JPH029372A - 変異されたｈｉｖエンベロープタンパク質 - Google Patents
変異されたｈｉｖエンベロープタンパク質Info
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- JPH029372A JPH029372A JP1072022A JP7202289A JPH029372A JP H029372 A JPH029372 A JP H029372A JP 1072022 A JP1072022 A JP 1072022A JP 7202289 A JP7202289 A JP 7202289A JP H029372 A JPH029372 A JP H029372A
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- cells
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ＡＩＤＳウィルスに対するワクチン、ＡＩＤ
Ｓウィルスの改変、およびＡＩＤＳウィルスの成熟に必
要な細胞性プロテアーゼのインヒビターを発見するのに
有用なプローブに関する。
Ｓウィルスの改変、およびＡＩＤＳウィルスの成熟に必
要な細胞性プロテアーゼのインヒビターを発見するのに
有用なプローブに関する。
ＡＩＤＳウィルス（ヒト免疫不全ウィルス−ＨＩＶ）は
、世界中に人々にとってかなり脅威と考えられている。
、世界中に人々にとってかなり脅威と考えられている。
大部分は、該ウィルスの伝染を減らすための教育的およ
び予防的処置に向けられている。
び予防的処置に向けられている。
該ウィルスを配列決定し、種々の蛋白質を単離し、それ
らの蛍白質および複製に関与する遺伝子等に対する免疫
応答の性質を調べることにより、該ウィルスを研究する
のに多大な尽力が費やされている。該ウィルスの多様性
およびそれの感染のメカニズムのためにはかられたばく
大な努力にもかかわらず、該ウィルスについて本質的な
不確定性が依然として残っている。
らの蛍白質および複製に関与する遺伝子等に対する免疫
応答の性質を調べることにより、該ウィルスを研究する
のに多大な尽力が費やされている。該ウィルスの多様性
およびそれの感染のメカニズムのためにはかられたばく
大な努力にもかかわらず、該ウィルスについて本質的な
不確定性が依然として残っている。
このウィルスの致命的性質のために、該ウィルスに対す
る免疫保護を提供しようと多数の研究が行われている。
る免疫保護を提供しようと多数の研究が行われている。
多数のウィルス性蛋白質フラグメントがワクチンとして
提案されている。加えて、より最近になって、ＣＤ４配
列、すなわち該ウィルスに結合するＴ−細胞表面の膜タ
ンパク賞、に関連したベプチ、ドが感染を阻害すること
が提唱された。感染に伴う不確実性を予想して、感染か
らの保護を提供するために開発すべきワクチンに代わり
の手段の用意をすることが重要となる。おそらくより重
要なのは、人間に病気を引きおこすＨＩＶおよび特定の
レトロウィルスに対して有効な療法形式を見出すことが
必要になる。
提案されている。加えて、より最近になって、ＣＤ４配
列、すなわち該ウィルスに結合するＴ−細胞表面の膜タ
ンパク賞、に関連したベプチ、ドが感染を阻害すること
が提唱された。感染に伴う不確実性を予想して、感染か
らの保護を提供するために開発すべきワクチンに代わり
の手段の用意をすることが重要となる。おそらくより重
要なのは、人間に病気を引きおこすＨＩＶおよび特定の
レトロウィルスに対して有効な療法形式を見出すことが
必要になる。
ＣＤ４とＨＩＶエンベロープタンパク賞との間の特異的
相互作用は、Ｄａｌｇｌｅｉｓｈら、Ｎａ Ｌｕｒｅ（
１９８４） ３１２ニア６３ ７６７； Ｋｌａｔｚ
ｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４） ３１２
： ７６７−７６８ Ｇ ＭｃＤｏｕｇａｌ ら
、 ５ｃｉｅｎｃｅ（１９８６）谷狭： ３８２−３８
５により報告されている。該エンベロープタンパク譬前
駆体ｇｐ１６０からｇｐ１２０／ｇｐ４１への開裂およ
び、ウィルス膜または感染された標的細胞の原形質膜へ
の輸送は、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、Ｎａｔｕｒｅ
（１９８６） ３２０ ： ５３５−５３７ ； Ｈｕ
ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６） ３２０ ： ５３７−
５４０ ； Ｒｏｂｅｙら、５ｃｉｅｎｃｅ （１９８
５）２２８ ： ５９３−５９５ ；および、Ｖｅｒｏ
ｎｅｓｅら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８５）擾現： １４
０２−１４０５により記載されている。
相互作用は、Ｄａｌｇｌｅｉｓｈら、Ｎａ Ｌｕｒｅ（
１９８４） ３１２ニア６３ ７６７； Ｋｌａｔｚ
ｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４） ３１２
： ７６７−７６８ Ｇ ＭｃＤｏｕｇａｌ ら
、 ５ｃｉｅｎｃｅ（１９８６）谷狭： ３８２−３８
５により報告されている。該エンベロープタンパク譬前
駆体ｇｐ１６０からｇｐ１２０／ｇｐ４１への開裂およ
び、ウィルス膜または感染された標的細胞の原形質膜へ
の輸送は、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、Ｎａｔｕｒｅ
（１９８６） ３２０ ： ５３５−５３７ ； Ｈｕ
ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６） ３２０ ： ５３７−
５４０ ； Ｒｏｂｅｙら、５ｃｉｅｎｃｅ （１９８
５）２２８ ： ５９３−５９５ ；および、Ｖｅｒｏ
ｎｅｓｅら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８５）擾現： １４
０２−１４０５により記載されている。
生産的感染を導く融合は、エンドサイト−シスさ−３４
８）または原形質膜（５ｔａｉｎら、釦旦（１９８７）
４９ ： ６５９−６６８）で起こる。続いて、エンベ
ロープタンパク質−依存性の形式において、感染された
細胞と非感染の標的細胞との間の融合が起こり、多核性
巨細胞の形成および細胞壊死を導＜ ＣＬｉｆｓｏｎら
、５ｃｉｅｎｃｅ （１９８６） ２３２ ： １１２
３ １１２７ ： Ｌｉｆｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ （
１９８６） ３２３ ： ７２５ ７２８ ） 、レト
ロウィルスのエンベロープタンパク質の一般的概論につ
いては、Ｗｅｉｓｓら編（１９８４） Ｔｈｅ Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ。
８）または原形質膜（５ｔａｉｎら、釦旦（１９８７）
４９ ： ６５９−６６８）で起こる。続いて、エンベ
ロープタンパク質−依存性の形式において、感染された
細胞と非感染の標的細胞との間の融合が起こり、多核性
巨細胞の形成および細胞壊死を導＜ ＣＬｉｆｓｏｎら
、５ｃｉｅｎｃｅ （１９８６） ２３２ ： １１２
３ １１２７ ： Ｌｉｆｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ （
１９８６） ３２３ ： ７２５ ７２８ ） 、レト
ロウィルスのエンベロープタンパク質の一般的概論につ
いては、Ｗｅｉｓｓら編（１９８４） Ｔｈｅ Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ。
ｏｆ Ｔｕ−ｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ、 第２版、第■
巻： ＲＮＡ ＴｕｍｏｒＶｉｒｕｓｅｓ、 Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ ： Ｃｏ１ｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを
参照のこと。
巻： ＲＮＡ ＴｕｍｏｒＶｉｒｕｓｅｓ、 Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ ： Ｃｏ１ｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを
参照のこと。
センダイウィルス（パラミクソウィルス）およびインフ
ルエンザウィルス（オルソミクソウィルス）に間する研
究において、エンベロープタンパク質前駆体の内因性タ
ンパク質分解による開裂の不在下では、ウィルスは生産
されるけれども感染性を有さず；センダイウィルスの場
合には、もはや巨細胞形成が起こらない（Ｈｏｍｍａお
よび０ｈｕｃｈｉ＋Ｃｈｏｐｐｉｎ、 狙工虹」ホ（１
９７４） ５７ ： ４７５ ４９０ ； Ｋｌｅｎｋ
ら、對工虹」■（１９７５） ６８ ： ４２６−４３
９ ； ＬａｚａｒｏｗｉｔｚおよびＣｈｏｐｐｉｎ、
■匹圏■（１９７５） ６８ ： ４４０−４５４；
５ｃｈｅｉｄおよびＣｈｏｐｐｉｎ、 ｎ皿圏■（１９
７６） ６９ ： ２６５−２７７ ３゜ ＲＩＰ７は完全なＨＩＶレトロウィルスを有する（Ｆｉ
ｓｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ （１９８６） ３２０ ：
３６７−３７１ ； Ｆｅｉｎ−ｂｅｒｇら、Ｃｅ１
ｌ （１９８６）並： ８０７−８１７ ：ｌ 。
ルエンザウィルス（オルソミクソウィルス）に間する研
究において、エンベロープタンパク質前駆体の内因性タ
ンパク質分解による開裂の不在下では、ウィルスは生産
されるけれども感染性を有さず；センダイウィルスの場
合には、もはや巨細胞形成が起こらない（Ｈｏｍｍａお
よび０ｈｕｃｈｉ＋Ｃｈｏｐｐｉｎ、 狙工虹」ホ（１
９７４） ５７ ： ４７５ ４９０ ； Ｋｌｅｎｋ
ら、對工虹」■（１９７５） ６８ ： ４２６−４３
９ ； ＬａｚａｒｏｗｉｔｚおよびＣｈｏｐｐｉｎ、
■匹圏■（１９７５） ６８ ： ４４０−４５４；
５ｃｈｅｉｄおよびＣｈｏｐｐｉｎ、 ｎ皿圏■（１９
７６） ６９ ： ２６５−２７７ ３゜ ＲＩＰ７は完全なＨＩＶレトロウィルスを有する（Ｆｉ
ｓｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ （１９８６） ３２０ ：
３６７−３７１ ； Ｆｅｉｎ−ｂｅｒｇら、Ｃｅ１
ｌ （１９８６）並： ８０７−８１７ ：ｌ 。
バラミクソウィルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｊｒｉｄａ
ｅ）とオルソミクソウィルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖ
ｉｒｉｄａｅ）の塘タンパク質間の構造類似性が肺ｉｔ
ｅら、Ｑｕａｒｔ、Ｒｅｖ。
ｅ）とオルソミクソウィルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖ
ｉｒｉｄａｅ）の塘タンパク質間の構造類似性が肺ｉｔ
ｅら、Ｑｕａｒｔ、Ｒｅｖ。
戊堕上瓦び工（１９８３）■し１５１−１９５により提
唱されている。Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ （１９
８１） ２８９：３６６ ３７３もまた参照のこと。
唱されている。Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ （１９
８１） ２８９：３６６ ３７３もまた参照のこと。
［発明の要約〕
生体外ｇｐ１６０突然変異誘発のだめのＤＮＡ配列を含
んで成る新規ＤＮＡ構成物、突然変異誘発されたＨＩＶ
ｇｐ１６０の配列、突然変異誘発されたＨＩＶｇｐ１
６０を含んで成る構成物、それの発現生成物、該発現生
成物をそれら自体でまたは他のタンパク質と共に調製す
る方法、並びにワクチンとして１イ、び秘ｇｐ１６０の
内因性タンパク譬分解性開裂、含まれるプロテアーゼお
よびそれのインヒビターの研究のためのプローブとして
の該生成物の利用が提供される。
んで成る新規ＤＮＡ構成物、突然変異誘発されたＨＩＶ
ｇｐ１６０の配列、突然変異誘発されたＨＩＶｇｐ１
６０を含んで成る構成物、それの発現生成物、該発現生
成物をそれら自体でまたは他のタンパク質と共に調製す
る方法、並びにワクチンとして１イ、び秘ｇｐ１６０の
内因性タンパク譬分解性開裂、含まれるプロテアーゼお
よびそれのインヒビターの研究のためのプローブとして
の該生成物の利用が提供される。
ＡＩＤＳと称しＨＩＶに関連性のある病気の病因を解明
する手助けのための方法および組成物が、ワクチンとし
て、療法のためのプローブとして等の利用のために提供
される。この方法および組成物は、ＨＩ Ｖｌタンパク
質の突然変異誘発を使って、該ウィルスのその他の正確
な会合を許容しながら、糖非タンパク’ｉ ｇｐ１６０
の内因性タンパク質分解による開裂を防ぐものである。
する手助けのための方法および組成物が、ワクチンとし
て、療法のためのプローブとして等の利用のために提供
される。この方法および組成物は、ＨＩ Ｖｌタンパク
質の突然変異誘発を使って、該ウィルスのその他の正確
な会合を許容しながら、糖非タンパク’ｉ ｇｐ１６０
の内因性タンパク質分解による開裂を防ぐものである。
ポリタンパク質ｇｐ１６０がプロセスされないように、
推定上の内因性タンパク質分解性プロセシング部位の領
域内の核酸を変更することにより、変異されたウィルス
が得られ、このウィルスは非−感染的であるけれども、
実質的に野生型と同じエピトープを示す。さらに、この
変異されたｇｐ１６０は、正常にはｇｐ１６０のタンパ
ク譬分解に関与する細胞内プロテアーゼを局在化するの
に利用され得る。−度局在化されれば、このプロテアー
ゼのインヒビターが発見または指摘できる。そのような
プロテアーゼインヒビターは、ＨＩ Ｖによる感染に対
する臨床上の有効性について評価され得る。
推定上の内因性タンパク質分解性プロセシング部位の領
域内の核酸を変更することにより、変異されたウィルス
が得られ、このウィルスは非−感染的であるけれども、
実質的に野生型と同じエピトープを示す。さらに、この
変異されたｇｐ１６０は、正常にはｇｐ１６０のタンパ
ク譬分解に関与する細胞内プロテアーゼを局在化するの
に利用され得る。−度局在化されれば、このプロテアー
ゼのインヒビターが発見または指摘できる。そのような
プロテアーゼインヒビターは、ＨＩ Ｖによる感染に対
する臨床上の有効性について評価され得る。
ポリタンパク質である糖タンパク譬ｇｐ１６０は、生成
するサブユニットｇｐ１２０（左側）およびｇｐ４１（
右側）に分割する内因性タンパク質分解性開裂部位の付
近に次のアミノ酸配列： を介することを特徴とする。配列中の矢印は潜在的なト
リプシン開裂部位を示している。該開裂部位領域のアミ
ノ酸をコードしているＤＮＡを種々様々な方法で変更で
きる。好ましくは、該開裂部位領域のアミノ酸を、もは
や内因性タンパク賞分解による開裂を受けないように置
換し、ここで認識部位に関与するアミノ酸のうちの１つ
（又は複数）を除去するか、または認識部位に関与する
アミノ酸の間に１つまたは複数のアミノ酸を挿入するこ
とができる。従って、コードしているＤ Ｎ Ａの欠失
、挿入または置換は、オープンリーディングフレームが
保存される限り、１または複数の塩基対を包含するだろ
う。
するサブユニットｇｐ１２０（左側）およびｇｐ４１（
右側）に分割する内因性タンパク質分解性開裂部位の付
近に次のアミノ酸配列： を介することを特徴とする。配列中の矢印は潜在的なト
リプシン開裂部位を示している。該開裂部位領域のアミ
ノ酸をコードしているＤＮＡを種々様々な方法で変更で
きる。好ましくは、該開裂部位領域のアミノ酸を、もは
や内因性タンパク賞分解による開裂を受けないように置
換し、ここで認識部位に関与するアミノ酸のうちの１つ
（又は複数）を除去するか、または認識部位に関与する
アミノ酸の間に１つまたは複数のアミノ酸を挿入するこ
とができる。従って、コードしているＤ Ｎ Ａの欠失
、挿入または置換は、オープンリーディングフレームが
保存される限り、１または複数の塩基対を包含するだろ
う。
変異は少な（とも１コドン、普通約８コドン以下、より
普通には約６コドン以下を含むことができる。便利には
、欠失および挿入のために用意することができ、該開裂
部位をコードするコドンの中または直前の単一の塩基対
を除去し、変更されたリーディングフレームが終止コド
ンを含まない限りでリーディングフレームを変更し、そ
してその後で１つの塩基対を挿入して前のリーディング
フレームを回復させる。
普通には約６コドン以下を含むことができる。便利には
、欠失および挿入のために用意することができ、該開裂
部位をコードするコドンの中または直前の単一の塩基対
を除去し、変更されたリーディングフレームが終止コド
ンを含まない限りでリーディングフレームを変更し、そ
してその後で１つの塩基対を挿入して前のリーディング
フレームを回復させる。
また、トランジションまたはトランスバージボンによっ
ても塩基対が置換され得、この場合には突然変異がサイ
レントミューチージョンではない。
ても塩基対が置換され得、この場合には突然変異がサイ
レントミューチージョンではない。
好ましくは、配列の変更が同じアミノ酸数を保持したま
まで、開裂部位のアミノ酸配列の変更をもたらすもので
ある０例えば、該開裂部位は正に荷電したアミノ酸を含
むので、中性アミノ酸、例えば非極性アミノ酸を包含す
る脂肪族アミノ酸、Ｇ。
まで、開裂部位のアミノ酸配列の変更をもたらすもので
ある０例えば、該開裂部位は正に荷電したアミノ酸を含
むので、中性アミノ酸、例えば非極性アミノ酸を包含す
る脂肪族アミノ酸、Ｇ。
Ａ、Ｐ、Ｖ、ＬおよびＩ；ヘテロ原子含有アミノ酸、Ｃ
，Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ；負に荷電したアミノ酸、Ｄ、Ｅ
、および芳香族アミノ酸、Ｆ、Ｈ。
，Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ；負に荷電したアミノ酸、Ｄ、Ｅ
、および芳香族アミノ酸、Ｆ、Ｈ。
Ｗ、Ｙ等の他のアミノ酸が利用できる。また、該開裂部
位の付近の別の正に荷電したアミノ酸の配列を変更する
こともできる。望ましくは、この変更が、ｇｐ１２０お
よびｇｐ４１を模倣するためのｇｐ１６０タンパク賞の
正しい折りたたみに支障のない配列変化をもたらすだろ
う。
位の付近の別の正に荷電したアミノ酸の配列を変更する
こともできる。望ましくは、この変更が、ｇｐ１２０お
よびｇｐ４１を模倣するためのｇｐ１６０タンパク賞の
正しい折りたたみに支障のない配列変化をもたらすだろ
う。
便宜上、改変された塩基対の領域に１つまたは複数の新
規な制限エンドヌクレアーゼ部位を導入することが望ま
れるかもしれない、そのような制限部位の存在は、多数
の操作上の利点を提供する。
規な制限エンドヌクレアーゼ部位を導入することが望ま
れるかもしれない、そのような制限部位の存在は、多数
の操作上の利点を提供する。
第一に、ゲル電気泳動を使ったフラグメントの制限マツ
ピンクにより所望の変異があるかどうかを迅速に決定で
きる。加えて、変異部位の付近に且つ隣接して２つの制
限部位があれば、該遺伝子を消化し、そして生じた２本
のアームをアダプターを用いて再連結せしめることによ
り、その領域を他の配列と容易に交換することができる
。従って、該開裂部位のアミノ酸を色々に変更しそして
該変質の利用を可能にすることができる。
ピンクにより所望の変異があるかどうかを迅速に決定で
きる。加えて、変異部位の付近に且つ隣接して２つの制
限部位があれば、該遺伝子を消化し、そして生じた２本
のアームをアダプターを用いて再連結せしめることによ
り、その領域を他の配列と容易に交換することができる
。従って、該開裂部位のアミノ酸を色々に変更しそして
該変質の利用を可能にすることができる。
問題のＤＮＡ組成物は種々の方法で調製され得る。便利
には、天然のｇｐ１６０遺伝子を特定のＨＩ３株から単
離し、そして部位変異的オリゴヌクレオチド介在突然変
異誘発用の一本積ファージベクターに挿入することがで
きる。第二のブライマーが変異誘発されたオリゴヌクレ
オチド配列を存する“二重ブライマー”法を使うことに
より、変異誘発された遺伝子を得ることができる。また
、該開裂部位領域をコードするコドンを括弧でくくる（
ｂｒａｃｋｅｔｉｎｇ）ユニーク制限部位を同様にして
野生型ＤＮＡ配列に導入し；次いでこれらを消化し、そ
して生じた２つの末端を、所望の変異配列をコードする
アダプターにより連結せしめてもよい。
には、天然のｇｐ１６０遺伝子を特定のＨＩ３株から単
離し、そして部位変異的オリゴヌクレオチド介在突然変
異誘発用の一本積ファージベクターに挿入することがで
きる。第二のブライマーが変異誘発されたオリゴヌクレ
オチド配列を存する“二重ブライマー”法を使うことに
より、変異誘発された遺伝子を得ることができる。また
、該開裂部位領域をコードするコドンを括弧でくくる（
ｂｒａｃｋｅｔｉｎｇ）ユニーク制限部位を同様にして
野生型ＤＮＡ配列に導入し；次いでこれらを消化し、そ
して生じた２つの末端を、所望の変異配列をコードする
アダプターにより連結せしめてもよい。
内因性タンパク譬分解性開裂部位のアミノ酸配列を変え
るように突然変異誘発部位を導入する特定の様式は、該
遺伝子が突然変異誘発されそして突然変異誘発された鎖
がオーブンリーディングフレームを保持している限り、
本発明にとって限定的でない。
るように突然変異誘発部位を導入する特定の様式は、該
遺伝子が突然変異誘発されそして突然変異誘発された鎖
がオーブンリーディングフレームを保持している限り、
本発明にとって限定的でない。
便利には、−本積ファージのオリゴヌクレオチド介在生
体外突然変異誘発を用いる場合、得られるヘテロ二本鎖
を修復−欠損宿主（μ＋ｔＬ）中に形質転換し、そして
ｒｅｃ Ａローン細胞上で増殖させ、プラーク選択する
ことができる。
体外突然変異誘発を用いる場合、得られるヘテロ二本鎖
を修復−欠損宿主（μ＋ｔＬ）中に形質転換し、そして
ｒｅｃ Ａローン細胞上で増殖させ、プラーク選択する
ことができる。
次いでトランスフェクトされたＤＮＡを単離し、そして
突然変異誘発された鎖の存在について分析する。複製型
のファージを単離し、遺伝子を切り取す、クローニング
し、そして分析して所望の損傷の存在を１ｉＩ認する。
突然変異誘発された鎖の存在について分析する。複製型
のファージを単離し、遺伝子を切り取す、クローニング
し、そして分析して所望の損傷の存在を１ｉＩ認する。
生じた遺伝子は、天然ｇｐ１６０のアミノ酸の普通中な
くとも約９５％、より普通には少なくとも約９８％をコ
ードしているであろう。
くとも約９５％、より普通には少なくとも約９８％をコ
ードしているであろう。
変異されたｇｐ１６０遺伝子は、哺乳類宿主へのトラン
スフェクションのために、ベクター、特に非−溶菌性ベ
クターに移入される。遺伝子の効率的発現のために用意
されるであろう、どんな便利な哺乳類宿主でも使用でき
る。加えて、天然タンパク質の翻訳後プロセシングに最
も密接に接近するように、発現生成物のグリコジル化を
有することが望ましいであろう０便利な細胞系は、ＣＯ
５−１細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞等を包含する。
スフェクションのために、ベクター、特に非−溶菌性ベ
クターに移入される。遺伝子の効率的発現のために用意
されるであろう、どんな便利な哺乳類宿主でも使用でき
る。加えて、天然タンパク質の翻訳後プロセシングに最
も密接に接近するように、発現生成物のグリコジル化を
有することが望ましいであろう０便利な細胞系は、ＣＯ
５−１細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞等を包含する。
この発現生成物は、ワクチンとして利用され得る。この
発現生成物は、あらゆる便利な宿主、特に哺乳類宿主に
おいて調製され得るが、原核または真核性の微生物宿主
を使うこともできる。例えば、Ｅ、コリ、酵母、例えば
Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、タルイベロマイセス（ｕ」
μ工１匹競）、例えばラクチスまたはフラギリス、アカ
パンカビ（７）、アスペルギルス（Ａｓ ｅｒ １ｌｌ
ｕｓ）等である。該タンパク質は分泌されるかまたは細
胞質中に保持され、常法に従って単離され、実質上完全
な純度（〉９５％純度）まで精製され、そしてワクチン
注射のために使用され得る。
発現生成物は、あらゆる便利な宿主、特に哺乳類宿主に
おいて調製され得るが、原核または真核性の微生物宿主
を使うこともできる。例えば、Ｅ、コリ、酵母、例えば
Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、タルイベロマイセス（ｕ」
μ工１匹競）、例えばラクチスまたはフラギリス、アカ
パンカビ（７）、アスペルギルス（Ａｓ ｅｒ １ｌｌ
ｕｓ）等である。該タンパク質は分泌されるかまたは細
胞質中に保持され、常法に従って単離され、実質上完全
な純度（〉９５％純度）まで精製され、そしてワクチン
注射のために使用され得る。
好ましくは、内因性タンパク譬分解による開裂をブロッ
クする変異の検出のために、変異用オリゴヌクレオチド
が、実質的に完全な複製可能なウィルス、即ぢ機能的な
ｐｍ、ｔｉ 、ｓｃ匡、お四および産道公子を有し、そ
して完全なＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅ
ｐｅａｔ）もまた有するもの、を改変せしめるのに利用
されるだろう。これは、ｅｎｖ遺伝子の突然変異された
部分を含むＤＮＡ断片を野生型ＨＩ Ｖウィルスゲノム
に導入することにより達成され得、ここで該ウィルスケ
゛ツムは、生産されたＨＩＶウィルス粒子が感染性であ
るか否かに左右されずＨＩＶゲノムの複製を引き起こす
ことのできるベクターの部分である。多数のＨＩＶ株が
、哺乳類へのトランスフェクション用に、機能的な非依
存性複製系を有するベクター中に挿入されている。一般
に、該ベクターはウィルスの復製系、例えばＳν４０複
製系、アデノウィルス複製系、ウシ乳頭腫ウィルス複製
系等ををする。
クする変異の検出のために、変異用オリゴヌクレオチド
が、実質的に完全な複製可能なウィルス、即ぢ機能的な
ｐｍ、ｔｉ 、ｓｃ匡、お四および産道公子を有し、そ
して完全なＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅ
ｐｅａｔ）もまた有するもの、を改変せしめるのに利用
されるだろう。これは、ｅｎｖ遺伝子の突然変異された
部分を含むＤＮＡ断片を野生型ＨＩ Ｖウィルスゲノム
に導入することにより達成され得、ここで該ウィルスケ
゛ツムは、生産されたＨＩＶウィルス粒子が感染性であ
るか否かに左右されずＨＩＶゲノムの複製を引き起こす
ことのできるベクターの部分である。多数のＨＩＶ株が
、哺乳類へのトランスフェクション用に、機能的な非依
存性複製系を有するベクター中に挿入されている。一般
に、該ベクターはウィルスの復製系、例えばＳν４０複
製系、アデノウィルス複製系、ウシ乳頭腫ウィルス複製
系等ををする。
ベクターへのＨＩＶ配列の挿入に利用でき、そして哺乳
類宿主内での安定な複製のために用意することのできる
多数のベクターが開発されている。
類宿主内での安定な複製のために用意することのできる
多数のベクターが開発されている。
複製および発現を提供することに加えて、ベクターは他
の機能、例えば原核生物内、特に大腸菌（４延）内で機
能的な複製系、並びに原核生物宿主および／または真核
生物宿主中での選択を可能にする１つもしくは複数のマ
ーカーを有する。
の機能、例えば原核生物内、特に大腸菌（４延）内で機
能的な複製系、並びに原核生物宿主および／または真核
生物宿主中での選択を可能にする１つもしくは複数のマ
ーカーを有する。
正常なヒトまたは他の哺乳類の細胞もしくは細胞系への
プラスミドのトランスフェクションの際には、該プラス
ミドベクターは、ＨＩＶの復製、ＲＮＡプロセシング、
タンパク質の翻訳および会合を生じさせるために機能的
な複製系を利用する。
プラスミドのトランスフェクションの際には、該プラス
ミドベクターは、ＨＩＶの復製、ＲＮＡプロセシング、
タンパク質の翻訳および会合を生じさせるために機能的
な複製系を利用する。
しかしながら、変異されたｇｐ１６０タンパク質を使っ
て、該ウィルスをＴ−リンパ芽球様細胞系にトランスフ
ェクトするか、またはＴ−リンパ芽球様細胞系もしくは
正常Ｔ−ヘルパー細胞と共に非−Ｔｍ細胞真核宿主を同
時培養する時、感染性のＨＩＶで観察される巨細胞形成
および二次感染のパターンが欠けている。上清中の最初
の逆転写酵素のピークは、親の野生型ＨＩＶと同様に、
トランスフェクション後２日目に観察される。従って、
変異したウィルス粒子は、許容細胞を感染せしめる能力
、並びに感染細胞と非感染細胞との間の巨細胞形成の潜
在能力を欠くらしいが、一方、ウィルスの複製および会
合に関連する他の機能を果たすことは可能である。
て、該ウィルスをＴ−リンパ芽球様細胞系にトランスフ
ェクトするか、またはＴ−リンパ芽球様細胞系もしくは
正常Ｔ−ヘルパー細胞と共に非−Ｔｍ細胞真核宿主を同
時培養する時、感染性のＨＩＶで観察される巨細胞形成
および二次感染のパターンが欠けている。上清中の最初
の逆転写酵素のピークは、親の野生型ＨＩＶと同様に、
トランスフェクション後２日目に観察される。従って、
変異したウィルス粒子は、許容細胞を感染せしめる能力
、並びに感染細胞と非感染細胞との間の巨細胞形成の潜
在能力を欠くらしいが、一方、ウィルスの複製および会
合に関連する他の機能を果たすことは可能である。
目的のウィルス粒子は、特にワクチンとして利用するこ
とができる。エンベロープおよびカプシドに関与するタ
ンパク質は、ｇｐｉ６ｏの内因性タンパク質分解性開裂
部位における相違を除いて野生型と同じであり、宿主免
疫機構に提示されるエピトープは、大部分は、野生型ウ
ィルスにより提示されるものと同じであろう。その点で
、宿主免疫機構は、細胞性応答も体液性応答も共に据え
つけることにより、弱毒化されたウィルスに対して応答
することが可能であろう。何故なら、弱毒化されたウィ
ルスのタンパク質は抗原−提示細胞により消化され、そ
れによりＣＤ４もＣＤ８も共に複雑になるからである。
とができる。エンベロープおよびカプシドに関与するタ
ンパク質は、ｇｐｉ６ｏの内因性タンパク質分解性開裂
部位における相違を除いて野生型と同じであり、宿主免
疫機構に提示されるエピトープは、大部分は、野生型ウ
ィルスにより提示されるものと同じであろう。その点で
、宿主免疫機構は、細胞性応答も体液性応答も共に据え
つけることにより、弱毒化されたウィルスに対して応答
することが可能であろう。何故なら、弱毒化されたウィ
ルスのタンパク質は抗原−提示細胞により消化され、そ
れによりＣＤ４もＣＤ８も共に複雑になるからである。
かくして、強い免疫応答が達せられるであろう。
トランスフェクトされた細胞を、弱毒化されたウィルス
の増殖源として使うことができる。細胞を増殖し、トラ
ンスフェクトし、そして該細胞中でウィルスを復製およ
び繁殖させる。次いでウィルスを単離し、続いて精製し
て宿主細胞に関連する核酸、タンパク質およびａｔの全
てを実買上取り除く。そして該ウィルスをワクチンとし
て使用する。
の増殖源として使うことができる。細胞を増殖し、トラ
ンスフェクトし、そして該細胞中でウィルスを復製およ
び繁殖させる。次いでウィルスを単離し、続いて精製し
て宿主細胞に関連する核酸、タンパク質およびａｔの全
てを実買上取り除く。そして該ウィルスをワクチンとし
て使用する。
また、変異されたｇｐ１６０エンベロープをコードして
いるサブゲノム領域は、高−発現性真核宿主内部のウィ
ルス残余物、例えば、ＬＴＲ、エンベロープおよびｔａ
ｔ領域を保持しているが機能的な工土工および！±遺伝
子を欠いているＨＩＶ欠失変異体、例えばｌｌＸＢ２．
Ｒ／ＣＰ１等から単離され得る。そのような構成物が
ヒトの細胞、例えばＨｅＬａ細胞にトランスフェクトさ
れると、ウィルス粒子の不在下において変異されたｇｐ
１６０の高レベルの発現をもたらすであろう。−度精製
されれば、変異タンパク質は中和抗体応答を誘発せしめ
るのに役立つであろう。
いるサブゲノム領域は、高−発現性真核宿主内部のウィ
ルス残余物、例えば、ＬＴＲ、エンベロープおよびｔａ
ｔ領域を保持しているが機能的な工土工および！±遺伝
子を欠いているＨＩＶ欠失変異体、例えばｌｌＸＢ２．
Ｒ／ＣＰ１等から単離され得る。そのような構成物が
ヒトの細胞、例えばＨｅＬａ細胞にトランスフェクトさ
れると、ウィルス粒子の不在下において変異されたｇｐ
１６０の高レベルの発現をもたらすであろう。−度精製
されれば、変異タンパク質は中和抗体応答を誘発せしめ
るのに役立つであろう。
ワクチンとして、該ウィルスは種々の形式、例えば皮下
、筋肉内、腹腔内等において投与され得る。該ウィルス
は、生理学上許容される媒体、例えば塩溶液、リン酸緩
衝化塩溶液等中に配合され得る。その濃度は、投与の形
式、例えば注射の回数、注射の位置等に依存して、大幅
に変化し得る。
、筋肉内、腹腔内等において投与され得る。該ウィルス
は、生理学上許容される媒体、例えば塩溶液、リン酸緩
衝化塩溶液等中に配合され得る。その濃度は、投与の形
式、例えば注射の回数、注射の位置等に依存して、大幅
に変化し得る。
注射されるウィルスの量は、観察される応答に依存して
経験的に決定されよう。
経験的に決定されよう。
このワクチンは、免疫応答を増強せしめるために種々の
アジュバントと共に投与され得る。様々なアジュバント
が知られており、そしであるものは投与の形式、ワクチ
ン等に関して他のものに比較した場合に好都合であろう
。
アジュバントと共に投与され得る。様々なアジュバント
が知られており、そしであるものは投与の形式、ワクチ
ン等に関して他のものに比較した場合に好都合であろう
。
ワクチンとしての利用に加えて、変異されたｇｐ１６０
は、野生型ｇｐ１６０の内因性タンパク質分解性開裂を
行うことのできるプロテアーゼを同定するためのプロー
ブとしても利用できる。これらのプロテアーゼは、ウィ
ルスで感染された宿主細胞の内因性生産物であり、そし
ておそら（分泌経路の個々側々の行程で区分されるだろ
う、 ｇｐ１６０は、細胞内のウィルス成熟過程の間
にこの行程を通過するので、開裂後にヘテロニ量体ｇｐ
１６０／ｇｐ４１が形成される。変異されたｇｐ１６０
はこのプロテアーゼと結合することができるが開裂され
ず、野生型ｇｐ１６０のための競合的インヒビターを提
供し得る。
は、野生型ｇｐ１６０の内因性タンパク質分解性開裂を
行うことのできるプロテアーゼを同定するためのプロー
ブとしても利用できる。これらのプロテアーゼは、ウィ
ルスで感染された宿主細胞の内因性生産物であり、そし
ておそら（分泌経路の個々側々の行程で区分されるだろ
う、 ｇｐ１６０は、細胞内のウィルス成熟過程の間
にこの行程を通過するので、開裂後にヘテロニ量体ｇｐ
１６０／ｇｐ４１が形成される。変異されたｇｐ１６０
はこのプロテアーゼと結合することができるが開裂され
ず、野生型ｇｐ１６０のための競合的インヒビターを提
供し得る。
野生型のウィルス構成物と、エンドプロテアーゼのため
の競合的インヒビターとして働（ことのできる変異され
たウィルス構成物とを宿主細胞に同時にトランスフェク
トすることにより、エンドプロテアーゼを溶解物中に単
離し、次いでこれを分別することができる。エンド１０
テアーゼと結合する親和性を提供するために、変異され
たｇｐ１６０を修飾してもよく、ここで変異されたｇｐ
１６０／エンドプロテアーゼ接合体を単離するためにｇ
ｐ１６０に対する抗体を利用することができる。
の競合的インヒビターとして働（ことのできる変異され
たウィルス構成物とを宿主細胞に同時にトランスフェク
トすることにより、エンドプロテアーゼを溶解物中に単
離し、次いでこれを分別することができる。エンド１０
テアーゼと結合する親和性を提供するために、変異され
たｇｐ１６０を修飾してもよく、ここで変異されたｇｐ
１６０／エンドプロテアーゼ接合体を単離するためにｇ
ｐ１６０に対する抗体を利用することができる。
下記の例は実例として提示されるのであり、限定として
ではない。
ではない。
ＲＩＰ７は、親のベクターＳＰ６５ｇｐ を内部に、生
物学的に活性なＨＩＶプロウィルスクローン（ＨＸＢ２
）を有する；加えて、それはＣＯ５−１細胞中での繁殖
のためのＳＶ４０複製開始点、真核細胞中での優性選択
のための…且遺公子、並びにＥ、コリ中での繁殖のだめ
のｐＢＲｏｒｉおよび鰹耐性遺伝子をコードする。これ
をＣＯ５−１細胞、ヒトＴ−細胞系またはＨｅＬａ細胞
中にトランスフェクトした時、感染性で細胞変性性のＨ
ＩＶウィルスを生ぜしめる。該ウィルスの複製、ＲＮＡ
プロセッシング、タンパク賞翻訳およびウィルス粒子の
会合は、ＨＩＶそれ自身のものと識別不能である。逆転
写酵素（ＲＴ）活性は、２日目までの上清においてピー
クがあり、そして次いで低下することが認められる。
ＣＤ４’ ＶＢ細胞（ヒトのＴ−リンパ腫細胞系）と
ＲＩＰ７でトランスフェクトされたｃｏｓａ＋胞との同
時培養は、二次感染、ウィルス複製のさらなる循環、お
よび上清のＲＴ活性の増加をもたらす。
物学的に活性なＨＩＶプロウィルスクローン（ＨＸＢ２
）を有する；加えて、それはＣＯ５−１細胞中での繁殖
のためのＳＶ４０複製開始点、真核細胞中での優性選択
のための…且遺公子、並びにＥ、コリ中での繁殖のだめ
のｐＢＲｏｒｉおよび鰹耐性遺伝子をコードする。これ
をＣＯ５−１細胞、ヒトＴ−細胞系またはＨｅＬａ細胞
中にトランスフェクトした時、感染性で細胞変性性のＨ
ＩＶウィルスを生ぜしめる。該ウィルスの複製、ＲＮＡ
プロセッシング、タンパク賞翻訳およびウィルス粒子の
会合は、ＨＩＶそれ自身のものと識別不能である。逆転
写酵素（ＲＴ）活性は、２日目までの上清においてピー
クがあり、そして次いで低下することが認められる。
ＣＤ４’ ＶＢ細胞（ヒトのＴ−リンパ腫細胞系）と
ＲＩＰ７でトランスフェクトされたｃｏｓａ＋胞との同
時培養は、二次感染、ウィルス複製のさらなる循環、お
よび上清のＲＴ活性の増加をもたらす。
付随して、巨細胞が形成する。これらの多核性細胞は、
低能力の位相差顕微鏡のもとて可視化されそして定量さ
れ得る。これらは、未怒染のＶＢ細胞と、感染されたＶ
Ｂ細胞および／またはＲＩＰ７でトランスフェクトされ
たｃｏｓ−を細胞との間の融合を提供する。未感染のＶ
Ｂ細胞を核色素Ｈｏｅｃｈｓ ｔ３３３４２で染色し、
そしてＲＩＰ７でトランスフェクトされたＣＯ５−１細
胞と混合すると、蛍光標識された抗−ＨＩＶ抗体でカウ
ンター染色（黄色）する細胞質中に、ＶＢ核（青）が組
み込まれた多核性巨細胞が形成する。
低能力の位相差顕微鏡のもとて可視化されそして定量さ
れ得る。これらは、未怒染のＶＢ細胞と、感染されたＶ
Ｂ細胞および／またはＲＩＰ７でトランスフェクトされ
たｃｏｓ−を細胞との間の融合を提供する。未感染のＶ
Ｂ細胞を核色素Ｈｏｅｃｈｓ ｔ３３３４２で染色し、
そしてＲＩＰ７でトランスフェクトされたＣＯ５−１細
胞と混合すると、蛍光標識された抗−ＨＩＶ抗体でカウ
ンター染色（黄色）する細胞質中に、ＶＢ核（青）が組
み込まれた多核性巨細胞が形成する。
ＲＩＰ７／ｍｕｔｌＯは、下記に記載のように、オリゴ
ヌクレオチド介在部位特異的突然変異誘発により生成さ
れた変異ｇｐ１６０サブ領域を有する。この突然変異は
、ｇｐ１２０とｇｐ４１とを分割する正常の内因性タン
パク質分解性開裂部位の付近で、野生型ｇｐ１６０から
のトリプシン−様開裂部位を除去するものである。この
突然変異はまた、野生型ｇＰ１６０には無い、キモトリ
プシンのための新しい開裂部位を導入する。
ヌクレオチド介在部位特異的突然変異誘発により生成さ
れた変異ｇｐ１６０サブ領域を有する。この突然変異は
、ｇｐ１２０とｇｐ４１とを分割する正常の内因性タン
パク質分解性開裂部位の付近で、野生型ｇｐ１６０から
のトリプシン−様開裂部位を除去するものである。この
突然変異はまた、野生型ｇＰ１６０には無い、キモトリ
プシンのための新しい開裂部位を導入する。
ＲＩＰ７／ ｍｕｔｌＯでトランスフェクトされたＣＯ
Ｓ −１細胞をＶＢ細胞と共に同時培養すると、ＲＩＰ
７の場合に観察された二次感染および巨細胞形成が起こ
らない。上清中の最初のＲＴピークは、野生型ＲＩＰ−
７と同様に、トランスフェクション後２日目に生じる。
Ｓ −１細胞をＶＢ細胞と共に同時培養すると、ＲＩＰ
７の場合に観察された二次感染および巨細胞形成が起こ
らない。上清中の最初のＲＴピークは、野生型ＲＩＰ−
７と同様に、トランスフェクション後２日目に生じる。
しかしながら、同時培養されたＶＢ細胞の存在下では、
上清のＲＴ活性における累進的上昇が全く観察されない
。さらに、巨細胞も全く形成しないようである。
上清のＲＴ活性における累進的上昇が全く観察されない
。さらに、巨細胞も全く形成しないようである。
ＲＩＦ５ ／ ｍｕ ｔｌｏ中に導入された、オリゴヌ
クレオチドに指向される障害が、生物活性の低下の原因
であることを確認するために、多数の対照評価を遂行し
た。ｃｏｓ−を細胞へのトランスフェクション後、ＲＩ
Ｐ？およびＲＩＰ７／ｍｕｔｌｏプロウィルスが原型ど
おりに複製されることが示された。染色体外ＤＮＡを旧
ｒｔ抽出後に分析すると、ＲＩＰ７／ｍｕｔｌＯの新規
なＥｃｏＲ１部位（変異された塩基対置換により導入）
が保存されていた。
クレオチドに指向される障害が、生物活性の低下の原因
であることを確認するために、多数の対照評価を遂行し
た。ｃｏｓ−を細胞へのトランスフェクション後、ＲＩ
Ｐ？およびＲＩＰ７／ｍｕｔｌｏプロウィルスが原型ど
おりに複製されることが示された。染色体外ＤＮＡを旧
ｒｔ抽出後に分析すると、ＲＩＰ７／ｍｕｔｌＯの新規
なＥｃｏＲ１部位（変異された塩基対置換により導入）
が保存されていた。
各構成物によりＣＯ５−１細胞のトランスフェクション
効率は、免疫蛍光法により分析された。エンベロープタ
ンパク賞のエピトープに対する反応性について選択され
たポリクローナル抗血清を使うと、ＲＩＰ７およびＲＩ
Ｐ７／ａ＋ｕｔｌＯによるトランスフェクション後率は
、低い（１％未満）がほとんど等しいことが示された。
効率は、免疫蛍光法により分析された。エンベロープタ
ンパク賞のエピトープに対する反応性について選択され
たポリクローナル抗血清を使うと、ＲＩＰ７およびＲＩ
Ｐ７／ａ＋ｕｔｌＯによるトランスフェクション後率は
、低い（１％未満）がほとんど等しいことが示された。
全細胞性ＲＮＡを、ＲＩＰ７およびＲＩＰ７／ｎ＋ｕｔ
ｌｏでトランスフェクトされた細胞から調製し、そして
半定量的ドツトプロットにより分析した。両者とも同じ
５′−および３′ｍＲＮＡの転写収率をもたらすことが
示された。ノーザンプロットにより分析すると、これら
のｉＲＮ＾は両者とも等しくプロセシングされることが
示された。
ｌｏでトランスフェクトされた細胞から調製し、そして
半定量的ドツトプロットにより分析した。両者とも同じ
５′−および３′ｍＲＮＡの転写収率をもたらすことが
示された。ノーザンプロットにより分析すると、これら
のｉＲＮ＾は両者とも等しくプロセシングされることが
示された。
ＨＩＶ−コードタンパク質は、ＲＩＦ７ ／ ｌｌ１ｕ
ｔｌｏでのトランスフェクション後のＣＯ５−１細胞
において、ＲＩＰ７でトランスフェクトされたｃｏｓ−
を細胞において認められるのと同等の細胞質の染色強度
および分布を伴って検出された。トランスフェクトされ
たＣＯ５−１細胞表面上のＨｒＶエンベロープタンパク
質の発現は、ｇｐ４１のエピトープ（ｇｐ１６０にも認
められる）に対して特異的なヒトのモノクローナル抗体
を使って評価された。Ｉ？ＩＰ７でトランスフェクトさ
れた細胞は、この抗体により明るい表面蛍光を示し；
ＲＩＰ７／ ｍｕｔｌｏでトランスフェクトされたもの
は、バンクグラウンドものよりもかなり上の、弱い蛍光
を示した。ＲＩＰ７でトランスフェクトされた細胞もＲ
ＩＰ７／ｍｕｔｌｏでトランスフェクトされた細胞も共
に、モノクローナル抗−ｐ２５抗体を用いて分析すると
、同じような量の細胞表面工且工を示した。
ｔｌｏでのトランスフェクション後のＣＯ５−１細胞
において、ＲＩＰ７でトランスフェクトされたｃｏｓ−
を細胞において認められるのと同等の細胞質の染色強度
および分布を伴って検出された。トランスフェクトされ
たＣＯ５−１細胞表面上のＨｒＶエンベロープタンパク
質の発現は、ｇｐ４１のエピトープ（ｇｐ１６０にも認
められる）に対して特異的なヒトのモノクローナル抗体
を使って評価された。Ｉ？ＩＰ７でトランスフェクトさ
れた細胞は、この抗体により明るい表面蛍光を示し；
ＲＩＰ７／ ｍｕｔｌｏでトランスフェクトされたもの
は、バンクグラウンドものよりもかなり上の、弱い蛍光
を示した。ＲＩＰ７でトランスフェクトされた細胞もＲ
ＩＰ７／ｍｕｔｌｏでトランスフェクトされた細胞も共
に、モノクローナル抗−ｐ２５抗体を用いて分析すると
、同じような量の細胞表面工且工を示した。
十分な成熟したウィルス粒子を生じさせる各構成物の能
力を、２つの方法において分析した。以前に記載された
ように、両者とも、トランスフェクトされたＣＯ５−１
細胞の上清中に、２日目にピークになる同量のＲＴ活性
をもたらすことがわかる。このＲＴ活性は、直接電子顕
微鏡により示されるように、成熟した形態学上等しいウ
ィルス粒子に関連することがわかった。
力を、２つの方法において分析した。以前に記載された
ように、両者とも、トランスフェクトされたＣＯ５−１
細胞の上清中に、２日目にピークになる同量のＲＴ活性
をもたらすことがわかる。このＲＴ活性は、直接電子顕
微鏡により示されるように、成熟した形態学上等しいウ
ィルス粒子に関連することがわかった。
ＲＩＰ７／ｍｕｔｌｏがサブゲノム領域ＪＬＬＬまたは
Ｉユ±に欠陥を有するかもしれない可能性を取り除くた
めに、ＨＩＶ変異体であるＨＸＢ２ ＲＩＰＩおよヒｌ
ｌＸＢ２ Ｒ／ＣＰＩを用いて補完実験を行なった。
Ｉユ±に欠陥を有するかもしれない可能性を取り除くた
めに、ＨＩＶ変異体であるＨＸＢ２ ＲＩＰＩおよヒｌ
ｌＸＢ２ Ｒ／ＣＰＩを用いて補完実験を行なった。
ＨＸＢ２ ＲＩＰＩ は、ｍ±遺伝子のリーディングフ
レームを中断する点突然変異を有し、 ＨＸＢ２ Ｒ／
ＣＰＴは、ＨＴＶの工ＵおよびＬ土±領域に及ぷ欠失を
有する。両者とも、ｅｎｖサブゲノム領域を含む野生型
の３′−末端を有する。ＣＯ５−１細胞にトランスフェ
クトした時、両者ともＲＴ活性の放出をもたらさず、ま
たＶＢ細胞を添加しても巨細胞の形成が起こらないこと
がわかった。しかし、どちらか一方をＲＩＰ７／ｍｕｔ
ｌｏと一緒にＣＯ５−１細胞にトランスフェクトするな
らば、ＲＴ活性が放出されそして巨細胞が形成する。従
って、各野生型の３′−末端領域は、ＲＩＰ７／ｍｕｔ
ｌｏのエンベロープ変異を補完し；相互的にＲＩＰ７／
１ｌｕｔｌＯの３′−末端の１−と」−および−Ｌ」−
Ｖ領域が機能的になる。
レームを中断する点突然変異を有し、 ＨＸＢ２ Ｒ／
ＣＰＴは、ＨＴＶの工ＵおよびＬ土±領域に及ぷ欠失を
有する。両者とも、ｅｎｖサブゲノム領域を含む野生型
の３′−末端を有する。ＣＯ５−１細胞にトランスフェ
クトした時、両者ともＲＴ活性の放出をもたらさず、ま
たＶＢ細胞を添加しても巨細胞の形成が起こらないこと
がわかった。しかし、どちらか一方をＲＩＰ７／ｍｕｔ
ｌｏと一緒にＣＯ５−１細胞にトランスフェクトするな
らば、ＲＴ活性が放出されそして巨細胞が形成する。従
って、各野生型の３′−末端領域は、ＲＩＰ７／ｍｕｔ
ｌｏのエンベロープ変異を補完し；相互的にＲＩＰ７／
１ｌｕｔｌＯの３′−末端の１−と」−および−Ｌ」−
Ｖ領域が機能的になる。
ＲＩＰ７／ｍｕｔｌＯ中の欠陥が、導入された障害に関
連するものであることを示すために、２つの実験を実施
した。第一に、ＲＩＰ７またはＲＩＦ７ ／ ｏ＋ｕ
ｔｌｏでトランスフェクトされたＣＯ５−１細胞中のエ
ンベロープタンパク質プロセシングを評価するためにウ
ェスタン分析を利用した。２つの異なる抗体、即ちｇｐ
１６０ともｇｐ１２０とも反応性であるポリクローナル
抗−ＨｆＶ抗血清、およびｇｐ１２０とは非反応性のモ
ノクローナル抗−ｇｐ４１／ｇｐ１６０抗体、を使った
。観察した時、ｇｐ１６０は、ＨＸＢ２で感染されたＨ
９細胞と同様に、ＲＩＰ７でトランスフェクトされたＣ
Ｏ５−１細胞において、前記モノクローナル抗体により
特異的に認識される。ＲＩＰ７でトランスフェクトされ
たＣＯ５−１細胞において、ｇｐ１２０は前記ポリクロ
ーナル抗体により同定され、そしてｇｐ４１はモノクロ
ーナル抗−ｇｐ４１／ｇｐ１６０抗体により検出される
。しかしながら、ＲＩＰ７／ ｍｕｔｌｏでトランスフ
ェクトされたＣＯ５−１細胞では、ｇｐ１６０は生産さ
れるがｇｐ１２０およびｇｐ４１は生産されない。
連するものであることを示すために、２つの実験を実施
した。第一に、ＲＩＰ７またはＲＩＦ７ ／ ｏ＋ｕ
ｔｌｏでトランスフェクトされたＣＯ５−１細胞中のエ
ンベロープタンパク質プロセシングを評価するためにウ
ェスタン分析を利用した。２つの異なる抗体、即ちｇｐ
１６０ともｇｐ１２０とも反応性であるポリクローナル
抗−ＨｆＶ抗血清、およびｇｐ１２０とは非反応性のモ
ノクローナル抗−ｇｐ４１／ｇｐ１６０抗体、を使った
。観察した時、ｇｐ１６０は、ＨＸＢ２で感染されたＨ
９細胞と同様に、ＲＩＰ７でトランスフェクトされたＣ
Ｏ５−１細胞において、前記モノクローナル抗体により
特異的に認識される。ＲＩＰ７でトランスフェクトされ
たＣＯ５−１細胞において、ｇｐ１２０は前記ポリクロ
ーナル抗体により同定され、そしてｇｐ４１はモノクロ
ーナル抗−ｇｐ４１／ｇｐ１６０抗体により検出される
。しかしながら、ＲＩＰ７／ ｍｕｔｌｏでトランスフ
ェクトされたＣＯ５−１細胞では、ｇｐ１６０は生産さ
れるがｇｐ１２０およびｇｐ４１は生産されない。
従って、ＲＩＰ７／ｍｕｔｌＯに導入された突然変異は
、ｇｐ１６０の内因性タンパク質分解性開裂を妨害する
。
、ｇｐ１６０の内因性タンパク質分解性開裂を妨害する
。
ＲＩＰ７／ｍｕｔｌｏ中の突然変異は、ＲＩＰ７の開裂
部位には見当らない、キモトリプシンのための新しい開
裂部位を作成する。 ｇｐ１６０の内因性タンパク質
分解的開裂が融合活性の活性化に必要であることをさら
に証明するために、キモトリプシンを添加した。ＲＩＰ
７でトランスフェクトされたＣＯ５−１細胞が、０．１
６％はどの低い血清濃度で且つＯ〜３２ｎ／ｒｔｒｉ
（０，５％血清中）の範囲のキモトリプシン濃度で、Ｖ
Ｂ細胞と融合し得ることを実験的に確立した後、ＲＩＰ
７／ｍｕｔｌｏでトランスフェクトされたＣＯ５−１細
胞を０．５％血清中ＶＢ細胞と共に同時培養し、そして
キモトリプシン濃度を増加しながら、一定のタンパク質
分解にかけた。１〜４μｇ／−のキモトリプシン存在下
では、巨細胞が低頻度において形成した。これらの巨細
胞は、ＲＩＰ７でトランスフェクトされたｃｏｓ−ｉ細
胞とＶＢ細胞との間で形成されるものと形態学的に類似
していた。それらは、ふくらんだ細胞質と継ぎ合わされ
ているがまだ融合していないＶＢ細胞とにより囲まれた
多核から成る。二重色蛍光により証明されるように、そ
の核はＶＢ細胞（核色素Ｈｏｅｃｈｓ ｔ３３３４２で
予め染色されている）により付与され、そして細胞質は
ＨＩＶに対する蛍光標識抗体で黄色にカウンター染色す
る。従って、ｇｐ１６０の内因性タンパク質分解的開裂
が一度回復すれば、変異されたＲＩＰ／ｍｕｔｌＯウィ
ルスの融合活性もまた回復する。
部位には見当らない、キモトリプシンのための新しい開
裂部位を作成する。 ｇｐ１６０の内因性タンパク質
分解的開裂が融合活性の活性化に必要であることをさら
に証明するために、キモトリプシンを添加した。ＲＩＰ
７でトランスフェクトされたＣＯ５−１細胞が、０．１
６％はどの低い血清濃度で且つＯ〜３２ｎ／ｒｔｒｉ
（０，５％血清中）の範囲のキモトリプシン濃度で、Ｖ
Ｂ細胞と融合し得ることを実験的に確立した後、ＲＩＰ
７／ｍｕｔｌｏでトランスフェクトされたＣＯ５−１細
胞を０．５％血清中ＶＢ細胞と共に同時培養し、そして
キモトリプシン濃度を増加しながら、一定のタンパク質
分解にかけた。１〜４μｇ／−のキモトリプシン存在下
では、巨細胞が低頻度において形成した。これらの巨細
胞は、ＲＩＰ７でトランスフェクトされたｃｏｓ−ｉ細
胞とＶＢ細胞との間で形成されるものと形態学的に類似
していた。それらは、ふくらんだ細胞質と継ぎ合わされ
ているがまだ融合していないＶＢ細胞とにより囲まれた
多核から成る。二重色蛍光により証明されるように、そ
の核はＶＢ細胞（核色素Ｈｏｅｃｈｓ ｔ３３３４２で
予め染色されている）により付与され、そして細胞質は
ＨＩＶに対する蛍光標識抗体で黄色にカウンター染色す
る。従って、ｇｐ１６０の内因性タンパク質分解的開裂
が一度回復すれば、変異されたＲＩＰ／ｍｕｔｌＯウィ
ルスの融合活性もまた回復する。
上の結果から、非怒染性ＨＩＶウィルスがワクチンとし
ての使用のために用意され得ることが明らかであり、こ
こで該ウィルスは十分に免疫原性を保持しており、天然
ウィルスと実質上同じコンホーメーションを維持してい
るが、怒染力および融合能力を欠いている。加えて、問
題の組成物は、ｇｐ１６０の内因性タンパク質分解性開
裂部位の付近の構造的／機能的相関物のためのプローブ
としても利用され得る。目的の組成物は、ｇｐ１６０の
内因性タンパク質分解性開裂に関与する細胞内性プロテ
アーゼの単離および特徴付けのためのプローブとしても
利用され得る。これらのプロテアーゼの同定は、次には
、それらの機能の特異的インヒビターの体系的評価を可
能にする。最後に、目的の組成物は、ＨＩＶのエピトー
プに対し特異的反応性の免疫細胞（Ｔ−およびＢ−細胞
）の同定および単離のためにも利用され得、これらの細
胞を評価してＨＩＶ惑染感染し存効な細胞性および／ま
たは体液性の防御の説明を導くことができよう。
ての使用のために用意され得ることが明らかであり、こ
こで該ウィルスは十分に免疫原性を保持しており、天然
ウィルスと実質上同じコンホーメーションを維持してい
るが、怒染力および融合能力を欠いている。加えて、問
題の組成物は、ｇｐ１６０の内因性タンパク質分解性開
裂部位の付近の構造的／機能的相関物のためのプローブ
としても利用され得る。目的の組成物は、ｇｐ１６０の
内因性タンパク質分解性開裂に関与する細胞内性プロテ
アーゼの単離および特徴付けのためのプローブとしても
利用され得る。これらのプロテアーゼの同定は、次には
、それらの機能の特異的インヒビターの体系的評価を可
能にする。最後に、目的の組成物は、ＨＩＶのエピトー
プに対し特異的反応性の免疫細胞（Ｔ−およびＢ−細胞
）の同定および単離のためにも利用され得、これらの細
胞を評価してＨＩＶ惑染感染し存効な細胞性および／ま
たは体液性の防御の説明を導くことができよう。
１１し目量
ｐＨＸＢ２ｇｐｔは、 ｐｓＰ６５ （Ｆｉｓｈｅｒら
、Ｎａｔｕｒｅ （１９８６）３２０ ： ３６７−３
７１ ）中に同じ転写方向に配向された）ＩＸＢ２Ｄ
［Ｓｈａｗら、５ｃｉｅｎｃｅ （１９８４） ２６
６ ： １１６５−１１７１３のウィルス性挿入部およ
びＥ、コリのｍ遺伝子を含む。ＲＩＰＩおよびＲＩＰ７
は、ＥｃｏＲＩによるｐ）ＩＸＢ２ｇｐｔの部分薄化に
続きヌクレオシド三リン酸の存在下でのＤＮＡポリメラ
ーゼＩのフレノウ断片とのインキュベーションおよび７
４ ＤＮＡリガーゼによる再環化により作製された。Ｈ
ＸＢ２ ＲＩＰＩにおいて、地図位置５０２８ （Ｒａ
ｔｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ （１９８４）３１３ ：
２７７−２８４のナンバリングシステム）のＥｃｏＲ１
部位を除去し、ｍ領域に点突然変異を引き起こし、 Ｒ
ＩＰ７において、ＨＸＢ２挿入部の外側のＥｃｏＲ１部
位を除去した。ＬＬ！Ｌ／史佳欠失変異体ＨＸＢ２Ｒ／
ＣＰＩを作製するために、垣−宿主ＧＭ１６１中でｐＨ
ＸＢ２ｇｐｔを増殖せしめ、Ｃ１ａ Ｉで完全に切断し
、次いでＥｃｏＲＩで部分的に切断し； ＥｃｏＲ１部
位で切断された単離物をフレノウ断片でフィルインし、
そしてＴ４ ＤＮＡリガーゼで閉環した。シーフェンシ
ングベクターｐＢｓＭ１３はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ ５ｙｓ−ｔｅＬＩｌｓ、 Ｓａｎ Ｄｉ
ｅｇｏ＋ ＣＡ ９２１２１から入手した。
、Ｎａｔｕｒｅ （１９８６）３２０ ： ３６７−３
７１ ）中に同じ転写方向に配向された）ＩＸＢ２Ｄ
［Ｓｈａｗら、５ｃｉｅｎｃｅ （１９８４） ２６
６ ： １１６５−１１７１３のウィルス性挿入部およ
びＥ、コリのｍ遺伝子を含む。ＲＩＰＩおよびＲＩＰ７
は、ＥｃｏＲＩによるｐ）ＩＸＢ２ｇｐｔの部分薄化に
続きヌクレオシド三リン酸の存在下でのＤＮＡポリメラ
ーゼＩのフレノウ断片とのインキュベーションおよび７
４ ＤＮＡリガーゼによる再環化により作製された。Ｈ
ＸＢ２ ＲＩＰＩにおいて、地図位置５０２８ （Ｒａ
ｔｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ （１９８４）３１３ ：
２７７−２８４のナンバリングシステム）のＥｃｏＲ１
部位を除去し、ｍ領域に点突然変異を引き起こし、 Ｒ
ＩＰ７において、ＨＸＢ２挿入部の外側のＥｃｏＲ１部
位を除去した。ＬＬ！Ｌ／史佳欠失変異体ＨＸＢ２Ｒ／
ＣＰＩを作製するために、垣−宿主ＧＭ１６１中でｐＨ
ＸＢ２ｇｐｔを増殖せしめ、Ｃ１ａ Ｉで完全に切断し
、次いでＥｃｏＲＩで部分的に切断し； ＥｃｏＲ１部
位で切断された単離物をフレノウ断片でフィルインし、
そしてＴ４ ＤＮＡリガーゼで閉環した。シーフェンシ
ングベクターｐＢｓＭ１３はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ ５ｙｓ−ｔｅＬＩｌｓ、 Ｓａｎ Ｄｉ
ｅｇｏ＋ ＣＡ ９２１２１から入手した。
Ｍ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｉｐ１９は既に記載されて
いる（ Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら、Ｇｅｎｅ （１９８４
） ２６ ： １０１ １０６）。
いる（ Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら、Ｇｅｎｅ （１９８４
） ２６ ： １０１ １０６）。
全てのクローニング操作は、標準手順（ＭａｎｉａＨｓ
ら、（１９８２） Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃ１ｏｎｉｎ
： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｍａｎｕａｌ、 Ｃｏ
１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ ： Ｃｏ
１ｄ ＳｐｒｉｎｇＩｔａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ 〕に従った。
ら、（１９８２） Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃ１ｏｎｉｎ
： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｍａｎｕａｌ、 Ｃｏ
１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ ： Ｃｏ
１ｄ ＳｐｒｉｎｇＩｔａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ 〕に従った。
Ｌ］”−
Ｉ８８は、ｇｐ４１ （従ってｇｐ１６０）のエンベロ
ープに対するヒ１へのモノクローナル抗体であり、Ｇｅ
ｎｅｌａｂｓ。
ープに対するヒ１へのモノクローナル抗体であり、Ｇｅ
ｎｅｌａｂｓ。
Ｉｎｃ、、 Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃ１ｔｙ、 ＣＡから入
手可能であり、免疫蛍光分析およびウェスタン分析にお
いては５ｎ／ｄ ＩｇＧの濃度で使われる。ＣＢはＨＩ
Ｖに対する高−力価のヒト抗血清であり、免疫蛍光分析
には１：５０〜１：５００で、そしてウェスタン分析に
はｌニア５０で使われる。抗−ｐ ２５（Ｌｉ ｔｔｏ
ｎ Ｂｉｏｎｅ−ｔｉｃｓ）は、ＨＩｖＬ！Ｌのサブユ
ニットｐ２５に対するマウスのモノクローナル抗体であ
り、免疫蛍光分析には２ ｎ ／ ｒｒｄｌ ［ｇＧで
使われる。マウスおよびヒトに対する蛍光標識された二
次抗体はＣａｐｐｅｌｌから購入した。
手可能であり、免疫蛍光分析およびウェスタン分析にお
いては５ｎ／ｄ ＩｇＧの濃度で使われる。ＣＢはＨＩ
Ｖに対する高−力価のヒト抗血清であり、免疫蛍光分析
には１：５０〜１：５００で、そしてウェスタン分析に
はｌニア５０で使われる。抗−ｐ ２５（Ｌｉ ｔｔｏ
ｎ Ｂｉｏｎｅ−ｔｉｃｓ）は、ＨＩｖＬ！Ｌのサブユ
ニットｐ２５に対するマウスのモノクローナル抗体であ
り、免疫蛍光分析には２ ｎ ／ ｒｒｄｌ ［ｇＧで
使われる。マウスおよびヒトに対する蛍光標識された二
次抗体はＣａｐｐｅｌｌから購入した。
鼠鳳糸
′ｒ−リンパ芽球様細胞系Ｈ９およびＨ９／ＨＸＢ（Ｐ
ｏｐｏｖｉｃら、５ｃｉｅｎｃｅ （１９８４） ２２
４ ： ４９７ ５００）およびＶ Ｂ （Ｌｉｆｓｏ
ｎら、５ｃｉｅｎｃｅ （１９８６） ２３２ ：１２
３２−１２３７ ）を、記載されたように維持した。
ｏｐｏｖｉｃら、５ｃｉｅｎｃｅ （１９８４） ２２
４ ： ４９７ ５００）およびＶ Ｂ （Ｌｉｆｓｏ
ｎら、５ｃｉｅｎｃｅ （１９８６） ２３２ ：１２
３２−１２３７ ）を、記載されたように維持した。
ＳＶ４０で形質転換されたアフリカミドリザル細胞系Ｃ
Ｏ５−１（Ｇｌｕｚｏ＋ａｎ、 Ｃｅ１ｌ （１９８０
） ２３ ： １７５ １８２）は、１０％ウシ胎児血
清（ＦＣ３）で補充されたＤＭＥ培地中、５％ＣＯ，雰
囲気下３７°Ｃにて増殖された。
Ｏ５−１（Ｇｌｕｚｏ＋ａｎ、 Ｃｅ１ｌ （１９８０
） ２３ ： １７５ １８２）は、１０％ウシ胎児血
清（ＦＣ３）で補充されたＤＭＥ培地中、５％ＣＯ，雰
囲気下３７°Ｃにて増殖された。
オリゴヌクレオチドの ７Ｎ ｉ兼部位特
異的突然変異誘発のための標的である、ｐＨＸＢ２ｇｐ
ｔからの２．６ｋｂのＳ ａｌ Ｉ ／ Ｂａａ＋ＨＩ
エンベロープ断片を、Ｍ１３ｍｐ１８中に挿入してＭ１
３ｗｐ１８／ ｅｎｖを作製した。変異オリゴヌクレオ
チド：は、ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍ１ｔｈ （据」工１
１■虹（１９８３＞１００ ： ４６８−５００ ）の
−瓜論に従って設計された３０−マーであった。コンピ
ータ−の助力による相同性調査は、ＮＩＨデータバンク
から引き出した１ＩＸＢ２およびＭ１３配列を使って行
われた。このオリゴヌクレオチドは、固体状態のホスホ
ジエステル法により合成され、そして精製された（Ｌｏ
ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
（ｉ９８４） ８１ ： ２２８５ ２２８９） 。
異的突然変異誘発のための標的である、ｐＨＸＢ２ｇｐ
ｔからの２．６ｋｂのＳ ａｌ Ｉ ／ Ｂａａ＋ＨＩ
エンベロープ断片を、Ｍ１３ｍｐ１８中に挿入してＭ１
３ｗｐ１８／ ｅｎｖを作製した。変異オリゴヌクレオ
チド：は、ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍ１ｔｈ （据」工１
１■虹（１９８３＞１００ ： ４６８−５００ ）の
−瓜論に従って設計された３０−マーであった。コンピ
ータ−の助力による相同性調査は、ＮＩＨデータバンク
から引き出した１ＩＸＢ２およびＭ１３配列を使って行
われた。このオリゴヌクレオチドは、固体状態のホスホ
ジエステル法により合成され、そして精製された（Ｌｏ
ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
（ｉ９８４） ８１ ： ２２８５ ２２８９） 。
＋１１３ｍｐ１８／ｅｎνの一本鎖子孫上での部位特異
的突然変異誘発は、万能のＭ１３シークエンジングブラ
イマーおよび変異オリゴヌクレオチドを使った“二重プ
ライマー”法（ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍ１ｔｈ、 ＤＮ
Ａ（１９８４）主： ４７９−４８８）により達せられ
た。次いでヘテロ二本鎖を修復欠陥体（ｍｕＬＬ ：：
ＴｎｌＯ） ＨＢ２ｉ５４株（Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 （１９８５） １
３ ：４４３１−４４４３ ）中に形質転換せしめ、そ
してＬ剣ＡＪＦ′１１０９ ローン細胞（Ｙａｎｉｓｃ
ｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ（１９８５）遥： １０
３−１１９ ）中で増殖させた。トランスフェクトした
ＤＮＡから生じた２２０個のプラークを■５−プレート
上でコロニーとして成長させ、ニトロセルロースに移し
、そして以前記載されたようにしてＣＷａｌｌａｃｅら
、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。
的突然変異誘発は、万能のＭ１３シークエンジングブラ
イマーおよび変異オリゴヌクレオチドを使った“二重プ
ライマー”法（ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍ１ｔｈ、 ＤＮ
Ａ（１９８４）主： ４７９−４８８）により達せられ
た。次いでヘテロ二本鎖を修復欠陥体（ｍｕＬＬ ：：
ＴｎｌＯ） ＨＢ２ｉ５４株（Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 （１９８５） １
３ ：４４３１−４４４３ ）中に形質転換せしめ、そ
してＬ剣ＡＪＦ′１１０９ ローン細胞（Ｙａｎｉｓｃ
ｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ（１９８５）遥： １０
３−１１９ ）中で増殖させた。トランスフェクトした
ＤＮＡから生じた２２０個のプラークを■５−プレート
上でコロニーとして成長させ、ニトロセルロースに移し
、そして以前記載されたようにしてＣＷａｌｌａｃｅら
、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。
（１９８１） ９ ： ８７９−８９４３ ”Ｐ−キナ
ーゼ処理された変異オリゴヌクレオチドを使って探索し
た。５５°Ｃでは全コロニーがハイブリダイズし；５８
°Ｃでは３１個がハイブリダイズし、そのうちの２５個
（１２％）が７０°Ｃで強いシグナルを与えた。これら
のコロニーからの複製型を単離し、そしてＳａｔ Ｉ
、 ＢａｍＨ！およびＥｃｏＲＩで消化した；９個（４
％）が、Ｓａｌ ｌ ／壜馴ＨＩエンベロープ断片を約
ＭＷ １．９ｋｂおよび０．７ｋｂの二断片に分割する
新たなＥｃｏＲ１部位の挿入を示した。これらの単離物
から、内因性タンパク質分解性開裂部位のコード領域の
近くに挿入されたＥｃｏＲ１部位を含む０．５ｋｂの旦
紅ＩＩ ／肛ｎｄＩ［Ｉ断片を、二方向ヌクレオチド配
列分析のためにＢａｍ）Ｉ （／肚閃■で切断された９
８５Ｍ１３ベクター中にサブクローニングした。それら
構成物を、ジデオキシチェーンターミネーション反応（
Ｓａｎｇｅｒら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 （１９８
０） １４３ ： １６１ １７８）を使って、製造
業者により記載されたように操作した。
ーゼ処理された変異オリゴヌクレオチドを使って探索し
た。５５°Ｃでは全コロニーがハイブリダイズし；５８
°Ｃでは３１個がハイブリダイズし、そのうちの２５個
（１２％）が７０°Ｃで強いシグナルを与えた。これら
のコロニーからの複製型を単離し、そしてＳａｔ Ｉ
、 ＢａｍＨ！およびＥｃｏＲＩで消化した；９個（４
％）が、Ｓａｌ ｌ ／壜馴ＨＩエンベロープ断片を約
ＭＷ １．９ｋｂおよび０．７ｋｂの二断片に分割する
新たなＥｃｏＲ１部位の挿入を示した。これらの単離物
から、内因性タンパク質分解性開裂部位のコード領域の
近くに挿入されたＥｃｏＲ１部位を含む０．５ｋｂの旦
紅ＩＩ ／肛ｎｄＩ［Ｉ断片を、二方向ヌクレオチド配
列分析のためにＢａｍ）Ｉ （／肚閃■で切断された９
８５Ｍ１３ベクター中にサブクローニングした。それら
構成物を、ジデオキシチェーンターミネーション反応（
Ｓａｎｇｅｒら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 （１９８
０） １４３ ： １６１ １７８）を使って、製造
業者により記載されたように操作した。
の −ンスフェクション
ＤＮＡ、 ＲＩＪＡもしくはタンパク質の分析またはウ
ィルス粒子の単離のためのＣＯＳ −１細胞のトランス
フェクションは、Ｌｏｐａ ｔａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。
ィルス粒子の単離のためのＣＯＳ −１細胞のトランス
フェクションは、Ｌｏｐａ ｔａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。
（１９８４）号１５７０７−５７１５に記載のように行
われた。
われた。
ＣＯ５−１細胞を、２Ｘ１０’細胞数／ １００ｍ＋プ
レート、２４−ウェルのプレート（Ｃｏｓｔｅｒ＋ Ｃ
ａｍｂｒｉ−ｄｇｅ、 ＭＡ、 ０２１３９）中に２Ｘ
１０’細胞数／ウエル、または８チヤンバーＬａｂ −
Ｔｅｋプレート（ＭｉｌｅｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、
Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ＋ 比、 ６０５６６）中に１０
４細胞数／ウエルの密度で接種し、プラスミドＤＮＡＬ
Ｏｎ／ａｄｌを用いて６−１２時間トランスフェクトし
、そして１０％ＦＣ５を有するＤＭＥＭ中に回収する前
に１０％ＤＭＳＯで２分間処理した。
レート、２４−ウェルのプレート（Ｃｏｓｔｅｒ＋ Ｃ
ａｍｂｒｉ−ｄｇｅ、 ＭＡ、 ０２１３９）中に２Ｘ
１０’細胞数／ウエル、または８チヤンバーＬａｂ −
Ｔｅｋプレート（ＭｉｌｅｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、
Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ＋ 比、 ６０５６６）中に１０
４細胞数／ウエルの密度で接種し、プラスミドＤＮＡＬ
Ｏｎ／ａｄｌを用いて６−１２時間トランスフェクトし
、そして１０％ＦＣ５を有するＤＭＥＭ中に回収する前
に１０％ＤＭＳＯで２分間処理した。
抜叔立捉
組込まれていない旧Ｖ ＤＮＡは、以前記載された方法
（Ｈｉｒｔ、 Ｊ、？Ｉｏｆ、Ｂｉｏ１．（１９６７）
２６ ： ５７０７−５７１７）の変法（５ｔｅｉｎ
ら、廊旦（１９８７）旦： ６５９−６８８）を使って
、Ｉ？ｒＰ７およびＲｒＰ７／５ｕｔｌｏ ）ラン
スフエクトｃｏｓ−ｉ細胞から調製された。２０ｎ／レ
ーンを０．８％アガロ−人スラブゲル上で電気泳動し、
ニトロセルロースに移し、そして０Ｐ−ラベル化旧Ｖ
ＤＮＡで探索した。制限エンドヌクレアーゼ消化後低融
点アガロースから全プローブを単離し、そして確立され
た方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ （１９８２）前掲〕に従っ
て二ックトランスレーシゴンを行った。
（Ｈｉｒｔ、 Ｊ、？Ｉｏｆ、Ｂｉｏ１．（１９６７）
２６ ： ５７０７−５７１７）の変法（５ｔｅｉｎ
ら、廊旦（１９８７）旦： ６５９−６８８）を使って
、Ｉ？ｒＰ７およびＲｒＰ７／５ｕｔｌｏ ）ラン
スフエクトｃｏｓ−ｉ細胞から調製された。２０ｎ／レ
ーンを０．８％アガロ−人スラブゲル上で電気泳動し、
ニトロセルロースに移し、そして０Ｐ−ラベル化旧Ｖ
ＤＮＡで探索した。制限エンドヌクレアーゼ消化後低融
点アガロースから全プローブを単離し、そして確立され
た方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ （１９８２）前掲〕に従っ
て二ックトランスレーシゴンを行った。
ハイブリダイゼーション後、フィルターを２ｘｓｓｃ（
Ｉ Ｘ５ＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｆ、 ０．０１５Ｍ
クエン酸ナトリウム）、０．５％ＳＯＳ中室温にて５分
間、同緩衝液中５０°Ｃにて５時間、次いでｏ、 ｉ
ｘｓｓｃ、 ｏ、 ｉ％ＳＯ５中５０°Ｃにて１時間
各１回ずつ洗浄した。
Ｉ Ｘ５ＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｆ、 ０．０１５Ｍ
クエン酸ナトリウム）、０．５％ＳＯＳ中室温にて５分
間、同緩衝液中５０°Ｃにて５時間、次いでｏ、 ｉ
ｘｓｓｃ、 ｏ、 ｉ％ＳＯ５中５０°Ｃにて１時間
各１回ずつ洗浄した。
Ｋｏｄａｋ ＸＡＲフィルムを使ったオートラジオグラ
フィーにより、ハイブリダイズしているバンドを検出し
た。
フィーにより、ハイブリダイズしているバンドを検出し
た。
トランスフェクトされたＣＯ５−１細胞からのＲＮＡを
熱フェノール抽出法（ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏ
ｒｅ、 Ｃｅ１ｌ （１９８４） ３３ニア４１ ７４
Ｂ ）により単離し、そしてノーザン分析および半定量
的ドツトプロット分析のために操作した（Ｆｅｉｎｂｅ
ｒｇ。
熱フェノール抽出法（ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏ
ｒｅ、 Ｃｅ１ｌ （１９８４） ３３ニア４１ ７４
Ｂ ）により単離し、そしてノーザン分析および半定量
的ドツトプロット分析のために操作した（Ｆｅｉｎｂｅ
ｒｇ。
釦旦（１９８６）並： ８０７−８１７） 。
Ｈｏｆｆｍａｎら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （１９８５）
１４７ ： ３２６ ３３５）から採用したアッセイを
使った逆転写酵素活性のために培養上清液を操作した。
１４７ ： ３２６ ３３５）から採用したアッセイを
使った逆転写酵素活性のために培養上清液を操作した。
ます上清を２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞およ
び細胞破片を除去した。ウィルス粒子を沈澱させるため
に、超遠心管に１．５−を移し、そして超遠心機中４°
Ｃにて１５．０００ｒｐｒ＠で３０分間遠心した。ペレ
ットを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、（ｐＨ８，０
）、 ５ｍＭ ロＴＴ、 ２ｌＭＭｇｉ、。
び細胞破片を除去した。ウィルス粒子を沈澱させるため
に、超遠心管に１．５−を移し、そして超遠心機中４°
Ｃにて１５．０００ｒｐｒ＠で３０分間遠心した。ペレ
ットを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、（ｐＨ８，０
）、 ５ｍＭ ロＴＴ、 ２ｌＭＭｇｉ、。
１５０ｍＭ ＫＣｊ！、 ０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、 ０
．０５％Ｔｒｉｔｏｎ １００＋２５ｎ／ｎｒｌのポ
リｒＡ：オリゴｄＴ１２−１８ブライマー、および５
１０μＣｉの’Ｈ−ＴＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ！
１ｕｃｌｅａｒ、 ＮＥＴ２２１Ｘ）を含む反応混合物
中に再懸濁し、そして３７°Ｃにて４５分間インキエベ
ートした。０．４−の１００ｍＭピロリン酸ナトリウム
、１０ｍＭＥＧＴ＾および５ ｎ ／ ｍｌ ｔ ＲＮ
Ａ並びに１．０ ｄの１０％トリクロロ酢酸を添加する
ことにより反応を止めた。氷上で１０分後、反応液をグ
ラスファイバー（Ｓ＆Ｓ ＃３０．２５ＩＩＩｌ）を通
して濾過し、そして冷却したＩ Ｍ ＨＣｊ！ 、 １
０ｍＭピロリン酸ナトリウムで３回、そして７０％エタ
ノールで１回洗浄した。−度乾燥したら、各フィルター
を、３Ｉ１１の０ｓｎｉｆｌｕｏｒを有するシンチレー
ションバイアル中に入れ、そしてカウントした。正の対
照は、ＨＩＶ−産生細胞系Ｈ９／ＨＸＢからの培養上清
液を含んでいた。負の対照は、（１）前記反応混合物中
２０ｍＭ ＭｇＣＩｌｚの代わりに５ｍＭＥＤＴＡの代
用、および（２）非感染のＨ９細胞から、又は適当な時
には偽（ｓｈａｍ） −トランスフェクトされたＣＯ５
−１細胞からの培養上清液の使用、を含んで成る。
．０５％Ｔｒｉｔｏｎ １００＋２５ｎ／ｎｒｌのポ
リｒＡ：オリゴｄＴ１２−１８ブライマー、および５
１０μＣｉの’Ｈ−ＴＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ！
１ｕｃｌｅａｒ、 ＮＥＴ２２１Ｘ）を含む反応混合物
中に再懸濁し、そして３７°Ｃにて４５分間インキエベ
ートした。０．４−の１００ｍＭピロリン酸ナトリウム
、１０ｍＭＥＧＴ＾および５ ｎ ／ ｍｌ ｔ ＲＮ
Ａ並びに１．０ ｄの１０％トリクロロ酢酸を添加する
ことにより反応を止めた。氷上で１０分後、反応液をグ
ラスファイバー（Ｓ＆Ｓ ＃３０．２５ＩＩＩｌ）を通
して濾過し、そして冷却したＩ Ｍ ＨＣｊ！ 、 １
０ｍＭピロリン酸ナトリウムで３回、そして７０％エタ
ノールで１回洗浄した。−度乾燥したら、各フィルター
を、３Ｉ１１の０ｓｎｉｆｌｕｏｒを有するシンチレー
ションバイアル中に入れ、そしてカウントした。正の対
照は、ＨＩＶ−産生細胞系Ｈ９／ＨＸＢからの培養上清
液を含んでいた。負の対照は、（１）前記反応混合物中
２０ｍＭ ＭｇＣＩｌｚの代わりに５ｍＭＥＤＴＡの代
用、および（２）非感染のＨ９細胞から、又は適当な時
には偽（ｓｈａｍ） −トランスフェクトされたＣＯ５
−１細胞からの培養上清液の使用、を含んで成る。
！！２＝シ」Ｌ１捉
トランスフェクトされたｃｏｓ−ｉ細胞中で合成される
ＨＩＶエンベロープタンパク賞は、確立された方法の変
法（Ｂｕｒｎｅｔｔｅら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。
ＨＩＶエンベロープタンパク賞は、確立された方法の変
法（Ｂｕｒｎｅｔｔｅら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。
（１９８１）月２ ： １９５ ２０３ ； Ｔｏｗｂ
ｉｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａ工ＬＡｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳ
Ａ（１９７９） ７６ ： ４３５０−４３５４）を使
って、ウェスタンプロットにより分析した。トランスフ
ェクションの４８−７２時間後に、細胞をリン酸緩衝化
塩溶液で１回洗浄し、そして１％Ｔｒｉ ｔｏｎ −Ｘ
１００＋０．５％デオキシコール酸ナトリウム、２５０
＋ａＭ ＮＮａＣ１２５Ｉｌ１ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （
ｐＨ７，５）および５ｄ ＥＤＴＡを含む緩衝液中、１
０’／ｄの濃度において繰返し渦動撹拌することにより
溶解せしめた。５Ｘ１０’！ｉｔ胞に相当するアリコー
トを１０％ポリアクリルアミドゲル上でのＳＯ３−ＰＡ
ＧＥにより解析し、そしてプロッティング緩衝液（１９
０ｎＭグリシン、２０％メタノールおよび２５ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−１１ＣＩ、 ｐＨ８，０）中、２５０ｍＡにて
８時間ニトロセルロース（Ｓ＆Ｓ、 ０．４５μ）に移
行せしめた。その膜をＴＢＳ （５００＋ｗＭ ＮａＣ
１、２０ｍＭＴｒｉｓ −ｔｉｃ Ｐ、、 ｐｔ１７．
５）中１％ゼラチンによりブロックし、そしてストリッ
プにして、指定された抗体または非免疫性の血清と共に
室温にて１０−１２時間インキエベートした。ＴＢＳ中
での３回の洗浄後、そのストリップを、アルカリホスフ
ァターゼが接合したヤギの抗−ヒトＩｇＧ（Ｐｒｏａ＋
ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でカウンター染色し、そして
１００ｍＭ ＮａＣｊ！、 １００＋ａＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ２ （ｐＨ９，５）および５ｍＭＭｇＣｊ！ｚ中で
ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４〜ク
ロロ−３−インドリルホスフェートと反応させた。
ｉｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａ工ＬＡｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳ
Ａ（１９７９） ７６ ： ４３５０−４３５４）を使
って、ウェスタンプロットにより分析した。トランスフ
ェクションの４８−７２時間後に、細胞をリン酸緩衝化
塩溶液で１回洗浄し、そして１％Ｔｒｉ ｔｏｎ −Ｘ
１００＋０．５％デオキシコール酸ナトリウム、２５０
＋ａＭ ＮＮａＣ１２５Ｉｌ１ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （
ｐＨ７，５）および５ｄ ＥＤＴＡを含む緩衝液中、１
０’／ｄの濃度において繰返し渦動撹拌することにより
溶解せしめた。５Ｘ１０’！ｉｔ胞に相当するアリコー
トを１０％ポリアクリルアミドゲル上でのＳＯ３−ＰＡ
ＧＥにより解析し、そしてプロッティング緩衝液（１９
０ｎＭグリシン、２０％メタノールおよび２５ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−１１ＣＩ、 ｐＨ８，０）中、２５０ｍＡにて
８時間ニトロセルロース（Ｓ＆Ｓ、 ０．４５μ）に移
行せしめた。その膜をＴＢＳ （５００＋ｗＭ ＮａＣ
１、２０ｍＭＴｒｉｓ −ｔｉｃ Ｐ、、 ｐｔ１７．
５）中１％ゼラチンによりブロックし、そしてストリッ
プにして、指定された抗体または非免疫性の血清と共に
室温にて１０−１２時間インキエベートした。ＴＢＳ中
での３回の洗浄後、そのストリップを、アルカリホスフ
ァターゼが接合したヤギの抗−ヒトＩｇＧ（Ｐｒｏａ＋
ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でカウンター染色し、そして
１００ｍＭ ＮａＣｊ！、 １００＋ａＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ２ （ｐＨ９，５）および５ｍＭＭｇＣｊ！ｚ中で
ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４〜ク
ロロ−３−インドリルホスフェートと反応させた。
λｊ」厄１泣
ＲＩＰ７またはＲＩＰ７／ｍｕｔｌＯでトランスフェク
トされたＣＯ５−１細胞により生産されるウィルスの直
接電子ｗ４微鏡による視覚化のために、培養上清（４０
ｍ）をトランスフェクション後４８時間口に収得した。
トされたＣＯ５−１細胞により生産されるウィルスの直
接電子ｗ４微鏡による視覚化のために、培養上清（４０
ｍ）をトランスフェクション後４８時間口に収得した。
細胞破片を２．０ＯＯｒｐｎ＋での２０分間の遠心によ
り除去した。この遠心からの上清を、Ｂｅｃｋ＋＋＋ａ
ｎ ５Ｗ２７０一ター中４°Ｃにて２３．０００ｒｐｍ
で２０分間遠心した。この遠心からのウィルスベレット
を３％グルタルアルデヒド中で固定し、四酸化オスミウ
ム中に浸し、そして確立された方法を使って電子顕微鏡
用の薄片に切り分けることにより調製した。
り除去した。この遠心からの上清を、Ｂｅｃｋ＋＋＋ａ
ｎ ５Ｗ２７０一ター中４°Ｃにて２３．０００ｒｐｍ
で２０分間遠心した。この遠心からのウィルスベレット
を３％グルタルアルデヒド中で固定し、四酸化オスミウ
ム中に浸し、そして確立された方法を使って電子顕微鏡
用の薄片に切り分けることにより調製した。
ＲＴＰ７ ａ＋ｕｔｌＯのキモトリプシン゛ＲＩＰ７
／ａ＋ｕｔｌｏの生物活性におけるキモトリプシンの効
果の分析のために、まず低血清条件において巨細胞形成
が起こることを実験的に立証した。
／ａ＋ｕｔｌｏの生物活性におけるキモトリプシンの効
果の分析のために、まず低血清条件において巨細胞形成
が起こることを実験的に立証した。
ＣＯ５−１細胞を２４−ウェルのミクロタイタープレー
ト中でＲＩＰ７またはＲＩＰ７／１ａｕｔｌｏでトラン
スフェクトし、そして無血清のＤＭＥＭまたは２倍ずつ
増加する０、 １６％から１０％までの範囲の濃度のＦ
ｅ２を有するＤＭＥＭ中に回収した。トランスフェクシ
ヨンの２日後、１０６個のＶＢ細胞（無血清ＤＭＥＭ中
で３回洗浄したもの）／ウェルを添加した。３日以内に
、位相差顕微鏡検査のもとで多核巨細胞を視覚化し、そ
してカウントした。０．１６％はどの低いＦｅＳ２度は
、ＲＩＰ７でトランスフェクトされたＣＯ５−１細胞と
ＶＢ細胞との間の巨細胞形成を支持することがわかり；
ＲＩＰ７／ｍｕＬ１０でトランスフェクトされたｃｏ
ｓ−を細胞とＶＢ細胞とでは、どの血清濃度においても
巨細胞を形成しなかった。
ト中でＲＩＰ７またはＲＩＰ７／１ａｕｔｌｏでトラン
スフェクトし、そして無血清のＤＭＥＭまたは２倍ずつ
増加する０、 １６％から１０％までの範囲の濃度のＦ
ｅ２を有するＤＭＥＭ中に回収した。トランスフェクシ
ヨンの２日後、１０６個のＶＢ細胞（無血清ＤＭＥＭ中
で３回洗浄したもの）／ウェルを添加した。３日以内に
、位相差顕微鏡検査のもとで多核巨細胞を視覚化し、そ
してカウントした。０．１６％はどの低いＦｅＳ２度は
、ＲＩＰ７でトランスフェクトされたＣＯ５−１細胞と
ＶＢ細胞との間の巨細胞形成を支持することがわかり；
ＲＩＰ７／ｍｕＬ１０でトランスフェクトされたｃｏ
ｓ−を細胞とＶＢ細胞とでは、どの血清濃度においても
巨細胞を形成しなかった。
従って、キモトリプシン逆転実験では、ＣＯＳ −１細
胞をトランスフェクション後にＤＭＥＭおよび０．５％
ＦＣ３で補充した。トランスフェクション後１ロ目、３
日目および５日目に、キモトリプシン（新しく作成した
原液より、１０ｍ１ｇ／ Ｉｒｌ ０．１ｍＭ Ｉ（Ｃ
１中）をＯｎ／−〜１２８ ｎ ／ ｍｌの範囲の指定
の濃度に添カロした。トランスフェクション後２臼目に
、１０”個のＶＢ細胞／ウェルをｃｏｓ−ｉ細胞と共に
同時培養した。５日目までに、低能力の位相差顕微鏡の
もとで巨細胞を視覚化し、カウントし、そして免疫蛍光
法のために操作した。
胞をトランスフェクション後にＤＭＥＭおよび０．５％
ＦＣ３で補充した。トランスフェクション後１ロ目、３
日目および５日目に、キモトリプシン（新しく作成した
原液より、１０ｍ１ｇ／ Ｉｒｌ ０．１ｍＭ Ｉ（Ｃ
１中）をＯｎ／−〜１２８ ｎ ／ ｍｌの範囲の指定
の濃度に添カロした。トランスフェクション後２臼目に
、１０”個のＶＢ細胞／ウェルをｃｏｓ−ｉ細胞と共に
同時培養した。５日目までに、低能力の位相差顕微鏡の
もとで巨細胞を視覚化し、カウントし、そして免疫蛍光
法のために操作した。
１災１ヱ仄
免疫蛍光アッセイは、細胞内抗原の検出用には１０％Ｈ
２０／アセトン中で固定された細胞、また表面抗原の可
視化用には、Ｌａｂ −Ｔｅｋ ミクロタイターウェル
に付着した生存ＣＯ５−１細胞において行った。非特異
的なバックグラウンドは、特異的抗体および蛍光標識さ
れた第二抗体の連続添加の前に、１０躇／−のヤギの抗
−マウス１ｇＧと共に室温で３０分間プレーインキユヘ
ーションすることにより減少された。幾つかの場合には
、細胞をエバンズブルーでさらにカウンター染色した。
２０／アセトン中で固定された細胞、また表面抗原の可
視化用には、Ｌａｂ −Ｔｅｋ ミクロタイターウェル
に付着した生存ＣＯ５−１細胞において行った。非特異
的なバックグラウンドは、特異的抗体および蛍光標識さ
れた第二抗体の連続添加の前に、１０躇／−のヤギの抗
−マウス１ｇＧと共に室温で３０分間プレーインキユヘ
ーションすることにより減少された。幾つかの場合には
、細胞をエバンズブルーでさらにカウンター染色した。
多核巨細胞の二色染色を次のように行った。
１５−のＬａｂ −Ｔｅｋウェル中でＣＯ５−１細胞を
１？ＩＰ７またはＲＩＰ７／ｍｕｔｌＯでトランスフェ
クトし、２ ｎ ／ ／ｌｌｉ！のキモトリプシンを含
むかまたは含まない、０．５％ＦＣ３含有ＤＭＥＭ中に
回収した。トランスフェクション２日後、ＶＢ細胞を核
色素Ｈｏｅｃｈｓ ｔ３３３４２ （５＋ｍＭ） と共
に３７°Ｃにて３０分間インキュベートし、ＤＭＥＭ中
で３回洗浄し、そして１０５個／ウェルの濃度で添加し
た。６日目に、この細胞を１０％Ｈ２０／アセトン中で
Ｌａｂ Ｔｅｋスライド上に固定し、ポリクローナル
抗血清ＣＢおよびフルオレセイン抗−ヒトＩｇで染色し
、そして表面蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）
のために備えられたＺｅｉｓｓユニバーサル顕微鏡写真
で視覚化した。青色（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）ま
たは緑色（フルオレセイン）の蛍光のどちらかを観察す
るため、フィルターを使って同一の視野を写真に撮った
；使用される露出条件下では、後者の蛍光色素からの発
光は黄色に見える。
１？ＩＰ７またはＲＩＰ７／ｍｕｔｌＯでトランスフェ
クトし、２ ｎ ／ ／ｌｌｉ！のキモトリプシンを含
むかまたは含まない、０．５％ＦＣ３含有ＤＭＥＭ中に
回収した。トランスフェクション２日後、ＶＢ細胞を核
色素Ｈｏｅｃｈｓ ｔ３３３４２ （５＋ｍＭ） と共
に３７°Ｃにて３０分間インキュベートし、ＤＭＥＭ中
で３回洗浄し、そして１０５個／ウェルの濃度で添加し
た。６日目に、この細胞を１０％Ｈ２０／アセトン中で
Ｌａｂ Ｔｅｋスライド上に固定し、ポリクローナル
抗血清ＣＢおよびフルオレセイン抗−ヒトＩｇで染色し
、そして表面蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）
のために備えられたＺｅｉｓｓユニバーサル顕微鏡写真
で視覚化した。青色（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）ま
たは緑色（フルオレセイン）の蛍光のどちらかを観察す
るため、フィルターを使って同一の視野を写真に撮った
；使用される露出条件下では、後者の蛍光色素からの発
光は黄色に見える。
証明されたように、ＡＩＤＳに対するワクチンの生産に
おいて利用を見い出すことのできる発現生成物のために
用意される新規ＤＮＡ配列が提供される。この発現生成
物は、旧Ｖ−１と交差反応性であるタンパク質に向けて
、または感染能力を欠き且つ細胞のシンシチウム融合を
提供できない旧ソ−１ウィルス粒子に向けて用意される
。該ワクチンの生産のため細胞を形質転換せしめるのに
役立つ新規な発現ベクターが提供される。目的のＤＮＡ
配列および発現生成物は、ＨＩＶウィルスの研究におい
てｇｐ１６０の酵素的開裂のインヒビターのために用意
することにも利用を見出す。
おいて利用を見い出すことのできる発現生成物のために
用意される新規ＤＮＡ配列が提供される。この発現生成
物は、旧Ｖ−１と交差反応性であるタンパク質に向けて
、または感染能力を欠き且つ細胞のシンシチウム融合を
提供できない旧ソ−１ウィルス粒子に向けて用意される
。該ワクチンの生産のため細胞を形質転換せしめるのに
役立つ新規な発現ベクターが提供される。目的のＤＮＡ
配列および発現生成物は、ＨＩＶウィルスの研究におい
てｇｐ１６０の酵素的開裂のインヒビターのために用意
することにも利用を見出す。
本明細書中に言及された全ての刊行物及び特許出願は、
本発明が関係する当業者の技術水準を示すものである。
本発明が関係する当業者の技術水準を示すものである。
全ての刊行物及び特許出願は、あたかも各々の刊行物ま
たは特許出願が特別に且つ個別に引用により組込まれる
ものであると指摘されていたかのように本明細書に引用
により組み込まれる。
たは特許出願が特別に且つ個別に引用により組込まれる
ものであると指摘されていたかのように本明細書に引用
により組み込まれる。
以上本発明は、明快な理解のための説明および実施例に
よりある程度詳細に記載されたが、特許請求の範囲内で
幾つかの変更および改良が成し得ることは明らかであろ
う。
よりある程度詳細に記載されたが、特許請求の範囲内で
幾つかの変更および改良が成し得ることは明らかであろ
う。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、機能的な内因性タンパク質分解性開裂部位を欠く完
全なＨＩＶｇｐ１６０タンパク質を実質上コードしてい
るＤＮＡ配列。 ２、前記ＤＮＡ配列が、本来の開裂部位の代わりに２個
の異なるアミノ酸を置換するために変異されている、請
求項１に記載のアミノ酸配列。 ３、原核生物中で機能的な複製開始点、原核生物中での
選択のためのマーカー、および機能的な内因性タンパク
質分解性開裂部位を欠く完全なＨＩＶｇｐ１６０タンパ
ク質を実質上コードしているＤＮＡ配列、を含んで成る
ＤＮＡベクター。 ４、哺乳類細胞中で機能的な転写開始領域および転写終
止領域を含んで成り、前記ＤＮＡ配列が前記開始領域と
終止領域との間にあり且つ前記開始領域の転写調節の支
配下にある、請求項３に記載のＤＮＡベクター。 ５、真核生物中で機能的な複製開始点、真核生物中での
選択のためのマーカー、および機能的な内因性タンパク
質分解性開裂部位を欠く完全なＨＩＶｇｐ１６０タンパ
ク質を実質上コードしているＤＮＡ配列、を含んで成る
ＤＮＡベクター。 ６、哺乳類細胞中で機能的な転写開始領域および転写終
止領域を含んで成り、前記ＤＮＡ配列が前記開始領域と
終止領域との間にあり且つ前記開始領域の転写調節の支
配下にある、請求項５に記載のＤＮＡベクター。 ７、機能的な内因性タンパク質分解性開裂部位を欠く完
全なＨＩＶｇｐ１６０タンパク質を実質上コードしてい
るＤＮＡ配列を含んで成る、変異されたＨＩＶウイルス
ゲノム。 ８、前記ＤＮＡ配列が、本来のプロセッシングシグナル
の代わりに２個の異なるアミノ酸に置換するために変異
されている、請求項７に記載の変異されたＨＩＶウイル
スゲノム。９、ＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＡＧＴ
Ｇから成るプロセッシングシグナルをブリッジしている
部分配列を含んで成り、配列中ＧＡＡＴＴＣがＡＡＡＡ
ＧＡに入れ換わっているＤＮＡ配列をコードするＨＩＶ
ｇｐ１６０。 １０、ＨＩＶウィルスに対して宿主を保護するためのワ
クチンを生産するための方法であって、機能的な内因性
タンパク質分解性開裂部位を欠く完全なＨＩＶｇｐ１６
０タンパク質を実質上コードしているＤＮＡ配列を含ん
で成る変異されたＨＩＶウイルスゲノムを用いて形質転
換されたＨＩＶウィルスを複製および発現せしめるため
にコンピテントな哺乳類細胞を増殖させる、 ことを含んで成る方法。 １１、請求項１に記載のＤＮＡ配列の発現生成物を含ん
で成るＨＩＶワクチン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US17400588A | 1988-03-28 | 1988-03-28 | |
| US174005 | 1988-03-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH029372A true JPH029372A (ja) | 1990-01-12 |
Family
ID=22634418
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1072022A Pending JPH029372A (ja) | 1988-03-28 | 1989-03-27 | 変異されたｈｉｖエンベロープタンパク質 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0335635A1 (ja) |
| JP (1) | JPH029372A (ja) |
| AU (1) | AU3170089A (ja) |
| DK (1) | DK149589A (ja) |
| IL (1) | IL89567A0 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| GB8923123D0 (en) * | 1989-10-13 | 1989-11-29 | Connaught Lab | A vaccine for human immunodeficiency virus |
| US5861282A (en) * | 1989-10-16 | 1999-01-19 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Non-infectious HIV particles and uses therefor |
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| JP3494300B2 (ja) * | 1990-04-03 | 2004-02-09 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | Ｈｉｖに対する予防接種のための方法および組成物 |
| EP0537247A4 (en) * | 1990-06-19 | 1993-09-08 | Immuvax | Nonpathogenic variant virus |
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| WO1994016081A1 (de) * | 1993-01-16 | 1994-07-21 | Manfred Schawaller | Verfahren zur gewinnung nativer domänen viraler membranproteine, deren verwendung, insbesondere als impfstoff gegen hiv |
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| WO2003059385A2 (en) * | 2002-01-14 | 2003-07-24 | Chiron Corporation | Hiv vaccine and method of use |
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| WO2014039561A1 (en) * | 2012-09-04 | 2014-03-13 | Mbio Diagnostics, Inc. | System and method for improving biomarker assay |
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-
1989
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- 1989-03-28 EP EP89303004A patent/EP0335635A1/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2767078B2 (ja) * | 1990-10-17 | 1998-06-18 | アメリカ合衆国 | Ｈｉｖ―１の分子クローンとその使用法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL89567A0 (en) | 1989-09-10 |
| DK149589A (da) | 1989-09-29 |
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| AU3170089A (en) | 1989-09-28 |
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