＴ Ｇ
−（ＢＣＰＯＡ） ＋ｓｏに結合したことを示すもの
である。ＳＡは遊離したチオール基を含んでいないため
、活性化されたＳＡは高分子量のホモポリマーを形成す
ることができない。
体の分離は、分子量Ｉ Ｘ １０’から７Ｘ１０’のタ
ンパク質を分画できるＵｌｔｒｏｇｅｌ Ａ ３４カラ
ムの分子篩特性によって行なわれる（第２図）０図中Ｘ
軸にカラムからの溶出量（ｍｌ） 、左Ｙ軸は２８０ｎ
ｍにおける吸光度を、右Ｙ軸には放射活性を示している
。このカラムは結合ＳＡと未結合ＳＡを大きく分けるこ
とができる。Ｓ Ａ −Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ｒ
ｓ。はＳＡの分子量６Ｘ１０’に対し、８Ｘ１０’以
上の分子量をもつ、この分離はＳＡにのみ係っている放
射性活性によって誘導した。このカラムのボイドボリュ
ーム付近の１２１１Ｉ放射性活性の存在はＳＡがＴ Ｇ
−（ＢＣＰＯＡ） ＋ｓｏに結合したことを示すもの
である。ＳＡは遊離したチオール基を含んでいないため
、活性化されたＳＡは高分子量のホモポリマーを形成す
ることができない。
このカラムは第２図に示しているようにＳＡに共存結合
している複合体から非複合体のＴＧ−（ＢＣＰＤＡ）
＋ａｏを分離することはできない、しかしながらイムノ
ピオチンカラムを使ったようなＴＧ−（ＢＣＰＤＡ）
＋ｓｏからＳ Ａ −Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ） ＋ｓ
ｏを精巧に精製する方法は必要ない、我々は実施モデル
として用いたα−フェトプロティン定量において、過剰
のＴ Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ＋ｓｏはバックグランド
蛍光全体に対して重大な意味をもたないことを認めたか
らである。
している複合体から非複合体のＴＧ−（ＢＣＰＤＡ）
＋ａｏを分離することはできない、しかしながらイムノ
ピオチンカラムを使ったようなＴＧ−（ＢＣＰＤＡ）
＋ｓｏからＳ Ａ −Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ） ＋ｓ
ｏを精巧に精製する方法は必要ない、我々は実施モデル
として用いたα−フェトプロティン定量において、過剰
のＴ Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ＋ｓｏはバックグランド
蛍光全体に対して重大な意味をもたないことを認めたか
らである。
第３図は、ピオチン結合した抗体でコートされたマイク
ロタイターウェルへの結合に関する研究において、直接
標識したＳＡに比較した５Ａ−Ｔ Ｇ （ＢＣＰＯＡ
） ｌｓ。複合体によって得られた改良感度を示したも
のである＃Ｘ軸にはピオチン結合の抗体量（ｎｇ／ｗｅ
ｌｌ）をとりＹ軸は蛍光量を示している。その複合体か
ら得られた蛍光値は同じ濃度条件でＢＣＰＤＡ標識され
たストレプトアビジンよりも少なくとも５倍以上高かっ
た。
ロタイターウェルへの結合に関する研究において、直接
標識したＳＡに比較した５Ａ−Ｔ Ｇ （ＢＣＰＯＡ
） ｌｓ。複合体によって得られた改良感度を示したも
のである＃Ｘ軸にはピオチン結合の抗体量（ｎｇ／ｗｅ
ｌｌ）をとりＹ軸は蛍光量を示している。その複合体か
ら得られた蛍光値は同じ濃度条件でＢＣＰＤＡ標識され
たストレプトアビジンよりも少なくとも５倍以上高かっ
た。
本発明の開発過程において、我々は他の多数の化学的結
合方法についても試みた。
合方法についても試みた。
我々はＴＧの糖分子上にアルデヒド基を形成するために
過ヨウ素酸ナトリウムを用いてＢＣＰＯＡ標識のＴＧを
活性化した後にＴｉｊｓｓｅｎ、 Ｐ、が酸素免疫法の
理論と実践（アムステルダム； Ｅｌａｅｖｉｅｒ。
過ヨウ素酸ナトリウムを用いてＢＣＰＯＡ標識のＴＧを
活性化した後にＴｉｊｓｓｅｎ、 Ｐ、が酸素免疫法の
理論と実践（アムステルダム； Ｅｌａｅｖｉｅｒ。
１９８５）の中で述べている過ヨウ素酸塩結合方法につ
いても実施した。
いても実施した。
アルデヒド基はＳＡのアミノ基と反応した後、水素化ホ
ウ素ナトリウムによる還元またはグリセロールの添加に
よりシッフ塩基を固定した。
ウ素ナトリウムによる還元またはグリセロールの添加に
よりシッフ塩基を固定した。
我々は又よく知られている同−二官能の（ｍｏｎｏｂｉ
−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）試薬であるベンゾキノンと新
しい試薬Ｎ−スクシニミディル−３−（２−ビリデイル
デイチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）も使用した。全
ケースにおいて、活性的複合体が得られたが、その生産
性はＳｕ Ｉｆｏ−３ＭＣＣ／５ＡＴＡ方法で得られた
ものよりも低かった。（第２表） 我々はまたＢＣＰＯＡの担体として働くものとしてＴＧ
以外に数多くのタンパク質を検討した。前にも述べてい
るように、それらのタンパク質としてはＢＳＡ、ヘモシ
アニン、ミオシン、フェリチン、カタラーゼ、アミノ酸
とリジンの比と分子量が異なるポリリジンコポリマーを
含んでいる。これらのタンパク質はＢＣＰＤＡ分子をで
きる限りたくさん付着させるための数多くのアミノ酸を
有するという点で選出された。
−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）試薬であるベンゾキノンと新
しい試薬Ｎ−スクシニミディル−３−（２−ビリデイル
デイチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）も使用した。全
ケースにおいて、活性的複合体が得られたが、その生産
性はＳｕ Ｉｆｏ−３ＭＣＣ／５ＡＴＡ方法で得られた
ものよりも低かった。（第２表） 我々はまたＢＣＰＯＡの担体として働くものとしてＴＧ
以外に数多くのタンパク質を検討した。前にも述べてい
るように、それらのタンパク質としてはＢＳＡ、ヘモシ
アニン、ミオシン、フェリチン、カタラーゼ、アミノ酸
とリジンの比と分子量が異なるポリリジンコポリマーを
含んでいる。これらのタンパク質はＢＣＰＤＡ分子をで
きる限りたくさん付着させるための数多くのアミノ酸を
有するという点で選出された。
我々は固相分析及びＡＦＰサンドイッチ分析法（下に示
す）において、ＢＳＡ、ヘモシアニン、フェリチンを用
いた複合体と比較した場合ＴＧ複合体がベストシグナル
を与えるというタンパク質試験の結果を得た。
す）において、ＢＳＡ、ヘモシアニン、フェリチンを用
いた複合体と比較した場合ＴＧ複合体がベストシグナル
を与えるというタンパク質試験の結果を得た。
Ｓ Ａ −Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ） ＋ｓｏ複合体の
安定性は４℃と３７℃であった。そして、ｐＨ６，０に
おいて、０、０５Ｍアセテート緩衝液又は７５ｍＭ
ＭＥＳ中にその複合体が比較的濃縮された溶液として保
持された場合（ストレプトアビジンに関して１５ｇｇ／
ｍｌ） 、安定性が最も優れていることが明らかになっ
た。
安定性は４℃と３７℃であった。そして、ｐＨ６，０に
おいて、０、０５Ｍアセテート緩衝液又は７５ｍＭ
ＭＥＳ中にその複合体が比較的濃縮された溶液として保
持された場合（ストレプトアビジンに関して１５ｇｇ／
ｍｌ） 、安定性が最も優れていることが明らかになっ
た。
この溶液は分析に用いる直前に１βあたり４０ｇのＢＳ
ＡとＥｕ” （４Ｘ １０−’Ｍ）を含むｐ１７．２０
の５０ｍＭトリス緩衝液にて通常５０倍に希釈される。
ＡとＥｕ” （４Ｘ １０−’Ｍ）を含むｐ１７．２０
の５０ｍＭトリス緩衝液にて通常５０倍に希釈される。
濃縮物として保存した場合４℃下で１２ケ月間安定であ
った。さらに続けられた安定性の研究では３７℃で少な
くとも２週間安定であった。文献によればこの発見は５
Ａ−ＴＧ−（ＢＣＰＯＡ） ｌｓ。複合体が４℃で少な
くとも２年間安定であることが示されている。希釈後室
温で１日間安定であるのでルーチン的定量に用いるのに
便利である。
った。さらに続けられた安定性の研究では３７℃で少な
くとも２週間安定であった。文献によればこの発見は５
Ａ−ＴＧ−（ＢＣＰＯＡ） ｌｓ。複合体が４℃で少な
くとも２年間安定であることが示されている。希釈後室
温で１日間安定であるのでルーチン的定量に用いるのに
便利である。
我々は２つのモノクローナル抗体を用いた血清中のα−
フェトプロティンに関する免疫検定法を開発した。一方
の第一抗体は固相形成のために白色不透明マイクロタイ
トレージョンウェルに固定する。第二抗体（検出抗体）
はコルチゾールモノクローナル抗体に対してＢＣＰＤＡ
で直接的に標識されたものか、ピオチン結合されたもの
である３２５ｎｍでの吸光度測定によって判明したその
抗体に対するＢＣＰＤＡの分子割合は１０である。
フェトプロティンに関する免疫検定法を開発した。一方
の第一抗体は固相形成のために白色不透明マイクロタイ
トレージョンウェルに固定する。第二抗体（検出抗体）
はコルチゾールモノクローナル抗体に対してＢＣＰＤＡ
で直接的に標識されたものか、ピオチン結合されたもの
である３２５ｎｍでの吸光度測定によって判明したその
抗体に対するＢＣＰＤＡの分子割合は１０である。
又我々は第４図に示すように、それぞれの方法による増
大効果を説明するために、ＡＥＰ定量に関して異なった
以下の３つの方法を実施した。
大効果を説明するために、ＡＥＰ定量に関して異なった
以下の３つの方法を実施した。
図中、Ｘ軸はＡＦＰ量（ｎｇ／ｍｌ）を示し、Ｙ軸は蛍
光量値を示している。また、（Ａ）は直接標識されたス
トレプトアビジン、（Ｂ）は抗体とピオチンを介して結
合し直接標識化されたストレプトアビジン、（Ｃ）は上
ですでに示したように標識化されたサイログロブリンに
複合されたストレプトアビジンを表わしている。その測
定結果は第４図に示している。我々はそれぞれの場合に
ついて９５％信頼限界でゼロから区分することができる
ＡＦＰ濃度として決定することが可能な検出限界を計算
し、各ケース毎の検出限界は、５，１゜０．２ｎｇ／ｍ
ｌであることがわかった。シグナルの観点からは方法（
ｂ）における標識法の改良効果は方法（ａ）の場合の約
１５倍である。しかしゼロのスタンダードから得られる
バックグラウンドシグナルがウェルの試薬に対し特定の
吸光度を持たないために方法（ｂ）が方法（ａ）よりも
高く、その検出限界の改良は約５倍にとどまる。方法（
ｂ）に対する方法（ｃ）のシグナルに関する改良は約１
５倍で、それ以下は検出限界における改良とも一致して
いる。方法（ｂ）及び（Ｃ）におけるバックグラウンド
シグナルは類似している。さらに検出力を高めたＳ Ａ
−Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ＋８゜は第４図に示さ
れた方法（Ｃ）の非増強の複合体に較べてシグナル的に
さらに５倍の感度アップを示している。増強された蛍光
性をもつストレプトアビジンベースの巨大分子複合体（
ＳＢＭＣ）はその実用性を決めるためのプロラクチン定
量に用いられる。
光量値を示している。また、（Ａ）は直接標識されたス
トレプトアビジン、（Ｂ）は抗体とピオチンを介して結
合し直接標識化されたストレプトアビジン、（Ｃ）は上
ですでに示したように標識化されたサイログロブリンに
複合されたストレプトアビジンを表わしている。その測
定結果は第４図に示している。我々はそれぞれの場合に
ついて９５％信頼限界でゼロから区分することができる
ＡＦＰ濃度として決定することが可能な検出限界を計算
し、各ケース毎の検出限界は、５，１゜０．２ｎｇ／ｍ
ｌであることがわかった。シグナルの観点からは方法（
ｂ）における標識法の改良効果は方法（ａ）の場合の約
１５倍である。しかしゼロのスタンダードから得られる
バックグラウンドシグナルがウェルの試薬に対し特定の
吸光度を持たないために方法（ｂ）が方法（ａ）よりも
高く、その検出限界の改良は約５倍にとどまる。方法（
ｂ）に対する方法（ｃ）のシグナルに関する改良は約１
５倍で、それ以下は検出限界における改良とも一致して
いる。方法（ｂ）及び（Ｃ）におけるバックグラウンド
シグナルは類似している。さらに検出力を高めたＳ Ａ
−Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ＋８゜は第４図に示さ
れた方法（Ｃ）の非増強の複合体に較べてシグナル的に
さらに５倍の感度アップを示している。増強された蛍光
性をもつストレプトアビジンベースの巨大分子複合体（
ＳＢＭＣ）はその実用性を決めるためのプロラクチン定
量に用いられる。
［実施例５］
プロラクチンスタンダード５０μ℃をプロラクチン抗体
を固定したマイクロタイトレージョンウェルへ分注し、
１時間振盪状態で室温にて保持した。その後ピオチンが
結合した第２抗体１５０μβを添加し、さらに振盪状態
で１時間室温で保持した。次に洗浄溶液でウェルを３回
洗浄したのち、直接的標識ストレプトアビジン溶液ある
いはストレプトアビジン・サイログロブリン複合体（増
強又は非増強は以下参照）１００μβを前記に従って希
釈しウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベートし
た。さらに３回洗浄の後、乾燥し、Ｃｙｂｅｒ Ｆｌｕ
ｅｒ Ｍｏｄｅｌ ６１５”イムノアナライザーで測定
した。
を固定したマイクロタイトレージョンウェルへ分注し、
１時間振盪状態で室温にて保持した。その後ピオチンが
結合した第２抗体１５０μβを添加し、さらに振盪状態
で１時間室温で保持した。次に洗浄溶液でウェルを３回
洗浄したのち、直接的標識ストレプトアビジン溶液ある
いはストレプトアビジン・サイログロブリン複合体（増
強又は非増強は以下参照）１００μβを前記に従って希
釈しウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベートし
た。さらに３回洗浄の後、乾燥し、Ｃｙｂｅｒ Ｆｌｕ
ｅｒ Ｍｏｄｅｌ ６１５”イムノアナライザーで測定
した。
［実施例６］
Ｅｕ”増強のＳＢＭＣ又は非増強のストレプトアビジン
サイログロブリン複合体５Ａ−ＴＧ−（ＢＣＰＤＡ）
＋ ｓ。を溶液中のストレプトアビジンに関して０．３
ｍｇ／βまで希釈した。それはｌβあたり９ｇＮａＣ１
，４０ｇ ＢＳＡ、０．５ｇアジ化ナトリウムを含ｔ
ＪｐＨ７，２０５０ｍＭ トリス緩衝液中にＥｕ”を４
Ｘ １０−’ ｍ１２／Ｑを含んでいた。この検出溶液
１００ｍβを実施例５で記述のとおり２回目のインキュ
ベーションの間にプロラクチンの各ウェルに添加した。
サイログロブリン複合体５Ａ−ＴＧ−（ＢＣＰＤＡ）
＋ ｓ。を溶液中のストレプトアビジンに関して０．３
ｍｇ／βまで希釈した。それはｌβあたり９ｇＮａＣ１
，４０ｇ ＢＳＡ、０．５ｇアジ化ナトリウムを含ｔ
ＪｐＨ７，２０５０ｍＭ トリス緩衝液中にＥｕ”を４
Ｘ １０−’ ｍ１２／Ｑを含んでいた。この検出溶液
１００ｍβを実施例５で記述のとおり２回目のインキュ
ベーションの間にプロラクチンの各ウェルに添加した。
［実施例７］
ＳＢＭＣは５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００丁”カラム
（２，６ｘ３５Ｃ！１１）を用いたゲルフィルトレージ
ョンクロマトグラフィーによっていかなる遊離のＢＣＰ
ＯＡ−標識されたサイログロブリンも単離された。それ
らのクロマトグラムは、約０．８ｎｍｏｌの５Ａ−ＴＧ
−（ＢＣＰＤＡ） １８６と３．３ ｎｍｏｌのＴ Ｇ
−（ＢＣＰＤＡ） ｌｓ ｏについてカラムにセット
するがｐＨ６，５０℃の７５ｍＭＭＥＳ （７６％ＢＣ
ＰＯＡを含む）の中でＥｕ”をともなったインキュベー
ションの前（・・・）と後（−）のサンプルを６０ｍＭ
ＭＥＳ、ｐＨ６、流速０．４ ｍｎ ／ｍｉｎで流出
した時得られた（第９図）、単離したＳＢＭＣのプロラ
クチン定量における３２５ｎｍ吸光度、放射性活性（＋
２ｆｌｌ−ＳＡ）、相対的蛍光シグナルが測定された。
（２，６ｘ３５Ｃ！１１）を用いたゲルフィルトレージ
ョンクロマトグラフィーによっていかなる遊離のＢＣＰ
ＯＡ−標識されたサイログロブリンも単離された。それ
らのクロマトグラムは、約０．８ｎｍｏｌの５Ａ−ＴＧ
−（ＢＣＰＤＡ） １８６と３．３ ｎｍｏｌのＴ Ｇ
−（ＢＣＰＤＡ） ｌｓ ｏについてカラムにセット
するがｐＨ６，５０℃の７５ｍＭＭＥＳ （７６％ＢＣ
ＰＯＡを含む）の中でＥｕ”をともなったインキュベー
ションの前（・・・）と後（−）のサンプルを６０ｍＭ
ＭＥＳ、ｐＨ６、流速０．４ ｍｎ ／ｍｉｎで流出
した時得られた（第９図）、単離したＳＢＭＣのプロラ
クチン定量における３２５ｎｍ吸光度、放射性活性（＋
２ｆｌｌ−ＳＡ）、相対的蛍光シグナルが測定された。
その後、ＳＢＭＣはその構成（ＢＣＰＯＡ標識のサイロ
グロブリンに放射的に結合しているストレプトアビジン
、 ＢＣＰＤＡ標識のサイログロブリンＥ ｕ ”）ま
で以下の方法により分解した。すなわちＳＢＭＣは、ｐ
）１９．１、ＮａｘＣＯｓ中、分子量的ニハ存在するＢ
ＣＰＯＡの３０倍のＥＤＴＡで室温にて一晩インキユベ
ートした。
グロブリンに放射的に結合しているストレプトアビジン
、 ＢＣＰＤＡ標識のサイログロブリンＥ ｕ ”）ま
で以下の方法により分解した。すなわちＳＢＭＣは、ｐ
）１９．１、ＮａｘＣＯｓ中、分子量的ニハ存在するＢ
ＣＰＯＡの３０倍のＥＤＴＡで室温にて一晩インキユベ
ートした。
得られた混合物はセファデックスＧ−２５カラムに加え
られｐＨ８ノ０．１ Ｍ Ｎａ＊ＣＯｓテ流出シタ（
第１０図）、その流出物を２８０ｎｍで観察し、各フラ
クションのＥｕ”量はｐＨ３，５１００ｍＭアセテート
緩衝液で１００倍に希釈した後測定した・その後、増強
液（Ｅｕｈａｎｃｅｍｅｎｔ ５ｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｌ
Ｋ Ｂ Ｗａｌｌａｃより購入）２００μ４を添加し
た透明のマイクロタイトレートストリップに１０μβを
ピペッティングし、その蛍光をＡｒｃｕｓフルオロメー
ターで測定した。そのＥｕ”濃度は同じ方法を用いて作
成できるスタンダード曲線を基本に定量された。
られｐＨ８ノ０．１ Ｍ Ｎａ＊ＣＯｓテ流出シタ（
第１０図）、その流出物を２８０ｎｍで観察し、各フラ
クションのＥｕ”量はｐＨ３，５１００ｍＭアセテート
緩衝液で１００倍に希釈した後測定した・その後、増強
液（Ｅｕｈａｎｃｅｍｅｎｔ ５ｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｌ
Ｋ Ｂ Ｗａｌｌａｃより購入）２００μ４を添加し
た透明のマイクロタイトレートストリップに１０μβを
ピペッティングし、その蛍光をＡｒｃｕｓフルオロメー
ターで測定した。そのＥｕ”濃度は同じ方法を用いて作
成できるスタンダード曲線を基本に定量された。
そのボイドボリューム付近の流出されたタンパク質ピー
クはプールされプロラクチン定量における３２５ｎｍ吸
光度、ｌ！Ｉ ｌ−５Ａ放射性活性、相対的蛍光シグナ
ルを測定した。
クはプールされプロラクチン定量における３２５ｎｍ吸
光度、ｌ！Ｉ ｌ−５Ａ放射性活性、相対的蛍光シグナ
ルを測定した。
２５μｇ／β標準プロラクチン溶液を用いた実施例５の
プロラクチン定量に関して、様々な複合溶液をピオチン
結合の抗体を用いた複合体の検出試薬として用いた。実
施例５に記載しているように、検出試薬はＥｕ”を含む
緩衝液に希釈した複合体溶液を含んでいる。結果は第６
図に示されている図中、Ｘ軸はユーロピウムによるＢＣ
ＰＯＡの飽和（Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）度を割合で示し
、左Ｙ軸は３２５ｎｍにおける吸光度を、右Ｙ軸は関連
のトレーサーの相対活性度をとりプロットしている。
プロラクチン定量に関して、様々な複合溶液をピオチン
結合の抗体を用いた複合体の検出試薬として用いた。実
施例５に記載しているように、検出試薬はＥｕ”を含む
緩衝液に希釈した複合体溶液を含んでいる。結果は第６
図に示されている図中、Ｘ軸はユーロピウムによるＢＣ
ＰＯＡの飽和（Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）度を割合で示し
、左Ｙ軸は３２５ｎｍにおける吸光度を、右Ｙ軸は関連
のトレーサーの相対活性度をとりプロットしている。
すなわち過剰のＴ Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ＋１１０を
伴いＥｕ”が存在する７５ｍＭ ＭＥＳにおいて、ｐ
Ｈ６，５０℃の条件で３時間インキュベーションした後
のＳ Ａ−Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ） ｔ ｓ。複合体
の検出を示している。また、Ｅｕ”の添加量はＴＧに共
有結合しているＢＣＰＤＡ分子に対するモル比として表
わされている。その生成物は３２５ ｎｍにおいて吸光
度を測定するとともに（ロ）、時間分解蛍光免疫検定法
における２ ５ ｍ ｇ ／ Ｉｌプロラクチンを含む
スタンダード溶液に対しての相対的蛍光シグナル（相対
的トレーサー活性）（■）を測定した。さらなる詳細、
限定、討議についてはテキストを参照されたい。ある点
（ＢＣＰＤＡ濃度に関して化学量論的に１：１の要求さ
れる同等量の６５％）までＥｕ”総量を増加することに
よってＢＣＰＯＡの吸光度は相対的に一定を保っている
。この点の後Ｅｕ”総量の増加はＢＣＰＤＡの吸光度の
減少を引きおこすが、これはＳ Ａ −Ｔ Ｇ −（Ｂ
ＣＰＤＡ） ＋ｓａとＴＧ−（ＢＣＰＤＡ） ＋＠ｏの
沈澱のためである（それはそれぞれ確認される）。又第
６図において、Ｅｕ”増強複合体の比活性が示されてい
る。その活性を以下に説明する。複合体Ｓ Ａ −Ｔ
Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ｒ ａ。が、５０℃でＥｕ”を
用いる活性化なしの条件で使われた場合プロラクチン定
量において２５μｇ／βプロラクチンスタンダードを用
いて検出される蛍光の読みとりを１．００の活性と専断
的に（Ａｒｂｉｔｒａｔｙ）決定した。使用する複合体
は前に述べたものを用いた。Ｅ ｕ３ ＊をそれぞれ添
加した後その比活性はＥｕ″＋増強なしの条件で測定さ
れた蛍光に対するＥｕ”増強を行なった場合の傾向の割
合を用いることによって算出した。
伴いＥｕ”が存在する７５ｍＭ ＭＥＳにおいて、ｐ
Ｈ６，５０℃の条件で３時間インキュベーションした後
のＳ Ａ−Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ） ｔ ｓ。複合体
の検出を示している。また、Ｅｕ”の添加量はＴＧに共
有結合しているＢＣＰＤＡ分子に対するモル比として表
わされている。その生成物は３２５ ｎｍにおいて吸光
度を測定するとともに（ロ）、時間分解蛍光免疫検定法
における２ ５ ｍ ｇ ／ Ｉｌプロラクチンを含む
スタンダード溶液に対しての相対的蛍光シグナル（相対
的トレーサー活性）（■）を測定した。さらなる詳細、
限定、討議についてはテキストを参照されたい。ある点
（ＢＣＰＤＡ濃度に関して化学量論的に１：１の要求さ
れる同等量の６５％）までＥｕ”総量を増加することに
よってＢＣＰＯＡの吸光度は相対的に一定を保っている
。この点の後Ｅｕ”総量の増加はＢＣＰＤＡの吸光度の
減少を引きおこすが、これはＳ Ａ −Ｔ Ｇ −（Ｂ
ＣＰＤＡ） ＋ｓａとＴＧ−（ＢＣＰＤＡ） ＋＠ｏの
沈澱のためである（それはそれぞれ確認される）。又第
６図において、Ｅｕ”増強複合体の比活性が示されてい
る。その活性を以下に説明する。複合体Ｓ Ａ −Ｔ
Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ｒ ａ。が、５０℃でＥｕ”を
用いる活性化なしの条件で使われた場合プロラクチン定
量において２５μｇ／βプロラクチンスタンダードを用
いて検出される蛍光の読みとりを１．００の活性と専断
的に（Ａｒｂｉｔｒａｔｙ）決定した。使用する複合体
は前に述べたものを用いた。Ｅ ｕ３ ＊をそれぞれ添
加した後その比活性はＥｕ″＋増強なしの条件で測定さ
れた蛍光に対するＥｕ”増強を行なった場合の傾向の割
合を用いることによって算出した。
シグナルにおける７、２倍の最大値はＥｕ”の最適量を
インキュベートすることによつて得られると見られた。
インキュベートすることによつて得られると見られた。
しかし適当値以上のＥｕ”の添加は、複合体の沈澱とそ
れに引き続き起こる活性の損失を招＜、（第６図）最大
値の検出を与える条件に適した混合物中の最適Ｅｕ”濃
度は非常に狭い範囲内にある。そのためＢＣＰＤＡの飽
和（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ） ７０〜８５％範囲でＥｕ
”を用いた最初の複合体のアリコートを実験的に滴定し
、完全な定量の中でそのアリコートを試験するのが望ま
しい。
れに引き続き起こる活性の損失を招＜、（第６図）最大
値の検出を与える条件に適した混合物中の最適Ｅｕ”濃
度は非常に狭い範囲内にある。そのためＢＣＰＤＡの飽
和（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ） ７０〜８５％範囲でＥｕ
”を用いた最初の複合体のアリコートを実験的に滴定し
、完全な定量の中でそのアリコートを試験するのが望ま
しい。
第７図はＸ軸にプロラクチン濃度をＹ軸に専断的に（Ａ
ｒｂｉｔｒａｔｙ）蛍光単位をとった完全なプロラクチ
ン検量線を示す、すなわち、（ａ）１４ＢＣＰＯＡ分子
で直接標識されたストレプトアビジン（カーブ１ ）
、 （ｂ） Ｅｕ”活性無しの５Ａ−ＴＧ−（ＢＣＰＯ
Ａ） ＋ｓｏ複合体（カーブ３）、（Ｃ）、様々なＥｕ
”量をもつＳＢＭＣ（カーブ２．４−８）を用いること
によって１２あたり０．１〜２５μｇの範囲でプロラク
チン検量線を示している。そのプロラクチン定量に関す
る検量線は（１）直線的なりＣＰＤ＾標識ＳＡ、（３）
Ｓ Ａ −Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ） Ｉｓｏ複合体
、又は過剰のＴ Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ｔ＠ｏとＥｕ
”の存在下でのＳ Ａ −Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ）
ｒ ｓ。のインキュベーションで生じる巨大分子複合体
及び存在するＢＣＰＤＡ量に関して（化学量論的に１＝
１として）Ｅｕ”量を （４）３０％、 （６）６０％
、（７）７０％、（８）７６％、（５）８０％、 （２
）８５％添加したものである。最大シグナル値はＥｕ”
による７６％ＢＣＰＯＡ飽和のフラクションにおいて測
定された（カーブ８）、その（ａ）と（ｂ）において測
定された増強度はそれぞれ約３５倍、７倍であった。
ｒｂｉｔｒａｔｙ）蛍光単位をとった完全なプロラクチ
ン検量線を示す、すなわち、（ａ）１４ＢＣＰＯＡ分子
で直接標識されたストレプトアビジン（カーブ１ ）
、 （ｂ） Ｅｕ”活性無しの５Ａ−ＴＧ−（ＢＣＰＯ
Ａ） ＋ｓｏ複合体（カーブ３）、（Ｃ）、様々なＥｕ
”量をもつＳＢＭＣ（カーブ２．４−８）を用いること
によって１２あたり０．１〜２５μｇの範囲でプロラク
チン検量線を示している。そのプロラクチン定量に関す
る検量線は（１）直線的なりＣＰＤ＾標識ＳＡ、（３）
Ｓ Ａ −Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ） Ｉｓｏ複合体
、又は過剰のＴ Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ｔ＠ｏとＥｕ
”の存在下でのＳ Ａ −Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ）
ｒ ｓ。のインキュベーションで生じる巨大分子複合体
及び存在するＢＣＰＤＡ量に関して（化学量論的に１＝
１として）Ｅｕ”量を （４）３０％、 （６）６０％
、（７）７０％、（８）７６％、（５）８０％、 （２
）８５％添加したものである。最大シグナル値はＥｕ”
による７６％ＢＣＰＯＡ飽和のフラクションにおいて測
定された（カーブ８）、その（ａ）と（ｂ）において測
定された増強度はそれぞれ約３５倍、７倍であった。
ＳＢＭＣの十分に活性化されたフラクションは４℃で保
存されその安定性を検定するために完全な免疫検定法に
おいてしばしば試験された。保存される濃縮物は（スト
レプトアビジンに関しては１５ｍｇ／Ｉ２濃度）少なく
とも１年間安定であることがわかった。
存されその安定性を検定するために完全な免疫検定法に
おいてしばしば試験された。保存される濃縮物は（スト
レプトアビジンに関しては１５ｍｇ／Ｉ２濃度）少なく
とも１年間安定であることがわかった。
これらの濃縮物は分析に使う直前に適当な緩衝液で５０
倍に希釈する。ストレプトアビジン調整のための希釈に
はｌＩ２中に９ ｇ ＮａＣ１，４０ｇＢＳＡ、０．５
ｇアジ化ナトリウムを含むｐＨ７，２０の５０ ｍｍ
ｏｌ／ １２ トリス緩衝液をバッファーとして用いる
。直接的に標識されたストレプトアビジン又は未処置の
Ｓ Ａ −Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ） ｒ ｇ。を検出
試剤として使用する時はこの緩衝液に過剰のＥｕ”（４
Ｘ １０−’ｍｏｌ ／ｆ２）を追加しなければならな
い、最大に増強されたＳＭＢＣの希釈緩衝液中のＥｕ″
＊に対する必要量とともに、希釈液中にＥｕ”が存在す
る又は存在しない場合の時間の経過に伴う希釈したＳＭ
ＢＣの安定性を試験した（第８図）、１βあたり４０ｇ
ＢＳＡ、９ｇＮａＣ［，０，５％アジ化ナトリウムを含
むｐＨ７，２０５０ｍＭトリス緩衝液へ希釈した後の巨
大分子複合体の相対的安定性は、４０μＭ ＥｕＣ１５
の存在（■）、非存在（ロ）で示している。図中、Ｘ軸
に時間を日で、Ｙ軸に相対的蛍光（％）をとっている。
倍に希釈する。ストレプトアビジン調整のための希釈に
はｌＩ２中に９ ｇ ＮａＣ１，４０ｇＢＳＡ、０．５
ｇアジ化ナトリウムを含むｐＨ７，２０の５０ ｍｍ
ｏｌ／ １２ トリス緩衝液をバッファーとして用いる
。直接的に標識されたストレプトアビジン又は未処置の
Ｓ Ａ −Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ） ｒ ｇ。を検出
試剤として使用する時はこの緩衝液に過剰のＥｕ”（４
Ｘ １０−’ｍｏｌ ／ｆ２）を追加しなければならな
い、最大に増強されたＳＭＢＣの希釈緩衝液中のＥｕ″
＊に対する必要量とともに、希釈液中にＥｕ”が存在す
る又は存在しない場合の時間の経過に伴う希釈したＳＭ
ＢＣの安定性を試験した（第８図）、１βあたり４０ｇ
ＢＳＡ、９ｇＮａＣ［，０，５％アジ化ナトリウムを含
むｐＨ７，２０５０ｍＭトリス緩衝液へ希釈した後の巨
大分子複合体の相対的安定性は、４０μＭ ＥｕＣ１５
の存在（■）、非存在（ロ）で示している。図中、Ｘ軸
に時間を日で、Ｙ軸に相対的蛍光（％）をとっている。
この希釈された複合体は４℃で適当な期間保存され、蛍
光プロラクチン免疫検出法を実施する時に用いる。トレ
ーサー希釈のすぐあとにプロラクチンスタンダード（５
μｇ／β）に対する蛍光シグナルを得て、それを１００
％と任意に決定した。実験によると、Ｅ、ｕ″″の非存
在下で希釈した時、ＳＢＭＣは類似のシグナルを与え、
より長い間安定性を示した。
光プロラクチン免疫検出法を実施する時に用いる。トレ
ーサー希釈のすぐあとにプロラクチンスタンダード（５
μｇ／β）に対する蛍光シグナルを得て、それを１００
％と任意に決定した。実験によると、Ｅ、ｕ″″の非存
在下で希釈した時、ＳＢＭＣは類似のシグナルを与え、
より長い間安定性を示した。
過剰のＥｕ’°の存在下で希釈したＳＢＭＣはおそらく
緩慢な沈殿形式過程を経るということによって、時間の
経過とともにその活性を失う、ＳＡ−Ｔ Ｇ −（ＢＣ
ＰＤＡ） ｌｓｏ複合体のＥｕ”効果は様々な温度とｐ
）Ｉ値で調べられた。ｐｉ（８は複合体増強のための最
適値でありｐ）１７〜５の範囲では弱いが効果は認めら
れ、ｐＨ８では認められない、また最も効果を増強する
温度はＳＢＭＣの形成の割合を変化する０例えばその増
強の完成は温度２４℃、３７℃、５０℃のそれぞれに対
して約４８．１６．３時間かかるであろう、６０℃以上
の温度では一般的に複合体は活性を減少する。
緩慢な沈殿形式過程を経るということによって、時間の
経過とともにその活性を失う、ＳＡ−Ｔ Ｇ −（ＢＣ
ＰＤＡ） ｌｓｏ複合体のＥｕ”効果は様々な温度とｐ
）Ｉ値で調べられた。ｐｉ（８は複合体増強のための最
適値でありｐ）１７〜５の範囲では弱いが効果は認めら
れ、ｐＨ８では認められない、また最も効果を増強する
温度はＳＢＭＣの形成の割合を変化する０例えばその増
強の完成は温度２４℃、３７℃、５０℃のそれぞれに対
して約４８．１６．３時間かかるであろう、６０℃以上
の温度では一般的に複合体は活性を減少する。
増強過程のメカニズムの試験によって以下の結果を得た
。
。
５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ −４００カラムのゲルろ過に
よって分離され、過剰のＢＣＰＯＡ標識サイログロブリ
ンを含まないＳ Ａ −［Ｔ Ｇ （ＢＣＰＯＡ）
＋ｓｏ］ ｓ形態の複合体は、Ｅ ｕ ３＋の添加によ
って増強される。直接的に標識されたストレプトアビジ
ンは、過剰のＢＣＰＤＡの存在下でさえもＥｕ”と反応
し活性化することはない、さらに、複合反応中のＢＣＰ
ＤＡ標識サイログロブリン総量が増加した時（例えば通
常用いる分子量割合比１：５から１：１０及びｌ：２ｏ
までの増加において）その利点はない。
よって分離され、過剰のＢＣＰＯＡ標識サイログロブリ
ンを含まないＳ Ａ −［Ｔ Ｇ （ＢＣＰＯＡ）
＋ｓｏ］ ｓ形態の複合体は、Ｅ ｕ ３＋の添加によ
って増強される。直接的に標識されたストレプトアビジ
ンは、過剰のＢＣＰＤＡの存在下でさえもＥｕ”と反応
し活性化することはない、さらに、複合反応中のＢＣＰ
ＤＡ標識サイログロブリン総量が増加した時（例えば通
常用いる分子量割合比１：５から１：１０及びｌ：２ｏ
までの増加において）その利点はない。
それらのデーターは、（ａ）増強後の新しい物質の形成
は、ＢＣＰＤＡ標識サイログロブリン分子に対するＥｕ
’＋の単なる結合過程ではない。（ｂ）新しい物質はＥ
ｕ”の最適量の添加によって正確な分子結合と沈殿を生
じる。（Ｃ）新しい物質は増強されないＳ Ａ −Ｔ
Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ｌｓｏに比べてストレプトアビ
ジンに対するＢＣＰＤＡ分子をより多く付着しているに
違なく、それがさらに感度の高い検出試薬となる。（ｄ
）認められた増強効果は、未反応のＢＣＰＤＡ標識サイ
ログロブリンの完全なる利用が３．３の最大係数（ｆａ
ｃｔｏｒ）によってシグナルを増強することがらＥｕ”
がｌ：２タイプのＢＣＰＤＡ複合体を形成するであろう
−ということを示している。その実験的に導かれた係数
は約７である。
は、ＢＣＰＤＡ標識サイログロブリン分子に対するＥｕ
’＋の単なる結合過程ではない。（ｂ）新しい物質はＥ
ｕ”の最適量の添加によって正確な分子結合と沈殿を生
じる。（Ｃ）新しい物質は増強されないＳ Ａ −Ｔ
Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ｌｓｏに比べてストレプトアビ
ジンに対するＢＣＰＤＡ分子をより多く付着しているに
違なく、それがさらに感度の高い検出試薬となる。（ｄ
）認められた増強効果は、未反応のＢＣＰＤＡ標識サイ
ログロブリンの完全なる利用が３．３の最大係数（ｆａ
ｃｔｏｒ）によってシグナルを増強することがらＥｕ”
がｌ：２タイプのＢＣＰＤＡ複合体を形成するであろう
−ということを示している。その実験的に導かれた係数
は約７である。
第９図では、５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００カラム（
２，６Ｘ３５ｃｍ）を用いた過剰のＴ Ｇ −（ＢＣＰ
ＤＡ） ＋ｓｏ存在下におけるＳ Ａ −Ｔ Ｇ −（
ＢＣＰＯＡ） ＋ｓｏ複合体の流出状態に関するゲルろ
過クロマトグラフィー実験が示されている。Ｘ軸にはカ
ラムからの溶出量（ｍＩ２）、Ｙ軸には２８０ｎｍの吸
光度をとっている。
２，６Ｘ３５ｃｍ）を用いた過剰のＴ Ｇ −（ＢＣＰ
ＤＡ） ＋ｓｏ存在下におけるＳ Ａ −Ｔ Ｇ −（
ＢＣＰＯＡ） ＋ｓｏ複合体の流出状態に関するゲルろ
過クロマトグラフィー実験が示されている。Ｘ軸にはカ
ラムからの溶出量（ｍＩ２）、Ｙ軸には２８０ｎｍの吸
光度をとっている。
図中の矢印はＴ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ） ｔｓｏが同一
の条件下でカラムから流出しているポイントを示してい
る。破線はストレプトアビジンとＢＣＰＤＡ Ｉ識すイ
ログロブリン（最初の分子量割合ｌ：５）間の結合反応
の混合液の流出パターンを示している。
の条件下でカラムから流出しているポイントを示してい
る。破線はストレプトアビジンとＢＣＰＤＡ Ｉ識すイ
ログロブリン（最初の分子量割合ｌ：５）間の結合反応
の混合液の流出パターンを示している。
約２．５〜３．０Ｘ１０’の分子量に対応する７０ｍ１
ｌあたりの小さな流出ピークが認められ、約０．８Ｘ１
０’の分子量に対応する１０５ｍρまで吸光度の継続的
スペクトルが続いている。７０ｍβ付近の流出ピークは
形成されたＳＡ−［ＴＧ−（ＢＣＰＤＡ） １１１０１
３の複合体によるものであると考えられ７０ｒｒｌｌと
１０５ｍｎの間はＳＡ−［ＴＧ−（ＢＣＰＤＡ） ＋ｉ
ｏ］ ａ形態の別の複合体の流出であろう、しかしなが
らその物質の大半はともに１０５ｔｎｉｌ付近に流出す
る未結合Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ） ｔｓｏとＳ Ａ
−Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ｒＩＩｏから成っている
。
ｌあたりの小さな流出ピークが認められ、約０．８Ｘ１
０’の分子量に対応する１０５ｍρまで吸光度の継続的
スペクトルが続いている。７０ｍβ付近の流出ピークは
形成されたＳＡ−［ＴＧ−（ＢＣＰＤＡ） １１１０１
３の複合体によるものであると考えられ７０ｒｒｌｌと
１０５ｍｎの間はＳＡ−［ＴＧ−（ＢＣＰＤＡ） ＋ｉ
ｏ］ ａ形態の別の複合体の流出であろう、しかしなが
らその物質の大半はともに１０５ｔｎｉｌ付近に流出す
る未結合Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ） ｔｓｏとＳ Ａ
−Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ｒＩＩｏから成っている
。
複合混合物の中にマーカーとして結合している１２１
Ｉ−ストレプトアビジンからの放射性活性のモニタリン
グによってＳＡ−［ＴＧ−（ＢＣＰＤＡ）＋ｓｏｌ ｓ
： Ｓ Ａ−［ＴＧ−（ＢＣＰＤＡ）＋＋ｏ］ ｚ：
Ｓ Ａ −Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ） ｔｓｏのおよ
その百分率が５：２０ニア５であることが考察される。
Ｉ−ストレプトアビジンからの放射性活性のモニタリン
グによってＳＡ−［ＴＧ−（ＢＣＰＤＡ）＋ｓｏｌ ｓ
： Ｓ Ａ−［ＴＧ−（ＢＣＰＤＡ）＋＋ｏ］ ｚ：
Ｓ Ａ −Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ） ｔｓｏのおよ
その百分率が５：２０ニア５であることが考察される。
ＳＡ−［Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ） ＋ ｓ。］２タイ
プの分離された複合体は、Ｅｕ”の添加によって増強さ
れない。
プの分離された複合体は、Ｅｕ”の添加によって増強さ
れない。
増強反応が完了した後、その反応混合物（第９図の点線
に相当する）は、実線によって表わされている流出パタ
ーンを生じる同様のカラムを用い再びクロマトグラフに
かけた０反応しないＴＧ−（ＢＣＰＤＡ） ｔｓｏが極
めて僅かか全くないと見受けられ、その主たるものは約
２．５〜３．０Ｘ１０’分子量の巨大分子複合体である
ことが現在明らかである。
に相当する）は、実線によって表わされている流出パタ
ーンを生じる同様のカラムを用い再びクロマトグラフに
かけた０反応しないＴＧ−（ＢＣＰＤＡ） ｔｓｏが極
めて僅かか全くないと見受けられ、その主たるものは約
２．５〜３．０Ｘ１０’分子量の巨大分子複合体である
ことが現在明らかである。
さらに、ＢＣＰＤＡ標識サイログロブリンに共有結合し
ているストレプトアビジン、ＢＣＰＤＡ標識サイログロ
ブリンに、Ｅｕ”の比に関するＳＢＭＣの組成の研究は
、室温で一晩３０倍過剰のＥＤＴＡを用いて５ｅｐｈａ
ｃｒｙｌ−４００カラムから得られたもの（２８０ｎｍ
に吸光度をもち、７０ｍ１２付近で流出するプールされ
たタンパク質ピーク、第９図をインキエベートすること
によって達成された。
ているストレプトアビジン、ＢＣＰＤＡ標識サイログロ
ブリンに、Ｅｕ”の比に関するＳＢＭＣの組成の研究は
、室温で一晩３０倍過剰のＥＤＴＡを用いて５ｅｐｈａ
ｃｒｙｌ−４００カラムから得られたもの（２８０ｎｍ
に吸光度をもち、７０ｍ１２付近で流出するプールされ
たタンパク質ピーク、第９図をインキエベートすること
によって達成された。
これで得られた溶液は５ｅｐｈａｄａｘＧ −２５カラ
ムにかけて第１Ｏ図に示した溶出クロマトグラムを与え
た。
ムにかけて第１Ｏ図に示した溶出クロマトグラムを与え
た。
第１０図は５ｅｐｈａｄａｘ Ｇ −２５カラム（１，
６Ｘ３６ｃｍ）からの過剰のＥＤＴＡの存在下における
ＳＢＭＣの溶出状態を示したものである。このクロマト
グラムはＥＤＴＡで一晩インキユベートした約０．２５
ｍｏｌのＳＢＭＣを、ｐＨ８，０，１Ｍ−ＮａＨＣＯ
ｓで平衡化しておいたカラムに（同じ液で）流速１．０
ｍＩ２／ｍｉｎにて溶出して得た。
６Ｘ３６ｃｍ）からの過剰のＥＤＴＡの存在下における
ＳＢＭＣの溶出状態を示したものである。このクロマト
グラムはＥＤＴＡで一晩インキユベートした約０．２５
ｍｏｌのＳＢＭＣを、ｐＨ８，０，１Ｍ−ＮａＨＣＯ
ｓで平衡化しておいたカラムに（同じ液で）流速１．０
ｍＩ２／ｍｉｎにて溶出して得た。
図中、Ｘ軸にカラムからの流出ｊ１（ｍＩ２）、左Ｙ軸
に２８０ｎｍにおける吸光度、右Ｙ軸にユーロピウム濃
度（ｎｍｏｌ）をとっている。溶出液は２８０ｎｍ（−
）でモニタリングされ、それぞれのフラクション（約２
ｍβ容量）中のＥｕ”量はＡｒｃｕｓ ｔｉｍｅ−ｒｅ
ｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ （■）で測定
された。ＥＤＴＡはＢＣＰＯＡとの親和力（Ｋａ＝１０
−１０）よりもＥｕ”に対してすぐれた親和力を示すた
めに、その添加がＳ８ＭＣ中に存在するＥｕ”を抽出し
結合するはずである。
に２８０ｎｍにおける吸光度、右Ｙ軸にユーロピウム濃
度（ｎｍｏｌ）をとっている。溶出液は２８０ｎｍ（−
）でモニタリングされ、それぞれのフラクション（約２
ｍβ容量）中のＥｕ”量はＡｒｃｕｓ ｔｉｍｅ−ｒｅ
ｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ （■）で測定
された。ＥＤＴＡはＢＣＰＯＡとの親和力（Ｋａ＝１０
−１０）よりもＥｕ”に対してすぐれた親和力を示すた
めに、その添加がＳ８ＭＣ中に存在するＥｕ”を抽出し
結合するはずである。
第１０図から明らかなように、すべてのたんばく質がボ
イドボリュームの付近で流出され、放射活性＜＋■ｌ−
５Ａ）による検出からその回収は１００％であった。さ
らにＥｕ”はタンパク質と結合せずカラムのベツドボリ
ューム近くまでフラクションに流出した。
イドボリュームの付近で流出され、放射活性＜＋■ｌ−
５Ａ）による検出からその回収は１００％であった。さ
らにＥｕ”はタンパク質と結合せずカラムのベツドボリ
ューム近くまでフラクションに流出した。
プールされたタンパク質分画中のＢＣＰＤＡ−ＴＧに対
するＳＡの割合はｌ：３．３の割合であるということが
わかった。
するＳＡの割合はｌ：３．３の割合であるということが
わかった。
しかしながら、プロラクチン定量についての検出試薬と
してのその活性は元々の増強されていないＳ Ａ −Ｔ
Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ｌｓ。複合体に対しては相関
関係があるがＳＢＭＣに対してはない、それゆえ、ＳＢ
ＭＣの組成は、ＢＣＰＤ＾標識サイログロブリンに共有
結合しているストレプトアビジン、ＢＣＰＤＡ標識サイ
ログロブリンに、Ｅｕ”に関して１ ：２．３ ：４
８０であるとみられる。
してのその活性は元々の増強されていないＳ Ａ −Ｔ
Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ｌｓ。複合体に対しては相関
関係があるがＳＢＭＣに対してはない、それゆえ、ＳＢ
ＭＣの組成は、ＢＣＰＤ＾標識サイログロブリンに共有
結合しているストレプトアビジン、ＢＣＰＤＡ標識サイ
ログロブリンに、Ｅｕ”に関して１ ：２．３ ：４
８０であるとみられる。
それらの結果、ストレプトアビジンベースの巨大分子複
合体（ＳＢＭＣ）の形成は以下に示すメカニズムが示唆
されるが、出願者らはその理論によって束縛されないこ
とを望んでいる＊Ｅｕ”の添加によって、混合物に過剰
に存在する非共有結合の遊離のＴ Ｇ −（ＢＣＰＯＡ
） ＩＩｔｏ分子が、第５図に示すように巨大分子複合
体を形成するために集まりＳ Ａ −Ｔ Ｇ −（ＢＣ
ＰＯＡ） ＋ ｓ。と結合する。この複合体は、もし沈
殿を生じないで負電荷を呈し、又はＥｕ”濃度がある限
界を超えなければ安定しているように見える。その集合
体の形成は相対的に緩慢であるが、５０’Ｃにおいて３
時間のインキュベーションで完成される。
合体（ＳＢＭＣ）の形成は以下に示すメカニズムが示唆
されるが、出願者らはその理論によって束縛されないこ
とを望んでいる＊Ｅｕ”の添加によって、混合物に過剰
に存在する非共有結合の遊離のＴ Ｇ −（ＢＣＰＯＡ
） ＩＩｔｏ分子が、第５図に示すように巨大分子複合
体を形成するために集まりＳ Ａ −Ｔ Ｇ −（ＢＣ
ＰＯＡ） ＋ ｓ。と結合する。この複合体は、もし沈
殿を生じないで負電荷を呈し、又はＥｕ”濃度がある限
界を超えなければ安定しているように見える。その集合
体の形成は相対的に緩慢であるが、５０’Ｃにおいて３
時間のインキュベーションで完成される。
実際の条件下で新しいストレプトアビジンベースの巨大
分子複合体は非常に有効である。またその調製は比較的
簡単である。実際の試薬は、特別な手法を使うことを必
要とせず直接的に標識されたストレプトアビジンの調製
と同様の方法で用いることができる。さらに、先に開発
された時間分解蛍光免疫検定法（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌ
ｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｇｓ
ａｙ ｓｙｓｔｅｍ）のすべての利点においても本試薬
（ＳＢＭＣ）の利用は同様に有効である。
分子複合体は非常に有効である。またその調製は比較的
簡単である。実際の試薬は、特別な手法を使うことを必
要とせず直接的に標識されたストレプトアビジンの調製
と同様の方法で用いることができる。さらに、先に開発
された時間分解蛍光免疫検定法（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌ
ｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｇｓ
ａｙ ｓｙｓｔｅｍ）のすべての利点においても本試薬
（ＳＢＭＣ）の利用は同様に有効である。
前述のストレプトアビジンベースの試薬に比較して、本
試薬の使用により開発された方法の感度は、標識された
ストレプトアビジンの少なくとも３５倍以上、Ｓ Ｇ
−Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ） ＋ａｏに比較して７倍以
上のファクターですぐれたものとなった。
試薬の使用により開発された方法の感度は、標識された
ストレプトアビジンの少なくとも３５倍以上、Ｓ Ｇ
−Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ） ＋ａｏに比較して７倍以
上のファクターですぐれたものとなった。
モデルとして実施例５で用いたプロラクチン分析の検出
限界は、直接標識されたストレプトアビジン、Ｓ Ａ
−Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ）１．。、新巨大分子複合体
をそれぞれ用いた検出方法に対し、それぞれ３．１４．
０．５０．０．０３μｇ／βであることが判明した０例
えばその増強試薬を用いると、約６８ｄｍｏｌのプロラ
クチンが測定可能である。
限界は、直接標識されたストレプトアビジン、Ｓ Ａ
−Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＤＡ）１．。、新巨大分子複合体
をそれぞれ用いた検出方法に対し、それぞれ３．１４．
０．５０．０．０３μｇ／βであることが判明した０例
えばその増強試薬を用いると、約６８ｄｍｏｌのプロラ
クチンが測定可能である。
又同じ試薬が補足試薬としてピオチン結合抗体を用いた
生物学的分解の他の定量測定にも用いられた。検出限界
に関して同様の有効な効果がすべてのケースにおいて認
められた。その地間試薬は免疫組織化学やＤＮＡプロー
ブのような他の検出分野にも用いられるであろう。
生物学的分解の他の定量測定にも用いられた。検出限界
に関して同様の有効な効果がすべてのケースにおいて認
められた。その地間試薬は免疫組織化学やＤＮＡプロー
ブのような他の検出分野にも用いられるであろう。
本発明の好ましい具体的事例がここに詳細に記されてい
るけれども、当業者は本発明の主旨と添付のクレームの
範囲からはずれることなく、そこに工夫される変法にお
いて、本技術を用いることを理解するであろう。
るけれども、当業者は本発明の主旨と添付のクレームの
範囲からはずれることなく、そこに工夫される変法にお
いて、本技術を用いることを理解するであろう。
第１図はＡＦＰ定量におけるＢＣＰＯＡ標識試薬とそれ
らの作用を表現した模式図である。 第２図は、本発明に係る複合体の旧ｔｒｏｇｅｌ Ａ
３４カラムを利用した時の溶出状態をプロットした図で
ある。 第３図は、マイクロティタレ−ジョンプレートにコート
したピオチン結合抗体に結合しているストレプトアビジ
ンの蛍光定量分析を示した図である。 第４図は、（Ａ）直接標識された抗体、（Ｂ）直接標識
されたストレプトアビジンがピオチンを介して結合して
いる抗体、（Ｃ）標識されたサイログロブリンがストレ
プトアビジンに結合し、それがピオチンを介し結合して
いる抗体の３種の方法を用いて行なったα−フェトプロ
ティン定量の測定曲線を示した図である。 第５図は巨大分子複合体形成におけるＢＣＰＯＡ標識試
薬の具体的変化現象の模式図である。 第６図は、ユーロピウムによるＢＣＰＯＡの飽和過程を
示す図である。 第７図は、プロラクチン定量に関する検量線を示した図
である。 第８図は、ユーロピウムの存在の有無における巨大分子
複合体の相対的安定性を示した図である。 第９図は、５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ −４００”カラム
から得られる定量Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ＋ｓｏ複
合体の溶出状態を表わした図である。 第１０図は、過剰のＥＤＴＡ存在下における５ｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｇ −２５丁′カラムからのＳＢＭＣの溶出
状態を示した図である。
らの作用を表現した模式図である。 第２図は、本発明に係る複合体の旧ｔｒｏｇｅｌ Ａ
３４カラムを利用した時の溶出状態をプロットした図で
ある。 第３図は、マイクロティタレ−ジョンプレートにコート
したピオチン結合抗体に結合しているストレプトアビジ
ンの蛍光定量分析を示した図である。 第４図は、（Ａ）直接標識された抗体、（Ｂ）直接標識
されたストレプトアビジンがピオチンを介して結合して
いる抗体、（Ｃ）標識されたサイログロブリンがストレ
プトアビジンに結合し、それがピオチンを介し結合して
いる抗体の３種の方法を用いて行なったα−フェトプロ
ティン定量の測定曲線を示した図である。 第５図は巨大分子複合体形成におけるＢＣＰＯＡ標識試
薬の具体的変化現象の模式図である。 第６図は、ユーロピウムによるＢＣＰＯＡの飽和過程を
示す図である。 第７図は、プロラクチン定量に関する検量線を示した図
である。 第８図は、ユーロピウムの存在の有無における巨大分子
複合体の相対的安定性を示した図である。 第９図は、５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ −４００”カラム
から得られる定量Ｔ Ｇ −（ＢＣＰＯＡ） ＋ｓｏ複
合体の溶出状態を表わした図である。 第１０図は、過剰のＥＤＴＡ存在下における５ｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｇ −２５丁′カラムからのＳＢＭＣの溶出
状態を示した図である。
Claims (14)
- （１）標識システムに用いる複合体であり、アビジン又
はストレプトアビジンが担体粒子に連結（ｌｉｎｋ）す
ること、その担体はその表面に独立に使用可能な標識で
標識化することができるアミノ基を１５以上有すること
、その担体がその複合体を形成するためのアビジン又は
ストレプトアビジンとの連結能力を有することで特徴づ
けられるもの。 - （２）粒子がその表面上に少なくとも１５のアミノ基を
有する合成のサブミクロンサイズ分子であることを特徴
とする請求項１に記載の複合体。 - （３）粒子が表面に前記アミノ基を有するタンパク質で
あることを特徴とする請求項１に記載の複合体。 - （４）担体粒子がアビジンに結合していることを特徴と
する前記いづれか一の請求項の複合体。 - （５）担体粒子がストレプトアビジンに結合しているこ
とを特徴とする前記いづれか一の請求項の複合体。 - （６）定量に用いる蛍光試薬システムであり、請求項１
の複合体で前記のアビジン又はストレプトアビジンは適
切にピオチンにより定量成分と連結し、前記担体粒子は
少なくとも１５の標識を配することができる多数のアミ
ノ基に付着（ａｔｔａｃｈ）する複数の配位子の部分（
ｍｏｉｅｔｙ）で標識され、その各々の標識は選ばれた
ランタニド金属の存在で蛍光性キレートを形成したもの
であり、この蛍光試薬システムは蛍光を発するように刺
激されて、そのランタニド金属イオン配位子部分の多数
が溶液で発する蛍光放射強度に比べて増幅された強度で
蛍光を放射することによって蛍光試薬システムにおける
多重標識に基づく消光効果（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｅｆ
ｆｅｃｔ）を無くしたもの。 - （７）配位子が４，７−ジフェニル−１，１０−フェナ
ントロリン−２，９−ジカルボン酸誘導体の一種である
ことを特徴とする請求項６に記載の蛍光試薬システム。 - （８）ランタニド金属イオンはユーロピウム、テルビウ
ム、ガドリニウム、サマリウム及びディスプロジウムか
ら成るグループから選出されたことを特徴とする請求項
６又は７に記載の蛍光試薬システム。 - （９）担体粒子がサイログロブリン、牛血清アルブミン
、ヘモシアニン、ミオシン、アポフェリチン、カタラー
ゼ、アミノ酸に対するリジンが異なった割合をもつポリ
リジンコポリマーのシリーズ、α＿２−マクログロブリ
ン、ロイシン−アミノペプチダーゼ、重メロミオシン及
びヒストン類から成るグループから選出されたことを特
徴とする請求項１から５のいずれか一に記載の複合体又
は請求項６から８のいずれか一に記載の蛍光試薬システ
ム。 - （１０）定量に用いる試薬システムであって、ストレプ
トアビジンまたはアビジンで多数の担体粒子が複合化し
た巨大分子複合体、その担体粒子の各々の表面上には、
ランタニド金属イオンのある蛍光性配位子の部分によっ
てそれぞれ独立に標識され得る１５以上のアミノ基、複
数の粒子上のランタニド金属のアミノ基に対する化学量
論比が１以下であり、この蛍光試薬システムは蛍光を発
するように刺激されると、該ランタニド金属配位子成分
の溶液中での蛍光放射強度より増幅された強度で蛍光を
放射すること、のそれぞれで特徴づけられるもの。 - （１１）ランタニド金属がユーロピウムであることを特
徴とする請求項１０に記載の蛍光試薬システム。 - （１２）担体粒子がサイログロブリンであることを特徴
とする請求項１０又は１１のいずれか一に記載の蛍光試
薬システム。 - （１３）配位子が４，７−ジフェニル−１，１０−フェ
ナントロリン−２，９−ジカルボン酸誘導体の一種であ
ることを特徴とする請求項１０、１１又は１２のいずれ
か一に記載の蛍光試薬システム。 - （１４）配位子部分が連結するアミノ基に対するユーロ
ピウムイオンの前記化学量論的割合が０．７５から０．
８５の範囲であることを特徴とする請求項１２に記載の
蛍光試薬システム。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA574,483 | 1988-08-11 | ||
| CA000574483A CA1308022C (en) | 1988-08-11 | 1988-08-11 | Multiple fluorescence labelling with europium chelators |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0288968A true JPH0288968A (ja) | 1990-03-29 |
Family
ID=4138527
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20706389A Pending JPH0288968A (ja) | 1988-08-11 | 1989-08-11 | ユーロピウムキレートを用いた多重蛍光標識 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0354847A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0288968A (ja) |
| AU (1) | AU3815389A (ja) |
| CA (1) | CA1308022C (ja) |
| NZ (1) | NZ229712A (ja) |
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| JP2008241374A (ja) * | 2007-03-26 | 2008-10-09 | Seiko Epson Corp | 検出キット |
| JP2011209307A (ja) * | 2011-07-29 | 2011-10-20 | Seiko Epson Corp | 検出キット |
| JP2011257410A (ja) * | 2002-06-17 | 2011-12-22 | Abbott Laboratories | アッセイコンジュゲート及びその使用 |
| JP2023524931A (ja) * | 2020-03-04 | 2023-06-14 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | イムノアッセイシグナルを増幅するための方法 |
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| DE69125992T2 (de) * | 1990-09-14 | 1997-08-21 | Tosoh Corp | Verfahren und Kit für Immunoassay |
| US6958148B1 (en) | 1998-01-20 | 2005-10-25 | Pericor Science, Inc. | Linkage of agents to body tissue using microparticles and transglutaminase |
| US6919076B1 (en) | 1998-01-20 | 2005-07-19 | Pericor Science, Inc. | Conjugates of agents and transglutaminase substrate linking molecules |
| US20010055763A1 (en) * | 1998-12-24 | 2001-12-27 | Sharat Singh | Individually addressable solid surfaces for multiplexed operations |
| GB0016813D0 (en) * | 2000-07-07 | 2000-08-30 | Lee Helen | Improved dipstick assays (4) |
| GB0029154D0 (en) | 2000-11-30 | 2001-01-17 | Lee Helen | Signal enhancement with multiple labelled-antibodies |
| EP1608977B1 (en) * | 2003-04-02 | 2007-08-15 | Turun Yliopisto | Nanoparticle for bioaffinity assays |
| WO2005071412A2 (en) * | 2004-01-09 | 2005-08-04 | Applera Corporation | Phosphor particle coded beads |
| EP1754972A1 (en) * | 2005-08-17 | 2007-02-21 | Agilent Technologies, Inc. | Folded peptides containing metal binding pockets for protein tagging |
| DK2444807T3 (da) * | 2006-11-01 | 2014-08-11 | Ventana Med Syst Inc | Mono- og dinitropyrazolhaptenkonjugater |
| CN101158688B (zh) * | 2007-11-19 | 2011-09-07 | 张瑞镐 | 一种经改进的固相荧光免疫的检测方法 |
| CN109917123B (zh) * | 2019-04-19 | 2024-02-13 | 广州安诺科技股份有限公司 | 一种基于delfia的农残检测装置及检测方法 |
| GB201912866D0 (en) | 2019-09-06 | 2019-10-23 | Cambridge Molecular Diagnostics Ltd | Miltiply labelled polymetric molecule for detection assays |
| GB202103321D0 (en) | 2021-03-10 | 2021-04-21 | Cambridge Molecular Diagnostics Ltd | Multiply labelled polymeric constructs for detection assays |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4434150A (en) * | 1981-10-19 | 1984-02-28 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Immunological reagents employing polymeric backbone possessing reactive functional groups |
| EP0201211A1 (en) * | 1985-04-10 | 1986-11-12 | Whittaker Corporation | Method and compositions for visual solid phase immunoassays based on luminescent microspheric particles |
| US5089423A (en) * | 1987-05-06 | 1992-02-18 | Cyberfluor Inc. | Immunoassay methods and reagents and methods for producing the latter |
-
1988
- 1988-08-11 CA CA000574483A patent/CA1308022C/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-06-26 NZ NZ22971289A patent/NZ229712A/en unknown
- 1989-07-14 AU AU38153/89A patent/AU3815389A/en not_active Abandoned
- 1989-08-09 EP EP19890402254 patent/EP0354847A3/en not_active Withdrawn
- 1989-08-11 JP JP20706389A patent/JPH0288968A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP2024123215A (ja) * | 2020-03-04 | 2024-09-10 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | イムノアッセイシグナルを増幅するための方法 |
Also Published As
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