JPH029366A - モノクローナル二特異的免疫グロブリンを製造するためのファストトラック法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、モノクローナル免疫グロブリンを製造するハ
イブリドーマを造る方法に関する。さらに詳しくは、本
発明はモノクローナルニ特異的免疫グロブリンを表現す
るポリオーマを造る方法に関する。

従来技術 天然に産する免疫グロブリンには三種類がありすなわち
ｒｇＡ、ｒｇＤＳｒｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭである。

ＩｇＧは最も普通の免疫グロブリンである。免疫グロブ
リンは、少なくとも二つのペプチド鎖すなわちＨ鎖とＬ
鎖を含む。各り鎖はジスルフィド結合によって対応する
Ｈ鎖に結合する。２価の免疫グロブリンは、対になった
二対のＨ鎖とＬ鎖を含む、二つのＨｔＸの各々はジスル
フィド結合によって相互に結合している。免疫グロブリ
ンの各種類は、そのＨ鎖の構造によって特徴づけられる
。つぎに、免疫グロブリンの各種類はＨ鎖の構造の内部
のもっと細かい差異によって特徴づけられる細分類に区
分される。最終的には、免疫グロブリンはＬ鎖の構造す
なわちラムダまたはカッパＬ　ｊ３１ｆによってさらに
区分できる。どちらの型のＬ　１１１もＨＳＸの種類お
よび細分類のどれとも組み合わさって産出する。

Ｈ鎖とＬ鎖の各々は、定常部と可変部に分けられる。定
常部は、各種類の免疫グロブリンの全分子構造および調
節因子に関する種々の分子相互作用の部位または焦点を
与える。対になったＨ鎖とＬ鎖の可変部は、互いに並列
して結合可変部を形成する。各結合可変部は、抗原結合
部位および抗原結合部位のための骨格を決定する。抗原
結合部位は、抗原が結合する免疫グロブリン上の部位で
ある。各抗原結合部位は、−価に当たる、二価の免疫グ
ロブリンは、二つの抗原結合部位を含む。

天然産の二価の免疫グロブリンの抗原結合部位は互いに
同じであり、すなわち天然産の免疫グロブリンは一特異
的である。

免疫グロブリンは、抗体表現細胞例えば血漿細胞および
種々の他の活性化Ｂリンパ球によって生産される。どの
天然産の抗体表現細胞も唯一つの種類の一特異的免疫グ
ロブリンしか表現しない。

しかし、血管系およびリンパ系は種々のそのような抗体
表現細胞を含んでいる。それで、血清抗体は多くの異な
った特異性をもつおおくの異なった免疫グロブリンを含
んでいてもよい。血′清抗体はそれゆえポリクローナル
であると言われる。

１９７５年に、コーラ−およびミルシュタインがハイブ
リドーマを造る方法を開発した（ネイチャー第２５６巻
、４９５−４９７頁）。ハイブリドーマは、リンパ球ま
たは他の抗体表現細胞を骨髄腫細胞すなわち融合相手細
胞と融合させて造った雑種細胞である。骨髄腫細胞は、
好ましくは抗体を表現せず、培養可能なすなわち培養液
中で不定に保持できる悪性血漿細胞である。一方、リン
パ球は抗体表現白血球である。リンパ球は培養不可能で
あり、すなわち培養液中に長時間保持できない、これら
の細胞融合生成物の成るものは、両方の親細胞の性質す
なわち免疫グロブリンを表現する能力および長時間培養
液中に保持されうる能力を併せ持つであろう、細胞融合
生成物またはハイブリドーマによって表現される免疫グ
ロブリンの特異性は、親のリンパ球によって表現される
免疫グロブリンの特異性によって決まる。適切に選別さ
れクローンされれば、ハイブリドーマは培養液中で長時
間増殖でき、大量の均一な一特異的免疫グロブリンすな
わちモノクローナル免疫グロブリンを生産するであろう
。

ハイブリドーマ技術の出現は、モノクローナル免疫グロ
ブリンの新しい開発と応用の急速な増殖をもたらした。

新しい開発に含まれるものに、二特異的免疫グロブリン
の新製造法がある。

二特異的免疫グロブリンは、二つの異なった抗原特異性
を有する免疫グロブリンである。二特異的免疫グロブリ
ンは、時に二官能免疫グロブリンとして知られる。二特
異的免疫グロブリンは、種々の免疫検定法、治療、その
他の用途にを用である。

二特異的免疫グロブリンを製造するための初期の努力は
、ポリクローナル免疫グロブリンへの化学的方法を使用
した。これらの方法の第一段階はポリクローナル免疫グ
ロブリンの二つの試料のそれぞれの還元的解離を包含し
た。ポリクローナル免疫グロブリンの二つの試料は、互
いに異なった特異性を持つように選ばれた。１元的解離
の後、二つの試料は一諸にされ酸化的再会合を受けさせ
た。第一段階で、ポリクローナル免疫グロブリンのジス
ルフィド結合は還元条件に曝されることによって切断さ
れた。第二段階で、解離したサブユニットは酸化条件下
で再構成するようにされた。

再構成の過程は若干無作為であり、所望の二特異的な形
への免疫グロブリンの再構成は若干非能率であることが
わかった。

化学的に二特異的免疫グロブリンを製造するもっと効率
的な方法を、最近モーリン・ブレナンらが開示した〔サ
イエンス第２２９巻、８１−８３頁（１９８５年）〕、
ブブレンは、出発勧賞としてモノクローナル免疫グロブ
リンの使用を開示している。それぞれ異なった抗原特異
性を持った二つのモノクローナル抗体を使用する。残念
ながらブＩノナンの方法は、出発抗体の限定されたペプ
ンン加水分解を包含し、そのため無傷の免疫グロブリン
分子（ＩｇＧ）でなく二特異的Ｆ　（ａｂ”）２フラグ
メントを生成する。しかし、ブレナンの方法の化学は比
較的効率がよい。

１９８　、ｉ年に、クリストファー・リーディングは、
組換え二特異的免疫グロブリンを表現するトリす一マお
よびクアドローマを遣る方法を開示した（米国特許第４
４７４８９３号）、リーディングｉよ、トリオーマを、
リンパ球およびハイブリドーマ細胞または培養可能で抗
体表現性の他のそ・２）」−うな−１’　［子細胞を融
合させて出来た細胞融）生成物であると定義している。

クアドローマは、二つのハイブリドーマすなわち二つの
融合相手細・抱の融合でできる細胞融合生成物と定義さ
れている。クアドローマは、時に”１１４１ハイブリド
ーマとして知られる。トリオーマに関してはリーディン
グ；よ、もしバイブリドーマとリンパ球が異なった抗体
を表現するならば、すなわら免疫グロブリンが異なった
特異性を有するならば、出来たトリオーマは組換え二特
異的免疫グロブリンを表現しうると指摘した。同様にク
アドローマに関しては、二つのハイブリドーマがそれぞ
れ異なった抗体を表現するならば、出来たクアドローマ
は組換え二特異的免疫グロブリンを表現しうる。どの所
定のトリオーマおよびクアドローマに・ついても、組換
えの部位はゲノム内で無作為に分布していると推定され
る。

他の研究者たちも、ヘテロハイブリドーマを造った。ヘ
テロハイブリドーマは、二つの異なった種の細胞から誘
導した細胞融合生成物である。

融合は、一つの種からの骨髄腫と別の種からのリンパ球
との間でも、一つの種から誘導されたハイブリドーマと
別の種からのリンパ球との間でも、または異なった種か
ら誘導された二つのハイブリドーマの間でもよい。これ
らのヘテロハイブリドーマは、二つの挿のそれぞれの部
分を含む辿換えモノクローナル免疫グロブリンを表現す
る。しかしそのようなヘテロハイブリドーマが二特異的
モノクローナル免疫グロブリンを生産するということは
報告されていない。

二特異的免疫グロブリンの製造にトリオーマおよびクア
ドローマを使用することの相対的な効率は、ブレナンの
化学的な方法（前記）と比較される。ブレナンは、彼女
の方法を使い、二種のモノクローナル免疫グロブリンの
供給から出発して、化学者は一週間以内に純粋の二特異
的免疫グロブリンを製造できると述べている。比較によ
ってブレナンは、もし最初からトリオーマまたはクアド
ローマを造る必要があるならば、精製された二特異的免
疫グロブリンの製造にはかなりの長時間が必要になろう
と指摘している。それゆえ、二特異的免疫グロブリンを
造りうる速度が多くの使用者にとって重要な因子である
ということがブレナンから推論できる。

事実、成る種の臨床的な状況では早い速度で二特異的モ
ノクローナル抗体を造ることが極めて重要である。リー
ディングは、二特異的モノクローナル抗体が腫瘍の治療
の試薬として使用できることを示している。この試薬の
一つの原子価は腫瘍に対して特異性を有し、この試薬の
別の原子価はＩｌ！！瘍に対して標的されるべき医薬ま
たは毒素に対して特異性を有する。しかし、もし患者が
異常なまたは独特な腫瘍特異性の抗原を持つ１１瘍を発
生させるならば、そのような腫瘍特異性の抗原に対応す
る新しい二特異的モノクローナル免疫グロブリンを造る
ことが必要になるであろう、もし二特異的モノクローナ
ル免疫グロブリンを使う試薬が臨床用途を持つべきなら
ば、患者の医師は試薬の速やかな入手法を持たねばなら
ない。もし試薬がセ者用の誂えのものであれば、それは
直ぐに製造できるものでなければならない。

ブレナンは、二特異的免疫グロブリンを造る化学的方法
が細胞法よりも早いと指摘している。しかし、ブレナン
の方法は適当なモノクローナル免疫グロブリンの供給が
予め存在していることを前提にしている。もし二特異的
モノクローナル免疫グロブリンが患者のＬ１瘍の特異性
に合わせて誂えられる必要があるならば、ブレナンの方
法とリーディングの方法の間の差はずっと凍る。

必要なのは、二特異的モノクローナル免疫グロブリンを
製造するファストトラック法である。先行技術の化学的
方法と異なり、ファストトラック法は新しい抗原特異性
を持った二特異的モノクローナル免疫グロブリンの製造
に適用可能なものでなければならない、必要なのは、ト
リオーマやクアドローマを造るのに先行技術の細胞法で
使われていた順次の融合およびクローニングを迂回する
二特異的モノクローナル免疫グロブリンの製造のための
ファストトラック法である。

発明の構成 本発明は、二特異的モノクローナル免疫グロブリンを表
現するポリオーマを製造するファストトラック法（ｆａ
ｓｔ　Ｌｒａｃｋ　ｍｅｔｈｏｄ）である、ポリオーマ
という語は、ここでは二つの抗体表現細胞と骨髄腫細胞
を含む細胞融合生成物を示す、ポリオーマは、その製造
法を除いてはリーディングが記載したトリオーマおよび
クアドローマと頚領している。ここに述べるポリオーマ
の製造法は、中間体のハイブリドーマを造る段階が省略
されるためリーディングの述べたトリオーマまたはクア
ドローマの製造法よりかなり短い、そのようなポリオー
マの製造に要する時間の短縮は、相当な臨床的および商
業的利益を持ちつる。

ここに述べる融合条件および細胞成分を用いることによ
って同時にまたは実質上同時に三つの細胞成分を融合し
て一つの細胞融合生成物を得ることができる。三つの細
胞全部の融合が、一つの短い融合段階で起こる。先行技
術で使われた融合法では、二つの細胞成分の融合しか起
こらない、先行技術は、三つの細胞成分の融合をなし遂
げるためには一連の融合段階を行わねばならないと教示
している。

ファストトラック法の融合段階のあと、細胞融合生成物
は二特異的免疫グロブリンを表現するポリオーマの生成
を検出するために選別される。供与動物がファストトラ
ック法によって適切に接種され選別されており、またフ
ァストトラック法に定められた融合条件が使用されてい
るならば、三つの細胞が同時または実質上同時に融合し
て有用なポリす−マを生成する頻度はかなり高いものと
なろう、この結果は従来技術からは予想されなかったこ
とである。ファストトラック法がポリオーマを造るのに
構築できるということは驚くべき結果であり、また、フ
ァストトラック法が多数の成功的なポリオーマを典型的
に得るということも驚くべき結果である。

ファストトラック法の重要な要素は、供与動物の接＋ａ
と選別である。好ましい方式では、二群の動物供与体を
順次接種して高い抗体力価を得る。

第一群の動物供与体に接種し、第一の抗原で一回以上の
追加免疫注射を与えてもよい、同様に、第二の動物供与
体に接種し第二の抗原で一回以上の追加免疫注射を与え
てもよい、接種のあと、接種物に関して抗体力価水準を
監視するために供与動物から血液試料を採取してもよい
、高い抗体力価をもつ動物すなわち良い応答者だけをそ
のあとの段階に使用する。

別の方式では、−群だけの供与動物を使用し、群のなか
の各動物を両方の抗体で同時にまたは順次に接種し追加
免疫する。残念ながら、両方の抗原に対して高い応答者
である動物の頻度は比較的低いことがわかった。それゆ
え、両方の抗原を接種するのに単一の群の動物を使用す
るのはファストトラック法の方式としては好ましくない
。

高い応答者の動物は高水串の抗体表現細胞を最も得やす
い動物である。抗体表現細胞を与える好ましい器官は［
１である。好ましい方式では、脾臓を高応答の供与動物
から摘出し、華−細胞懸眉吻が生成されるまで撹拌する
。この２．１物内の脾臓リンパ球の細胞数をつぎに測定
する。

二つの群の最高の応答者の各々からの抗体表現細胞をつ
ぎに、骨１１ｆｆｌ細胞またはハイブリドーマを一緒に
造るための類偵の形質転換細胞と同時または実質上同時
に融合させる。この融合段階は、三細胞の融合であるの
でハイブリドーマ、トリオーマなどのための先行技術の
融合段階とは本質的に異なる。先行技術の融合段階は、
二つの細胞すなわち一つの抗体表現細胞および一つの骨
Ｕ種細胞だけしか包含しない、また、ファストトラ７り
法の融合段階の最適条件は、先行技術の融合段階の最適
条件と著しく異なっている。

ハイブリドーマを造るための先行技術は、融合段階の間
、二つの細胞すなわち一つの抗体表現細胞および一つの
骨ｕ１１細胞だけを含む細胞融合生成物の最高の終了を
得るために、リンパ球と骨髄腫細胞の比を最適化しなけ
ればならないと教示している。さらに、トリオーマおよ
びクアドローマ（准種ハイブリドーマ）を造るための先
行技術はこれらの細胞融合生成物が、それぞれ二つだけ
の１抱の融合をＩ順次おこなわねばならないと教示して
いる８各二つの細胞融合に使用される細胞の比ｉよ、二
つだけに細胞を含む細胞融合生成物の終了を最大にする
ように決められる。これに対して、本発明の明細書は、
ファストトラック法でポリオーマを造る場合、三つの細
胞全体の比が考慮されねばならず、その相対的な比率は
三つの細胞すなわち二つのリンパ球（それぞれ異なった
特異性を持つ抗体を表現する）および一つのＷ　ｉｆＪ
　Ｍｆｆｉを含む＄ＩｉＩ胞融合生成物の数を最大にす
るように調節されねばならないことを教示している。ポ
リオーマを造るためにファストトラック法で使用される
リンパ球対骨髄腫細胞の最適比は、ハイブリドーマなど
を造るためのリンパ球対骨ｕ　Ｍｌ細胞の対応する最適
比よりもかなり大きい。

融合段階は、骨髄腫細胞が成長の「ＳＪ！Ｉｌｌにある
ときに行われる。融合の最中および後には、免疫グロブ
リン遺伝子のかなり無作為な組換えが起こる。最後にポ
リオーマで表現される得られた二特異的免疫グロブリン
はこの無作為組換えの生成物である。本質的に、免疫グ
ロブリンの正確な横道はこの組換えでは予想できない。

融合段階のあと、細１１２！融合生成物の分別物をマイ
クロタイタープレートのウェルのなかにピペットで入れ
、培養し、選別する。好ましい方式では二つの選別段階
を行う。第一の１別段階は、単に接種段階の間に使用し
た二つの抗原のどちらかに特異性を持つ細胞融合生成物
を同定するだけである。試験で陽性のウェル；よつぎに
さらに増殖させる。増殖したウェルは二つ以上の１￥異
性すなわち接種段階に使用した抗原のそれぞれに特異性
を持つモノクローナル抗体を同定するために選別される
。

別の方式では、選別段階は短縮できる。第一の選別段階
の間に、同時に複数の特異性を選別できる。しかし、こ
の別法はかなり余分の作業を伴い第二の増殖段階が必要
なためモノクローナル抗体の製造を大きくは促進しない
。さらに別の方式では、細胞融合生成物はＥＩＩＳＡ法
で選別され、この場合固相は第一の抗原で造られ、酵素
標識の可溶性の相は第二の抗原に接合される。

細胞融合生成物が二特異的免疫グロブリンを生産するポ
リオーマであると仮に同定されたあと、そのようなポリ
オーマはつぎに限界希釈法でクローンする。クローンさ
れたポリオーマによって表現される免疫グロブリンの二
特異性は、さらにその免疫グロブリンの一つの特異性を
結合する親和性のマトリックスのうえに免疫グロブリン
を通しつぎにマトリックスから免疫グロブリンを放出さ
せ、溶出液にＥＬ　Ｉ　ＳＡ法を行って第二の特異性を
試験することによって確認される。

ポリオーマを造るためのファストトラック法は実施例に
よって最もよく説明できる。ここに開示した実施例の目
的は、ブタソマトトロピン（ｐｓＴ）およびネコ白血病
ウィルスエンベロープ蛋白ｆｆ（ｐ２７）の両方に結合
特異性を有する二特異的免疫グロブリンを表現するポリ
オーマを得ることである。

第一の抗原、すなわちブタソマトトロピン（ｐＳＴ）は
天然の成長ホルモンであり、デラチャ、ＪＭ、およびゾ
ンネンベルグ、Ｍ、（ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、第２３９巻、１５１５−１５２０頁
（１９６４年）、「ウシ成長ホルモン」〕の方法で単離
、精製できる。精製のあと、ｐＳＴはその免疫原性を増
加させるために標準法によってキーホールカサガイヘモ
シアニン−ｋｅｙｈｏｌｅ１ｉ＋１ｐｅＬ　ｈｏｍｏｃ
ｙａｎｉｎ−（ＫＬ）（１）に接合できる。

第二の抗原、すなわちネコ白血病ウィルスエンベロープ
蛋白質（ｐ２７）　　はネコ白血病ウィルス（ＰｅＬＶ
）の主要コア蛋白質であり２７．０００の分子量を持つ
。

ルックらが、ネコ白血病ウィルスという表題の書物（エ
ルゼビエル／アムステルダム、１９８０年）に始めてｐ
ＳＴを記載した。Ｐ２７は、アメリカン・タイプ・ティ
シュ−・コレクシラン（ベセスダ、メリーランド州）か
ら入手できるネコリンフォブラストイド細胞系であるＰ
Ｌ−７４から得られる。　ＰＬ−７４は、ＦｅＬＶおよ
びＰ２７を含む分泌ウィルス蛋白質によって永続的に感
染される。精製ｐ２７は、ｐ２７特異性の抗体を接合し
た親和性カラム上にＰＬ−７４培養液を通すことによっ
て得られる。ｐ２７特異性のモノクローナル抗体は、シ
ンビオティックス・コーポレーション（サンジエゴ、カ
リフォルニア州）から市販されており、またルックの開
示した方法によって製造できる。

二つの精製された抗原はつぎに供与動物に接種するのに
使用できる。１０匹のＢａ１ｂ／ｃマウスの２群を供与
動物としてすなわち各抗原につき１群を使用することが
できる。好ましい方式では最初の接種およびそのあとの
追加免疫の注射は、腹膜内に行うことができる。しかし
、最後の追加免疫の注射は静脈内投与でもよい。接種の
期間内には、供与マウスの抗体力価水準によってその免
疫応答を監視するためにそのマウスから血液試料を規則
的に採取しなければならない、下記の融合に使うための
その抗体表現細胞を与えるためにマウスの各群から最高
の応答者だけが選ばれる。免疫応答を最大にするように
設計された接種および追加免疫のスケジュールおよびプ
ロトコルを下記に示す。

ｐＳＴ−ＫＬ１１接種スケジュール 第１８　：完全フロインドアジュバント中５０マイクロ
グラムのｐＳＴ−ＫＬＩ（による第一次接種； 第２２日：不完全フロインドアジュバント中５０マイク
ログラムのｐＳＴ−ＫＬＩＩによる最初の追加免疫注射
； 第２９日：採血； 第５４日：燐酸塩緩衝塩水中２５マイクログラムのｐＳ
Ｔ−ＫＬＨによる「予備融合」静脈内追加免疫注射； 第５７日：１０匹のうち１匹のマウスを融合段階のため
に選択。

ｐ　２７接種スケジュール 第１日　：完全フロインドアジュバント中２０マイクロ
グラムのｐ２７による第−次接 挿： 第２２日：不完全フロインドアジュバント中２０マイク
ログラムのｐ２７による最初の 追加免疫注射； 第２９日：採血； 第５４日：Ｐｉｌヴ塩緩衝塩水中２０マイクログラムの
ｐ２７による「予備融合」静脈内追 ＋Ｊ＋］免疫注射； 第５７日・１０四のうち１匹のマウスを融合段階のため
に選択。

どのマウスが最高の応答者であるかを調べるために接種
プロトコルの間に各供与マウスの免疫応答を追跡する。

免疫応答は、各注射後−週間目および融合段階に使うた
めに最高の応答者が犠牲になった日に採取された血液の
抗体力価を測定することによって監視される。抗体力価
は、二つの抗原すなわちｐ２７およびｐＳＴで構成され
たＥＬＩＳＡ法によって測定する。Ｅｌ、ＩＳＡ法は、
下記に説明する。抗体力価が１２０００より高い場合そ
のマウスは良い応答者であると考えられる。

各群からの最高の応答者を同定し、その牌はを摘出する
。各脾臓をつぎに緩衝液に入れ、撹拌によって単一細胞
のジ阻濁吻に変換する。懸濁物中のｊンバ球の細胞数を
数える。脾臓細胞の懸濁物はつぎに骨８種細胞との融合
段階に使用する。

骨髄腫細胞は、ｉＡ択可能でなければならない。

すなわち、培養液中での骨髄腫細胞の成長は培養培地の
与える因子に依存し、なければならない、しかし、抗体
表現細胞と融合したあとは、できた細胞融合生成物はこ
の因子への依存性を失う。したがって、細胞融合生成物
はこの因子の存在なしに培養液中で成長できる。好まし
い骨髄腫細胞系には、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇｕ　ＩおよびＰ
３Ｘ６３−Ａｇ８．８５３があり、どちらもアメリカン
・タイプ・ティシュ−・コレクションから入手できる。

融合段階のすぐ前に、骨Ｎ！Ｊ細胞系を「Ｓ」成長塊月
二こ■７＜。

融合段階の間に、骨髄腫細胞の試料とｐ２７に関する最
高の′６６部のマウスからの脾臓リンパ球の・９発物の
試ｆ４およびｐｓＴに関する最高の応答音のマウスか、
ｌＩの！ＩＩＩ！臓リンパ球の懸濁物の試料Ｎ０両刃と
を一諸にして細胞混合物を造る。１：２：２の細胞組成
を持つ細胞混合物、すなわち１部の骨、油種細胞：２部
の９２７反応性マウスからの碑、”１１．１ンパ球：２
部の９８１反応性マウスからのｊヤ臓すンパＥｉを使っ
たとき、最高の結果を得る。

１会、′￥Ｃ−誘ｔするには、つぎに上記の細胞混合物
を１７・Ｖ条件下；こポリエチレングリコール（ＰＥＧ
！　１１００　）と−諸にし、培養培地中５０％溶液を
形成さセる。−１二分ののち、できた細胞混合物ｆ−：
ｌ０ＩＩ！！すなわちダルベツコの最少必須培地（ＤＭ
Ｅ’、Ｉ）、１０％ウシ胎児血７ｇ、ヒボキサンチン、
アミ、ノブテリン、およびチミジンで希釈する。希釈；
、ｔ、１ミリＩＪノトルあたり１〜］、５ＸＩＯ’個の
細胞を有する細胞混合物が得られるように計算するや希
釈さ机た細胞混合物の０．２ミリリツトルの分別物をつ
ぎに、マイクロタイタープレート好ましくは９６ウエル
のプレートに入れる。マイクロタイタープレートのウェ
ルは、マウス胸腺リンパ球の支持細胞層をも含まねばな
らない、できた融合生成物をつぎにマイクロタイタープ
レート中で１０〜１２日間培養する。

１０〜１２日間の培養のあと、各マイクロタイターウェ
ルのなかの細胞融合生成物を、抗ｐ２７および／または
抗ｐＳＴ免疫グロブリンの存在に関して選別する。

好ましい方式では、ｐ２７およびｐＳＴのどちらかまた
は両方に特異性を持つ免疫グロブリンを）食出するため
の予備的ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法を工夫する。

それゆえ、この予備的ＥＬＩＳＡ法は二特異的および一
特異的免疫グロブリンの両方を検出する。

予備的ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法は、ｐ２７およびｐｓＴの抗原
の両方で表面コートされたウェルを持つマイクロタイタ
ープレートを使う。予備的Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ法はまた
、媒体の存在において呈色反応の触媒になり得るマウス
免疫グロブリンへの酵素接合したボリフローナル抗体も
使う、これらの材料がｊＪｉｌ製されたら、培養中の細
胞融合生成物から少量の上澄液を対応する予（ＩｉＥＬ
ＩＳＡ法ウェルに移す、予（ＩＥＬＩｓＡ法ウェルで培
養したあと、上澄液をウェルから洗い出して未結合の免
疫グロブリンを除く、つぎに、ｔ！ｌ！ｌｉ抗マウス抗
体を予備ＥＬＩＳＡ法ウェル法人エル培養を続ける。培
養のあと、抗マウス抗体の酵素包合体の未結合部分をウ
ェルから洗い出す、つぎに、基体をウェルに加え結合酵
素包合体が呈色反応を行うのに任せる。ウェル内の呈色
が、ｐ２７およびｐＳＴのどちらかまたは両方に特異性
を持つ二特異的または一特異的免疫グロブリンの存在を
示す、そのような免疫グロブリンの存在が今度は、上澄
液を採取した培養ウェルのなかにハイブリドーマまたは
ポリオーマが存在することを示す。

成る実施例では、１１００個のウェルのうち、１１１の
ウェルすなわちウェルのほぼ１０％が上記の予（ＩＥＬ
ＩｓＡ法で陽性を示した。陽性を示したウェルはｐ２７
またはｐＳＴに特異性を持つ一特異的免疫グロブリンを
生産するハイブリドーマかまたは二特異的免疫グロブリ
ンを生産するポリオーマのどちらかを含む。つぎに、陽
性を示したウェルを２４個のウェルを持つ第二のマイク
ロタイタープレートに移し、新しい培地２ミリリツトル
を加えて１０倍に増加させた細胞融合生成物をつぎに３
〜５日間培養する。

予備ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法で陽性を示した細胞融合生成物を
増加させ培養したあと、増加した細胞融合生成物をつぎ
に二つ一組の二次ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法にかける。二次ＥＬ
ＩＳＡ法の一つは、抗ｐ２７免疫グロブリンを検出し、
もう一つの二次ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法は抗ｐＳＴ免疫グロブ
リンを検出する。二次ＥＬＩＳＡ法は、二組のマイクロ
タイタープレートを使い、各組のプレートのウェルが別
々の抗原すなわちｐ２７またはｐＳＴでコートされてい
るほかは予備ＥＬＩＳＡ法と同様である。成る実施例で
は、増加させた細胞融合生成物の１１１個のウェルのう
ち３個すなわち約３％が二次ＥＬｒＳＡ法で陽性を示し
た。

別の一次または二次ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法では、マイクロタ
イタープレートを第一の抗原でコートし、可溶性酵素包
合体を第二の抗原に接合させた。第一の抗原はマイクロ
タイタープレートにコートされ酵素に接合される第二の
抗原とは異なる０例えばマイクロタイタープレートはｐ
２７でコートされ酵Ｘｔ！識はｐＳＴに接合される。こ
の別法のＥＬＩＳＡ法は、第一の構成とは別にまたは連
携して逆の構成を含んでもよい、これらのＥＬＩＳＡ別
法の使用は、偽陽性すなわち二特異的免疫グロブリンを
同定しない陽性の数を減らす効果がある。

１性を示したウェルのうちいくらかが一つ以上のハイブ
リドーマまたはポリオーマを含む可能性を減らすために
、これらのウェルの細胞融合生成物を限界希釈法でクロ
ーンしてもよい、細胞融合生成物を培地で希釈し、細胞
１〜５個が各ウェルにプレートされるようにマイクロタ
イクープレートにプレートする。培養および増殖の期間
のあとウェルをもう一度ＥＬＩＳＡ法で選別する。ウェ
ルの５ないし５９％が陽性でなければならない。

場合によって、限界希釈法で二次のクローニングを行っ
てもよい、成る実施例では、クローンの約９０％がこの
方法で二特異的免疫グロブリンを表現することがわかっ
た。

つぎに、最高の三個のクローンされたポリオーマを取り
出しマウスに腹膜内注射して腹水を造った。つぎに、漂
準の精製法でこの腹水から二特異的モノクローナル免疫
グロブリンを得た。

最終のチエツクとして、免疫グロブリンの二特異性を親
和性クロマトグラフィーで確認してもよい０例えば、ｐ
ＳＴ抗原は親和性マトリックスに共有的に結合させ得る
。つぎに二特異的免疫グロブリンを含むと思われる溶液
をマトリックス材料のうえに通す、二特異的免疫グロブ
リンおよび／または抗ｐＳＴ−特異的免疫グロブリンは
マトリックスに結合するであろう。一方、非結合の免疫
グロブリンはマトリックスから溶出する。つぎに結合免
疫グロブリンを溶出剤の添加によってマトリックスか溶
出させる。？８出した免疫グロブリンをつぎに抗ｐ２１
免疫グロブリンの研修のために上記に説明したｌ＋！類
のＥＬＩＳＡ法で試験する。

二特異的免疫グロブリンはＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ法で陽性
を示し、−特異的免疫グロブリンは陰性を示すであろう
。この試験に使用される親和性クロマトグラフィーキッ
トは、ブローディスクと言う商品名で二ニー・ブルンス
ウィノク・サイエンティフィック（エジソン、ニューシ
ャーシー州）から入手できる。このキットは、ポリカー
ボネートのケースに入ったグルタルアルデヒドと架橋し
たポリ塩化ブニル（Ｐ　Ｖ　Ｃ）マトリックスを含んで
いる。マトリクス（オ料を抗原と接触させたあと、抗原
をグルタルアルデヒド残基を介して吸着させる。マトリ
クス材料はこれで対応する抗体を可逆的に結合する用意
ができている。

代　理　人　新実健部（外１名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）第一のハプテンまたは抗原および第二のハプテン
   または抗原に対する特異性を持つ二特異的免疫グロブリ
   ンを表現する一つ以上のポリオーマを製造するためのフ
   ァストトラック法であって、第一のハプテンまたは抗原
   が第二のハプテンまたは抗原と異なっており、 段階Ａ：第一のハプテンまたは抗原に対する特異性を持
   つ第一の免疫グロブリンを表現する抗体表現細胞の第一
   の試料を得る、ただし前記第一の試料の抗体表現細胞は
   天然に産するものである、 段階Ｂ：第二のハプテンまたは抗原に対する特異性を持
   つ第二の免疫グロブリンを表現する抗体表現細胞の第二
   の試料を得る、ただし前記第二の試料の抗体表現細胞は
   天然に産するものである、 段階Ｃ：選択的であり、かつ第一および第二の試料の抗
   体表現細胞と融合可能な骨髄腫細胞の試料を得る、その
   後 段階Ｄ：細胞混合物を形成するように、その骨髄腫細胞
   の試料を抗体表現細胞の第一および第二の試料と結合さ
   せる、次いで 段階Ｅ：細胞混合物に融合剤を添加して細胞融合生成物
   を形成させる、ただし、前記細胞融合生成物は実質上同
   時に三個の細胞、すなわち骨髄腫細胞一個、第一の試料
   からの抗体表現細胞一個、および第二の試料からの抗体
   表現細胞一個を融合して製造した一つ以上のポリオーマ
   を含む、その後 段階Ｆ：前記細胞融合生成物のなかから、二特異的免疫
   グロブリンを表現する一つ以上のポリオーマを選択する
   、 ことを特徴とする二特異的な免疫グロブリンを表現する
   一つ以上のポリオーマを製造するファストトラック法。 （２）前記段階Ａにおいて、第一のハプテンまたは抗原
   を接種され第一の免疫グロブリンの高い力価で応答され
   た第一の動物から抗体表現細胞の第一の試料を得、かつ 前記段階Ｂにおいて、第二のハプテンまたは抗原を接種
   され第二の免疫グロブリンの高い力価で応答された第二
   の動物から抗体表現細胞の第二の試料を得ることを特徴
   とする請求項１に記載した二特異的な免疫グロブリンを
   表現する一つ以上のポリオーマを製造するファストトラ
   ック法。 （３）前記段階ＡおよびＢにおいて、第一および第二の
   ハプテンまたは抗原の両方を接種され、第一および第二
   の免疫グロブリンの両方の高い力価で応答された抗体表
   現細胞の第一および第二の試料を得ることを特徴とする
   請求項１に記載した二特異的免疫グロブリンを表現する
   一つ以上のポリオーマを製造するファストトラック法。 （４）前記段階Ｄにおいて、細胞混合物が、骨髄腫細胞
   の試料からよりも、抗体表現細胞の第一および第二の試
   料のそれぞれからの細胞を、より多く含む細胞組成を有
   することを特徴とする請求項１に記載した二特異的免疫
   グロブリンを表現する一つ以上のポリオーマを製造する
   ファストトラック法。 （５）前記段階Ａにおいて、第一の試料の抗体表現細胞
   が第一の抗原に関して高い抗体力価を有する第一の動物
   の脾臓から摘出されたリンパ球であり、 前記段階Ｂにおいて、第二の試料の抗体表現細胞が第二
   の抗原に関して高い抗体力価を有する第二の動物の脾臓
   から摘出されたリンパ球であり、 前記段階Ｄにおいて、細胞混合物が実質上 ２：２：１（第一の試料のリンパ球：第二の試料のリン
   パ球：骨髄腫細胞）の比率の細胞組成を有することを特
   徴とする請求項１に記載した二特異的免疫グロブリンを
   表現する一つ以上のポリオーマを製造するファストトラ
   ック法。 （６）前記段階Ｆにおいて、 補助段階Ｆ．１：第一のハプテンまたは抗原および第二
   のハプテンまたは抗原のどちらかまたは両方に特異性を
   有する免疫グロブリンを表現するポリオーマを同定する
   ために前記段階Ｅの細胞融合生成物を予め選別し、その
   後、補助段階Ｆ．２：第一のハプテンまたは抗原および
   第二のハプテンまたは抗原の両方に特異性を有する二特
   異的免疫グロブリンを表現するポリオーマを同定するた
   めに前記補助段階Ｆ．１の予備的選別において同定され
   たポリオーマを二次的に選別するという 補助段階によって一つ以上のポリオーマを選択すること
   を特徴とする請求項１に記載した二特異的免疫グロブリ
   ンを表現する一つ以上のポリオーマを製造するファスト
   トラック法（７）前記段階Ｆにおいて、 補助段階Ｆ．１：ポリオーマの選択的な成長を促進する
   培地で細胞融合生成物を希釈し、個々のポリオーマを単
   離するために細胞融合生成物の分別物をミクロタイター
   プレートにプレーティングし、その後 補助段階Ｆ．２：そのミクロタイタープレート内で細胞
   融合生成物の分別物を培養し、その後補助段階Ｆ．３：
   第一のハプテンまたは抗原および／または第二のハプテ
   ンまたは抗原に特異性を有する免疫グロブリンを表現す
   る陽性の分別物を検出するために前記補助段階Ｆ．２で
   培養した分別物のそれぞれからの培地を試験し、その後 補助段階Ｆ．４：培地を更に追加して前記補助段階Ｆ．
   ３で検出された陽性の分別物を増殖させ、その後 補助段階Ｆ．５：前記補助段階Ｆ．４で増殖した陽性の
   分別物のそれぞれを培養し、その後 補助段階Ｆ．６：第一のハプテンまたは抗原および第二
   のハプテンまたは抗原の両方に特異性を有する二特異的
   免疫グロブリンを表現する二重陽性の分別物を検出する
   ために、前記補助段階Ｆ．５で培養した陽性の分別物の
   それぞれからの培地を試験し、その後 亜段階Ｆ．７：前記亜段階Ｆ．６で検出された二重陽性
   の分別物の一つ以上を選択し、それからのポリオーマの
   一つ以上を単離する という亜段階によって一つ以上のポリオーマを選択する
   ことを特徴とする請求項１に記載した二特異的免疫グロ
   ブリンを表現する一つ以上のポリオーマを製造するファ
   ストトラック法。 （８）第一のハプテンまたは抗原および第二のハプテン
   または抗原に特異性を有する二特異的免疫グロブリンを
   表現する一つ以上のポリオーマを製造するファストトラ
   ック法であって、前記第一のハプテンまたは抗原が前記
   第二のハプテンまたは抗原と異なり、 段階Ａ：第一のハプテンまたは抗原を接種され第一のハ
   プテンまたは抗原に選択性をもつ第一の免疫グロブリン
   の高い力価で応答された第一の動物から抗体表現細胞の
   第一の試料を得、 段階Ｂ：第二のハプテンまたは抗原を接種され第二のハ
   プテンまたは抗原に選択性をもつ第二の免疫グロブリン
   の高い力価で応答された第二の動物から抗体表現細胞の
   第二の試料を得、 段階Ｃ：選択的であり、かつ第一および第二の試料の抗
   体表現細胞と融合可能な骨髄腫細胞の試料を得、その後 段階Ｄ：前記骨髄腫細胞の試料よりも、前記抗体表現細
   胞の第一および第二の試料のそれぞれからの細胞をより
   多くもつ細胞混合物を形成するように、前記骨髄腫細胞
   の試料を抗体表現細胞の第一および第二の試料と結合さ
   せ、その後 段階Ｅ：細胞混合物に融合剤を添加して細胞融合生成物
   を形成させ、ただし、この細胞融合生成物は実質上同時
   に三個の細胞、すなわち骨髄腫細胞一個、第一の試料か
   らの抗体表現細胞一個、および第二の試料からの抗体表
   現細胞一個を融合して製造した一つ以上のポリオーマを
   含む、その後 段階Ｆ：前記細胞融合生成物のなかから、二特異的免疫
   グロブリンを表現する一つ以上のポリオーマを選択する ことを特徴とする二特異的免疫グロブリンを表現する一
   つ以上のポリオーマを製造するファストトラック法。 （９）前記段階Ｆにおいて、 補助段階Ｆ．１：ポリオーマの選択的な成長を促進する
   培地で細胞融合生成物を希釈し、個々のポリオーマを単
   離するために細胞融合生成物の分別物をミクロタイター
   プレートにプレーティングし、その後 補助段階Ｆ．２：前記ミクロタイタープレート内で細胞
   融合生成物の分別物を培養し、その後補助段階Ｆ．３：
   第一のハプテンまたは抗原および／または第二のハプテ
   ンまたは抗原に特異性を有する免疫グロブリンを表現す
   る陽性の分別物を検出するために、前記亜段階Ｆ．２で
   培養した分別物のそれぞれからの培地を試験し、その後 補助段階Ｆ．４：培地をさらに追加してその補助段階Ｆ
   ．３で検出された陽性の分別物を増殖させ、次いで 補助段階Ｆ．５：前記補助段階Ｆ．４で増殖した陽性の
   分別物のそれぞれを培養し、次いで 補助段階Ｆ．６：第一のハプテンまたは抗原および第二
   のハプテンまたは抗原の両方に特異性を有する二特異的
   免疫グロブリンを表現する二重陽性の分別物を検出する
   ために、前記補助段階Ｆ．５で培養した陽性の分別物の
   それぞれからの培地を試験し、次いで 補助段階Ｆ．７：前記補助段階Ｆ．６で検出された二重
   陽性の分別物の一つ以上を選択し、それからのポリオー
   マの一つ以上を単離する、 という補助段階によって一つ以上のポリオーマを選択す
   ることを特徴とする請求項８に記載されたように二特異
   的免疫グロブリンを表現する一つ以上のポリオーマを製
   造するファストトラック法。 （１０）前記段階Ａにおいて、第一の試料の抗体表現細
   胞が、第一の抗原に関して高い抗体力価を有する第一の
   動物の脾臓から摘出されたリンパ球であり、 前記段階Ｂにおいて、第二の試料の抗体表現細胞が、第
   二の抗原に関して高い抗体力価を有する第二の動物の脾
   臓から摘出されたリンパ球であり、 前記段階Ｄにおいて、細胞混合物が、実質上２：２：１
   （第一の試料のリンパ球：第二の試料のリンパ球：骨髄
   腫細胞）の比率の細胞組成を有することを特徴とする請
   求項９に記載した二特異的免疫グロブリンを表現する一
   つ以上のポリオーマを製造するファストトラック法。 （１１）第一のハプテンまたは抗原および第二のハプテ
   ンまたは抗原に特異性を有する二特異的免疫グロブリン
   を表現する一つ以上のポリオーマを製造するファストト
   ラック法であって、その第一のハプテンまたは抗原がそ
   の第二のハプテンまたは抗原と異なり、 段階Ａ：第一のハプテンまたは抗原を接種され第一のハ
   プテンまたは抗原に特異性を有する第一の免疫グロブリ
   ンの高い力価で応答された第一の動物から抗体表現細胞
   の第一の試料を得、 段階Ｂ：第二のハプテンまたは抗原を接種され第二のハ
   プテンまたは抗原に特異性を有する第二の免疫グロブリ
   ンの高い力価で応答された第二の動物から抗体表現細胞
   の第二の試料を得、 段階Ｃ：選択的であり、かつ第一および第二の試料の抗
   体表現細胞と融合可能な骨髄腫細胞の試料を得、つぎに 段階Ｄ：その骨髄腫細胞の試料よりも、前記抗体表現細
   胞の第一および第二の試料のそれぞれからの細胞を、よ
   り多くもつ細胞混合物を形成するように、その骨髄腫細
   胞の試料を抗体表現細胞の第一および第二の試料と結合
   させ、つぎに 段階Ｅ：細胞混合物に融合剤を添加して細胞融合生成物
   を形成させ、ただし前記細胞融合生成物は実質上同時に
   三個の細胞、すなわち骨髄腫細胞一個、第一の試料から
   の抗体表現細胞一個、および第二の試料からの抗体表現
   細胞一個を融合して製造した一つ以上のポリオーマを含
   み、つぎに 段階Ｆ：前記細胞融合生成物のなかから、二特異的免疫
   グロブリンを表現する一つ以上のポリオーマを下記の方
   法で選択する： 補助段階Ｆ．１：第一のハプテンまたは抗原および第二
   のハプテンまたは抗原のどちらかまたは両方に特異性を
   有する免疫グロブリンを表現するポリオーマを同定する
   ために前記段階Ｅの細胞融合生成物を予め選別し、つぎ
   に、補助段階Ｆ．２：第一のハプテンまたは抗原および
   第二のハプテンまたは抗原の両方に特異性を有する二特
   異的免疫グロブリンを表現するポリオーマを同定するた
   めに、前記補助段階Ｆ．１の予備的選別において同定さ
   れたポリオーマを二次的に選別する ことを特徴とする二特異的免疫グロブリンを表現する一
   つ以上のポリオーマを製造するファストトラック法。 （１２）第一のハプテンまたは抗原および第二のハプテ
   ンまたは抗原の両方に特異性を有する組換え二特異的免
   疫グロブリンを表現するポリオーマであって、前記第一
   のハプテンまたは抗原が第二のハプテンまたは抗原と異
   なり、 ポリオーマを形成するように、実質上同時に骨髄腫細胞
   一個、第一の抗体表現細胞一個、および第二の抗体表現
   細胞一個を融合する、ただし前記第一の抗体表現細胞は
   第一のハプテンまたは抗原に特異性を有する免疫グロブ
   リンを表現し、前記第二の抗体表現細胞は第二のハプテ
   ンまたは抗原に特異性を有する免疫グロブリンを表現す
   る、その後 ポリオーマ内に組換え二特異的免疫グロブリンをコード
   し表現する組換え免疫グロブリン遺伝子を形成するよう
   に第一の抗体表現細胞の免疫グロブリン遺伝子を第二の
   抗体表現細胞の免疫グロブリン遺伝子と無作為に組み換
   える ことによって形成されることを特徴とする二特異的免疫
   グロブリンを表現するポリオーマ。 （１３）第一のハプテンまたは抗原および第二のハプテ
   ンまたは抗原の両方に特異性を有する二特異的免疫グロ
   ブリンを製造するファストトラック法であって、前記第
   一のハプテンまたは抗原が第二のハプテンまたは抗原と
   異なり、 段階Ａ：実質上同時に骨髄腫細胞一個、第一の抗体表現
   細胞一個、および第二の抗体表現細胞一個を融合する方
   法によって二特異的免疫グロブリンを表現するポリオー
   マを製造する、ただし、前記第一の抗体表現細胞は第一
   のハプテンまたは抗原に特異性を有する免疫グロブリン
   を表現し、前記第二の抗体表現細胞は第二のハプテンま
   たは抗原に特異性を有する免疫グロブリンを表現し、第
   一および第二の抗体表現細胞は天然に産するものであり
   、出来たポリオーマは二特異的免疫グロブリンを表現す
   る型のものである、その後 段階Ｂ：二特異的免疫グロブリンを表現するために前記
   段階Ａで製造されたポリオーマを培養する、次いで 段階Ｃ：前記段階Ｂで培養されたポリオーマで表現され
   る二特異的免疫グロブリンを捕集し精製する ことを特徴とする二特異的免疫グロブリンを製造するフ
   ァストトラック法。 （１４）第一のハプテンまたは抗原に特異性を有する第
   一の結合領域、 第二のハプテンまたは抗原に特異性を有する第二の結合
   領域、および、 前記第一および第二の結合領域に骨格を与え、前記第一
   および第二の結合領域を結合させ、組換え二特異的免疫
   グロブリンに免疫グロブリン構造を与える組換え非結合
   領域 を含むものであって、 前記第一のハプテンまたは抗原は前記第二のハプテンま
   たは抗原と異なり、 前記第一および第二の結合領域およびその組換え非結合
   領域は、骨髄腫細胞一個、第一の抗体表現細胞一個、お
   よび第二の抗体表現細胞一個の同時融合の間に免疫グロ
   ブリンの無作為組換えで出来た組換え免疫グロブリン遺
   伝子の表現であり、第一および第二の抗体表現細胞は天
   然に産するものであり、 第一の抗体表現細胞の免疫グロブリン遺伝子は第一のハ
   プテンまたは抗原に特異性を有する第一の免疫グロブリ
   ンをコードし、 第二の抗体表現細胞の免疫グロブリン遺伝子は第二のハ
   プテンまたは抗原に特異性を有する第二の免疫グロブリ
   ンをコードし、 第一の抗体表現細胞の免疫グロブリン遺伝子は第二の抗
   体表現細胞の免疫グロブリン遺伝子と異なることを特徴
   とする組換え二特異的免疫グロブリン。 （１５）段階Ａ：培養不可能であり、第一の特異性をも
   つ第一の免疫グロブリンを表現する抗体表現細胞の第一
   の試料を得る、その後 段階Ｂ：細胞混合物に融合剤を添加して脂肪融合生成物
   を形成させる、前記細胞混合物は融合相手細胞および第
   一の試料からの抗体表現細胞を含み、前記融合相手細胞
   は培養可能であって第一の試料からの抗体表現細胞と融
   合でき、細胞融合生成物は二特異的免疫グロブリンを表
   現する培養可能な細胞を含む、次いで 段階Ｃ：前記細胞融合生成物のなかから二特異的免疫グ
   ロブリンを表現する培養可能な一つ以上の細胞を選択す
   る という古い方法を使用するものであって、 段階Ａ．１：前記段階Ｂの前に、培養不可能であって第
   一の特異性と異なる第二の特異性をもつ第二の免疫グロ
   ブリンを表現する抗体表現細胞の第二の試料を得る という付加的な段階を含み、かつ 前記段階Ｂにおいて、細胞混合物が融合相手細胞および
   第一および第二の試料の両方からの抗体表現細胞を含み
   、前記融合相手細胞が第一および第二の試料の両方から
   の抗体表現細胞と実質上同時に融合可能であることを特
   徴とする二特異的免疫グロブリンを表現する培養可能な
   細胞を製造する改良法。