JPH03105253A - 高度にモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの選択的クローニング - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はハイブリドーマ技術に属するものであって、普
通の水準より一層高度にモノクローナル抗体（Ｍ　Ａ　
ｂ）を分泌する細胞を選別し、これをクローニングする
ための予測可能で、かつ迅速な方法を提供する。この方
法は、細胞表浦に平均より一層高密度の免疫グロブリン
を有する細胞を選び出すことに基づいている。

従来の技術 モノクローナル抗体はバイオテクノロジー関連生産物の
急速に発展した分野の主要な構戊要素となった。ＭＡｂ
診断および治療用生産物の開発と全般的な流通のため、
大規模な生産技術が必要であることが明白になった。

ＭＡｂは腹水液採取によりイン・ビボで生産できるが、
イン・ビトロによる細胞大量培養が多くの点で好ましい
［サモイロピッチ（Ｓ　ａｍｏｉｌｏｖｉｃｈ）ら（１
９８７年）、ハイプリドーマ・テクノ口ジーニュー・デ
ベロップメンツ・オブ・ブラクティカル・インタレスト
（ハイブリドーマ技術：実用的に興味のある新しい開発
）、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（　
Ｊ　．　　Ｉ　＋ｎｍｕｎｏ１、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、
１０１巻、１５３頁］。これらの大量培養に要する著し
い生産経費のため、反応性ＭＡｂの最高収量を挙げるこ
とが実に重要である［ベレッ（Ｖｅｌｅｚ）ら（１９８
６年）、キネティックス・オブ・モノクローナル・アン
ティボディー・プロダクション・イン・ロウ・シーラム
・グロウス・メジウム（低血清増殖培地におけるモノク
ローナル抗体生産の速度論）、ジャーナル・オブ・イム
ノロジカル・メソッズ（　Ｊ　．　　Ｉ　ｍｍｕｎｏ１
、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、８６巻、４５頁、リューベニ−
（Ｒ　ｅｕｖｅｎｙ）ら（１９８６年）、コンハリスン
・オブ●セル●ブロパゲーション・メソッズ・フォア・
ゼア・エフェクト・オン・モノクローナル・アンティボ
ディー・イールド・イン・ファーメンターズ（発酵槽に
おけるモノクローナル抗体収量に対する細胞増殖方法の
効果の比較）、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メ
ソッズ（　Ｊ　．　　Ｉ　ｍｉｕｎｏ１、　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ）、８６巻、５３頁］。

これまでのこの領域における報告の多くは、培地の配合
を最適化し、環境培養条件を調節することによってＭＡ
ｂ収量を改善する方法を記載している（サモイロピッチ
ら、前掲）。然しながら欠けているのは高濃度のＭＡｂ
を分泌できる初期の変異ハイブリドーマのスターター培
養の選択および維持に関する議論である。

モノクローナル抗体を生産する方法はｌ９７５年にケー
ラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ）によって最初に報告された。それ以来、彼らの
方法に関して多数の変更および改良が加えられてきた［
それらに関する全般的な総説はメソッズ●イン●エンジ
モロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅ　ｎｚｙｍｏ
１ｏｇｙ）、１２１巻、１９８６頁参照］。本発明は新
規なハイブリドーマを構築する方法に関するものではな
く、既存のハイブリドーマ細胞系をクローニングし、こ
れを再選別する方法に主眼をおいている。

ハイブリドーマ細胞は４倍体骨髄腫細胞と２倍体抗原刺
激リンパ球の融合によって生じる。ここで骨髄腫細胞は
培養中で無限に増殖する能力を付与し、一方、抗体の特
異性およびその型を暗号化している遺伝情報はリンパ球
からもたらされる。

生じたハイブリドーマ細胞は無限に増殖し、既知の特異
性を有する一律に矛盾のない均質なＭＡｂを分泌するこ
とができる。その倍数体性のため、生じたハイブリドー
マはまた遺伝子的に不安定でアル。ハイブリドーマの遺
伝子的不安定性とは、時間経過と共に表現型の深刻な変
化をもたらすことがあるという、よく立証された事実で
ある。ハイブリドーマ培養はＭＡｂを分泌する速度を減
じ、それに対応してその増殖速度を増大することが極め
て多い。それらの変化が重なった結果、培養はＭＡｂを
産生じ分泌する能力が次第に低下し、絶えず基質消費量
が増大し、そのためＭＡｂではなく、大きい菌体塊だけ
を生じるということが起こる。アイソタイプスイッチン
グは、ハイブリドーマ細胞系を連続培養し放置した場合
に起こり得るもう一つの表現型の変化である。アイソタ
イプスイッチングは、培養中の小量の細胞亜集団が異な
ったタンパク質主鎖（アイソタイプ）へと変化するが、
前と同一の抗原特異性を維持しているときに起こる。ハ
イブリドーマ培養が被り得る最も有害な表現型の変化は
増殖能を失うことである。この現象はかなり一般的に起
こることであり、細胞が、増殖に不可欠な構造タンパク
質または酵素を暗号化している染色体を放出したり、あ
るいはこれを複製し損なうと、極めて急速に起こる。上
に掲げた幾つかの好ましくない特徴を排除しまたは回避
するためには、遺伝的に安定で均質な細胞系を維持でき
るよう、ハイブリドーマ培養をたびたび、継続的に再遺
別またはクローニングすることが必要である。

ハイブリドーマ培養は、限界希釈法によるクローニング
、軟アガロース上でのクローニング、または蛍光染色細
胞自動選別法によるクローニングからなる３種の基本約
手技のうちの任意の１つを用いてクローン化する。限界
希釈法によるクローニングは、細胞の小型集団を無作為
に選別し、ついで極めて低濃度でこれを増殖培地へ希釈
することによって行なわれる。ついで理論的に１または
それ以下の細胞を含有する細胞浮遊液の少量のアリコー
トを、それらが新しい培養として増殖し得る別々の増殖
ウエルヘ加える。

軟アガロース上でのクローニングは、好適量のアガロー
スを含有する加温培地で極めて希薄な細胞浮遊液を作成
することによって行なわれる。理論的に１０〜１００個
の細胞を含有している細胞浮遊液の一定容量をペトリ皿
に入れ、これを冷却し固化させる。個々の細胞が増殖し
分裂すると、半固体培地で固定された細胞コロニーが生
じる。

この手技はちょうど細菌学における混釈平板法に類似し
ている。

最後に蛍光染色（活性化）細胞選別法はハイブリドーマ
培養のクローニングを促進することができる。この場合
は、細胞が単一細胞の流れとして装置内を流れるので、
レーザー光は個々の細胞に向けられる。細胞の濃密な核
物質がレーザー光線の通過を妨げると光散乱パターンを
生じる。したがってレーザー光散乱能に基づいて細胞を
無作為に選別することができる。細胞が同定されると、
細胞の流れからこれを分取し、自動細胞クローニング装
置によって増殖ウエルヘ送る。このフロー法は、蛍光染
色細胞選別機が、１個の、ただｉ個の細胞を別々の増殖
ウエルヘ割り当てる点で前記の各手技より明らかに優れ
ている。その他の方法は、統計的にｌウエル当たりｌ細
胞または１単位エリア当たり１細胞となる機会を、確実
にではなく、およそ見込みで設定する理論的な計算に依
存している。

上記の３つの手技はすべて、細胞の無作為的な選別に依
存している。所望のＭＡｂ分泌特性を有するクローンの
単離に成功するのは、無作為確率の法則にしたがうしか
なく、それ以上に予測可能なものではない。本発明は無
作為選別によってクローンされた細胞よりも、一層高水
準で分泌することが最も期待できる、単一細胞クローニ
ングのためのハイブリドーマ細胞を選別する方法を提供
するものである。

本発明は、既知の特異性を有するモノクローナル抗体を
親ｍｂより一層高水準で分泌する、形質膜に関連しかつ
その形質膜の外表面に存在する免疫グロブリンを含有す
る、該親細胞由来の細胞集団を選択的に単離する方法で
あって、該免疫グロブリンと優先的に結合するプローブ
と親培養細胞を接触させ、高いプローブ濃度を有する細
胞を細胞自動選別機によって単離することからなる方法
を提供するものである。本発明はさらに自動クローニン
グ設備を設置した細胞自動選別機によって、選ばれた細
胞をそれぞれ別々の増殖ウェルヘ割り当てる方法を提供
するものである。最後に本発明は、本質的に非分必型の
ハイブリドーマ培養のモノクローナル抗体分泌能を助け
る方法を提供するものである。

下記の本発明に関する詳細な説明は蛍光プローブおよび
蛍光染色細胞選別機に主眼をおいているが、細胞表面に
ある免疫グロブリンを検出するその他の方法も完全に使
用し得る。蛍光プローブおよび蛍光染色細胞選別機を使
用する下記の説明は単に本発明を説明するため例示した
ものである。

たたし蛍光検出が好ましい。

ハイブリドーマ細胞は、ｌまたはそれ以上の骨髄腫細胞
とｌまたはそれ以上のリンパ球との融合によって作或さ
れた真核細胞である。多数の異なった型の骨髄腫細胞が
アメリカン・タイプ・カルチャー●コレクション（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ）［ｏ　’／クビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
）、マリーランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ）］およびベント
レックス・ラボラトリーズ社（Ｖ　ｅｎｔｒｅｘ　　Ｌ
　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　　Ｉ　ｎｃ．　）［ポー
トランド（　Ｐ　ｏｒｔｒａｎｄ）、メイン（Ｍａｉｎ
ｅ）コから商業的に入手可能である。リンパ球は免疫し
たドナーのさまざまな臓器部位から入手できる。最も代
表的な部位はひ臓、リンパ節および血液である。

アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴ
ＣＣ）に貯蔵され、カタログに掲載されている本発明に
利用できる樹立ノ＼イブリドーマ細胞系の例を下表に示
す。

抗原決定基 型 名称 ＡＴＣＣ番号 アセチルコリンエステラーゼ （ヒト）　　　　　　　　　ＩｇＧ．　　　ＡＥ−２ア
クチン（原核性） ＩｇＧ， ＡＣＴ　＋ ［ＩＢ　７３ １１Ｂ　８０ 細菌性アドヘッシン （Ｋ９９線毛）　　　　ＩｇＧ ２ＢＤ４Ｅ４　Ｋ９９　ＨＢ　８１７８ガン胎児性抗原 （ＣＥＡ）、高分子 絨毛性ガン クラトリン （ウシ、脳） 結腸直腸ガン ＩｇＭ ＩｇＧ， １１１６ＮＳ−３ｄ　　ＣＲＬ　８０１９１６２−４６
．２　　　ＨＢ　１８７ ＩｇＧ＊ａ　　ＣＶＣ．７　　　　ＴＩＢ　１３８１１
１６−ＭＳ−　　　｝ＩＢ　８０５９１９−９ Ｉｇｃｌ Ｃ１ｑ（ヒト） ｃｔｑ（ヒト）　　　　　　ＩｇＧ ジフテリア毒素 ＩｇＧ ＩｇＧ （ヒト） ４＾４Ｂｌ１ １２Ａ５Ｂ？ １６Ｍ３Ｆｌ０ ８Ｂ　８３２７ １１Ｂ　８３２８ ！ＩＢ　８３６３ ｄｓＤＮＡ ＩｇＭ ＣＨ２６−１３５２ ＪＩ８　８３２９ ＤＮＡポリメラーゼα ＩｇＧ＋ ＳＴＫ　　１ ＣＲＬ　１６５２ エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）（Ｋ９９線毛）　　　　ＩｇＧ　　　２ＢＤ４Ｅ４
　Ｋ９９　ＨＢ　８１７８（表つづき） ？ｇＧｔａおよびＩｇＧｔｂ （マウス）　　　　　　ＩｇＧ■　ＥＤＩ−１９−１（
ラ１｝）　　　　６−５ ｒｇｃ，ヒンジ領域 （ヒト）　　　　　　　　　Ｉｇｃｌ ＨＰ　６０４７ ＩｇＧ．Ｆｃ領域 （ヒト） ＩｇＭ（Ｆａｂ部分〉 ＩｇＧ＋ ＨＰ　６０２５ ＩｇＧ＋ Ｍ−２８６ インスリン ＩｇＧ． ＣＥ９　｝＋９ インスリン（ヒト） （＾８〜１０残基） Ｉｇｃ， 八Ｅ９Ｄ８ ｙインターフェロン （ヒト）　　　　　　　　　Ｉｇｃｌ ＩＦＧＣＰ−ＦＩ ＢＡＩＯ インターロイキン−４ ＩｇＧ，　　　ＩＩＢＩＩ ＨＢ　９０ ＣＲＬ　１７７４ ＣＲＬ　１７７５ ｝ＩＢ　１３８ ＪＩＢ　１２７ ＨＢ　１２５ ＨＢ　８２９１ ＨＢ　［８ レジオネーラ・ニューモフィラ （Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）Ｉ
ｇＧ１ｂＬｐｌ　ＭＡＢ２　　ＣＲＬ　１７７０κ軽鎖
（ヒト）　　　　ＩｇＧｔａ　　ＨＰ　６０５３　　　
ＣＲＬ　１７５８集光性複合体 （ＬＩＩＣ−１１．） ＩｇＧｌ ＭＬＴ｛１ ＣＲＬ　１７６６ （表つづき〉 フィブロネクチンＩｇＧ，　　Ｐ，ＮＰ／ＰＦＮ　　Ｈ
Ｂ　９１フォルスマン抗原１ｇＭ　　　Ｍｌ／２２．２
５．　　ＴＩＢ　１２１（ラ？｝）　　　８．１比 グルタミン酸脱炭酸酵素 ＩｇＧ＋　　ＣＡＤ−１ ＨＬＡ抗原 Ａ２ ＩｇＧｔｂ　　Ｂ８７．２ ＡｌｌおよびＡ２４ ＩｇＧ３ Ａ，Ｂ，Ｃ（単一形） ＩｇＧ Ｂ７およびＢ４．ＩｇＧ Ａｌ１、　ＬＭ ＨＢ　１８４ ＨＢ　８２ ＨＢ　１６４ ＢＢ７．５　　　　　１Ｉ８　１２０ ＢＢ７　６　　　　　ＨＢ　１１５ ＤＲ，ＤＰおよびＤＱ ＩｇＧ＋　　　ＩＶＡ１２　　　　　ＨＢ　１４５Ｉａ
−ヒト（単一形）　　ＩｇＧｔａ　　Ｌ２４３　　　　
　ＩＩＢ　５５ＩｇＥ（ヒト）　　　　　ＩｇＧ，．　
　Ｅ５ＢＢ３１１Ａ２　　１１Ｂ１２１ｒｇＧＦｃ領域 （ヒト） ＩｇＧｔａ　　ｌ｛Ｐ　６０１７ Ｉ　ｇｃ　，，およびＩｇＧｔｂ （マウス）［ｇＧｔａ　　ＥＤＩ−１９−１６−５ ＣＲＬ　１７５３ ＪＩＢ　９ｆｌ （表つづき） 低密度リボタンバク質（ＬＤＬ）受容体く家兎）　　　
　　　［ｇＧ．　　９Ｄ９肺ガン（非小細胞）　ＩｇＧ
，．κ７０４Ａ１肺ガン（小細胞）　　ＩｇＭ　　　Ｓ
ＭＩＬｙｔ２．２ 乳ガン 黒色腫 リンパ球（活性化） （ヒト）　　　　　　　　　ＩｇＧ＋ ＯＫＴ！Ｉ ＩｇＧｌｂ　　２．４３ ０γト） ＣＲＬ　１７０３ １１Ｂ　８３０２ ■Ｂ　８４６２ ＣＲＩ、８０２１ ＴＩＢ　２１０ ＩｇＧ，　　　Ｂ６．　２　　　　　ＨＢ　８１０６＋
ｇＧ！．　　ＸＭＭＭＥ−００１　　１１８　８７５９
七ノアミン酸化酵素Ｂ （ヒト）　　　　　　　　　ＩｇＧ ＭＡＯ−１ｃ２＃８１　｝ＩＢ　８１７６ｃ−ｒａｙｃ
タンパク質 （ヒト） ｒｇＧ　＋ ＭＹＣ　ＣＴ９ Ｂ７．３ ＣＩ？Ｌ　１７２５ ｖ−ｍｙｂタンパク質 （ウイルス）　　　　　Ｉｇａ，　　ＭＹＢ　２−７．
７７　　ＣＲＬ　１７２４神経芽細胞腫細胞　１ｇＭ　
　　Ｍａｂ　１２６　　　ＪＩＢ　８５６８ヌル細胞（
ヒト）　　　ＩｇＧｔｂ　　ＯＫＭＩ　　　　　ＣＲＬ
　８０２６オルニチン脱炭酸酵素 （マウス、腎臓）　　　ＩｇＭ　　　Ｂｌｌ　　　　　
ＩＩＢ　８３７２レニン（ブタ）　　　　ＩｇＧ．　　
Ｆ３２ＶＩＩＩＣ４　　ＣＲＩ、１６５３（表つづき） リシンＡ鎖 リシンＢ鎖 小細胞ガン（ヒト） ＩｇＧ，　　ＴＦＴＡＩ　　　　ＣＲＬ　１７７１Ｉｇ
Ｇ．　　ＴＦＴＢＩ　　　　ＣＲＬ　１７５９ＩｇＭ　
　　ＳＭＩ　　　　　ＨＢ　８４６２Ｔ細胞サブセット
およびマクロファージ（ブタ）　　　　　　　　ＩｇＭ
κ　７６−６−７　　　　１Ｂ　１４１Ｔ細胞表面抗原
　１ｇＭ　　　２Ｔ８−３ＥｌＯ　　ＨＢ　８２１３（
ヒト） Ｔ細胞（末梢） （ヒト）　　　　　　　　　ＩｇＧ，，　　ＯＫＴ３　
　　　　　ＣＲＬ８００１破傷風毒素　　　１ｇ０　　
　９Ｆ１２　　　　ＨＢ　８１７７（ヒト） トロンボスボンジン ＩｇＧｔａ　　ａｈＴＳＰ−１　　　ｔｌＢ　８４３２
Ｌ−チロキシン　　ＩｇＧ．　　Ｔ４ク■一冫３　　Ｈ
Ｂ８４９９？ランスフエリン受容体 ＩｇＧ■　Ｌ５．　１ ＪＩ８　８４ ２，４．６４リニトロフエニル ＩｇＧ，　　ｌＢ７．１ｌ ＴＩ８　１９１ ウイルス性抗原 エブスタインーバーウイルス ＩｇＧ＋　　７２Ａｌ １｛８　１６ｇ Ｂ型肝炎表面抗原１ｇＧＩ　　Ｈ２５ＢＩＯ　　　ＣＲ
Ｌ　８０１７（表つづき） ｌ型単純ヘルペスＩｇＧｔｓ　　３９−Ｓ　　　　ＪＩ
Ｂ　８１８０インフルエンザウイルス ＩｇＧ＊　　ＨＫ−ＰＥＧ−Ｉ　　ＣＬ　１ｇ９インフ
ルエンザＡ核タンパク質 ＩｇＧ＋　　４６／４　　　　ＨＢ　６７当業者であれ
ば上記の表に列挙したハイブリドーマ細胞系が既知の方
法によって入手でき、または構築することができる細胞
系を単に例示するために示したものであり、そのような
表によって本発明が何ら制限されるものではないことは
よく理解し得よう。

ハイブリドーマ細胞はＭＡｂを産生じ、これを周囲の培
地へ分泌する。またノ＼イブリドーマは構成要素として
または受動的に形質膜外表面に関連している同一のタイ
プの、そして同一の特異性を有するＭＡｂを有する。現
在のところこれらのＭＡｂが細胞表面に出現する正確な
メカニズムは分かっていないが、いずれにせよ本発明は
そのようなメカニズムとは係わりがない。本明細書に於
いては、細胞外表面に出現し、構成要素としてまたは受
動的にこの膜と関連しているＭＡｂを免疫グロブリンと
呼ぶ。

本発明は高度の免疫グロブリン発現と高度のＭＡｂ分泌
の間の相関関係を利用するものである。

この相関は高いので、高密度の免疫グロブリンでハイブ
リドーマを選別することにより、高いＭＡｂを分泌する
培養を単離し得る一般的な確率は従来の方法より著しく
高い。

興味ある細胞を同定し、選別するのに使用するプローブ
の性質は種々変わり得る。本発明の実施を可能にするた
め、プローブは２つの機能を果たすべきである。第１に
プローブは細胞の外表面上に存在する免疫グロブリンと
優先的に結合すべきである。第２にプローブは蛍光染色
（活性化）細胞選別機に適合可能な態様で蛍光を発する
ことができなければならない。プローブがこれら２つの
機能を果たし得る限り、その正確な構成はさほど厳密さ
を問わない。

当業者であれば、本発明がプローブの免疫グロブリンへ
の１工程付着だけに限定されるものでないことを理解し
得よう。２或分系または多戊分系プローブもまた本発明
の範囲に含まれ、その技術範囲に包含される。

例えばビオチンーアビジンは周知の２成分プローブ系で
ある。この場合、免疫グロブリンと特異的に結合する抗
体またはタンパク質を、化学的にビオチンと結合させる
。そのようなビオチン化した抗体およびタンパク質は商
業的に入手可能である（下表を参照）。ビオチンへ特異
的に結合するアビジンはプローブの第２成分であり、フ
ルオレセインおよびテキサスレ・ノド（（Ｔｅｘａｓ　
　Ｒｅｄ）、商標）（ベーリンガー・マンノ＼イム（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディ
アナポリス（　Ｉ　ｎｄｉａｎａｐｏｌ　ｉｓ）、ＩＮ
）と結合した形で商業的に人手できる。ビオチン化した
タンパク質は免疫グロブリンに対し特異的であり、プロ
ーブの第ｌ戊分を構成する。プローブの第２成分は蛍光
色素で標識したアビジンである。このようにビオチン化
した抗体または夕ンバク質の特異性を介して蛍光色素を
究極的に免疫グロブリンへ結合させる。

既に標的と特異的に結合した別の抗体へ抗体を結合させ
ることによって蛍光シグナルを増幅する技術は免疫学の
分野で周知のことであり、これは多戊分系プローブと考
えられる。そのようなプローブの例は、マウス免疫グロ
ブリンに特異的であるヤギ抗血清から組立てられ、ヤギ
抗体に特異的であるヒツジ抗血清によって結合される。

ついでヒツジ抗体と特異的に結合する蛍光色素で標識し
た家兎抗体をヒツジ抗体と結合させる。この場合、ヤギ
抗血清は、マウスハイブリドーマの表面に存在している
免疫グロブリンと特異的に結合するプローブの戊分であ
る。蛍光色素で標識した家兎血清は蛍光を発するプロー
ブの成分である。ヤギおよびヒツジ抗血清は、細胞表面
の免疫グロブリンへ特異的に結合するプローブ或分へ蛍
光部分を結合させるプローブの構成要素である。

ある与えられた種によって産生きれる任意の抗体のＦｃ
領域へ結合する普遍的プローブも同様に使用し得る。こ
れらの型のプローブは、さまざまな宿主種において種々
の型の抗体クラスに対して生じた抗血清およびＭＡｂか
ら或る標準的な免疫学的試薬である。ＭＡｂおよび抗血
清を精製し、好適な特異性を保証するために免疫吸着す
る。ついで精製した試薬をフルオレセイン、ロータミン
、テキサスレッド（商標）、フィコエリトリンまたはフ
ィコシアニンのような標準的な蛍光色素へ化学的に結合
させる。このプローブ型のための多数の商業的な入手源
がある。その幾つかの例を下表に示す。

（以下余白） 入手源　特異性 （ＭＡｂ） マウス （ＭＡｂ） 鎖 家兎１ｇＧ ヒトＩｇＧ ヒトＩｇＧ マウスＩｇＧ マウスＩｇＭ 家兎１ｇＧ ラットＩｇＧ マウスＩｇＧ ラットＩｇＧ 家兎１ｇＧ Ｌ｝ＩｇＧ ７ウスＩｇＧ ７ウスＩｇＡ ヒトＩｇＧ−Ｆｃ ７ウスＩｇＧ 蛍光色素 （ビオチン） ａ一タ゛ミン トタ゛ミン ａ一タ゛ミン ロータ′ミン ａ一タ゛ミン ａ一タ゛ミン テキサスレ１ト゛３ テキサスレアト゛８ フィゴエリトリン フィコエリトリン フィゴシ１二冫 （ヒ゛オｆ冫） ７ルオレセイン α一タ゛ミン 提供会社 ア７プク社ｔ） カルＥ゛オケム２） カル七゛オケム２） カルヒ゛オケム２） カルヒ゛オケム２） カルヒ゛オケム２） カルヒ゛オケム２） カルＬ゛オケム２） カルヒ゛オケム２） カルヒ゛オケム２） カルヒ゛オケム２） カルビオケム２） カルＥ゛オケム２） 力へ゜ル３） 力へ６ル３） （表つづき） 家兎　　ヒトＩｇＧ ￥１　　　　　マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’　）ｔ テキサスレ１ト゛３　　　カヘ゜ル３）７ルオレセイン
　　　　　力ヘ゜ル３）ヤ今゛ 家兎 Ｌ７シ′ ヒトＩｇＥ ヒトＩｇＧ 七｝ＩｇＧ フルオレセイン フルｔレセイン ７ルオレセイン 力へ゜４３） 力へ゜ル３） 力ヘ０ル３） （表つづき） ラブト　　　　　７ウス＋ｇ０．　　　　７ルオレセイ
ン（ＭＡｂ） サ゛イムト゛７） ７ウス　　　　　ヒトＩｇＧ＋ （ＭＡＲ） （ｈ”オチン） サ゛イムト゛７） マウス　　　　　ヒトＩｇＧｚ，，　　　（ヒ゛オヂノ
）（ＭＡｂ） サ゛イムト゛７） ？フト　　　　　マウスＩｇＧ■　　（Ｌ’オチン）（
ＭＡｂ） サ゛イムト゛７） ラブト　　　　　７ウスＩｇＧ１ｂ　　　（ヒ゛オチン
）（ＭＡｂ） サ゛イムト゛７） ラット　　　　　マウスＩｇＭ　　　　　（ヒ゛オｆン
）（ＭＡｂ） サ゛イムト゛７） ヤキ゛　　　　　　Ｅト１ｇＧ　　　　　　（ヒ゛オｆ
冫）　　　　　９゛イムト゛７）ｌ）アマソク社（Ａｍ
ａｃ　Ｉｎｃ．）、ウエストブルツク（Ｗｅｓｔｂｒｏ
ｏｋ）、ＭＥ ２）カルビオケム（Ｃ　ａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、サンジ
エゴ（ＳａｎＤ　ｉｅｇｏ）、ＣＡ ３）カペル（Ｃａｐｐｅ！）、マルバーン（Ｍａｌｖｅ
ｒｎ）、ＰＡ ４）ジャンセン社（Ｊａｎｓｅｎ　　Ｉｎｃ．　）、ビ
スカタウエイ（　Ｐ　ｉｓｃａｔａｗａｙ）、ＮＹ５）
バンデックス部門（Ｐａｎｄｅｘ　　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ
）、マンデライン（Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ）、ＩＬ６）セ
ラ・ラボ社（Ｓｅｒａ　　Ｌａｂ）、ウエストバリー（
Ｗｅｓｔｂｕｒｙ）、ＮＹ ７）ザイムド（　Ｚ　ｙｍｅｄ）、サンフランシスコ（
ＳａｎＦ　ｒａｎｃｉｓｃｏ）、ＣＡ 当業者であれば、上記の表に列挙したプローブが既知の
方法によって入手でき、または構築することができるプ
ローブを単に説明するため例示したものであり、そのよ
うなリストによって本発明が何ら制限されるものでない
ことをよく理解し得よう。

また抗原を蛍光色素で標識するか、または本来蛍光性を
有している場合、免疫グロブリンのＦａｂ領域と結合す
る特定の抗原をプローブとして使用することもできる。

例えば本発明を用いて、インスリンに特異的であるＭＡ
ｂを産生ずるハイブリドーマ培養を選択的にクローニン
グする場合、フルオレセイン標識したインスリン［シグ
マ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　
Ｃｏ．　）、セントルイス（Ｓ　ｔ．　　Ｌｏｕｉｓ）
、ＭＯコもまた特異的なプローブとして使用できる。抗
原型プローブの他の２つの例は、フルオレセインで標識
したウシ血清アルブミンおよびフルオレセインで標識し
たイヌ血清アルブミンであり、これらは２つとも商業的
に入手可能である（シグマ・ケミカル社、セントルイス
、ＭＯ）。これらの試薬は、それぞれウシ血清アルブミ
ンおよびイヌ血清アルブミンに特異的なＭＡｂを産生ず
るハイブリドーマ培養に本発明を適用する際にプローブ
として使用できる。

精製したタンパク質は、実質的にすべて十分確立された
手技を用いて容易に蛍光化できるから、本発明に使用す
るのに好適な抗原型プローブを組立てることができる。

商業的に人手可能な精製タンパク質の例として、ガン胎
児性抗原［Ｃ　Ｅ　Ａ，バイオデザイン社（Ｂ　ｉｏｄ
ｅｓｉｇｎ　　Ｉ　ｎｃ、）、ケンネバンクボート（Ｋ
　ｅｎｎｅｂｕｎｋｐｏｒｔ）、ＭＥ］、ヒト絨毛性性
腺刺激ホルモン［ｈＣＧ，ケンブリッジ・メジカル・ダ
イアグノスティックス社（　Ｃ　ａＩＩｌｂｒ　ｉｄｇ
ｅｅｌｌｅｒｉｃａ）、ＭＥ］、ヒト或長ホルモン［ｈ
ＧＨ１ハイブリテック（Ｈ　ｙｂｒｉｔｅｃｈ）、サン
ジエゴ（ＳａｎＤｉｅｇｏ）、ＣＡ］のようなタンパク
質は蛍光色素で標識できる。蛍光色素で標識すれば、Ｃ
ＥＡＳｈＣＧおよびｈＧＨに対し、それぞれ対応するＭ
Ａｂを産生ずるハイブリドーマ培養に本発明を適用する
際、これらのタンパク質は好適なプローブとなる。タン
パク質を標識するために確立した手技を用い、本発明に
使用できる多くの抗原プローブを組立てることができる
。

ハプテンは、それ自身に対する免疫反応を惹起すること
ができない化学的化合物である。然しこの化合物を真の
免疫原と結合すると、免疫系が反応し、それまで非免疫
原であった化合物に対し抗体を産生ずることができる。

そのような免疫原の１つはキーホールリンペットヘモシ
アニン（ＫＬＨ）タンパク質である。抗生物質アクチノ
マイシン−Ｄ（Ａｃｔ−Ｄ，シグマ・ケミカル社、セン
トルイス、Ｍｏ）はハプテン物質の例である。免疫系を
ＫＬＨと結合させると、Ａｃｔ−Ｄは高い免疫原性を有
するＫＬＨタンパク質上の抗原エビトープとして作用す
る。Ａｃｔ−Ｄに対するＭＡｂを分泌するハイブリドー
マが組立てられた。当業者は通常の手段により、蛍光色
素をＡｃｔ−Ｄへ直接、またはＫＬＨのような担体タン
パク質へ結合することができ、生じた結合体を本発明の
プローブとして使用できることは容易に理解し得よう。

その他のハプテンプローブも同様の方法で組立てること
ができる。２，４−ジニトロフェノールおよび２，４．
６−｝リニトロフェノールのようなハプテン化合物は、
蛍光色素で標識したＫＬＨのような担体分子へ結合する
と、本発明の好適なノ１プテンプローブである。

ハプテンプローブを組立てるために、他にも多くの可能
性がある。ホスホコリンおよびホスホチ口シン（ベーリ
ンガー・マンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）のよ
うな化合物もＭＡｂを生じるハプテンとして使用されて
いる。これらの化合物を蛍光色素標識担体タンパク質と
結合させると、本発明の好適なハプテンプローブである
。一般にハプテンとして免疫反応を惹起できる任意の化
合物は、蛍光色素で直接標識するか、または蛍光色素で
標識した担体タンパク質へ結合させて本発明のハプテン
プローブとして使用できる。

特定の抗原またはハプテンは適当な蛍光特性を持ってい
ることがあり、本発明のプローブとして、その天然の抗
原またはハプテンそのものを使用することができる。フ
ルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド（商標）、
フィコエリトリンおよびフィコシアニンのようなすべて
の標準的な蛍光色素は、これらをハプテンーとして使用
すれば、この特殊状況の例となる。

本発明を説明するため、蛍光染色細胞選別機を例示的に
使用する［その簡単な概説としてハーゼンバーグ（Ｈ　
ｅｒｚｅｎｂｅｒｇ）ら（　Ｌ９　７　６年）、フルオ
レッセンス・アクティベーティッド・セル・ソーティン
グ（蛍光染色細胞選別法）、サイエンティフィック・ア
メリカン（Ｓｃｉ，　ＡＩＩｇｅｔ．　）、２３４巻、
１０８頁、詳細な検討のためにはフロー・サイトメトリ
ー・アンド・ソーティング（フローサイトメトリーおよ
び選別方法）、メラマド（Ｍｅｌａｍａｄ）、マラニー
（Ｍｕｌｌａｎｅｙ）およびメンデルソーン（Ｍｅｎｄ
ｅｌｓｏｈｎ）Ｅｌ、ジョン・ウイリー・アンド・サン
ズ社（Ｊｏｈｎ　　Ｗｉｌｅｙ　　ａｎｄ　　Ｓｏｎｓ
　　Ｉｎｃ，　）、ニューヨーク（Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ
）、１９７９年参照コ。簡単に説明すれば、蛍光染色細
胞選別機に細胞浮遊液を加え、検出機の近くに配置され
たレーザーによって細胞を１列に通過させる。細胞が装
置を通過する時、検出器が各細胞の蛍光強度を測定し、
細胞番号対蛍光強度のヒストグラム・プロットを作戊す
る。ゲート即ち限界点をヒストグラム上に設けることが
でき、このようにして特定の細胞集団を同定できる。選
別した細胞を他のすべての細胞から分離するよう静電的
に装置に指示が与えられる。

バッチ形式では蛍光染色細胞選別機はゲート域内に入る
細胞を共通容器へ分離分取する。得られたバッチ採集培
養は単クローン的に誘導された培養ではなく、したがっ
て選別過程を完了した時点では、培養は遺伝子的に不均
一（ヘテロローガス）である。この不均一状態は、新し
くバッチ選別された培養が、それが誘導されたもとの培
養が分泌するより一層高率にＭＡｂを分泌する事実を打
ち消すものではない。

最近、蛍光染色細胞選別機に自動細胞クローニング装置
を設置することができる。そのような装置は、選別した
細胞を１個ずつ個々の増殖ウエルヘ割り当てるよう装置
に指示できるものである。

本発明を操作する好ましい方法は、選別した単一細胞を
一個の増殖ウエルに割り当て、そこで増殖させて単クロ
ーン的に誘導したハイブリドーマ培養を得ることによっ
て、新しい培養を樹立することである。このようにして
、遺伝子的な均一性が新たにクローニングされた培養内
で樹立される。

本発明による単離では、細胞自動選別機は、最高のプロ
ーブ強度を有する細胞群、それは通常培養内の細胞の小
画分であるが、それを選別するように設定される。選別
機に設定する強度水準および選別される細胞画分は、親
培養の状態および単離の目的によって決まる。一般に、
オペレーターは最初に培養のアリコートを選別し、強度
対細胞数のヒストグラムを記録すべきである。そうすれ
ば、オペレーターは選別水準を設定することができ、最
も活性な細胞の好適な数を単離することができる。

衰えた培地で、ＭＡｂがもはや検出できない程度まで培
養のＭＡｂ分泌能が劣化したとき、本発明は特に有用で
ある。細胞系はもはや本質的に非分泌型培養と考えるこ
とができる。この現象は当業者周知のことであり、「従
来の技術」の項で論じた理由により比較的しばしば起こ
る。ＭＡｂ水準が非常に感度の高い幾つかの測定の検出
限界以下であっても、培養が全く非分出であるわけでは
ない。本質的に非分泌型の培養でも、ＭＡｂ分泌能を有
している細胞が、ｉｏｏｏ個中ｌ個〜１００００個中１
個の範囲で存在することがある。従来のクローニング手
技を用いて、本質的に非分泌型の培養から生存可能な分
泌培養を単離することは可能ではあるが、極めて精力的
な、膨大な時間を消費する努力によってのみ達戊できる
。本発明は、ＭＡｂ分泌能を既に喪失した細胞を無作為
にクローニングするという困難な、時間を消費する過程
を回避するものである。本発明では数１０万の細胞を数
分間で選別し、ＭＡｂ分泌がなお可能な、ほとんど消滅
した少数の細胞を同定し捕捉することができる。

用いたクローニング手技に関わりなく、生じたハイブリ
ドーマ培養をＭＡｂ生産および特異性についてスクリー
ニングしなければならない。これらのパラメーターを測
定するための多くの技術および方法が科学文献に記載さ
れている。

本発明が従来のハイブリドーマ細胞に限定されるもので
はないことは強調されるべきである。既知の特異性を有
するＭＡｂを産生し分泌する任意の細胞型を利用する方
法は、本発明の範囲に包含される。本発明は生産される
ＭＡｂの型によって限定されない。雑種抗体、任意の種
のＭＡｂ、２価ＭＡｂおよび多重特異性ＭＡｂを産生ず
る細胞を利用する方法は、すべて本発明の範囲に包含さ
れる。

実施例Ｉ　　Ｌ２−ＫＳ マウスハイブリドーマ細胞系Ｌ２−ＫＳは詳細に報告さ
れており［スクーリング（Ｓ　ｔａｒｌｉｎｇ）ら、１
９８９年、イン・ビボ・エフィカシー・オブ・モノクロ
ーナル・アンチボディー−ドラッグ・コンジュゲーツ・
オブ・スリー・ディファレント・サブアイソタイプス・
ウイッチ・バインド・ザ・ヒューマン●チコーマー●ア
ソシエイティッド・アンチゲン・デファインド・パイ・
ザ・ＫＳ　ｌ／４・アンチボディー（ＫＳＩ／４抗体に
よって認識されるヒト・ガン関連抗原を結合するモノク
ローナル抗体一薬物結合体の３種の異なったサブアイソ
タイプの生体内における効果）、Ｃ．　　Ｉ．Ｉ．、２
８巻、ｌ７１頁］、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションからＨＢ９９４０の番号のもとに入手可能
である。簡単に説明すれば、この細胞系は、ＫＳＩ／４
として知られている４００００ダルトンのヒト・ガン関
連糖鎖抗原と反応するＩｇＧ，ＭＡｂを分泌するマウス
・ハイブリドーマである［バルキ（Ｖａｒｋｉ）ら、１
９８４年、アンチゲンズ・アソシエーティッド・クイズ
・ア・ヒューマン・ラング・アデノカルシノーマ・デフ
ァインド・パイ・モノクローナル・アンチボディーズ（
モノクローナル抗体によって認識されるヒト・肺腺ガン
関連抗原）、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　　
Ｒｅｓ．　）、４４巻、６８１頁］。

すべてのフロー・サイトメトリーによる細胞選別はエビ
ックスＣ　［Ｅ　ｐｉｅｓ　　Ｃ　（コールター・エビ
ックス部門（Ｃｏｕｌｔｅｒ　　Ｅｐｉｃｓ　　Ｄｉｖ
ｉｓｉｏｎ）、ハイアレ−（Ｈ　ｉａｌｅａｈ）、ＦＬ
］−フロー・サイトメーター細胞自動遺別機（ＦＣＣＳ
）で行なった。アルゴンイオン・レーザーから照射され
た４８８ｎｍ先の６００ＭＷでハイブリドーマ細胞を励
起した。

細胞に生じた蛍光発光を４８８干渉光学フィルターおよ
び５１５ロングパス吸収光学フィルターによって捕捉し
た。ＦＣＣＳ装置の光学的配置を最適化し、得られる蛍
光の読みを均一な蛍光球体を用いて標準化した。フロー
サイトメーターに「オートークローン（ＡＵＴＯ−ＣＬ
ＯＮＥ（商標）」（コールター・エビックス部門、ハイ
アレー、ＦＬ）とよばれる単一粒子または細胞を標準的
な９６ウエルの微量滴定培養板の選ばれた区画へ割り当
てるようプログラムを指令できる自動クローニング設備
を設置した。選別した蛍光球体の顕微鏡観察によって選
別遅延時間条件を確かめた。オートークローン（商標）
テスト評価では、３枚の別の微量滴定板のウエルへそれ
ぞれただ１個の蛍光球体が割り当てられるようにプログ
ラムした。蛍光顕微鏡検査により、２８８個のウエルは
いずれも正確に１個ずつの蛍光球体を保有し、重複した
り欠けたりすることはなかった。クローニング前に、９
５％エタノールを３０分間流すことによってＦＣＣＳの
細胞と接触する要素を滅菌し、ついで滅菌リン酸緩衝化
食塩液（ＰＢＳ，ギブコ（ＧＩＢＣＯ）、グランドアイ
ランド（Ｇ　ｒａｎｄ　　Ｉ　ｓｒａｎｄ）、ＮＹ）シ
ース（Ｓｈｅａｔｈ）Ｍで完全に洗い流した。

１〜３Ｘ１０’ハイブリドーマ細胞を回収し、ヤギ抗マ
ウスｒｇＧ−Ｆ　ＩＴＣ（ＡＭＩＧＧ−Ｆ　ＩＴＣ，キ
ャベル（Ｃａｐｐｅｌ）、Ｃａｔ＃　１　３　１　１　
−００８１、ウエストチェスター（Ｗｅｓｔ　　Ｃ　ｈ
ｅｓｔｅｒ）、ＰＡ）のＦ　（ａｂ’　）ｙ断片の１：
１０希釈液１ｊ１１２中で細胞を氷上で４５分間インキ
ユベートし、ついで培養培地［ＨＬ−１、ベントレック
ス・ラボラトリーズ、ボートランド、ＭＡ、１０％ウシ
胎児血清（ハイクローン（｝｛ｙｃｌｏｎｅ）、オグデ
ン（Ｏｇｄｅｎ｝、ＵＴ）添加］で２回洗浄することに
より選別する細胞を調製した。生存細胞を認識し選別す
るのに役立てるため、選別直前に細胞標品１ｆｆＣへヨ
ウ化プロピジウム５０μ９／ｘ（ｌ溶液２００μＱを添
加した。

選別すべき亜集団は直線ゲートにより、または集積した
２つのパラメーター（ＦＡＬＳ対対数グリーン蛍光）ヒ
ストグラムの多角形ビットマソブのいずれかによって認
識されるＦＣＣＳであった。

３滴選別法を用いて最高の純度を保証するのに役立てた
（製造会社の指示による）。２４時間前に、培養培地２
００ｕ（！に５　Ｘ　１　０’Ｃ　３　Ｈ／ＨｅＪ胸腺
細胞支持細胞（ジャクソン・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋ
ｓｏ−ｎ　　Ｌａｂｓ）、バーａハーバー（　Ｂ　ａｒ
　　Ｈ　ａｒｂｏｕｒ）、ＭＡ）を接種した微量滴定板
ウエルへただ１個ずつのハイブリドーマ細胞を割り当て
た。

衰えた培養培地のＭＡｂ濃度をベーリンガー・レーザー
・ネフロメトリ−（ベーリンガー・ダイアクノスティッ
クス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ
）、ラ・ジョラ（Ｌａ　　Ｊｏｌａ）、ＣＡ）を使用す
る自動レーザー比濁法によって測定した。濃度をμ９／
村／７２時間で表わし、細胞数ｌＯＯ万個に標準化した
。その成績を第１表に示す。この成績はさらに本発明を
実証するものである。

実施例２　　Ｌｌ−ＫＳ マウスハイブリドーマ細胞系Ｌｌ−ＫＳは詳細に報告さ
れている（スターリングら、前掲）。この細胞はＫＳＩ
／４抗原と反応するＩｇＧｔｂＭＡｂを分泌する。実質
上、実施例ｌに示した方法にしたがってクローニングを
実施した。その戊績を第１表に示す。この戊績はさらに
本発明を実証するものである。

実施例３　　Ｌｌ−ＫＳ マウスハイブリドーマ細胞系Ｌ４−ＫＳは詳細に報告さ
れている（スターリングら、前掲）。この細胞はＫＳＩ
／４抗原と反応するＴｇＧｔ−ＭＡｂを分泌する。実質
上、実施例ｌに示した方法にしたがってクローニングを
実施した。その或績を第１表に示す。この戊績はさらに
本発明を実証するものである。

実施例４　　１４−９５−５５ マウスハイブリドーマ細胞系１４−９５−５５はＣＥＡ
と反応する［　ｇ　Ｇ　！　−Ｍ　Ａ　ｂを産生ずる。

この細胞系を本発明に使用した時点では、本質的に非分
泌型培養であった。実質上、実施例１に示した方法にし
たがってクローニングを実施した。その成績を第１表に
示す。この成績はさらに本発明を実証するものである。

（以下余白）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、既知の特異性を有するモノクローナル抗体を親細胞
   より一層高水準で分泌する、形質膜に関連しかつその形
   質膜の外表面に存在する免疫グロブリンを含有する、該
   親細胞由来の細胞集団を選択的に単離する方法であって
   、該免疫グロブリンと優先的に結合するプローブと親培
   養細胞を接触させ、高いプローブ濃度を有する細胞を細
   胞自動選別機によって単離することからなる方法。 ２、培養がハイブリドーマ培養であり、細胞自動選別機
   が蛍光染色細胞選別機であり、プローブが蛍光色素標識
   抗体、蛍光色素標識抗原性物質または蛍光色素標識ハプ
   テン物質からなる群から選ばれたものである請求項１記
   載の方法。 ３、自動クローニング設備を設置した細胞自動選別機に
   よって、選ばれた細胞集団をそれぞれ別々の増殖ウエル
   へ割り当てることからなる請求項１または２記載の方法
   。