JPH0297377A

JPH0297377A - アミノ酸ラセマーゼ生産菌の培養方法

Info

Publication number: JPH0297377A
Application number: JP24977188A
Authority: JP
Inventors: Masato Terasawa; 真人寺沢; Makiko Fukushima; 福島　真樹子; Mitsunobu Shimazu; 光伸島津; Hisashi Yamagata; 山縣　恒; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Research Association for Utilization of Light Oil
Current assignee: Research Association for Utilization of Light Oil
Priority date: 1988-10-05
Filing date: 1988-10-05
Publication date: 1990-04-09

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はアミノ酸ラセマーゼを含有する微生物の培養方
法に関する。

（従来の技術と課題）アミノ酸製造法において、有機合成法で得られるアミノ
酸は、通常ＤＬ体であり、Ｌ体もしくは０体のみを製造
する場合には光学的分割などの方法を用いなくてはなら
ない。その場合、目的の光学異性体ではないアミノ酸を
再びＤＬ体にもどす必要がある。又、Ｌ−システィン、
Ｉ７−チロシン、Ｌ−トリプトファン等のし一アミノ酸
を醗酵法で製造する場合、基質としてＤＬ−セリン用い
ると、未反応Ｄ−セリンが反応系に蓄積するため工業的
製法としては、残存するＤ−セリンをラセミ化して再び
反応系に戻す必要がある。このように、有機合成法で安
価に製造しうるＤ　Ｌ−アミノ酸の利用にはラセミ化工
程が必要となる場合が多い一方ラセミ化方法としては、
熱処理などが知られているが、目的アミノ酸の熱分解が
生し、工業的製法においては、収率、純度低下などの問
題がある。

しかしながら酵素によるラセミ化は、常温常圧反応であ
り、目的アミノ酸の分解はみられず工業的に優れた方法
である。

このような、ラセミ化を触媒する酵素の例として、シュ
ードモナス・プチダ（ＩＦＯ１２９９６）が有する、ア
ミノ酸ラセマーゼがある。このアミノ酸ラセマーゼに対
して芳香層アミノ酸、βメチル基が置換を受けた構造を
持つアミノ酸（例えばイソロイシン、バリン、スレオニ
ン）は基質とならないが、その他多くのアミノ酸例えば
リジン、アルギニン、メチオニン、アラニン、セリンな
どは、基質となり、ラセミ化を受ける。（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ｒｅ５ｅ
ａｃｈ　Ｃｏｍｕｎｉｃａｔｉ。

ｎ　Ｖｏｌ　３５．Ｎｏ、３．３６３−３６８（１９６
９）生化学　第４６巻第５号　２０３〜２２３　（１９
７４））この性質を利用して、Ｄ　Ｌ−セリンを基質の
一つとして、Ｌ−）リプトファン、Ｌ−システィン、Ｉ
５−チロシンを製造する場合のラセミ化反応にも応用で
きる。しかしながら本酵素は、通常菌体内には、微量し
か含まれておらず、本酵素を工業的規模で、使用するに
は、酵素活性（ｉ位時間、単位菌体当たりのＤ又はＬ−
アミノ酸のラセミ化能）の高い菌体を、高収量で得る培
養方法が強く望まれている。

ラセマーゼ能を有する菌体の培養方法としては、グルコ
ース濃度を１％以下に保ちながら培養を行う方法（特開
昭５８−２０１８７号公報）が提案されているが、該方
法はグルコースを炭素源としているため、低濃度でも酵
素生成の阻害を避けることはできない。さらに、グルコ
ース濃度を１％以下に制限することは、工業的に非常に
煩雑で望ましくない。

本発明等は、先に、炭素源として、グリセリル、エタノ
ール、乳酸、酢酸、クエン酸、フマール酸、Ｌ−リンゴ
酸、コハク酸、酒石酸よりなる群より選ばれた１種又は
２種以上を主たる炭素源として使用する方法（特開昭６
２−２０５７８１号公報）を提案している。本発明者ら
は、さらに窒素源濃度について、検討を加えたところ、
培地中の窒素源濃度を、窒素原子濃度に換算して０゜０
２重量％以下０．００５重量％以上の範囲内に維持する
ことによって、酵素活性の高い菌体を収量を下げること
なく得られることを見出し本発明に到達した。なお、」
１記の窒素源濃度を維持するには、窒素源を連続的又は
連続的に添加することが出来る。

（発明の構成及び効果）本発明は、シュードモナス属に属しアミノ酸ラセマーゼ
を含有する微生物を培養する際に、培地中の窒素源濃度
を窒素原子濃度に換算して、０゜０２重量％以下ｏ、ｏ
ｏｓ重量％以上の範囲内に維持することを特徴とするシ
ュードモナス属に属し、アミノ酸ラセマーゼを含有する
微生物の培養方法である。

本発明に供する主たる炭素源は、特に規定するものでは
ないが、グリセロール、エタノール、が特に好ましい炭
素源である。

又、窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、燐酸アンモニウム等のアンモ
ニウム塩、及びアンモニア、さらに硝酸カリ、硝酸ナト
リウム、硝酸アンモニウム等の硝酸塩、グルタミン酸、
グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン等の有機窒
素等が適当であり、無機物としては、リン酸カリウム、
硫酸マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、カ
ルシウムの硫酸塩または、塩酸塩などが用いられ、成長
促進物質としては、サイアミン、ビオチン等のビタミン
類、メチオニン、システィン等のアミノ酸、あるいはこ
れら全部若しくは部分的に含有する酵母エキス、ポリペ
プトン、肉エキス、コーンステイープリカー、カザミノ
酸等が用いられる。培養温度は、１０〜４５℃好ましく
は２５〜４０℃の範囲であり培地ｐ　Ｈは３〜１０好ま
しくは、５〜９の範囲である。培養中のｐＨ変化がある
場合にはアンモニア、苛性ソーダ、苛性加里などで上記
の範囲で一定に保持することが望ましい更に培養は好気
的条件下で行い、培養中の溶存酸素が不足しないように
、通気攪拌をすることが望ましい。

実施例　１ポリペプトン１０ｇ、肉エキス１０ｇ、ＮａＣ７！５ｇ
、蒸留水１０００ｍ６、ｐＨ７，２の培地１００ｍｆｆ
１を５００ｍｆｆ容三角フラスコに分注し１２０℃１５
分間滅菌処理した。この培地にラセマーゼ生産菌である
、シュ−ドモナス属プチダ（Ｉ　ＦＯ１２９９６）を１
白金耳植菌し、３０℃で１５時間振盪培養を行った後、
この培養物の１ｍｅを表１に示ず各培地１００ｍｊ！に
植菌し３０°Ｃで２０時間培養を行った。培養終了時の
窒素原子濃度は各々０．００５重量％、０．０１５重量
％、０．０２０重量％、０．０２５重量％であった。

該各培養物の１００ｍｆｆから遠心分離（６，。

００ｒｐｍ、１５分間、４℃）により集菌し、該集菌菌
体をＯ，］Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ８，０）４０ｍｌにて１
度洗浄後、同緩衝液の４ｍ７！に懸濁する。菌体懸濁液
を超音波破砕機（プランフン２００型）により破砕した
後、遠心分ｔｉｌｔ（１２，０００ｒｐｍ、４０分間、
４℃）により上清液を分離し、これを粗酵素液とし、さ
らに該粗酵素液中のセリン分解活性を抑制させるため、
−２０℃にて２４時間凍結保存させた。

表に２ＨＰＯ４Ｋ　　Ｈ２Ｐ　　０４（ＮＩ＋４）２ＳＯ４０，５、Ｍｇ５Ｏ，・　７　Ｈ２０グリセロール蒸留水を加えてｐＨ７，０ｇｇ１．０　　＝　　１．２５．１．５　ｇｏ、１　　ｇ０　　　ｇ１０００　　　ｍｊ！００ｍＭ０、　０４ｍＭ００ｍＭ表　　２Ｄ−セリンピリドキサール５燐酸トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液ｐＨ８，０表２に示す反応液４．５ｍｌに各々の硫安濃度を用いた
培養で得られた前述の粗酵素液の０．５ｍｆｆを加え３
７℃３０ｍ１ｎ反応させた後、反応液中のセリンの旋光
度変化を旋光計（日本分光ＤＩＰ３６０型）を用い、酸
性条件下で測定し、更に全セリン濃度をＨＰ　Ｌ　Ｃに
て測定し、Ｄ−セリンからのＩ、−セリンの生成量を求
めその結果より、硫安濃度０．１５％すなわち窒素原子
濃度０゜０３％とした場合の活性を１００として表３を
作成した。又、酵素中のタンパク質濃度は、＋−ｏ　ｗ
ｒｙ等の方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、上１１２６５
　１９５１）に従い求めた。

表３窒素原子濃度（重量％）　　相対活性（％）１　％２　％２５　％３％（対照）実施例　２ポリペプトン１０ｇ、肉エキス１０ｇ、ＮａＣＡ５ｇ、
蒸留水１０００ｍｎ、ｐＨ７，２の培地１００ｍｌを５
００ｒｒ＋ｊ！容三角フラスコに分注し１２０℃１５分
間滅菌処理した。この培地にラセマーゼ生産菌である、
シュードモナス・プチダ（ＩＦｏ　　１２９９６）を植
菌し、３０℃で１５時間振盪培養を行った後、この培養
物２ｍｌを上記培地１００ｍｆｆ１に植菌し、３０℃で
１５時間培養を行った。

さらにこの培養物を表４に示す培地１リツトル「イワシ
ャ製２リットル　ジャーファーメンメンタ−」に植菌し
６００ｒｐｍ、ｌｖｖｍ、３０℃にて２４時間通気攪拌
培養した。なおｐ　Ｈは必要に応じて４Ｎ水酸化ナトリ
ウム添加にて７．２前後に調整した。

培地中の窒素量は、ネスラー法（朝倉書店、実験農芸化
学、紐巻ｐ５６）によりアンモニウムイオンを定量して
求め、培地中の窒素原子濃度が００１重量％以下０．０
０５重量％以上の範囲内に保たれるように硫酸アンモユ
ムを１時間毎に断続的に添加した。

該培養物のｌ　Ｑｍｊ！から遠心分離（６，００Ｏｒｐ
ｍ、１５分間、４℃）により集菌し、該集菌菌体をＯ，
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）４０ｍｌにて１度洗浄
後、同緩衝液の２　ｍ　ｌに懸濁する。該菌体懸濁液を
超音波破砕機（ブランフン２００型）により破砕した後
、遠心分離（１２，００Ｏｒｐｍ、４０分間、４℃）に
より上滑液を分離し、これを粗酵素液とし、さらに、該
粗酵素液中のセリン分解活性を抑制させるため、−２０
℃にて２４時間凍結保存させた。

セリンに対するラセマーゼ活性の測定は、実施例１と同
様の操作で実施した。

表４に２　　ＨＰ　　０４Ｋ　　Ｈ２Ｐ　　０４（Ｎ　Ｈ４）　　２　　Ｓ　０４ＭｇＳＯ４・　７Ｈ２グリセロール蒸留水を加えてｐＨ７，２ｇｇｏ、　５　ｇ０　　　　　　　　　　　０．１ｇ０ｇ０００ｚ又、表４における硫酸アンモニウム濃度を１゜５ｇ／Ａ
（窒素原子濃度０．０３重量％）に変え以後硫安を添加
しないで、他はこれと同様の操作を施したものを対照と
した。以上の結果を次の表５に示す。

表５窒素原子濃度　　０．０１重量％　　初発０．０３重量
％以下　　　　　（対照）菌体収量　　　　　３．　６　　　　　３．　５（ｇ、
ｄｒｙ　　ｃｅｌｌ／　Ｒ）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）シュードモナス属に属し、アミノ酸ラセマーゼを
含有する微生物を培養する際に、培地中の窒素源濃度を
窒素原子濃度に換算して、０．０２重量％以下０．００
５重量％以上の範囲内に維持することを特徴とするシュ
ードモナス属に属しアミノ酸ラセマーゼを含有する微生
物の培養方法。