JPH09176199A - 抗ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体モノクローナル抗体及びその使用 - Google Patents
抗ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体モノクローナル抗体及びその使用Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ファクターＸａ・ティシュファクターパスウ
ェイインヒビター複合体の新規な測定方法の提供。 【解決手段】 ファクターＸａ・ティシュファクターパ
スウェイインヒビター複合体（Ｘａ・ＴＦＰＩ）と特異
的に反応するが、遊離のファクターＸ、遊離のファクタ
ーＸａ及び遊離のティシュファクターパスウェイインヒ
ビター（ＴＦＰＩ）とは反応しないモノクローナル抗
体、このモノクローナル抗体を分泌するハイブリドー
マ、並びにこのモノクローナル抗体を用いることを特徴
とする、ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェ
イインヒビター複合体の免疫学的測定方法。
ェイインヒビター複合体の新規な測定方法の提供。 【解決手段】 ファクターＸａ・ティシュファクターパ
スウェイインヒビター複合体（Ｘａ・ＴＦＰＩ）と特異
的に反応するが、遊離のファクターＸ、遊離のファクタ
ーＸａ及び遊離のティシュファクターパスウェイインヒ
ビター（ＴＦＰＩ）とは反応しないモノクローナル抗
体、このモノクローナル抗体を分泌するハイブリドー
マ、並びにこのモノクローナル抗体を用いることを特徴
とする、ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェ
イインヒビター複合体の免疫学的測定方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗ファクターＸａ
・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体モ
ノクローナル抗体、前記モノクローナル抗体を分泌する
ハイブリドーマ及び前記モノクローナル抗体を用いる、
ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒ
ビター複合体の免疫学的測定方法に関する。
・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体モ
ノクローナル抗体、前記モノクローナル抗体を分泌する
ハイブリドーマ及び前記モノクローナル抗体を用いる、
ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒ
ビター複合体の免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】臨床分野において血中のプロトロンビン
をトロンビンに変換させるファクターＸａ（以下、Ｘａ
ともいう）を測定することは、播種性血管内凝固症候群
（ＤＩＣ）や血栓症等の凝固亢進状態を知るうえで重要
である。しかしながら、生成したＸａを直接測定するこ
とは非常に困難である。なぜなら、Ｘａは生成するやい
なや阻害剤のティシュファクターパスウェイインヒビタ
ー〔組織因子凝固系阻害剤（Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏ
ｒ Ｐａｔｈｗａｙ Ｉｎｈｉｂｉｏｒ）、以下、ＴＦ
ＰＩともいう〕と結合して、ファクターＸａ・ティシュ
ファクターパスウェイインヒビター複合体（以下、Ｘａ
・ＴＦＰＩともいう）を形成するからである。
をトロンビンに変換させるファクターＸａ（以下、Ｘａ
ともいう）を測定することは、播種性血管内凝固症候群
（ＤＩＣ）や血栓症等の凝固亢進状態を知るうえで重要
である。しかしながら、生成したＸａを直接測定するこ
とは非常に困難である。なぜなら、Ｘａは生成するやい
なや阻害剤のティシュファクターパスウェイインヒビタ
ー〔組織因子凝固系阻害剤（Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏ
ｒ Ｐａｔｈｗａｙ Ｉｎｈｉｂｉｏｒ）、以下、ＴＦ
ＰＩともいう〕と結合して、ファクターＸａ・ティシュ
ファクターパスウェイインヒビター複合体（以下、Ｘａ
・ＴＦＰＩともいう）を形成するからである。
【０００３】それ故、血中で生成したＸａ量を測定する
ための最も簡便な方法は、生成したＸａ量を間接的に反
映しているＸａ・ＴＦＰＩを定量することである。その
量からＸａ量を推定して凝固活性化の指標とすることが
できる。従来、Ｘａ・ＴＦＰＩを測定するには、ファク
ターＸ（以下、Ｘともいう）とＸａに対するポリクロー
ナル抗体あるいはモノクローナル抗体と、ＴＦＰＩに対
するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体の
２種類を抗体を組み合わせたサンドイッチＥＩＡ法が用
いられている。しかしながら、従来の測定方法では、検
体中に共存する遊離のＸあるいは遊離のＴＦＰＩの干渉
を受けてしまうため、正確にＸａ・ＴＦＰＩを測定する
ことは困難であった。
ための最も簡便な方法は、生成したＸａ量を間接的に反
映しているＸａ・ＴＦＰＩを定量することである。その
量からＸａ量を推定して凝固活性化の指標とすることが
できる。従来、Ｘａ・ＴＦＰＩを測定するには、ファク
ターＸ（以下、Ｘともいう）とＸａに対するポリクロー
ナル抗体あるいはモノクローナル抗体と、ＴＦＰＩに対
するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体の
２種類を抗体を組み合わせたサンドイッチＥＩＡ法が用
いられている。しかしながら、従来の測定方法では、検
体中に共存する遊離のＸあるいは遊離のＴＦＰＩの干渉
を受けてしまうため、正確にＸａ・ＴＦＰＩを測定する
ことは困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、血中に存
在するＸａ・ＴＦＰＩの定量に用いられていた従来のサ
ンドイッチＥＩＡ法において、検体中に共存する遊離の
Ｘあるいは遊離のＴＦＰＩの干渉を受けるという欠点を
解消するべく鋭意研究をした結果、ＸａとＴＦＰＩが結
合して複合体を形成することによって、新たに生じる抗
原決定基を認識するモノクローナル抗体を産生、分泌す
るハイブリドーマを得、このハイブリドーマの培養物を
分離、精製してＸａ・ＴＦＰＩに特異性を示すモノクロ
ーナル抗体を見出した。従って、本発明は、新たに見出
したモノクローナル抗体を利用して、Ｘａ・ＴＦＰＩを
簡便に、正確にそして再現性よく測定する方法を提供す
るものである。
在するＸａ・ＴＦＰＩの定量に用いられていた従来のサ
ンドイッチＥＩＡ法において、検体中に共存する遊離の
Ｘあるいは遊離のＴＦＰＩの干渉を受けるという欠点を
解消するべく鋭意研究をした結果、ＸａとＴＦＰＩが結
合して複合体を形成することによって、新たに生じる抗
原決定基を認識するモノクローナル抗体を産生、分泌す
るハイブリドーマを得、このハイブリドーマの培養物を
分離、精製してＸａ・ＴＦＰＩに特異性を示すモノクロ
ーナル抗体を見出した。従って、本発明は、新たに見出
したモノクローナル抗体を利用して、Ｘａ・ＴＦＰＩを
簡便に、正確にそして再現性よく測定する方法を提供す
るものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、ファク
ターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター
複合体（Ｘａ・ＴＦＰＩ）と特異的に反応するが、遊離
のファクターＸ、遊離のファクターＸａ及び遊離のティ
シュファクターパスウェイインヒビター（ＴＦＰＩ）と
は反応しないモノクローナル抗体に関する。また、本発
明は、ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイ
インヒビター複合体で免疫した哺乳動物の脾臓細胞と哺
乳動物のミエローマ細胞との融合によって形成され、Ｘ
ａ・ＴＦＰＩと特異的に反応するが、遊離のファクター
Ｘ、遊離のファクターＸａ及び遊離のＴＦＰＩとは反応
しないモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマま
たはそれに由来する細胞株に関する。更に、本発明は、
前記のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、
ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒ
ビター複合体の免疫学的測定方法に関する。
ターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター
複合体（Ｘａ・ＴＦＰＩ）と特異的に反応するが、遊離
のファクターＸ、遊離のファクターＸａ及び遊離のティ
シュファクターパスウェイインヒビター（ＴＦＰＩ）と
は反応しないモノクローナル抗体に関する。また、本発
明は、ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイ
インヒビター複合体で免疫した哺乳動物の脾臓細胞と哺
乳動物のミエローマ細胞との融合によって形成され、Ｘ
ａ・ＴＦＰＩと特異的に反応するが、遊離のファクター
Ｘ、遊離のファクターＸａ及び遊離のＴＦＰＩとは反応
しないモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマま
たはそれに由来する細胞株に関する。更に、本発明は、
前記のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、
ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒ
ビター複合体の免疫学的測定方法に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体は新規なマウス・
ハイブリドーマを、それぞれ培地またはマウスの腹腔内
で培養することによって製造できる。ここで用いるマウ
ス・ハイブリドーマは一般的にはＸａ・ＴＦＰＩで免疫
したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とを、Ｋｏｈ
ｌｅｒ及びＭｉｌｉｓｔｅｉｎの細胞融合の基本方法
［Ｎａｔｕｒｅ 第２５６巻 ４９５頁（１９７５年）
参照］により細胞融合して製造することが可能である。
詳細には、下記実施例に述べる如くである。
抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体は新規なマウス・
ハイブリドーマを、それぞれ培地またはマウスの腹腔内
で培養することによって製造できる。ここで用いるマウ
ス・ハイブリドーマは一般的にはＸａ・ＴＦＰＩで免疫
したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とを、Ｋｏｈ
ｌｅｒ及びＭｉｌｉｓｔｅｉｎの細胞融合の基本方法
［Ｎａｔｕｒｅ 第２５６巻 ４９５頁（１９７５年）
参照］により細胞融合して製造することが可能である。
詳細には、下記実施例に述べる如くである。
【０００７】また、上記のハイブリドーマを培養する培
地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地であれ
ばよく、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須
培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｅ
ａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ
ｍｅｄｉｕｍ 以下、ＤＭＥと記す）にウシ胎児血清、
Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸および抗生物質（ペニ
シリンＧとストレプトマイシン）を含む培地が用いられ
る。
地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地であれ
ばよく、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須
培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｅ
ａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ
ｍｅｄｉｕｍ 以下、ＤＭＥと記す）にウシ胎児血清、
Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸および抗生物質（ペニ
シリンＧとストレプトマイシン）を含む培地が用いられ
る。
【０００８】このようにして製造された培養液またはマ
ウスの腹水から、蛋白質の単離、精製に一般的に用いら
れる方法により前述の抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル
抗体を分離、精製することが可能である。そのような方
法としては、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いる
イオン交換カラムクロマトグラフィー、分子節ゲルを用
いる分子節カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結
合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透
析、凍結乾燥等がある。
ウスの腹水から、蛋白質の単離、精製に一般的に用いら
れる方法により前述の抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル
抗体を分離、精製することが可能である。そのような方
法としては、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いる
イオン交換カラムクロマトグラフィー、分子節ゲルを用
いる分子節カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結
合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透
析、凍結乾燥等がある。
【０００９】このようにして得られた抗Ｘａ・ＴＦＰＩ
モノクローナル抗体は、遊離のＸ、Ｘａ及びＴＦＰＩと
は結合しないで、Ｘａ・ＴＦＰＩとだけ結合する能力を
有し、Ｘａ・ＴＦＰＩの免疫定量用の試薬として有用で
ある。この発明の抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体
（例えば後述の実施例で得られたＸＴ−１）は、酵素免
疫定量法（ＥＩＡ）、蛍光免疫定量法（ＦＩＡ）、発光
免疫定量法（ＬＩＡ）あるいは放射能免疫定量法（ＲＩ
Ａ）等ににおける試薬として使用できる。酵素免疫定量
法としては、マイクロタイターあるいはプラスチックチ
ューブを用いるワン・ステップ・サンドイッチ酵素免疫
定量法が例として挙げられる。
モノクローナル抗体は、遊離のＸ、Ｘａ及びＴＦＰＩと
は結合しないで、Ｘａ・ＴＦＰＩとだけ結合する能力を
有し、Ｘａ・ＴＦＰＩの免疫定量用の試薬として有用で
ある。この発明の抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体
（例えば後述の実施例で得られたＸＴ−１）は、酵素免
疫定量法（ＥＩＡ）、蛍光免疫定量法（ＦＩＡ）、発光
免疫定量法（ＬＩＡ）あるいは放射能免疫定量法（ＲＩ
Ａ）等ににおける試薬として使用できる。酵素免疫定量
法としては、マイクロタイターあるいはプラスチックチ
ューブを用いるワン・ステップ・サンドイッチ酵素免疫
定量法が例として挙げられる。
【００１０】この酵素免疫定量法の具体例は、下記実施
例７に示す通りであるが、一般的には、抗Ｘａ・ＴＦＰ
Ｉモノクローナル抗体を用いて行い、まずマイクロタイ
ター・プレートの穴（ウェル）あるいはプラスチックチ
ューブを前もって一次抗体として、本願発明の抗Ｘａ・
ＴＦＰＩモノクローナル抗体（ＸＴ−１）で感作させて
おき、次に、この穴あるいはプラスチックチューブにＸ
ａ・ＴＦＰＩを含む被検体および二次抗体として酵素標
識した抗ＴＦＰＩ抗体の溶液を入れ、約３０分間静置後
清浄し、酵素基質溶液を加えて３０分間程度酵素反応を
行う。反応終了後、比色法等により、被検体中のＸａ・
ＴＦＰＩの量を定量することにより行うことが可能であ
る。
例７に示す通りであるが、一般的には、抗Ｘａ・ＴＦＰ
Ｉモノクローナル抗体を用いて行い、まずマイクロタイ
ター・プレートの穴（ウェル）あるいはプラスチックチ
ューブを前もって一次抗体として、本願発明の抗Ｘａ・
ＴＦＰＩモノクローナル抗体（ＸＴ−１）で感作させて
おき、次に、この穴あるいはプラスチックチューブにＸ
ａ・ＴＦＰＩを含む被検体および二次抗体として酵素標
識した抗ＴＦＰＩ抗体の溶液を入れ、約３０分間静置後
清浄し、酵素基質溶液を加えて３０分間程度酵素反応を
行う。反応終了後、比色法等により、被検体中のＸａ・
ＴＦＰＩの量を定量することにより行うことが可能であ
る。
【００１１】または、一次抗体として抗ＴＦＰＩモノク
ローナル抗体［例えば、化学及血清療法研究所で取得し
たハイブリドーマＨＴＦＰＩ−Ｋ９（寄託番号：ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ−１４４６７）が産生する抗ＴＦＰＩモノクロー
ナル抗体］、二次抗体として酵素等で標識した本願発明
の抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体（ＸＴ−１）を
用いて前記と同様の操作を行っても血中のＸａ・ＴＦＰ
Ｉを定量することができる。また、本発明のモノクロー
ナル抗体は、後述するようにラテックス凝集免疫法にも
使用できる。本発明のモノクローナル抗体を感作したラ
テックスと被検体を接触させ、それに伴う凝集の有無を
測定することで、被検体中のＸａ・ＴＦＰＩを定量する
ことができる。
ローナル抗体［例えば、化学及血清療法研究所で取得し
たハイブリドーマＨＴＦＰＩ−Ｋ９（寄託番号：ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ−１４４６７）が産生する抗ＴＦＰＩモノクロー
ナル抗体］、二次抗体として酵素等で標識した本願発明
の抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体（ＸＴ−１）を
用いて前記と同様の操作を行っても血中のＸａ・ＴＦＰ
Ｉを定量することができる。また、本発明のモノクロー
ナル抗体は、後述するようにラテックス凝集免疫法にも
使用できる。本発明のモノクローナル抗体を感作したラ
テックスと被検体を接触させ、それに伴う凝集の有無を
測定することで、被検体中のＸａ・ＴＦＰＩを定量する
ことができる。
【００１２】
【実施例】次にこの発明の実施例により更に詳細に説明
する。実施例１．Ｘａ・ＴＦＰＩの調製 Ｘａ・ＴＦＰＩの調製は次のような操作で行った。精製
したＸａ５ｍｇ（０．５ｍｇ／ｍｌのＸａ溶液、１０ｍ
ｌ）と精製したＴＦＰＩ１５ｍｇ（５ｍｇ／ｍｌのＴＦ
ＰＩ溶液、３ｍｌ）を混合し（モル比１：２）、３７℃
で１時間反応後、１Ｍのジイソプロピルフルオロリン酸
溶液を１３ｍｌ反応液に添加することによって反応を停
止させた。この混合液を前もって０．１Ｍ ＮａＣｌを
含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化
したヘパリン−セファロースカラム（カラム容量１００
ｍｌ）に充填した。
する。実施例１．Ｘａ・ＴＦＰＩの調製 Ｘａ・ＴＦＰＩの調製は次のような操作で行った。精製
したＸａ５ｍｇ（０．５ｍｇ／ｍｌのＸａ溶液、１０ｍ
ｌ）と精製したＴＦＰＩ１５ｍｇ（５ｍｇ／ｍｌのＴＦ
ＰＩ溶液、３ｍｌ）を混合し（モル比１：２）、３７℃
で１時間反応後、１Ｍのジイソプロピルフルオロリン酸
溶液を１３ｍｌ反応液に添加することによって反応を停
止させた。この混合液を前もって０．１Ｍ ＮａＣｌを
含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化
したヘパリン−セファロースカラム（カラム容量１００
ｍｌ）に充填した。
【００１３】このカラムを上記の緩衝液約４００ｍｌで
洗浄後、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．４）と０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）による直線濃度勾
配によって溶離する。溶出液は、５ｍｌずつ集めた。ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法によって、複合体の含
まれている分画を測定した。Ｘａ・ＴＦＰＩが含まれて
いる分画番号６１−１２０を集め、５０ｍＭ ＮａＣｌ
を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液で透析した。
洗浄後、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．４）と０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）による直線濃度勾
配によって溶離する。溶出液は、５ｍｌずつ集めた。ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法によって、複合体の含
まれている分画を測定した。Ｘａ・ＴＦＰＩが含まれて
いる分画番号６１−１２０を集め、５０ｍＭ ＮａＣｌ
を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液で透析した。
【００１４】次に、前もって５０ｍＭ ＮａＣｌを含む
２０ｍＭトリス塩酸緩衝液で平衡化してあるＤＥＡＥ−
セファセルカラム（カラム容量５０ｍｌ、ファルマシャ
社製）に充填する。このカラムを上記の緩衝液約２００
ｍｌで洗浄後、０．０５ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液による直線濃度勾配によって溶離した。溶
出液は２ｍｌずつ集めた。上記の方法で調べたＸａ・Ｔ
ＦＰＩの含まれている分画を集め、限外濾過法によって
濃縮し、Ａ２８０ｎｍ＝１．０のＸａ・ＴＦＰＩ、５ｍ
ｌを得た。このようにして得たＸａ・ＴＦＰＩ溶液は、
免疫原として、また抗Ｘａ・ＴＦＰＩ抗体産生ハイブリ
ドーマを選別するためのＥＬＩＳＡ用抗原として使用し
た。
２０ｍＭトリス塩酸緩衝液で平衡化してあるＤＥＡＥ−
セファセルカラム（カラム容量５０ｍｌ、ファルマシャ
社製）に充填する。このカラムを上記の緩衝液約２００
ｍｌで洗浄後、０．０５ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液による直線濃度勾配によって溶離した。溶
出液は２ｍｌずつ集めた。上記の方法で調べたＸａ・Ｔ
ＦＰＩの含まれている分画を集め、限外濾過法によって
濃縮し、Ａ２８０ｎｍ＝１．０のＸａ・ＴＦＰＩ、５ｍ
ｌを得た。このようにして得たＸａ・ＴＦＰＩ溶液は、
免疫原として、また抗Ｘａ・ＴＦＰＩ抗体産生ハイブリ
ドーマを選別するためのＥＬＩＳＡ用抗原として使用し
た。
【００１５】実施例２． （ａ）免疫化した脾臓細胞の調製：上記のＸａ・ＴＦＰ
Ｉ免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量のフロイ
ンド氏完全アジュバンドと乳化するまで混合し、その混
合液２００μｌをマウス腹腔内に投与することにより免
疫を行った（第１回免疫）。３０日経過後、該マウスに
上記の同様の方法でマウス腹腔内に投与した（第２免
疫）。第２回免疫から２１日経過後、Ｘａ・ＴＦＰＩ免
疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量の生理食塩水
で希釈し、その希釈液２００μｌを、該マウスの静脈内
に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、脾
臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に使用した。
Ｉ免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量のフロイ
ンド氏完全アジュバンドと乳化するまで混合し、その混
合液２００μｌをマウス腹腔内に投与することにより免
疫を行った（第１回免疫）。３０日経過後、該マウスに
上記の同様の方法でマウス腹腔内に投与した（第２免
疫）。第２回免疫から２１日経過後、Ｘａ・ＴＦＰＩ免
疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量の生理食塩水
で希釈し、その希釈液２００μｌを、該マウスの静脈内
に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、脾
臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に使用した。
【００１６】（ｂ）細胞融合：無菌的に摘出した上記の
脾臓を、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地５
ｍｌを入れたシャーレに入れる。次に脾臓を１０〜１５
％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５ｍｌで還流して
脾細胞を流出させた後、この脾細胞懸濁液をナイロンメ
ッシュに通す。この脾細胞を５０ｍｌ遠心チューブに集
めて５００×ｇ、１０分間遠心する。こうして得たペレ
ットに３〜５ｍｌのヘモライジング溶液（１５５ｍＭ
ＮＨ4 Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ3 、１ｍＭ Ｎａ２Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ７．０）を加え、懸濁させる。０℃で、５
〜１０分間放置すると懸濁液中の赤血球は破壊される。
１０〜２０ｍｌの１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭ
Ｅ培地を加えてから遠心分離する。このようにして得た
細胞ペレットをＤＭＥ培地で遠心法によって洗浄し、生
きている脾細胞数を測定する。
脾臓を、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地５
ｍｌを入れたシャーレに入れる。次に脾臓を１０〜１５
％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５ｍｌで還流して
脾細胞を流出させた後、この脾細胞懸濁液をナイロンメ
ッシュに通す。この脾細胞を５０ｍｌ遠心チューブに集
めて５００×ｇ、１０分間遠心する。こうして得たペレ
ットに３〜５ｍｌのヘモライジング溶液（１５５ｍＭ
ＮＨ4 Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ3 、１ｍＭ Ｎａ２Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ７．０）を加え、懸濁させる。０℃で、５
〜１０分間放置すると懸濁液中の赤血球は破壊される。
１０〜２０ｍｌの１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭ
Ｅ培地を加えてから遠心分離する。このようにして得た
細胞ペレットをＤＭＥ培地で遠心法によって洗浄し、生
きている脾細胞数を測定する。
【００１７】一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細
胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４ 約２×１
０7 個に１×１０8 個の上記脾細胞を加え、ＤＭＥ培地
中でよく混合し、遠心分離を行った（５００×ｇ、１０
分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐ
し、３８℃に保温しておいた４０％ポリエチレングリコ
ール４０００溶液０．５ｍｌを滴下し、遠心チューブ
を、手で１分間穏やかに回転することによってポリエチ
レングリコール溶液と細胞ペレットを混合させた。次
に、３８℃に保温しておいたＤＭＥ培地を、３０秒毎に
１ｍｌ加えてチューブを穏やかに回転させる。
胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４ 約２×１
０7 個に１×１０8 個の上記脾細胞を加え、ＤＭＥ培地
中でよく混合し、遠心分離を行った（５００×ｇ、１０
分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐ
し、３８℃に保温しておいた４０％ポリエチレングリコ
ール４０００溶液０．５ｍｌを滴下し、遠心チューブ
を、手で１分間穏やかに回転することによってポリエチ
レングリコール溶液と細胞ペレットを混合させた。次
に、３８℃に保温しておいたＤＭＥ培地を、３０秒毎に
１ｍｌ加えてチューブを穏やかに回転させる。
【００１８】この操作を１０回繰り返した後、２０〜３
０ｍｌの１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地を
加えて、遠心分離（５００×ｇ、１０分間）を行った。
上清を除去した後、細胞ペレットを１０〜１５％ウシ胎
児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にアミノプテリン
４×１０-7Ｍ、チミジン１．６×１０-5Ｍ、ヒポキサン
チン１×１０-4Ｍになるように添加したのも）で、遠心
法によって２回洗浄後、４０ｍｌの上記ＨＡＴ培地に懸
濁した。この細胞懸濁液を９６ウエル細胞培養プレート
の各ウエルに２００μｌずつ分注し、３７℃、５％炭酸
ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開始した。
０ｍｌの１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地を
加えて、遠心分離（５００×ｇ、１０分間）を行った。
上清を除去した後、細胞ペレットを１０〜１５％ウシ胎
児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にアミノプテリン
４×１０-7Ｍ、チミジン１．６×１０-5Ｍ、ヒポキサン
チン１×１０-4Ｍになるように添加したのも）で、遠心
法によって２回洗浄後、４０ｍｌの上記ＨＡＴ培地に懸
濁した。この細胞懸濁液を９６ウエル細胞培養プレート
の各ウエルに２００μｌずつ分注し、３７℃、５％炭酸
ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開始した。
【００１９】培養中、２〜３日間隔で各ウエルの培地を
約１００μｌ除き、新たに上記のＨＡＴ培地を１００μ
ｌ加えることによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリド
ーマを選択した。８日目頃から１０〜１５％ウシ胎児血
清を含むＨＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６×１０
-5Ｍ、ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加し
たもの）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察すると
ともに、約１０日目に、下述のＥＬＩＳＡ法により、抗
Ｘａ・ＴＦＰＩ抗体産生ハイブリドーマをクスリーニン
グした。
約１００μｌ除き、新たに上記のＨＡＴ培地を１００μ
ｌ加えることによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリド
ーマを選択した。８日目頃から１０〜１５％ウシ胎児血
清を含むＨＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６×１０
-5Ｍ、ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加し
たもの）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察すると
ともに、約１０日目に、下述のＥＬＩＳＡ法により、抗
Ｘａ・ＴＦＰＩ抗体産生ハイブリドーマをクスリーニン
グした。
【００２０】（Ｃ）ハイブリドーマの樹立 ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無はＥＬＩＳ
Ａ法により測定した。９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート
（Ｉｍｍｕｌｏｎ 、日本ダイナテック株式会社）の各
ウエルに、前述の精製Ｘａ・ＴＦＰＩ溶液（Ａ２８０ｎ
ｍ＝０．０５、生理食塩水で希釈したもの）を５０μｌ
ずつ分注し、２５℃で２時間放置した。次に、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０（ＩＣＩ社の登録商標）−生理食塩水
で３回洗浄した後、各ウエルに培養上清を５０μｌ加
え、２５℃で１時間反応させた。
Ａ法により測定した。９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート
（Ｉｍｍｕｌｏｎ 、日本ダイナテック株式会社）の各
ウエルに、前述の精製Ｘａ・ＴＦＰＩ溶液（Ａ２８０ｎ
ｍ＝０．０５、生理食塩水で希釈したもの）を５０μｌ
ずつ分注し、２５℃で２時間放置した。次に、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０（ＩＣＩ社の登録商標）−生理食塩水
で３回洗浄した後、各ウエルに培養上清を５０μｌ加
え、２５℃で１時間反応させた。
【００２１】次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食
塩水で２００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス
抗体（ダコ社、デンマーク）５０μｌを各ウエルに加え
た。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩
水で各ウエルを３回洗浄し、０．５ｍＭアミノアンチピ
リン、１０ｍＭフェノール、及び０．００５％過酸化水
素水を含む溶液２５０μｌを各ウエルに加え、２５℃で
３０分間反応させ、各ウエルの４９０ｎｍにおける吸光
度を測定した。その結果、１９２ウエル中、２３ウエル
に抗体産生が認められた。
塩水で２００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス
抗体（ダコ社、デンマーク）５０μｌを各ウエルに加え
た。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩
水で各ウエルを３回洗浄し、０．５ｍＭアミノアンチピ
リン、１０ｍＭフェノール、及び０．００５％過酸化水
素水を含む溶液２５０μｌを各ウエルに加え、２５℃で
３０分間反応させ、各ウエルの４９０ｎｍにおける吸光
度を測定した。その結果、１９２ウエル中、２３ウエル
に抗体産生が認められた。
【００２２】上記のＥＬＩＳＡ法によって認められた培
養上清中の抗Ｘａ・ＴＦＰＩ抗体が、ＴＦＰＩ及びＸａ
と反応するか否かを、ＴＦＰＩ及びＸａを感作した９６
ウエルＥＬＩＳＡ用プレートを用いて上記と同様の方法
で測定した。その結果、Ｘａ・ＴＦＰＩと反応した２３
ウエルの培養上清中、１８ウエルの培養上清がＴＦＰＩ
とも反応した。一方、Ｘａとは全く反応しなかった。Ｔ
ＦＰＩ及びＸａとは反応しないで、Ｘａ・ＴＦＰＩのみ
に特異的に反応する１ウエル中のハイブリドーマは２４
ウエルプレートに移し、１０〜１５％ウシ胎児血清を含
むＨＴ培養で４〜５日間培養した。
養上清中の抗Ｘａ・ＴＦＰＩ抗体が、ＴＦＰＩ及びＸａ
と反応するか否かを、ＴＦＰＩ及びＸａを感作した９６
ウエルＥＬＩＳＡ用プレートを用いて上記と同様の方法
で測定した。その結果、Ｘａ・ＴＦＰＩと反応した２３
ウエルの培養上清中、１８ウエルの培養上清がＴＦＰＩ
とも反応した。一方、Ｘａとは全く反応しなかった。Ｔ
ＦＰＩ及びＸａとは反応しないで、Ｘａ・ＴＦＰＩのみ
に特異的に反応する１ウエル中のハイブリドーマは２４
ウエルプレートに移し、１０〜１５％ウシ胎児血清を含
むＨＴ培養で４〜５日間培養した。
【００２３】その後、再度ＥＬＩＳＡ法によって抗Ｘａ
・ＴＦＰＩ特異的抗体（以下単に抗Ｘａ・ＴＦＰＩ抗体
という）の産生の有無を確認してから限界希釈法により
クローニングした。限界希釈法は、ＨＴ培地でハイブリ
ドーマが５個／ｍｌとなるように希釈した細胞浮遊液
を、予め正常ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔細胞がウエル
あたり２×１０4 個分注してある９６ウエルプレートの
各ウエルに１００μｌずつ分注した。約１０日後、ＥＬ
ＩＳＡ法によって、抗Ｘａ・ＴＦＰＩ抗体を産生するハ
イブリドーマのクローンをスクリーニングした。その結
果、各ハイブリドーマにつき、２０〜４０個の抗体産生
クローンが得られた。
・ＴＦＰＩ特異的抗体（以下単に抗Ｘａ・ＴＦＰＩ抗体
という）の産生の有無を確認してから限界希釈法により
クローニングした。限界希釈法は、ＨＴ培地でハイブリ
ドーマが５個／ｍｌとなるように希釈した細胞浮遊液
を、予め正常ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔細胞がウエル
あたり２×１０4 個分注してある９６ウエルプレートの
各ウエルに１００μｌずつ分注した。約１０日後、ＥＬ
ＩＳＡ法によって、抗Ｘａ・ＴＦＰＩ抗体を産生するハ
イブリドーマのクローンをスクリーニングした。その結
果、各ハイブリドーマにつき、２０〜４０個の抗体産生
クローンが得られた。
【００２４】これらのクローンの中から、増殖のよい、
抗体分泌能の高い、しかも安定なクローンを選び、前述
と同様の方法で再クローン化を行い、抗Ｘａ・ＴＦＰＩ
特異的抗体産生ハイブリドーマＸＴ−１を樹立した。な
お、ハイブリドーマＸＴ−１は、工業技術院生命工学工
業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５３５７として、平成
７年１２月２０日に寄託された。
抗体分泌能の高い、しかも安定なクローンを選び、前述
と同様の方法で再クローン化を行い、抗Ｘａ・ＴＦＰＩ
特異的抗体産生ハイブリドーマＸＴ−１を樹立した。な
お、ハイブリドーマＸＴ−１は、工業技術院生命工学工
業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５３５７として、平成
７年１２月２０日に寄託された。
【００２５】実施例３．モノクローナル抗体の製造 イン・ビトロ法 マウスハイブリドーマＸＴ−１を１５％ウシ胎児血清を
含むＤＭＥ培地中で３７℃、５％二酸化炭素雰囲気中７
２〜９６時間培養した。培養物を遠心分離（１００００
×ｇ、１０分）後、上清に固形の硫酸アンモニウムを５
０％最終濃度となるように徐々に加えた。混合物を氷冷
下３０分間撹拌した後６０分間放置し、遠心分離（１０
０００×ｇ、１０分）後、得られた沈渣を少量の１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量
の１０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析した。
含むＤＭＥ培地中で３７℃、５％二酸化炭素雰囲気中７
２〜９６時間培養した。培養物を遠心分離（１００００
×ｇ、１０分）後、上清に固形の硫酸アンモニウムを５
０％最終濃度となるように徐々に加えた。混合物を氷冷
下３０分間撹拌した後６０分間放置し、遠心分離（１０
０００×ｇ、１０分）後、得られた沈渣を少量の１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量
の１０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析した。
【００２６】これを、１０ｍＭリン酸緩衝液で既に平衡
化したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに充填した。モノ
クローナル抗体の溶出は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）と０．２Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ８．０）の間で濃度勾配法により行った。溶
出されたモノクローナル抗体を限外濾過法で濃縮し、
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し
た。ウシ血清ＩｇＧを除くために、透析物をヤギ抗ウシ
血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムに通した。次に
通過液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化
したプロテインＡ−セファロース４Ｂのカラムに充填し
た。カラムをｐＨ３．５の緩衝液で溶出して精製した抗
Ｘａ・ＴＦＰＩ抗体ＸＴ−１の溶液を得た。
化したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに充填した。モノ
クローナル抗体の溶出は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）と０．２Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ８．０）の間で濃度勾配法により行った。溶
出されたモノクローナル抗体を限外濾過法で濃縮し、
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し
た。ウシ血清ＩｇＧを除くために、透析物をヤギ抗ウシ
血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムに通した。次に
通過液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化
したプロテインＡ−セファロース４Ｂのカラムに充填し
た。カラムをｐＨ３．５の緩衝液で溶出して精製した抗
Ｘａ・ＴＦＰＩ抗体ＸＴ−１の溶液を得た。
【００２７】イン・ビボ法 プリスタン（２，６，１，１４−テトラメチルペンタデ
カン）０．５ｍｌを１０から１２週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系
マウスの腹腔内に投与後１４〜２０日目のマウス腹腔内
にインビトロで増殖させたハイブリドーマＸＴ−１をマ
ウス一匹あたり２×１０6 細胞となるように接種した。
各ハイブリドーマにつき一匹のマウスから約１０〜１５
ｍｌの腹水が得られた。その抗体濃度は、２〜１０ｍｇ
／ｍｌであった。腹水中のモノクローナル抗体の精製
（但し、ヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカ
ラムを通す操作は除く。）は、上記のインビトロ精製法
と同様の方法で行った。
カン）０．５ｍｌを１０から１２週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系
マウスの腹腔内に投与後１４〜２０日目のマウス腹腔内
にインビトロで増殖させたハイブリドーマＸＴ−１をマ
ウス一匹あたり２×１０6 細胞となるように接種した。
各ハイブリドーマにつき一匹のマウスから約１０〜１５
ｍｌの腹水が得られた。その抗体濃度は、２〜１０ｍｇ
／ｍｌであった。腹水中のモノクローナル抗体の精製
（但し、ヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカ
ラムを通す操作は除く。）は、上記のインビトロ精製法
と同様の方法で行った。
【００２８】実施例４．モノクローナル抗体の免疫グロ
ブリンクラス及び特異性の同定 抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体ＸＴ−１の免疫グ
ロブリン・クラス、及び特異性の同定は、各々オクテロ
ニー免疫拡散法、及びエンザイムイムノアッセイ法によ
り行った。その結果、モノクローナル抗体ＸＴ−１の免
疫グロブブリン・クラスは「ＩｇＧ2a」であった。ま
た、特異性はマウスの腹水の希釈列を用いて行った結果
を図１に示す。
ブリンクラス及び特異性の同定 抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体ＸＴ−１の免疫グ
ロブリン・クラス、及び特異性の同定は、各々オクテロ
ニー免疫拡散法、及びエンザイムイムノアッセイ法によ
り行った。その結果、モノクローナル抗体ＸＴ−１の免
疫グロブブリン・クラスは「ＩｇＧ2a」であった。ま
た、特異性はマウスの腹水の希釈列を用いて行った結果
を図１に示す。
【００２９】実施例５．ラテックス凝集免疫定量法 抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体によるラテックス
（日本合成ゴム社製、０．４９７μｍ）の感作は次のよ
うな操作で行った。モノクローナル抗体ＸＴ−１の濃度
が０．１ｍｇ／ｍｌの溶液１０ｍｌに、ラテックス濃度
が１％（ｗ／ｖ）になるようにラテックスを加え、２５
℃で１時間激しく撹拌した。次に、牛アルブミン溶液
（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．２ｍｌ添加し、２５℃で３０
分間激しく撹拌後、遠心分離（２００００×ｇ、３０分
間）を行う。沈渣を５０ｍｌの水に懸濁し、抗Ｘａ・Ｔ
ＦＰＩモノクローナル抗体感作ラテックス液を得た。
（日本合成ゴム社製、０．４９７μｍ）の感作は次のよ
うな操作で行った。モノクローナル抗体ＸＴ−１の濃度
が０．１ｍｇ／ｍｌの溶液１０ｍｌに、ラテックス濃度
が１％（ｗ／ｖ）になるようにラテックスを加え、２５
℃で１時間激しく撹拌した。次に、牛アルブミン溶液
（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．２ｍｌ添加し、２５℃で３０
分間激しく撹拌後、遠心分離（２００００×ｇ、３０分
間）を行う。沈渣を５０ｍｌの水に懸濁し、抗Ｘａ・Ｔ
ＦＰＩモノクローナル抗体感作ラテックス液を得た。
【００３０】上記抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体
に代えて、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体［ハイブリド
ーマＨＴＦＰＩ−Ｋ９（寄託番号：ＦＥＲＭ−Ｐ−１４
４６７）より得られたモノクローナル抗体］を用いて同
様の操作を行い、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体感作ラ
テックス液を得た。これらを以下のラテックス凝集反応
に用いた。上記の２種類の抗体感作ラテックス液を等量
混合し、この混合液ラテックスとＸａ・ＴＦＰＩを含む
検体とを混合して反応させ、分光学的に凝集反応速度を
ＬＰＩＡ−１００（商品名、三菱化学製）を用いて測定
した。エピトープを２個もつＸａ・ＴＦＰＩは凝集する
が、エピトープを１個しかもたないＸ及びＴＦＰＩは凝
集しないため、正確に検体中のＸａ・ＴＦＰＩを測定す
ることができた。図２にＸａ・ＴＦＰＩ濃度と凝集反応
速度との関係（検量線）を示す。
に代えて、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体［ハイブリド
ーマＨＴＦＰＩ−Ｋ９（寄託番号：ＦＥＲＭ−Ｐ−１４
４６７）より得られたモノクローナル抗体］を用いて同
様の操作を行い、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体感作ラ
テックス液を得た。これらを以下のラテックス凝集反応
に用いた。上記の２種類の抗体感作ラテックス液を等量
混合し、この混合液ラテックスとＸａ・ＴＦＰＩを含む
検体とを混合して反応させ、分光学的に凝集反応速度を
ＬＰＩＡ−１００（商品名、三菱化学製）を用いて測定
した。エピトープを２個もつＸａ・ＴＦＰＩは凝集する
が、エピトープを１個しかもたないＸ及びＴＦＰＩは凝
集しないため、正確に検体中のＸａ・ＴＦＰＩを測定す
ることができた。図２にＸａ・ＴＦＰＩ濃度と凝集反応
速度との関係（検量線）を示す。
【００３１】実施例６．ワンステップ・サンドイッチ酵
素免疫定量法 西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノ
クローナル抗体ＸＴ−１に結合させる方法は、ナカネ及
びカワオイ［ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・
アンド・サイトケミストリー 第２２巻 １０８４〜１
０９１頁（１９７４年）］の方法に準じて行った。この
酵素ラベル抗体を用いてＸａ・ＴＦＰＩのサンドイッチ
酵素免疫定量を次のようにして行った。
素免疫定量法 西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノ
クローナル抗体ＸＴ−１に結合させる方法は、ナカネ及
びカワオイ［ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・
アンド・サイトケミストリー 第２２巻 １０８４〜１
０９１頁（１９７４年）］の方法に準じて行った。この
酵素ラベル抗体を用いてＸａ・ＴＦＰＩのサンドイッチ
酵素免疫定量を次のようにして行った。
【００３２】抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体（前記実施
例５で用いたモノクローナル抗体）を２０ｍＭ炭酸緩衝
液中に１０μｇ／ｍｌの濃度にした溶液を、９６ウエル
平底型ポリスチレン製マイクロタイター・プレートに、
１００μｌ入れて２５℃で３０分間静置した。そのプレ
ートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む生理食塩水で
３回洗浄した。このようにして得た抗体を感作したプレ
ートのウエルに、５０μｌの被検体、及び上記で調製し
たペルオキシダーゼ標識抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナ
ル抗体、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、及び２％ウシアルブミ
ンを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００μ
ｌを加えた。
例５で用いたモノクローナル抗体）を２０ｍＭ炭酸緩衝
液中に１０μｇ／ｍｌの濃度にした溶液を、９６ウエル
平底型ポリスチレン製マイクロタイター・プレートに、
１００μｌ入れて２５℃で３０分間静置した。そのプレ
ートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む生理食塩水で
３回洗浄した。このようにして得た抗体を感作したプレ
ートのウエルに、５０μｌの被検体、及び上記で調製し
たペルオキシダーゼ標識抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナ
ル抗体、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、及び２％ウシアルブミ
ンを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００μ
ｌを加えた。
【００３３】２５℃で３０分間静置後、プレートを０．
０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む生理食塩水で３回洗浄し
た。次いで、酵素基質液（１０ｍＭフェノール、２０ｍ
Ｍ４−アミノアンチピリン、及び０．００５％ 過酸化
水素を含む液）２００μｌずつをプレートのそれぞれの
ウエルに添加した。２５℃で３０分反応後、各ウエルの
４９０ｎｍにおける吸光度をＭＰ−５９０型マイクロエ
ライザ・ミニリーダー（ダイナテック社製）で測定した
被検体中のＸａ・ＴＦＰＩの量は、同時に測定した検量
用複合体の４９０ｎｍにおける吸光度から描いた検量線
から求めた。図３にそのときの検量線を示す。
０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む生理食塩水で３回洗浄し
た。次いで、酵素基質液（１０ｍＭフェノール、２０ｍ
Ｍ４−アミノアンチピリン、及び０．００５％ 過酸化
水素を含む液）２００μｌずつをプレートのそれぞれの
ウエルに添加した。２５℃で３０分反応後、各ウエルの
４９０ｎｍにおける吸光度をＭＰ−５９０型マイクロエ
ライザ・ミニリーダー（ダイナテック社製）で測定した
被検体中のＸａ・ＴＦＰＩの量は、同時に測定した検量
用複合体の４９０ｎｍにおける吸光度から描いた検量線
から求めた。図３にそのときの検量線を示す。
【００３４】
【発明の効果】この発明は遊離のＴＦＰＩ、Ｘａとは反
応せず、Ｘａ・ＴＦＰＩに特異的に反応する抗Ｘａ・Ｔ
ＦＰＩモノクローナル抗体を新規に得、これを使用すれ
ば、上述の如く、Ｘａ・ＴＦＰＩを感度よく定量するこ
とができる。
応せず、Ｘａ・ＴＦＰＩに特異的に反応する抗Ｘａ・Ｔ
ＦＰＩモノクローナル抗体を新規に得、これを使用すれ
ば、上述の如く、Ｘａ・ＴＦＰＩを感度よく定量するこ
とができる。
【図１】抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体（ＸＴ−
１）のＸａ、ＴＦＰＩ及びＸａ・ＴＦＰＩとの結合力
を、抗原を直接９６ウエルマイクロタイター・プレート
にコートして、腹水中のＸＴ−１との反応性により、エ
ンザイムイムノアッセイ法で測定した結果を表すグラフ
図である。
１）のＸａ、ＴＦＰＩ及びＸａ・ＴＦＰＩとの結合力
を、抗原を直接９６ウエルマイクロタイター・プレート
にコートして、腹水中のＸＴ−１との反応性により、エ
ンザイムイムノアッセイ法で測定した結果を表すグラフ
図である。
【図２】ＬＰＩＡ−１００を用いて測定したラテックス
凝集反応速度とＸａ・ＴＦＰＩの濃度との検量線のグラ
フ図である。
凝集反応速度とＸａ・ＴＦＰＩの濃度との検量線のグラ
フ図である。
【図３】抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体を一次抗体と
し、抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体（ＸＴ−１）
を酵素標識二次抗体として行った、Ｘａ・ＴＦＰＩなど
のサンドイッチエンザイムイムノアッセイの結果を表す
グラフ図である。
し、抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体（ＸＴ−１）
を酵素標識二次抗体として行った、Ｘａ・ＴＦＰＩなど
のサンドイッチエンザイムイムノアッセイの結果を表す
グラフ図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 9282−4Ｂ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 久米田 幸介 熊本県玉名郡玉東町山口147−２ (72)発明者 神窪 勇一 熊本県熊本市八景水谷３−６−28 コーポ 渡辺内
Claims (3)
- 【請求項１】 ファクターＸａ・ティシュファクターパ
スウェイインヒビター複合体（Ｘａ・ＴＦＰＩ）と特異
的に反応するが、遊離のファクターＸ、遊離のファクタ
ーＸａ及び遊離のティシュファクターパスウェイインヒ
ビター（ＴＦＰＩ）とは反応しないモノクローナル抗
体。 - 【請求項２】 ファクターＸａ・ティシュファクターパ
スウェイインヒビター複合体で免疫した哺乳動物の脾臓
細胞と哺乳動物のミエローマ細胞との融合によって形成
され、Ｘａ・ＴＦＰＩと特異的に反応するが、遊離のフ
ァクターＸ、遊離のファクターＸａ及び遊離のＴＦＰＩ
とは反応しないモノクローナル抗体を分泌するハイブリ
ドーマまたはそれに由来する細胞株。 - 【請求項３】 請求項１記載のモノクローナル抗体を用
いることを特徴とする、ファクターＸａ・ティシュファ
クターパスウェイインヒビター複合体の免疫学的測定方
法。
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|---|---|---|---|
| JP33922995A JP3681206B2 (ja) | 1995-12-26 | 1995-12-26 | 抗ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体モノクローナル抗体及びその使用 |
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| EP96943313A EP0812859B1 (en) | 1995-12-26 | 1996-12-26 | ANTIFACTOR Xa-TISSUE FACTOR PATHWAY INHIBITOR COMPLEX MONOCLONAL ANTIBODY AND USE OF THE SAME |
| ES96943313T ES2168521T3 (es) | 1995-12-26 | 1996-12-26 | Anticuerpo monoclonal frente al complejo de factor xa-inhibidor de la via del factor tisular, y su uso. |
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Family
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| WO2016157513A1 (ja) * | 2015-04-03 | 2016-10-06 | 株式会社日立製作所 | 抗原抗体間相互作用量の同定法及び装置 |
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| PT3345615T (pt) * | 2010-03-01 | 2020-01-17 | Bayer Healthcare Llc | Anticorpos monoclonais otimizados contra inibidor da via do fator tecidual (tfpi) |
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-
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- 1995-12-26 JP JP33922995A patent/JP3681206B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-12-26 DE DE69619226T patent/DE69619226T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-26 AU AU12089/97A patent/AU706547B2/en not_active Ceased
- 1996-12-26 ES ES96943313T patent/ES2168521T3/es not_active Expired - Lifetime
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- 1996-12-26 KR KR1019970705837A patent/KR100249314B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1996-12-26 EP EP96943313A patent/EP0812859B1/en not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002316999A (ja) * | 2001-04-17 | 2002-10-31 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | モノクローナル抗体 |
| WO2016157513A1 (ja) * | 2015-04-03 | 2016-10-06 | 株式会社日立製作所 | 抗原抗体間相互作用量の同定法及び装置 |
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| KR100249314B1 (ko) | 2000-03-15 |
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