JPH03103128A - バラ属植物の不定芽形成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、バラ属植物の側芽や頂芽をサイトカイニンを
含有する培地で継代培養することにより得られる植物体
の葉柄部および葉部から効率よく不定芽を形成させる方
法に関し、本発明方法により得られた不定芽をさらに培
養することによりバラ属植物を効率よく再生、増殖させ
ることができる。

本発明は、バラ属植物の品種改良に体細胞突然変異、細
り包融合および遺伝子組換えなどの技術を導入すること
を可能にする。

従来の技術 バラは古来より園芸的に最も重要な花のひとつであり、
その品種改良は盛んにおこなわれている。

最近新しい育種の方法として遺伝子組換え技術、遺伝子
導入技術、体細胞変異技術などの園芸植物への応用が盛
んに報告されているが、バラ属植物については未だその
ような報告はない。その理由のひとつは、バラ属植物の
体細胞（葉、茎、葉柄あるいはカルス）からのは物体の
再生（再分化〉の技術が確立していないことがあげられ
る。現在までにバラ属植物の体細胞からの不定芽形成に
関する報告として次のａ），ｂ）があげられる。

ａ）４％シュークロースを含むムラシゲ・スクーグ培地
に、葉を培養するときにはペンジルアデニン０．５■／
ｌを、根を培養するときにはペンジルアデニン２．０■
／ｌを添加した培地を用いたローザ●バーシカ　キサン
ティナ（Ｒ．ｐｅｒｓ＋ｃａｘａｎｔｈｉｎａ）　、ｏ
−ザラエビガータ（Ｒ．ｌａｅｖｉｇａｔａ）およびロ
ーザフィチュライアーナ（Ｒ，　ｗｉｃｈｕｒａｉａｎ
ａ）の不定芽形成方法〔ユーフィティカ（Ｅｕｐｈｙｔ
　ｉｃａ）３７　　３１−３６（１９８８））。材料と
して用いた植物体が、どのような培養条件で前培養され
得られたのか、この文献には触れられていない。

ｂ）ローザ　マネッティ（Ｒ，ｍａｎｅｔｔｉ）、ロー
ザハイブリーグ（Ｒ．ｈｙｂｒｉｄａ）のカルス、葉お
よび茎に、ペンジルアデニン、カイネチンおよびナフタ
レン酢酸を組合せたものあるいはジベレリンを作用させ
る方法。〔サイエンテイア　ホルティカルチュラア（Ｓ
ｃｉｅｎｔｉａ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａａ）１７　
　３６１−３７０（１９８２）　）。この文献では不定
芽の形成は認められなかった。

ａ）　、ｂ）の報告は実験方法が不備であり、かつ再現
性に乏しく実用に供することはできない。

また、通常の組織培養技術によってバラ属植物の茎頂、
側芽などからバラ属植物を増殖させる方法については下
記の報告がある。

Ｃ）ペンジルアデニン３．０ｍｇ／ｊ！，インドール酢
酸０．３■／１を添加したムラシゲ・スクーグ培地を用
いたローザ　ハイブリーグ（Ｒ．ｈｙｂｒｉｄａ）の腋
芽増殖方法〔ホルト　サイエンス（ＨｏｒｔＳｃｉｅｎ
ｃｅ）１４　　６１０〜６１２（１９７９）　）。

ｄ〉ペンジルアデニン１．０〜２．　０　ｍｇ／　ｉ’
、ナフクレン酢酸０．１〜０．　１　５　ｍｇ／　ｊ！
を添加したムラシゲ・スクーグ培地を用いたローザ　カ
ニナ（Ｒ，　ｃａｎｉｎａ）およびローザダマセナ（Ｒ
．ｄａｍａｃｅｎａ）の定芽培養による増殖方法〔ジャ
ーナル　オブホルティカルチュラル　サイエンス（Ｊ，
　ｏｆ｝１ｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ
）５７　３１５　〜３１９（１９８２）　’Ｉ。

ｅ）ペンジルアデニン１，０、３．０、１０．０ｍｇ／
Ａ、ナフタレン酢酸０．　３　ｍｇ／　Ｒを添加したム
ラシゲスクーグ培地を用いたローザ　ハイブリーグ（Ｒ
，　ｈｙｂｒｉｄａ）の定芽増殖方法〔ジャーナル　オ
ブ　アメリカン　ソサイエティー　オブ　ホルティ力ル
チュラル　サイエンス（Ｊ，　ｏｆ　ＡｍｅｒＳｏｃ．
ｌｌｏｒｔ，　Ｓｃｉ）　１０５　　２１６〜２２０（
１９８０）　　）。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、バラ属植物の葉柄部および葉部から不
定芽を形成させることにより植物体の再生増殖技術を確
立することである。

課題を解決するための手段 本発明によれば、バラ属植物の側芽あるいは頂芽を０．
　１〜３　０．　０　ｍｇ／　ｊ！のサイトカイニンを
含有する培地で培養し側芽あるいは頂芽を有する植物体
を得る工程、得られた植物体の側芽あるいは頂芽につい
て前記工程を少なくともｌ＠繰返し（以下、継代培養と
いう。）かつその継代培養中の最柊継代培養にあっては
４〜８週間培養する工程を経て得られる植物体の葉柄部
および葉部を、３．０〜３　０．　Ｏ　ｍｇ／　１２の
サイトカイニンを含有する培地で培養することにより、
不定芽を形成させることができ、さらに培養することに
よりバラ属植物を効率よく再生、増殖させることができ
る。

以下に本発明を詳細に説明する。

本明細書では、本発明で用いられるバラ属植物の葉柄部
および葉部を得るための培養を一時培養といい、一時培
養の結果得られる葉柄部および葉部から不定芽を形成さ
せるための培養を二次培養という。また、バラ属植物の
側芽あるい１よ頂芽を０．１〜３０．０■／βのサイト
カイニンを含有する培地で２〜１２週間培養し、得られ
る植物体の側芽あるいは頂芽を、０．１〜３　０．　０
　ｍｇ／　ｌのサイトカイニンを含有する新しい培地に
移し再び２〜１２週間培養する操作を少なくとも１回繰
返すことを継代培養という。

バラ属植物は、通常無菌状態で用いる。たとえば、側芽
あるいは頂芽を組織培養して得られる植物体、圃場で生
育した植物体などに滅，菌処理を施して得られる無菌状
態の植物体、種子を無菌発芽させ無菌的に得られる植物
体などがあげられる。

劇芽あるいは頂芽は、無菌であることが好ましい。バラ
属植物から無菌的に側芽あるいは頂芽のみを採取して用
いることもできるが、好ましくは無菌的にバラ属植物か
ら側芽や頂芽を有する３〜４節を含むように切断された
小節を用いる。

サイトカイニンとしては、ペンジルアデニン、カイネチ
ン、ゼアチン、Ｎ−　（２−クロロー４−ピリジル）−
Ｎ−フェニルウレア（４−ＰＵ）などがあげられる。一
次培養では０，１〜３　０．　０　ｍｇ／ｌ１好ましく
は１．　０　〜１　０．　０　ｍｇ／　Ｉｔ　，二次培
養では３．０〜３０．０ｍｇ／ｆのサイトカイニンを培
地に含有させる。

本発明で用いる培地としては、通常の植物組織培養で用
いられる培地あるいはさらに必要に応じて植物成長調節
物質、ビタミン類、アミノ酸類、有機物質類などを添加
した培地に、サイトカイニンを含有させた培地であれば
いずれでもよい。

通常の植物組織培養で用いられる培地としては、無機或
分、炭素源を必須或分としている培地であればよく、た
とえばムラシゲ・スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆　ｓ
ｉｔｏｏｇ）の培地、リンスマイヤー・スクーグ（Ｌｉ
ｎｓｍａ↓ｒｅ　＆　ＳＫｏｏｇ）の培地、ホワイト（
Ｗｈｉｔｅ）ｔ の培地、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）のＢ−５培地、
三井のＭ−９培地、ニ−／チ’　＝−／チ（Ｎｉｔｓｃ
ｈ　＆　Ｎｉｔｓ（ｈ）培地などがあげられる。とくに
、ムラシゲ・スクーグ培地が好ましい。なお、本明細書
中では、「ムラシゲ・スクーグ培地」といった場合、下
記組戒からなるものをいう。

ムラシゲ・スクーグ培地 ＣａＣｆ２’２８２００．４４ｇ／ｊ！，ＫＮＯ３１．
９ｇ／７２，ＭｇＳＯ，４Ｈ２００．　３　７　ｇ／．
ｊｌ！、Ｎｌ｛４ＮＯ３　　１．６５ｇ／Ａ，Ｎａｚ−
ＥＤＴＡ・３　７．’　３　ｍｇ／　１２　，　＆Ｉｎ
ＳＯ．−４１１．０　　２　２．　３　ｍｇへ ／　ｌ，　ＺｎＳＯ＜４ＨｚＱ　８．　６ｍｇ／　Ｌ　
Ｈ３ＢＯｓ　６．　２ｍｇ／ｌ１ＫＩ　　Ｏ．　８　３
ｍｇ／　Ｌ　ＣｕＳＯ＜・５Ｈ２０　０．　０　２　５
ｍｇ／　Ｒ　ＳＮａ２ＭｏＬ・２｝１２０ｏ．　２　５
　ｍｇ／　Ｒ，　ＣＯＣ　Ａ　ｚ・６Ｌ００．０２５ｍ
ｇ／４２，チアミン塩酸塩　０．　４−ｍｇ／　（１、
ピリドキシン塩酸塩　０．　５　ｍｇ／　Ｉ！　，ニコ
チン酸０．　５　ｍｇ／　Ｒ　，ミオイノシトール　０
．１ｇ／Ｃグリ／ン　２．　０　ｍｇ／　ｌ、シューク
ロース　３０ｇ　／　Ｒ　０ 無機戒分としては、窒素、リン、カリウム、ナトリウム
、カルシウム、マクネシウム、イオウ、鉄、マンガン、
亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、コバルトな
どの元素を含む無機塩があげられる。

これら無機戊分を含む化合物としては、具体的には硝酸
カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、リン酸１
水素カリウム、リン酸２水素ナトリウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化マグネシウム、硫酸ナ｝　ＩＪウム、硫酸第
１鉄、硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、モリブデン
酸ナ｝ＩＪウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、
硫酸亜鉛、ホウ酸、塩化コバルトなどがあげられる。

炭素源としては、ンユクロース、グルコース、フラクト
ース、マルトースなどの炭水化物あるいはその誘導体、
脂肪酸、有機酸などがあげられる。

値物戊長調節物質としては、ナフタレン酢酸、インドー
ル酢酸、インドール酪酸などのオーキシン類、アブサイ
ジン酸などがあげられる。

ビタミン類としては、ピオチン、ビタミンＢ（チアミン
）、ビタミンＢ６　（ビリドキシン、ピリドキサル、ビ
ルドキサミン）、パントテン酸カルシウム、ビタミンＣ
〈アスコルビン酸〉、イノシトール、ニコチン酸、ニコ
チン酸アマイド、ビタミンＢ２（リボフラビン）゛など
があげられる。

アミノ酸としては、グリシン、アラニン、ロイシン、イ
ンロイシン、パリン、グルタミン、グルタミン酸、シス
テイン、メチオニン、アルギニン、リジン、チロシン、
フェニルアラニンなどがあげられる。

有機物質類としては、カゼイン加水分解物、ココナッツ
ミルク、酵母エキス、ペプトン、ジャガイモの破砕物、
バナナの破砕物などがあげられる。

前記した培地戊分は、通常、無機戊分０．ＯｉμＭ〜１
００ｍＭ　，炭素源０．５〜１２０ｇ／Ｌオ一ヰシンな
どの植物戊長調節物質０〜０．０３ｍｇ／Ｌビタミン類
０．　１＝　１　５　０ｍｇ／　（１，アミノ酸　０〜
１０００ｍｇ／　Ｒ、有機物質類０．１　〜１０ｇ／ｌ
の濃度範囲になるように培地に添加される。

培養は、固形培地での静置培養、液体培地での振盪培養
、通気培養など、いずれの方法を用いてもよいが、固形
培地での静置培養が好ましい。固形培地を用いる場合に
は前記した培地に寒天を０．１〜２．０％脊有させるか
あるいはゲランガム（ｇｅｌｒｉｔｅ）を０．　０　０
　５〜０．３％含有させることが好ましい。

以下に培養方法について説明する。

まず一次培養について説明する。

バラ属植物から、通常側芽あるいは頂芽を有する３〜４
節を含むように切断して得られた無菌の小節を０．　１
〜３０．０＋＋＋ｇ／ｊ！，好ましくは１．０〜１　０
．　０　ｍｇ／　ｊ！のサイトカイニンを含有する培地
で２〜１２週間培養し、側芽あるいは頂芽を有する植物
体を得る。その後、得られた植物体の側芽あるいは頂芽
について継代培養をおこなう。継代培養はその継代培養
中の最終継代培養を４〜３週問おこなう。

一次培養中の培養は、温度１５〜３０℃、好ましくは２
５℃付近、照度２００〜２００００ルクス（光周期はと
くに限定しない。〉好ましくは４０００ルクス付近で１
６時間日照でおこなわれる。

一次培養時の最＃継代培養において、培養を４〜８週問
おこなって得られる植物体から葉柄部および葉部を、芽
が混らないように採取する。

次に二次培養について説明する。

一次培養で得られた葉柄部および葉部を３．０〜３　０
．　０　ｍｇ／　ｊ！のサイトカイニンを含有する培地
で６〜ＩＯ週間培養する。

培養は、温度１５〜３０℃、好ましくは２５℃付近、照
度２００〜２００００ルクス（光周期はとくに限定しな
い。）好ましくは４０００ルクス付近で１６時間日照で
おこなわれる。

二次培養で用いられる葉柄部および葉部は、先の一次培
養時の最＃．継続培養において４〜８週間培養して得ら
れる植物体から採取されたものに限られ、展開していな
い葉程よい。展開している葉とは、外側から肉眼で葉が
開いていることが確認できる状態になっている葉のこと
をいう。そのときの葉の大きさは約５ｍｍ程度である。

最林継代培養で８週間を越えて培養すると品種間により
多少の差はあるが、植物の新たな出葉が急減する。また
、８週間を越えて培養して得られた多芽状植物体から採
取された葉柄部および葉部を用いると不定芽形成能も激
減する。

このようにして不定芽が形戒され、植物体を再生するこ
とができる。得られた植物体は、公知の植物組織培養法
に従ってさらに培養することにより、容易に鉢上げでき
る状態にすることが可能である。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１． 温室で生育している植物体（品種：ソーニャＳａｎｉａ
）の茎の節部の側芽を採取して表面殺菌し、全戊分を５
０％減少させたムラシゲ・スクーグ培地にバクト・アガ
ー（ディフコ社製）８ｍｇ／ｊ！を添加した培地（以下
、ＫＭＳ固形培地という。）にさらにペンジルアデニン
を３ｍｇ／ｆ添加した培地に置床し培養した。

培養は、２５℃、４０００ルクス、１６時間日照で６週
問おこなわれた。その結果、無菌状態の多芽状バラ属植
物体を得た。

得られた植物体から側芽や頂芽を有する３〜４節を含む
ように切断した小節を、ペンジルアデニン３■／ｌを含
む’Ａ　Ｍ　Ｓ固形培地に置床し、上記と同条件下で培
養した。その後継代培養を１回おこなって得た植物体お
よび５あるいは１０回おこなって得た植物体の葉柄部お
よび葉部をそれぞれ芽が混じらないように採取した（一
次培養）。

なお、継代培養も上記と同様な条件下でおこなった。得
られた葉柄部および葉部をペンジルアデニン１０ｍｇ／
Ｊを含むＸＭＳ固形培地に置床し培養した。また、先に
得られている無菌状態の多芽状植物体から継代回数０回
として、直接得た葉柄部および葉邪についても芽が混じ
られないように切り取り、ペンジルアデニン１０■／ｌ
を含むＸＭＳ固形培地に置床し、培養した。

各々の葉柄部および葉部の培養は、２５℃、４０００ル
クス、１６時間日照の条件下、７週問おこなわれた。そ
の結果、葉晒部および葉部から多数の不定芽が発生した
（二次培養〉。

さらに培養を続け３週間後に、３０ｇ／ｆのシュークロ
ースのかわりに３ｇ／ｉのシュークロースを含むＡＭＳ
固形培地に移植した。２５℃下、４０００ルクスで１６
時間日照後８時間暗期による操作を繰返しながら、２週
間培養した後、鉢上げ可能な植物体が得られた。

ローヤル　ルビ−（Ｒｏｙａｌ　ｒｕｂｙ）　、ディー
ブレッド（Ｄｅｅｐ　ｒｅｄ）の２品種についても、上
記と同様な操作をおこなって、不定芽を発生させ、植物
体を再生させた。

結果を第１表に示す。第１表は、それぞれの品種におけ
る、継代培養の回数と不定芽を形成した葉柄部および葉
部の割合を示したものである。なお、比較として、一次
培養時の５回目の継代培養の際、％ＭＳ固形培地を用い
て培養した植物体の葉柄部および葉部を用いる以外は、
上記と同様な操作をおこなった場合についても第１表に
示す。

第 １ 表 発明の効果 本発明によれば、バラ属植物の葉柄部および葉部の体細
胞からの不定芽形成、植物体の再生が可能となり、体細
胞変異、遺伝子導入技術のバラ．嘱植物への応用が可能
となる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）バラ属植物の側芽あるいは頂芽を０．１〜３０．
   ０ｍｇ／ｌのサイトカイニンを含有する培地で培養し、
   側芽あるいは頂芽を有する植物体を得る工程、得られた
   植物体の側芽あるいは頂芽について前記工程を少なくと
   も１回繰返し（以下、継代培養という。）かつその継代
   培養中の最終継代培養にあっては４〜８週間培養する工
   程を経て得られる植物体の葉柄部および葉部を、３．０
   〜３０．０ｍｇ／ｌのサイトカイニンを含有する培地で
   培養することにより不定芽を形成させることを特徴とす
   るバラ属植物の不定芽形成方法。（２）継代培養時の培
   地中のサイトカイニンの含有量が１．０〜１０．０ｍｇ
   ／ｌである請求項（１）記載のバラ属植物の不定芽形成
   方法。