JPS63500399A - アナライトが存在可能な媒体中のアナライトをルミネセンスによって検出および／または測定するための均質方法およびその方法に使用するキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アナライトが存在可能な媒体中のアナライトをこの発明はアナライト（Ａｎａｌ ｙｔｅ）が存在している可能性のある媒体中で、アナライトを検出および／また は測定するための均質方法に関する。

生物学的液体中で循環している有機または生物学的物質の存在または濃度を測定 することは、多数の疾病の診断での１つの重要な段階である。

この測定に通常使用される方法の１つは、アナライト、即ち、検出または測定す べき物質と、このアナライトに特異的に結合し得る物質であるアナライトレセプ ターとの間の錯体の形成に基づいている。こうして形成された錯体はＩＩＩ識し た試薬によって明らかにされる。

この方法には、例えば「モノクローナル　アンチボディーズアンド　ディベロッ プメント　イン　イムノアフセイ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐ＋ｗｅｎｔ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）　Ｊ 　ｓエルセビーア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）　１９８１年の３〜２１頁にアール　エ キンズ（Ｒ，ＥＫＩＮＳ）が記載した、「競合にょる」または「過剰にょる」、 所謂、免疫学的測定方法が含まれる。使用する試薬は、特に、放射性元素、酵素 またはルミネセンス化合物、例えば、螢光、化学発光またはりん光化合物などの 助けによって標識されている。それ故、ここでは、放射線免疫学的方法、免疫酵 素的方法またはルミネセンス（螢光、りん光または化学発光）を用いる免疫学的 方法を参照する。

所謂、競合による免疫学的測定方法では、標識アナライトが存在し得る媒体は、 一定量の標識アナライトの存在下、アナライトレセプターの不足下でインキュベ ートする。

次いで、レセプターに対する競合が標的アナライトと標識アナライトとの間で生 起する０次いで、結合した標識アナライトを含有するフラクションを、遊離標識 アナライトを含有するフラクションから分離し、１つまたは他のフラクション中 の標識アナライト量を測定する。

所謂、過剰による測定方法では、標的アナライトに対して異なる特異性を有する ２つのレセプターを使用し、その際、レセプターの１つは標識されている。これ らの方法は、また、結合した標識レセプターを含有するフラクションを、遊離標 識レセプターを含有するフラクシヨンから分離する段階も必要である。

このため、測定を非常に高い感度で迅速に行うべく、分離段階を省略する種々の 方法が探索され、所謂、「均質」方法が開発された。

免疫学的測定の分野では、螢光を用いての均質方法はあまりなされていない。

各均質螢光方法は、標識レセプターとアナライトが結合すると螢光性分子の放出 特性が変更されるという事実に基づいている。

例えば、螢光偏光では、放出光の偏光を測定する。この偏光は螢光分子を有する 分子構造の大きさによって変動する。

他の均質方法は、２つの発色体間のエネルギー移動の現象に基づいており、フラ ンス特許２２８２１１５に記載されている。この方法では、供与体発色体の放出 スペクトルと受容体発色体の励起スペクトルが重複する場合（エネルギー適合性 ）および２つの発色体間の距離が一般的に１００人未満である場合には、供与体 発色体から受容体発色体へのエネルギー移動が生起する。同様に、フランス特許 ２４２２１６５に記載されている方法は、化学発光分子が近いが衝突を起こさな い距離、即ち、一般的には１００人未満の距離にあるとき、化学発光による光放 出を変更し得る抑制剤および化学発光トレーサを使用する。

しかしながら、これらの方法には欠点がある。偏光の場合には、標的アナライト の大きさに関連した制限がある。エネルギー移動を使用する方法では、アナライ トとレセプターを両方共標識しなければならず、そして、受容体のルミネセンス の放出が供与体のルミネセンスの測定を妨げる。更に、この場合には、すべての 発色体対を選択できるわけではない（エネルギー適合性）　。

米国特許４３１８７０７およびシバ（ＳＹＶＡ）名義のヨーロッパ特許出願１７ ９０８に記載されている、螢光を用いる均質測定方法にも言及することもできる 。

米国特許４３１８７０７に記載されている方法では、励起強度を減じおよび／ま たは電気的に励起可能な分子の放出強度を減じ得る粒子を使用する。

ヨーロッパ特許出願１７９０８による方法は、発色物質を、発色源がその発色活 性を保持しているフラクションと発色活性が阻止されているフラクションとに分 布させる能力に基づいており、その際、分布の程度は測定媒体中のアナライトの 濃度に依存する。

更に、螢光化合物の構造の近傍または内部にヨウ素原子のような重原子が存在す ると、その螢光が減少するということが知られている。

この極＜一般的な効果は文献、例えば、ニューヨーク州　エムデツカ−（Ｍ、　 Ｄｅｋｋｅｒ）の、ギルボートル（Ｇ、　Ｇ、　Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ））編集の ［フルオレセンス（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）　Ｊ、１９６７年、中のイーエ ル　ホエリ−（Ｅ、　Ｌ、　ＭＥＲＲＹ）によって記載されている。その技術水 準によれば、この効果は、螢光分子が天然に重原子を含有するとき、重原子を化 学的に螢光分子に導入するとき、または重原子が測定媒体の溶液中に存在すると きに観察される。この重原子効果のメカニズムは、重原子が分子外にある場合に はあまり良くは知られていない、しかしながら、螢光分子が重原子を含有する（ 天然に存在するかまたは化学的に導入した）場合、この現象は、重原子を含有し ていないホモローブと比較して上記螢光分子のスピン軌道カップリングの増加に よって説明され、そして、これは非光放射系間遷移Ｓ　１　”　／Ｖ−Ｔ　Ｉ　 ”および光放射系間遷移ＴＩ”−８ｏの増加をもたらすが、非光放射内部変換３ 　Ｉ”　Ｎ−３５の増加も生じさせる０重原子の存在による螢光の減少が全ての 場合に観察され、りん光の変更は分子および測定条件が可能なときに観察される 。この効果の具体的な例は、フルオレセインがトリョードチロニン（Ｔ、）また はテトラヨードチロニン（Ｔ４）ような多ヨード化分子に化学的に結合している ときに観察される、フルオレセインの量子生成の減少である。これは内部重原子 の効果である。

重原子が化学的結合によって螢光分子に固定されているのではなく、測定媒体の 溶液中に存在している場合には、ルミネセンス分子のスピン軌道カンプリングの 上昇は螢光分子の重原子との衝突か、または荷電移動による弱い錯体形成のいず れかによるものと考えられている。それは実際に、ルミネセンス分子のシステム 間遷移、Ｓ　１　”　ｒＪ−−Ｔ　１　”およびＴＩ”→Ｓｏの上昇によって明 らかになるので、重原子効果はりん光分子の強度をときには上昇させ、ときには 減少させるが、螢光分子の強度は常に減少させられる。

この内部重原子効果は既に螢光分析法による均質測定法で利用されている。ここ で、リガンド類似体と螢光化合物間に形成される共役体を使用するこのタイプの 方法を記載したヨーロッパ特許出願１５６９５を引用する。その方法では、リガ ンド類似体は上述の螢光分子を消滅させ得る重原子を本来有しており、上記共役 体は共有結合的に巨大分子ポリサンカロイドに結合している。この場合には、重 原子含有分子と抗体との特異的な結合によって阻止が減少し、その結果螢光が上 昇する。

重原子効果はルミネセンスを用いてアナライトを検出および／または測定するた めの均質方法で有利に使用し得ることがみいだされた。その際、重原子は測定媒 体の溶液中に存在せず、また、ルミネセンス分子と固定していない。

驚くべきことに、実際、ルミネセンス分子が使用する試薬の１つに結合し、一方 もう１つの試薬が少なくとも１つの重原子を含有するユニットを有するときには 、競合または過剰による免疫学的測定では、系間遷移がルミネセンス分子中で生 起することがみいだされた。

それ故、一般的観点から、この発明は、アナライトと少なくとも１つの対応する レセプターとの反応生成物を明らかにすることによって、アナライトが存在する 可能性のある媒体中でアナライトを検出および／または測定するための方法に関 し、この方法は、１）　上記アナライトのレセプターからなる第１の試薬を上記 媒体に添加し、 ２）　アナライトの反応生成物の少なくとも１つの成分および少なくとも１つの アナライトレセプターからなる第２の試薬を添加し、その際、２つの試薬のうち の１つはルミネセンス化合物と力、プリングしており、もう１つの試薬は重原子 または重原子含有ユニットを有しており、 ３）　各試薬を添加した後または両試薬を添加した後に上記媒体をインキュベー トし、 ４）　得られた媒体を励起させ、そして５）　平衡時にまたは運動中にルミネセ ンス化合物から放出された信号を測定し、その際、上記信号は重原子効果によっ て変更される、 ことからなっている。

この明細書では以下の定義を適用する。

−「アナライト」：検出および／または測定すべき類似体物質の任意の物質また は群。

−「レセプター」：上記アナライト上の部位に特異的に固定し得る任意の物質。

−［ルミネセンス化合物」ニ一定の波長でまたは一定の化合物によって励起させ たときに光を放出し得る任意の物質。

−「重原子」：原子番号の大きい原子で、ルミネセンス分子の近傍に存在すると 、ルミネセンス分子のスピン軌道カンプリングを増加させ得る原子、この発明の 目的に適合し得る重原子と決定される例には、特に、ハロゲン原子、水銀、タリ ウム、鉛および銀がある。

−「少なくとも１個の重原子を含有するユニット」：少なくとも１個の重原子を 天然に含有するか、または、少なくとも１個の重原子が固定し得る任意の物質。

更に、「アナライトの反応生成物の成分および少な（とも１つのアナライトレセ プター」の表現は、使用した方法のタイプにより、アナライトまたは少なくとも １つのアナライトレセプターを表す。

アナライトは生物学的または非生物学的種類のものであり得る。

アナライトは、特に、抗体、抗原、毒素、酵素、例えば、蛋白質Ａの如くの蛋白 質、ホルモン、ステロイド、アビジン、ビオチン。

微生物およびハプテンのような生物学的物質並びに医薬品のようなりガントと特 異的に結合し得る非生物学的物質を抱合する。

この発明方法によって検出し得るアナライトの例は、参照文献としてこの明細書 に引用したヨーロッパ特許出＠１７９０８に記載されている。

このようなアナライトの特別の例は：副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）　、抗 利尿ホルモン（ＡＤＨ）　、アルドステロン、アルブミン。

環状ＡＭＰ　、アンドロステンジオン、アンジオテンシン、抗チログロブリン抗 体、炭水化物抗原ＣＡ−１２５，ＣＡ１９−９およびＣＡ１５−３．コルチゾル 、ジゴキシン、ジギトキシン、エストリオール、フェリチン、ガストリン、成長 ホルモン（ＨＧＩ＋）　、胎盤性泌乳刺激ホルモン（ＰＬＯ）　、インシュリン 、メソトレキセート、ミオグロビン、上皮小体ホルモン、蛋白酵素原、１７−ア ルファーヒドロプロゲステロン、チログロブリン、チロキシン結合グロブリン、 グルカゴン。

トリプシン、　Ｈｌｌｌｅおよび抗１（Ｂｅ肝炎＋　ＨＢｓおよび抗ＨＢｓ肝炎 、デルタ−および抗−デルタ−粒子、トランスフェリン、　ＩｇＧ　、　ＩｇＭ 　。

ＩｇＡ、Ｃ３，ハプトグロブリン、セルロプラスミン、アルファｌ抗トリプシン 、リウマチ様因子であり、更に詳細には、癌胚性抗原（ＣＥＡ）　、アルファー フィートプロティン（ＡＦＰ）　、エストラジオール、プロゲステロン、テスト ステロン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＩ（）　、）リョードチロシン（Ｔ３）　 、遊離トリヨードチロシン（ＰＴ３）　、チロキシン（Ｔ４）　、遊離チロキシ ン（ＦＴ４）　、プロラクチン黄体化ホルモン（Ｌｌ（）　、卵胞成熟ホルモン （ＳＦＨ）　、総１ｇＥである。

この発明の方法で使用するルミネセンス化合物は、螢光、化学発光またはりん光 化合物からなる群から選択することができる。

使用することができる螢光化合物は、３００ｎｍを越える、好ましくは４００ま たは４５０ｎｍを越える波長で光を吸収し、４００ｎｍを越えて１０’より大き い吸光係数を有する任意の化合物である。

この発明の目的に適合するもう１つのクラスの螢光化合物は、ピレン誘導体のよ うな寿命の長い螢光性有機分子および螢光性希土類キレートとされる。

この発明の目的に適合する螢光化合物の例は、特に、ヨーロッパ特許１５６９５ および米国特許３９９８９４３に記載されており、これら特許は参照としてこの 明細書に加える特に好ましい螢光化合物は、本出願人によるフランス特許出願８ ４１４７９９に記載されたフルオレセイン、フルオレセイン　イソシアネート並 びに希土類キレートおよび希土類クリプテートである。

この発明による方法では、ルミネセンスおよびアクリジニウムエステルのような 化学ルミネセンス化合物（メソソズインエンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　１９７８＋５７　＋４２４）、または、オキサレ ートとヒドロジヱンペリオキシドとの反応生成物により励起されるフルオレセイ ンのような螢光化合物（Ａｃｃ、　Ｃｈｅ■、　Ｒｅｓ。

１９６９、２８０）を用いることができる。

例えば、エリスロシンおよびエオシンのようなりん元化合物（８ｉｏｃｈｅｍ、 　Ｊ、　１９７９．１８３．５０）も、この発明の目的のルミネセンス化合物と して適切である。

ヨウ素化合物であるエリスロシンおよびエオシンも、少なくとも１つの重原子を 含有するユニットとして使用できることが注目される。

試薬の１つとルミネセンス化合物のカップリングは、上記試薬とルミネセンス化 合物間の共有結合を生じさせるように、慣用のカップリング法により実施される 。ルミネセンス化合物を試薬の１つに、吸着によって固定させることも可能であ る。

試薬の１つに存在する重原子は、例えば、ハロゲンの場合の直接的置換、芳香族 核のような生物学的分子中に存在するユニットでの置換、または、重原子含有ユ ニットを試薬に固定することによって導入することができる。これらのユニット を、蛋白質に通常使用される任意のカンプリング法、例えば、キレート剤によっ てか、または、英国特許２１０９４０７に記載されているような水銀の場合での ジスルフィンドブリッジとのカップリングによって固定させることができる０重 原子は、例えば、ニー　イー　ボルト７（Ａ、　Ｅ、　ＢＯＬＴＯＮ）およびダ プリュエヌハンター（Ｗ、　Ｎ、ＨＵＮＴＥＲ）の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ 、　１３３．５２９．１９７３）によるヨウ素化によって、第２の試薬に導入し たヨウ素原子であることが好ましい。

重原子または少なくとも１個の重原子を含有するユニットを、試薬の１つとのカ ンプリングに適合する機能、および、重原子または少なくとも１個の重原子を含 有するユニットとのカンプリングに適合する機能を有している適当な分子によっ て、その試薬に固定することもできる０例えば、ポリペプチドは中間体分子とし て使用でき（例えば、ポリリジン）、その際、試薬と重原子、または、少なくと も１個の重原子を含有するユニットとのカップリング反応は、慣用のカンプリン グ法によって実施される。

このような中間体分子を使用すると、免疫反応性にあまり影響を与えないで、試 薬近辺の重原子数を増加させる。

「少なくとも１個の重原子を含有するユニット」の例にはサクシンイミドのヨウ 素誘導体、例えば、以下の誘導体がある。

Ｎ−（３，５−’；ヨードー４−ヒドロキシフェニル）プロピオニロキシ〕サク シンイミドエステル、−Ｎ−（３−（３−ヨード−４−ヒドロキシフェニル）プ ロピオニロキシ〕サクシンイミドエステル、−Ｎ−（２−（４−ヨードフェニル スルホンアミド）アセトキシ〕サクシンイミドエステル、 −Ｎ−（６−（４−ヨードフェニルスルホンアミド）へキシロキシ〕サクシンイ ミドエステル、゛ 並びに、これら化合物とポリリジンのようなポリペプチドとのカンプリング生成 物。

これらヨウ素化した有機誘導体は、この発明に従う方法で使用する試薬の適当な 緩衝溶液にその誘導体を接触させることによって上記試薬と直接結合させられる 。

この発明の方法の第１および第２の試薬は、同時にまたは段階的に添加すること ができる０段階的に添加する場合、媒体は有利には各試薬を添加する間でインキ ュベートする。

励起段階は、運動中または平衡時に測定を行った後、後のインキュベート中また はインキュベート後に実施する。

この励起段階は、ルミネセンス化合物が、螢光またはりん元化合物であるときに は光エネルギーを用いて、そして、ルミネセンス化合物が、化学発光化合物であ るときには適当な化学的試薬を用いて実施する。

光エネルギーによる励起段階は、使用した螢光またはりん元化合物の吸収スペク トル内の波長で行う。

光励起段階は慣用方法で、または、振動化方法で、例えば、米国特許４．０５８ ．７３２でウィーダ−（ＷＩＥＤＥＲ）が開示した方法に従って実施することが できることに注目すべきである。この後者の場合には、分析すべき媒体中に含ま れる物質および分析材料のような周囲物質の衰退寿命と比較して、ルミネセンス （螢光またはりん光）衰退寿命が長いルミネセンス化合物を使用することが必要 である。この衰退寿命は１μｓｅｃ、より長いことが好ましい、勿論、励起期間 は選択したルミネセンス化合物のルミネセンス衰退寿命より短くすべきである。

フランス特許出願８４．１４．７９９に開示されているもののような、希土類キ レートまたは希土類クリプテートを長い螢光衰退寿命（または長い半減期）を有 する螢光化合物として使用することが有利である。

一方、この発明の方法は液相で実施され、そして螢光またはりん光の測定がスト リップのような固体相、ゲルまたは他の任意の好適な支持体に反応媒体を沈着さ せた後で行われることに注目すべきである。

それ故、過剰方法の場合には、この発明の方法は、１）標的アナライトを含有す る媒体に、ルミネセンス化合物とカップリングした、上記アナライトのレセプタ ーからなる第１の試薬を添加し、 ２）上記アナライトの１つ、または、それ以上のさらに他のレセプターからなる 、重原子または重原子含有ユニットを有している第２の試薬を加え、 ３）上記条件の媒体をインキュベートし、４）得られた媒体を励起させ、そして 、５）平衡時または運動中に放出される信号を測定する、ことからなる。

競合方法の場合には、この発明の方法は、１）標的アナライトを含有する媒体に 、上記アナライトのレセプターからなり、重原子または重原子を含有するユニッ トを有する第１の試薬を添加し、 ２）ルミネセンス化合物とカップリングしたアナライトからなる第２の試薬を添 加し、 ３）上記条件の媒体をインキュベートし、４）得られた媒体を励起させ、そして 、５）平衡時または運動中に放出される信号を測定する、ことからなる。

競合方法の場合のこの発明方法のもう１つの実施態様によれば、標的アナライト を含有する媒体を上記アナライトのレセプターからなる第１の試薬と共に最初に インキュベートし、その際、上記レセプターは、ルミネセンス化合物とカップリ ングしており、そして、重原子または重原子を含有するユニットを有するアナラ イトを第２の試薬として添加し、その後の段階は上述したものと同様である。

この発明に従う方法は、過剰または競合による抗原またはハプテンの免疫学的測 定に特に適している０例えば、競合による抗原またはハブテンの測定には、第１ の試薬として、フルオレセインで標識した、もしくは、ヨウ素化した対応する抗 体、および、ヨウ素化した、もしくは、フルオレセインで標識した一定量の抗原 を使用する。

過剰による抗原、または、ハブテンの測定には標的抗原またはハプテンに対して 異なる特異性を有する２つの抗体を使用し、その際、一方はフルオレセインで標 識されており、もう一方はヨウ素化されている。勿論、このタイプの測定では、 上述したような他の螢光化合物および少なくとも１個の重原子を含有する他のユ ニットを使用することも可能である。

この発明は更に、 一測定すべきアナライトの少なくとも１つのレセプターからなる第１の試薬、 −アナライトの反応生成物の少なくとも１つの成分および少なくとも１つのアナ ライトレセプターからなる第２の試薬、その際、試薬の１つはルミネセンス化合 物とカンプリングしており、他の１つは重原子または少なくとも１個の重原子を 含有するユニットを有している、 一標準曲線または標準領域を確立するための、既知量の測定すべきアナライトを 含有する標準試料、および−測定に必要な稀釈剤または緩衝液、 から本質的になるキットに関する。

ルミネセンス化合物が化学発光化合物である場合、この発明によるキットは更に 、励起に必要な適当な化学的試薬も含有する。

この発明は、ここに、下記の非制限的な実施例によって更に詳細に説明する。そ の際、検出または測定すべき物質は抗体または抗原である。

これらの実施例では、次の化合物を使用した。

−マイルス（Ｍｉｌｅｓ）社のラビットガンマグロブリン（Ｔ□）、−γ１で免 疫化したシーブ抗血清をＤＥＡＥ−セルロースカラムを通過させて得られた、抗 ラビットシープガンマグロブリン（γ□５．）、 −ＰＨ７，４の０．１Ｍりん酸塩緩衝液中１０ｍｇ／ａ＋Ｊの濃度のヒユーマン 血清アルブミン（ＩＳＡ）、 一フルオレセインイソチオシアネート、異性体Ｉ、−３−（４−ヒドロキシフェ ニル）プロピオン酸のリンゴ酸エステル（ＮＨ５ＰＰ：ポルトン（Ｂｏｌｔｏｎ ）及びハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）試薬）、−メタ重亜硫酸ナトリウム、 一ヨウ素発生剤として、１．３，４．６−チトラクロロー３ａ。

６ａ−ジフェニルアセチレン尿素、 −イオン交換剤としてワットマン（Ｗｈａｔａ＋ａｎ）　ＤＥ　５２　ＤＥＡＥ −セルロース、 −ＰＤＩＯファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の濾過ゲルのカラム、−りん酸 塩緩衝液（ＰＢ）、 螢光測定はパーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＬＳ　５．２．５ ／１０ｎ−のスリットで、４９５ｎｌｌでの励起、　５２９ｎｍでの放出および 拡大ファクター１５で行った、 一オリスインゲスドリー　ニス　エイ（ＯＲＩＳ　ＩＮＤＵＳＴＲＩＥ　ＳＡ） 社製で「エルザブロル（ＥＬＳＡ　ＰＲＯＬ）　Ｊの名称で市場で入手し得るプ ロラクチンのイムノラジオメトリック試薬用のキットに含まれている抗プロラク チンモノクローナル抗体抗体Ｅ１および３Ｄ３、並びに、 一オリス　インゲスドリー　ニス　エイ社製で［エルグ　シイ（ＥＬＳＡ　ＣＥ Ａ）　Ｊの名称で市場で入手し得る癌胚抗原のイムノラジオメトリック試薬用の キットに含まれている抗ＣＥＡモノクローナル抗体Ｇ１２．Ｇ１３およびＧ１５ ゜１　重量　効　の証 ａ）ｒｕｅのフルオレセイン 螢光化合物（ＦＩＴＣ）１．４４閣ｇを水１　ｗａｇに溶解し、ｐｎを水酸化ナ トリウムで９．５にした。

ｒ　ｍｅ　２４＋ｇをＰＨ７，４の０．０５Ｍりん酸塩緩衝液２　ｍｌに溶解し 、螢光化合物を含有する溶液２００μｌを加えた０反応は室温で２時間行い、そ の際、ｐＨは希水酸化ナトリウムで９．５に維持した。

次いで、反応混合物はｐＨ７，４の０．０５Ｍりん酸塩緩衝液で一夜透析した。

次いで、溶液は、ｐＨ１，４の０．０５Ｍりん酸塩緩衝液で平衡化したワットマ ン　ＤＥ　５２　ＤＥＡＥ−セルロースのカラムを通過させた。

種々のフラクションは塩分上昇勾配溶出（ＮａＣｌ　）により溶出させた。フル オレセイン／蛋白質（ｒ　ＫＧ）のモル比は式６式％ で決定した０式中、 −ＡＩは波長Ｘでの吸収であり、 −ｇはモル吸収係数をあられし、 −８４９５＝７２．０ＯＯ１そして、 −Ｇ２．。は重量／容量比で０．１％に対して１．４である。

移動相の塩度に従って得られた種々のフラクションを以下に示す。

（Ｎａ　ＣＪ）　Ｆ／Ｐ　ｒｕｅ（７）　ｙ−Ｆ’０．０５　Ｍ　ユ１．３　１ ２０　μｇ／■１Ｏ６Ｉ　Ｍ　＝２．２　１４０　μｇ／ｍｔｔ０．２　Ｍ　＝ ３．５　２４０　μｇ／ｍ１０．４　Ｍ　ユ５．５　１８０　μｇ／−１１ｂ　 ）　Ｔ　Ａ＊ｓａのヨウ、 この標識化はアール　ハンター（Ｒ，Ｈｕｎｔｅｒ）（Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　 Ｅｘｐ。

Ｂｉｏｊ！、　Ｍｅｄ、　１３３　（３）、９８９．１９７０）のクロラミンＴ 法によって行った０次のものを３分間接触させた。

３．５　＋ａｇ／　ｔａｌｌの濃度のｒ　Ａｌｌ。２００　μｌ−水中１０４Ｍ の濃度のＫＩ１００μｌ、および、−水中１０−”Ｍの濃度のクロラミンＴ　２ ００μ１１次いで、１０−”ＭのＭＢＳ水溶液２００μｉを加えた。

得られた溶液は、Ｐ）１７．５の０．０５Ｍりん酸塩緩衝液で平衡化したＰＤ　 １０カラムに入れた（ポンプ効率＝１６ｍＪ／時間）、カラム出口での検出は２ ８０ｎａ＋で光学的密度を測定して行った。最初のピークの頂点に対応するフラ クションを集めた。そのγａ　＊　ｓ　ｃ　ｔＲ度は０．２４ｍｇ／ｍｊであっ た。

Ｃ）ヨウ、原　を果の量目 ３つの溶液を調整した。

インキュベーションを１時間３０分行い、ｐＨ７，４の０．１　Ｍりん酸塩緩衝 液２５０μｌを加え、４９５ｎｍでの励起で測定した。

系間遷移効率Ｅは弐 ■遊離溶液−Ｉ参照溶液 （式中、■は螢光の強度である）で決定した。

フラクシヨンＦ／Ｐ　＝３．５で得られた結果は、下表夏に示す。これらはフル オレセイン分子の放出エネルギーの１６％が非放射的に移動したことを示してい る。使用したγ□、Ｇの量が過剰量であるから、γＩＩＧは全て結合していると 考えられる。

−例２　ボリヨードヒしたユニットの使ＮＨ３ＰＰを幾らかベンゼン／アセトア ルデヒドの１＝１混合物に溶解し、１．３　・１０−”モル／ｌを含有する溶液 を得た。

次のものを接触させた。

一管の底で蒸発させたＮ　ＨＳ　Ｐ　Ｐ　１００μ！ＴＡ１３Ｇ　２００ｐ４１ 　３　ｅｒｇ／ａ１反応は水中で１５分間進行させ、その後、次のものを添加し た。

−ＫＩ（５・１０−’Ｍ）　２０μｌ −クロラミンＴ（５・１０−”Ｍ）　２０μ！そして、５　・１０　”ＭノＭＢ 　Ｓ２０μ／　ヲ１　分子ｉニ加エタ。

この溶液をＰＤ　１０カラムに入れ、最初のピークの頂上部を集めた。このもの は２８０ｎ＋＊で０．５２７の光学的密度であった。実施例１と同様の条件下で 調整した３つの溶液の螢光を４９５ｒ＋ｓ＋で励起して測定した。

下記表１に示す結果から、本方法の効率がポリヨード化ユニットを使用すること で高められることが示される。

去豊敬ｌ ａ）ヨウ、化したー薬の調 次の化合物を管中で接触させた。

−ＮＨ３ＰＰ　（１０−”Ｍ）　１００μｌ−Ｋ　Ｉ　（１０−’Ｍ）　１００ μｌ−クロラミン　（１０−”Ｍ）　１００μ！接触３分後に、ＭＢＳ　（１０ −”Ｍ）１００μｌを加えた。

次いで、ジメチルホルムアミド２０μＥを含有するベンゼン各２霧ｌで２回抽出 した。有機層は別の管中で蒸発させ、γ□、Ｇ１００μｌを加えた０反応は水中 で１５分間行った。混合物はＰＤ１０カラムに入れた。採集したピークの頂上部 は２８０ｎｎ＋で光学的密度が０．１であった。

ｂ）里凰ヱ四来少藍貝 ３．５を用いて、実施例１と同様の比率の結合溶液を調整するために使用した。

参照および遊離溶液は、実施例１と同様の条件下で別々に調整した。螢光測定の 結果は表１に示す。

実崖五↓ 次のものを接触させた。

−ＮＨ３ＰＰ　１０−”Ｍ　蒸発　１００μ１−ＣＣｌ４中のヨウ素発生剤　５ ・１０４Ｍ　蒸発　２０μ１−Ｋｌ　５・１０−”Ｍ　２０ＩＩＡ −りん酸塩緩衝液　０．０５Ｍ　ｐＨ７，４４０μ！１分間の接触時間後、ジメ チルホルムアミド中のベンゼン（１％）各１　ｍｌで２回抽出した。有機層を別 の管で留去し、Ｔ□８．。

した。

７　ｍ＊５ｃ（７）１／１０稀釈物は遊離溶液およびｒＲＧ、１／４００　、　 Ｆ／Ｐ　＝３．５の結合溶液を製造するために使用し、実施例１に従って調整し た。

得られた結果を表１に示す。

表１ ス１１膀− Ｔ工をフルオレセインで標識した効果を評価した。実施例４に従ってヨウ素標識 し、ＩＳＡで１／２０に稀釈したγＡｌ１３Ｇおよび実施例１で調整した種々の γ□フラクシヨン使用した。

螢光測定は実施例１の方法に従って行った０次の結果が得られた。

参照溶液の螢光は２６．８であった。

その効果はＴＩＩＧ当たりのフルオレセイン数に従って増加することが認められ る。この増加は、フルオレセイン分子間の分子間移動によってフルオレセインの 励起状態のエネルギー移動に関連する。

スｍ灸 従って標識した抗体ＴＡＲＭＧの稀釈曲線を作成した。

次の結果が得られた。

杵例７　′。剰による測　法でのこの　Ｈの　法の使用９．７　ｗａ　ｇ／　ａ ｌｌのＥ、溶液０．５ｍｊ！を水０．５ｔｍ　Ｉｌ中でＦＩＴＣ（分子プローブ ）０．２ｍｇと混合した。　ｐＨは水酸化ナトリウムで９．３に調節した。

反応は室温で３時間進行させ、ｐＨは一定に保った０次いで、溶液をｐＨ７に中 和し、ＰＨ７，４の０．０５Ｍりん酸塩緩衝液２１で２回、２０時間透析した。

ｐＨ７，４の０．０５Ｍりん酸塩緩衝液で平衡化した約１５ｍ１のＤＥＡＲ−セ ルロースゲルのカラムを作った。透析した反応媒体をカラムに入れ、溶出はＮａ Ｃｊ！に関してそれぞれ０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ。

０．４Ｍ、０．７ＭおよびＩＭの緩衝液で実施し、緩衝液のｐＨは７．４であっ た。

０．４ＭのＮａＣＩｌおよび０．７ＭのＮａＣＩｌ緩衝液で溶出したピークを集 め、透析した。

０．４Ｍ　ＮａＣｊ！緩衝液で得られたピークで観察された光学的密度は、２Ｂ Ｏｎ＋ｉで０．１８４であり、４９５ｎｍで０．１６７であった。これは約９０ ／ｊｇ／ｍｊ！の抗体濃度および約４のＦ／Ｐ比に対応する。

ｂ）モノクローナルｒ　３Ｄ３のヨウ素による　識プロトコールは実施例４と同 様である。次の製品を使用した。

−ＮＨ３ＰＰ　（１０−’Ｍ）　２００μｌ−ヨウ素発生剤　（５，１０−”Ｍ ）　４０　ｔｔｌ−Ｋｌ　（５・１０−”Ｍ）　４０μｌ−りん酸塩緩衝液、０ ．０５Ｍ５ｐ）１７．４　４０μｌ抽出はジメチルホルムアミド中１％の濃度の ベンゼン各１　ａｌｌで２回実施した。留去後、３．３　ｔａ　ｇ／　ｍｌの３ Ｄ３を２００μ！加え、反応は水中で１５分間進行させた０分離はＰＤ　１０の カラムで行い、２８０ｎｍで０．４８５の光学的密度を有するフラクションを回 収した。

その濃度は３５０．ｃｒｇ／ｍ１であった。

Ｃ）盪剋見よゑ災足 −５ｇｇ／ｓ　ｌのＨ３Ａ溶液中３μｇ／ｒｓｌの濃度の螢光性Ｅｌ　（Ｅｌ　 ）、 一同様のＩＳＡ溶液中１１０μｇ７請ｉの濃度のヨウ素標識した３Ｄ３　（３Ｄ ３’　）、 一同様のＩＳＡ溶液中１１０μｇ／ｒａｎの濃度の３Ｄ３、−同様のＨ３Ａｉ液 中０．６μｇ７ｍ１．の濃度のプロラクチン、ＰＲＬ。

次の３つの溶液を調整した。

一参照溶液　５＋ｉｇ／＋ｗｊ！のＨ３Ａ　１５０μｌ各溶液は室温で２時間イ ンキュベートし、ｌ５Ａ１００μ！およびりん酸塩緩衝液２５０μｌを添加した 。

実施例工の方法に従って行った螢光測定によって次の結果が得られた。

螢光 参照溶液　２９．７ 結合溶液’　１９７．３ 結合溶液　２３１．１ それ故、競合方法（実施例１〜６）の場合と同じ現象が、異なる特異性を有する ２つの抗体を標識することによって、過剰方法（実施例７）で観察される。

８　・察 ５μｇ／ｍｊ！のｌ３Ａ１００μ！中に０．６μｇ７ａｉのプロラクチンＰＲＬ を含有する溶液および同様ではあるが濃度を変動させた試薬Ｅ、と３Ｄ３１を使 用して実施例７の測定を室温で繰り返した。

システム間移動の効率Ｅはインキュベーション時間の関数として測定した。

次の濃度を使用した。

得られた結果を添付の図１のグラフに示す、グラフでは、インキュベーション時 間（分）を横座標に、効率Ｅ（％）を縦座標にプロットしている。

これらの結果は、この発明の方法が動力学においても使用できることを示してい る。

施９標曲 ５ｔｓｇ／１ａｌｌ　のＨ５Ａ溶液中、６００，１５０，７５．３０゜および１ ２０μｇ７ｍｚの３Ｄ３’　５０μＥと共に管中でインキュベートし、りん酸塩 緩衝液３５０μｌを添加した６次いで、阻止効率Ｅは５ｍｇ／ｓ＋ｊ！のＨ３Ａ １５０μｌからなる標準媒体の値の関数として測定した。その際、１μＵ＝３０ ｎｇである。

得られた結果は添付の図２のグラフに示す、このグラフでは、プロラクチンＰＲ Ｌ濃度（ｎｇ／管）を横座標に、効率Ｅ（％）を縦座標にプロットしている。

かくして、測定すべき各蛋白質の標準曲線を作成することができる。

去ＪＬｆＬＬ！ＩＬ この実施例は、抗ＣＥＡ抗体Ｇ１２．Ｇ１３およびＧ１５を使用して実施した。

ａ）　ｒ　ＣＥＡｔ”　Ｇ　１２（７）７ＭＩｚオＬｚ（＝４７標−使用したプ ロトコールは実施例７ａと同様であった。透析およびカラム溶出はｐＨ８の０． ＯＩＭ　トリス（ＴＲＩＳ）緩衝液で実施した。

０．２および０．４Ｍ　ＮａＣｊ！で溶出したピークを回収した。０．２で溶出 したピークではＦ／Ｐの値は約２．７５であった。集めた溶液は８００μｇｌ蒙 ｌに濃縮した。

ｂ）Ｇ１５のヨウ素による標識 プロトコールは実施例４と同様であった。次の製品を使用した。

ＮＨ３ＰＰ　（１０−”Ｍ）　２００μ！ヨウ素発生剤　（５・１０−”Ｍ）　 ４０μｋＫｌ　（５・１０−”Ｍ）　４０μに りん酸塩緩衝液　０．０５Ｍ、　ｐＨ７，４４０μ１Ｇ１５　（５ｍｇ／ｍｆ） 　２００　μ　！２８０ｎｍで０．８４の光学的密度を有するフラクシヨンを集 めた。

その濃度は６００μｇ／ｍｊ！であった。

ｃ）Ｇ１３のヨウ素による　− 上記の方法に従って、２８０ｎｓ＋で０．３５の光学的密度を有するフラクショ ンを集めた。その濃度は２５０μｇノ■ｌであった。

１　ｗｉｔ当たり３００ｎｇのＣＥＡを含有する標準液を使用した。

次の３つの溶液を調整した。

一参照溶液　Ｈ３Ａ１００，１７４！十緩衝液１００μ！これらの溶液は４５° Ｃで各１時間２回インキュベートし、りん酸塩緩衝液３００μｌを添加した。

各溶液の螢光は４９５ｎ＋ｗで励起して測定し、次の結果を得た。

溶　液　螢光強度　効　率 それ故、特異性の異なる２つの抗体が抗原に結合しているとき、１６％の阻止が ある。

３番目のインキュベーションでは、Ｇ１２およびＧ１５とは持久の溶液を試験し た。

これらの溶液を４５°Ｃで各１時間３回インキュベートし、りん酸塩緩衝液２５ ０μｌを加えた。次の結果が得られた。

溶　液　螢光強度　効　率 ΔＦ＝１８．２ 遊＃溶液　１２４．９ これらの結果は、抗原のもう一方の部位をヨウ素化した別の抗体が存在すると、 フルオレセインで標識した抗体Ｇ１２の螢光阻止を増加させることを示す。

１１　標°曲線 ３００．２００，１００およびＯｎｇ／＋７！の４つのＣＥＡｉ液を調整した。

各溶液はＨ３Ａで１／３０００に稀釈したＧ＋を並びにＨ３Ａ溶液でそれぞれ１ ／３および１７６に稀釈したＧ、および０１％と共にインキュベートして、螢光 を測定した。

次の結果が得られた。

溶　液　螢光強度　ΔＦＥ％ 参照溶液　５４−一 ３００ｎｇ／ｓ＋ｊ含有溶液　６５．９　１１．９　０．５２００ｒ＋ｇ／ｓｉ 含有溶液　６Ｂ　９．８　０．４１１ＱＯｎｇ／ｍｆｆ１含有溶ｉ　７１．８　 ６　０．２５Ｑｎｇ／＊ｊｌ含有溶液　７７．８　０　０１２　ノ１なくとも１ 　の重　を　るユニ・トとしてのサクシンイミドのヨウ、ヒ銖 Ａ　サクシンイミドのヨウ、ヒ銹　の調ａ）發ｌ江　：式 ％式％） クシンイミドエステル（出所：フル力（ＦＬＵＫＡ））　１　ｘ　１０−’モル （２６，３ｗ＋ｇ）をヘンゼンおよび酢酸工５−）Ｌｔ（Ｄ混合物（５０：５０ Ｖ／Ｖ）２．５ｓ＋ｊ！に溶解し、その後ヨードゲン■（Ｉｌｄｏｇｅｎ）　（ 出所：シグマ（ＳＩＧＭＡ）　２・１０−’モル（８６，４ｍｇ）を１度に添加 し、続いてりん酸塩緩衝液（０，０５Ｍ）（ｐＨ７，４）　１００μｌの溶液中 のヨウ化カワウム８３ｍｇを添加した。明るい紫色が直ちに発現した０反応は２ ０°Ｃで攪拌しながら１５分間（アルゴン下で）続けた０次いで、反応は、反応 媒体が消色するまでメタ重亜硫酸ナトリウムの水性飽和溶液を加えて停止させた 。有機層を傾瀉して分離し、次いで無水Ｍｇ５Ｏ，で乾燥し、そして真空下で留 去した。残渣はＣＨ，Ｃ１，または無水ベンゼンで取った。

次いで生成物はシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。溶出剤はベンゼン／ 酢酸エチルの不連続勾配であった。予期した生成物はベンゼンと酢酸エチルの混 合物（９０：ＩＯＶ／Ｖ）で溶出した。化合物１の純度はＣ，Ｃ，Ｍ、　（溶出 剤：　トルエン／酢酸エチル１／Ｉ　Ｖ／Ｖ　）で確認し、対照、ＲＦ−０，７ と比較した０元素分析および質量分析は本製品の構造と一致していた。収量：　 ５８％ｂ）水贅１吻」よ：式 ％式％） この化合物は化学物１について上述したようにして、下記成分を以下に示した比 率で使用して得られた。

−Ｎ−（３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオニロキシ〕サクシンイミドエ ステル、２・１０４モル（０，５２６ｇ）−ヨードゲン■（シグマ）　２・１０ −３モル（０，８６４ｇ）−ＫＩ　４１０−’モル（０，５８４ｇ）０．０５Ｍ のりん酸塩緩衝液（ｐＨ７，４）　５００μ！中得られた生成物は化合物」と同 様の精製および確認工程に付した。

Ｃ）化合物３：式 ％式％ 化合物３は次の反応図に従って、中間生成物Ａの精製および単離を経て、２つの 別々の工程で合成した。

０　０″ ジオキサン５　ｍｘｔ８液中のｐ−ヨードフェニルスルホクロリド８・１０４モ ル（２，４ｇ）を、予めＩＭの水酸化ナトリウム（１０ｍ　ｌ　）でｐＨ９に調 整し、水浴中で冷却したグリココール水溶液７・１０−３モル（０，５２５ｇ） に滴下しながら添加した。添加が完了したとき、水浴を除き、反応は攪拌しなが ら２０°Ｃで１時間続行させた（ｐ）ＩはｐＨ計でｎ認し、反応の間中ｐ）１９ に再調整した。）。

反応終了時に、混合物はその容量の２倍の蒸留水で稀釈した。

溶液は濾過して反応不溶性物質を除去した。濾液は攪拌しながら６Ｎ塩酸を滴下 してｐＨ２に酸性化した。予期した縮合生成物が０片で多量に沈澱した。粗生成 物は濾過し、次いで蒸留水で数回洗浄し、次いでＰｔＯ３の存在下乾燥具中真空 で一夜乾燥した。

収量ニア３％（１，７５ｇ） 生成物の純度はＣ，Ｃ，Ｍ、および慣用の分光測定法によって確認した。

一化澄Ｊぢじ緊釦戊 子め、０″Ｃに冷却した、ＴＨＦ１０ｍｆ中２ミリモルの人（０，６８２ｇ）お よび２ミリモルのＮ−ヒドロキシサクシンイミド（０，２３０ｇ）の溶液に２ミ リモルのジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）　（０，４１２ｇ）を１度 に加えた０反応混合物は攪拌し、０°Ｃの温度で１時間保った。１時間後、冷却 浴を除去し、反応混合物はフリットガラスＮ００３で濾過し、過液は真空中で留 去した。白い泡からなる残渣はＣＨｔ　Ｃｊ！、で取り、セライト■（Ｃｅ　ｌ 　１ｔｅ）で濾過し、次いで真空中で再び留去した。得られた粗生成物はＣＨｚ Ｃｌｔで再結晶した。得られた重量：　０．３７１ｇ、収量４２％。

生成物は慣用の分光測定法によって同一のものであることを認め、その組成は百 分性分析で確認した。

囮企惣工＝ −のＮ−（６−（４−ヨードフェニルスルホンアミド）へキシロキシ〕サクシン イミドエステル、 化合物４の合成は次の反応図に従って中間生成物Ｂの単離を経て２工程で行った 。

１）旦皇企底： ５　ａｌｌのジオキサン溶液中５ミリモル（１，５２ｇ）のｐ−ヨードフェニル スルホクロリドを、予めＩ　Ｍ　ＮａＯ８１０ｍ　ｌでｐＨ９に調整し水浴で冷 却した７ミリモル（０，９１８ｇ）の５−アミノカプロン酸（フル力）水溶液に 滴下しながら添加した。

ヨウ素化した試薬を添加した後、水浴を除去し、反応は２０”Ｃで３時間続けた （ｐＨはやはり上記実施例と同様に反応の間中確認した。）。

次いで、反応混合物はフリットガラスＮｏ、３で濾過し、濾液は１２ＮＨＣＡ’ 数滴でρ１４に酸性化した。次いで、予期した生成物Ｂが夕景沈澱した。この生 成物を濾過し、濾過物を多量の蒸留水で洗浄し、脱水し、最後に乾燥耳中ＰｚＯ ｓで真空下で一夜乾燥した。得られた重量：　１．３０ｇ　、収量二６８％。生 成物の純度はＣ０Ｃ，Ｍ、　（シリカ）で確認し、溶出剤はＣＨＣｊ！、／メタ ノール（３：１ｖ／ν）であった、融点は１５４±１°Ｃであった。生成物の構 造は百分性分析により確認した。

２）化合物４の合成 この合成は次の成分を用いて、化合物３について示したようにして行った。

一生成物８　２ミリモル（０，７６２ｇ）−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド　３ ミリモル（０，３４５ｇ）−Ｄ、Ｃ，Ｃ，３ミリモル（０，６１４ｇ）−ＴＨＦ 溶媒　１０＋ｍｊ！ 反応は４°Ｃで１時間および２０°Ｃで一夜であった。

生成物の精製は化合物３と同様であった。得られた重量：０．８４０ｇ、収量２ ９１％、純度はＣ，Ｃ，翫（溶出剤、酢酸エチル／ＣＨｔ　ｃｐｔ　（１：　１ ））および百分性分析によって確認した。生成物の構造は分光光度測定法１．Ｒ ，および質量分析によって決定した。これは記載の化合物４について予期した構 造と一致していた。

Ｂ　サクシンイミド憬　の　とのカンプリング抗体３Ｄ、（抗−プロラクチン抗 体）をこの実施例では使用した。

０．０５Ｍのりん酸塩緩衝液（ｐＨニア、４）　２００μｌおよび０．ＯＩＭの ホウ酸緩衝液（ｐＨ９）２００μ！溶液中の１・ｔｏ−’モル３Ｄｓ（１０ｍｇ ／　ＩＩＮ）を、予めｃＨｔ　ｃｚ、に溶解したヨウ素化した試薬（化合物１） ２ｍｇに加え、蒸発させて反応管の壁土に被覆を形成させた。カンプリング反応 は２０°Ｃで１時間攪拌しながら続行させた０次いで、１時間後にヨウ素標識し た３Ｄ、はＰＤ　１０のカラムでのクロマトグラフィによって精製し、標識抗体 に相当するピーク（カラムの溶出溶量）を単離した０次いで、その濃度を２８０ ｎｍでの吸収度によって測定した。

単離した標識抗体は１５０ｇｇｌｕｔの濃度で螢光阻止試験に使用した。

これは化合＠ＩＪ３および４について示したようにして行った。

類似の方法に従って、化合物２は抗ＣＥＡ抗体Ｇ１５とカンプリングさせた。こ の目的のために、抗体Ｇ１５　（６，５＋ｍｇ／ｍｊ！で２００、ｃｒＪ）は２ ００μｌの化合物２　（ＣＨｚ　Ｃ１ｚ　３．７５ｍＮ中１．２４ｍｇ、ついで 、管の底で留去して２００μｌ）および２００μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ９）と 接触させた。混合物は周囲温度で１時間３０分インキュベートした。

Ｃプロラクチンの′。　による 使用した試薬は次のとおりである。

３Ｄ、′抗体：５ｇ／ｊ！のＨ３Ａで稀釈して１５０／ｊｇ／Ｉｌｊ！；５ｍｇ ／１１１の濃度のラビットガンマグロブリン溶液中１／１００”　Ｃ１μｇ／プ ロラクチン抗原（イムノチック（Ｉｍ＋＋＋ｕｎｏｔｅｃｈ）供給）；５ｇ／ｊ ！のＨ３Ａ溶液中に０．５μｇ／−ｌ。

−稀釈剤： ５０ｍＭのりん酸塩緩衝液（ｐＨ７，４）溶液中のラビットガンマグロブリン（ 濃度５μ八〇 ５（１＋Ｍのりん酸塩緩衝液中のＨ３Ａ　（濃度５ｇ八へ一対照：　Ｈ３Ａ　（ ５ｇ／／）十精製の溶出溶液（５０：　５０ｖ／ｖ）次の３つの溶液を調整した 。

一対照溶液　ＴＧＬ　５０μ１ ＩＳＡ　５０μｌ 対照　５０μｌ プラクチン　５０μｌ −遊離溶液　Ｅｌ　５０μ１ Ｈ３Ａ　５０μｐ 各溶液は２０＠Ｃで１時間インキュベートした０次いで、読み取りを行う前に、 ０．０５Ｍのりん酸塩緩衝液（ｐＨ７，４）　３５０μｌをそれぞれに加えた。

螢光測定は４９６ｎｍ（励起）および５２０ｎ＋ｓ（放出）でフルオロメータを 用いて行い、効率Ｅを決定した。

得られた結果は次表に示す。

Ｄ　ＣＥＡｒ原の゛　による測 プロラクチンの代わりにＣＥＡ抗原を用い、次の試薬を使用して上記方法を繰り 返した。

一ジク」１ζｍ：この溶液は化合物２を用いてＢ項で得た。溶液はＰＤ　１０で 精製した後、０．１０　ｍｇ／　＋＋４！に調整した。

聚友広”Ｊ　：Ｇ１２の溶液はフルオレセインで標識し：１／２０００に稀釈し た。

インキュベーションは４５°Ｃで２時間実施した。得られた結果も次の表に示す 。

１１３７１なくとも１　の重加　を人　するユニットとしての、ポリペプチドお よびヨウ、ヒ　、のカフブリングｌ皇便里 この実施例では、ポリリジンおよびショート化化合物１間のカンプリング生成物 を調整した。このカンプリング生成物は、以後、試薬Ａと称する。

試薬Ａは次の統計的式によって示される。

ＮＨｇ　ＮＨｔ ｌｌ （ｃＨｔ　）　＊　（ＣＨ２）　ｔ Ｎ）Ｉｔ　−ＣＨＣｏ−（Ｎｕ　ＣＯＣＯ）　−ＮＨ−ＣＨＣ０ＯＨ式中　ｎ＝ ３２７ シグマケミカルズ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）供給のポリリジン塩酸塩 （分子量−４８００）　５　ｓ＋ｇ（１，０４・１Ｏ−７モル）を０．０１Ｍの ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，９）　５００μｌに溶解した。その後、得られた溶液 のｐＨを水酸化ナトリウム（０，５Ｍ’）で１２に調整し、上記化合物１のＣＨ 。

Ｃｊ　ｘ溶液を留去して、予め試験管の底部に沈着させた上記化合物１２．７μ ｊ！、（５，２・１０−’）　ニ加えた０反応は攪拌下２０”Ｃで１時間続けた 。

反応生成物は５０ｍＭのりん酸塩緩衝液を用いてＰＤ　１０（セフ１デツクス（ Ｓｗｐｈａｄｅｓ）　Ｇ　２５　）で溶出した０回収フラクションは遠沈して９ ０μ！用量に濃縮した。

Ｂ　試薬Ａと　３Ｄ３とのカップリング２５■Ｍのりん酸塩緩衝液（ｐＨ５）１ ２０μｌを試薬Ａ８０μｌに加え、その後、カルボジイミド溶液（２ｍｇ／水Ｉ ＮＮ）１００μＥに加えた。

２〜３分後、抗体３Ｄｓ溶液（５０ｍＭのりん酸塩緩衝液（ｐＨ７，４）中９． ６　ｗｉｇ／　ｍｌの３Ｄｓ　２００μｊ！＋２００　ｓＭのりん酸塩緩衝液（ ｐＨ８）２００μｌ１）４００μｌを加えた。

インキュベーションは、２０＠Ｃで１時間、ついで、４”Ｃで一夜、そして２０ ＠Ｃで１時間行った。

分離は、溶出剤として５０−Ｍのりん酸塩緩衝液（ｐＨ７，４）を使用してＰＤ 　１０のカラムで実施した・このカラムの溶出用量から、２８０ｎｍで０．７４ ２の光学的密度を有する溶液（１５ｊ２）を集めた。この溶液の抗体濃度は５３ ０μｇ７ａｌｌであると推計された。上記展開物を実施例１２に記載した螢光阻 止試験に付した。

異なる溶液の螢光強度は次のとおりであった。

参照溶液　１６ 結合溶液　１３４ 遊離溶液　１５０ 効率Ｅ　１１．９％ ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　−伍ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲ τＯＮ会−＋−−――・−−１―＋＋＋−・−−・・＋−−――＋＋−一・−― ＋・―――＋−一一

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．アナライトと対応するレセプターの反応生成物を明らかにすることによって 、アナライトが存在している可能性のある媒体中のアナライトを検出および／ま たは測定する均質方法であって、１）上記アナライトのレセプターからなる第１ の試薬を上記媒体に添加し、 ２）アナライトの反応生成物の少なくとも１つの成分および少なくとも１つのア ナライトレセプターからなる第２の試薬を添加し、その際２つの試薬のうちの１ つはルミネセンス化合物とカップリングしており・他の試薬は重原子または重原 子含有ユニットを有しており、 ３）夫々の試薬を添加した後、または、両試薬を添加した後に上記媒体をインキ ュベートし、 ４）得られた媒体を励起させ、そして、５）平衡時にまたは運動中にルミネセン ス化合物から放出された信号を測定し、その際、上記信号は重原子効果によって 変更される、 ことを特徴とする方法。
2. ２．過剰方法からなる特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、 １）ルミネセンス化合物とカップリングした上記アナライトレセプターからなる 第１の試薬を標的アナライト含有媒体に添加し、 ２）上記アナライトの１つまたはそれ以上の追加レセプターからなる第２の試薬 を添加し、その際、上記第２の試薬は重原子または重原子含有ユニットを有して おり、３）夫々の試薬を添加した後、または、両試薬を添加した後に上記媒体を インキュベートし、 ４）得られた媒体を励起し、そして、 ５）平衡時にまたは運動中に放出された信号を測定する、ことからなることを特 徴とする方法。
3. ３．競合方法からなる特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、 １）標的アナライト含有媒体に、重原子または重原子含有ユニットを有するアナ ライトレセプターからなる第１の試薬を添加し、 ２）ルミネセンス化合物とカップリングしたアナライトからなる第２の試薬を添 加し、 ３）夫々の試薬を添加した後、または、両試薬を添加した後に上記媒体をインキ ュベートし、 ４）得られた媒体を励起させ、そして、５）平衡時にまたは運動中に放出された 信号を測定する、ことからなることを特徴とする方法。
4. ４．競合方法からなる特許請求の範囲第１項に記載の方法であって、 １）標的アナライト含有媒体に、上記アナライトのレセプターからなる第１の試 薬を添加し、その際、上記レセプターはルミネセンス化合物とカップリングして おり、２）第２の試薬として、重原子または重原子含有ユニットを有するアナラ イトを添加し、 ３）夫々の試薬を添加した後、または、両試薬を添加した後に上記媒体をインキ ュベートし、 ４）得られた媒体を励起し、そして、 ５）運動中または平衡時に放出された信号を測定する、ことからなることを特徴 とする方法。
5. ５．アナライトが、生物学的または非生物学的物質であることを特徴とする、特 許請求の範囲第１項から４項のいずれかに記載の方法。
6. ６．アナライトが、抗体，抗原，毒素，酵素，蛋白質，ホルモン，ステロイド， アビジン，ビオチン，微生物およびハプテン、並びに医薬品のようなリガンドと 特異的に結合し得る非生物学的物質からなる群の中から選択されることを特徴と する、特許請求の範囲第１項から４項のいずれかに記載の方法。
7. ７．アナライトがプロラクチンまたは癌胚抗原であることを特徴とする、特許請 求の範囲第１項から５項までのいずれかに記載の方法。
8. ８．ルミネセンス化合物が、螢光、化学発光またはりん光化合であることを特徴 とする、特許請求の範囲第１項から６項までのいずれかに記載の方法。
9. ９．ルミネセンス化合物が、フルオレセイン並びに希土類クリブテートおよびキ レートからなる群から選択した螢光化合物であることを特徴とする、特許請求の 範囲第７項に記載の方法。
10. １０．試薬の１つがフルオレセインで標識され、他の１つがヨウ素化されている ことを特徴とする、特許請求の範囲第１項から８項までのいずれかに記載の方法 。
11. １１．ルミネセンス化合物が長い発光衰退寿命を有し、かつ、得られた媒体の励 起がパルス励起であることを特徴とする、特許請求の範囲第１項から９項までの いずれかに記載の方法。
12. １２．ルミネセンス化合物が希土類クリブテートであることを特徴とする、特許 請求の範囲第１０項に記載の方法。
13. １３．競合方法によって抗原またはハプテンを測定するための、特許請求の範囲 第１項および第３項から１２項までのいずれかに記載の方法であって、標的抗原 を含有する媒体を、一定量のヨウ素化抗原の存在下で対応するフルオレセイン標 識抗体と共にインキュベートすることからなることを特徴とする方法。
14. １４．競合方法によって抗原またはハプテンを測定するための、特許請求の範囲 第１項および第３項から１３項までのいずれかに記載の方法であって、一定量の フルオレセイン標識抗原の存在下で、標的抗原を含有する媒体を、対応するヨウ 素化抗体と共にインキュベートすることからなることを特徴とする方法。
15. １５．過剰方法によって抗原またはハプテンを測定するための、特許請求の範囲 第１項，２項および５項から１４項までのいずれかに記載の方法であって、標識 抗原を含有する媒体を第１のフルオレセイン標識抗体と共に、一定量の第２のヨ ウ素化抗体の存在下で（両抗体は標的抗原に対し特異的が異なる）、またはその 逆でインキュベートすることからなることを特徴とする方法。
16. １６．アナライトが存在する可能性のある媒体中のアナライトの液相での均質的 検出および／または測定用キットであって、−測定すべきアナライトの少なくと も１つのレセプターからなる第１の試薬、 −アナライトの反応生成物の少なくとも１つの成分および少なくとも１つのアナ ライトレセプターからなる第２の試薬、その際試薬のうちの１つはルミネセンス 化合物とカップリングしており、他の１つの試薬は重原子または少なくとも１つ の重原子を含有するユニットを有し、 −標準曲線を作成するための、測定すべきアナライトの概知量を含有する標準試 薬、 および、 −測定に必要な稀釈剤または緩衝液、 を含むことを特徴とするキット。
17. １７．ルミネセンス化合物が化学発光性化合物であることを特徴とする、特許請 求の範囲第１６項に記載のキット、そして、その際該キットは更に、励起に必要 な適当な化学試薬からなる。
18. １８．プロラクチンまたは癌胚性抗原を測定するための、特許請求の範囲第１６ 項または第１７項に記載のキット。