JP4868731B2

JP4868731B2 - 哺乳動物培養細胞由来の無細胞タンパク質合成システム

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Publication number: JP4868731B2
Application number: JP2004333250A
Authority: JP
Inventors: 寛晃今高; 暁三上; 茂之横山
Original assignee: RIKEN
Current assignee: RIKEN
Priority date: 2004-11-17
Filing date: 2004-11-17
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2024-11-17
Also published as: EP2145953A1; EP2145953A4; US20070281337A1; WO2006054556A1; JP2006141240A; US8012712B2; US20110300575A1; US8445232B2

Description

本発明は、無細胞系におけるタンパク質の製造方法に関し、さらに詳細には、哺乳動物培養細胞由来の抽出液を用いた無細胞タンパク質合成システムに関する。

哺乳動物細胞由来の無細胞タンパク質合成システムは、真核生物遺伝子産物の解析や、翻訳の制御の研究に重要である。最も一般的には、ウサギ網状赤血球の抽出液(reticulocyte lysate)が用いられており、この系で発現された多くのタンパク質は正しいフォールディングやプロセシングが起こり、正常なインビボでの活性が発現される（例えば、非特許文献１参照）。例えば、アセチル化、イソプレニル化、リン酸化などの翻訳後の修飾がタンパク質の機能や活性に必要な場合がある。また、シグナルペプチドの切断や糖鎖の付加のような翻訳後修飾（プロセッシング）は、上記翻訳反応液にイヌのミクロゾーム膜を添加することによって行われている（例えば、非特許文献２参照）。

一方、真核生物におけるタンパク質の合成反応、特に、翻訳反応は、原核生物よりはるかに多くの翻訳開始因子が関与しており、その相互作用も複雑であることが知られている。真核生物のタンパク質合成系の開始には少なくとも１０種類の真核生物開始因子(eukaryotic initiation factor:ｅＩＦ)が必要である。最初のステップはプレ開始複合体の形成で、ｅＩＦ２のＧＴＰ型は４０Ｓリボソーム小サブユニットのところに開始ｔＲＮＡ（Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉ）を運ぶ。次にプレ開始複合体が真核生物ｍＲＮＡの５’末端に結合する。このステップには、ｅＩＦ４Ｆ（キャップ結合複合体とも呼ばれ、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ａ及びｅＩＦ４Ｇからなる）とｅＩＦ３が必要である。この複合体が５’末端に最も近いＡＵＧを探す。Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉが開始ＡＵＧと結合した後で、開始因子ｅＩＦ５がｅＩＦ２とｅＩＦ３を解離させる。最後に開始ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、４０Ｓサブユニットからなる複合体に６０Ｓサブユニットが結合して８０Ｓ開始複合体が形成される。真核生物細胞では翻訳反応の制御は、ほとんどの場合このような開始因子が行っていると考えられる（例えば、非特許文献３〜５参照）。

真核生物細胞において、タンパク質合成の鋳型となるｍＲＮＡは、５’末端のリン酸に７−メチルグアノシンがピロリン酸を介して結合するキャップ構造（^ｍ７ＧｐｐｐＮ）を有することが知られている。この構造はｍＲＮＡの酵素分解に対する保護作用だけでなく翻訳開始機構にも重要な役割を果たす。キャップ構造には、キャップ結合因子（ｅＩＦ４Ｅ）が結合することにより翻訳を促進している。また、ｍＲＮＡの３’末端には、８０〜１００のポリアデニル酸が連結されたポリＡ構造を有し、ｍＲＮＡを安定化しているが、ポリＡ結合因子（ＰＡＢＰ）を介して翻訳開始複合体とも相互作用している。このキャップ構造は無細胞タンパク質合成系でも翻訳を促進することが知られている。試験管内においてｍＲＮＡの５’末端にキャップを付けるためには、キャップアナログと呼ばれるキャップ類似体を基質にして、ＲＮＡポリメラーゼの酵素反応でキャップを持ったｍＲＮＡを合成することが出来る。しかし、このキャップ化ｍＲＮＡを用いてタンパク質を合成する場合、キャップアナログがタンパク質合成に対して阻害作用を持つため、ｍＲＮＡからキャップアナログを除く操作が別に必要になる。更に、キャップアナログを用いた場合、合成されるｍＲＮＡの量が減少するという問題もある。

Pelham, HR. and Jackson, RJ. "An efficient mRNA-dependent translation system from reticulocyte lysates." (1976) Eur J Biochem. Vol. 67, pp. 247-256. Walter, P. and Blobel, G. (1983) Method. Enzymol., Vol. 96, pp.84 Imataka, H. et al., (1997) EMBO J. Vol.16, pp.817-825 Imataka, H. et al., (1998) EMBO J. Vol.17, pp.7480-7489 Svitkin, YV. et al. (2001) RNA Vol.7, pp.1743-1752

ウサギ網状赤血球の抽出液は、複数の市販品が存在するが、高価であり、動物を使用していることが原因でロット間による活性のばらつきが認められる。動物の殺傷を行わずかつ安定したタンパク質合成活性を維持するためにＨｅＬａ細胞等の培養細胞由来の系が開発されているが、一般的にはウサギ網状赤血球の抽出液の方がタンパク質合成活性が高いと信じられている。したがって、本発明は、哺乳動物の培養細胞抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系において、タンパク質合成能力の改善された抽出液組成物を作製することを目的とする。

本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、哺乳動物の培養細胞の抽出液に、ある種の翻訳開始因子又は翻訳制御因子を添加することにより、ウサギ網状赤血球の抽出液の能力に匹敵するか、あるいはこれを超えるタンパク質合成能を得ることに成功した。また、添加する翻訳開始因子や翻訳制御因子の種類を種々検討することにより、キャップ構造を有しないｍＲＮＡを用いた場合においても高い翻訳能力が得られることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。

すなわち、第一の視点において、本発明のタンパク質の製造方法は、哺乳動物の培養細胞から調製された抽出液に、鋳型ｍＲＮＡと、真核生物の翻訳開始因子とを添加することを特徴とする。前記翻訳開始因子は、翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）、翻訳開始因子２（ｅＩＦ２）、及び翻訳開始因子２Ｂ（ｅＩＦ２Ｂ）からなる群より選択される一種又は二種以上であることが好ましい。

１つの実施形態において、前記鋳型ｍＲＮＡは、５’末端にキャップ構造が付加されたｍＲＮＡである。

また、他の１つの実施形態において、本発明のタンパク質の製造方法は、哺乳動物の培養細胞から調製された抽出液と、５’末端にピコルナウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有する鋳型ｍＲＮＡとを含む無細胞タンパク質合成系に、翻訳開始因子２（ｅＩＦ２）、及び翻訳開始因子２Ｂ（ｅＩＦ２Ｂ）の一方又は両方を添加することを特徴とする。特に、非キャップ付加ｍＲＮＡがウイルス核酸由来のリボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含むことが好ましい。また、翻訳開始因子が翻訳開始因子２（ｅＩＦ２）、及び翻訳開始因子２Ｂ（ｅＩＦ２Ｂ）であり、１２０ｍＭから２４０ｍＭのカリウムイオンを含むことが好ましい。

さらに他の１つの実施形態において、本発明のタンパク質の製造方法は、哺乳動物の培養細胞から調製された抽出液に、キャップ付加されていない鋳型ｍＲＮＡと、真核生物の翻訳開始因子２（ｅＩＦ２）、及び２Ｂ（ｅＩＦ２Ｂ）、並びに真核生物の翻訳制御因子ｐ９７からなる群より選択される一種又は二種以上の因子を添加することを特徴とする。

本発明の異なる視点において、哺乳動物培養細胞の抽出液と、翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）、翻訳開始因子２（ｅＩＦ２）、及び翻訳開始因子２Ｂ（ｅＩＦ２Ｂ）からなる群より選択される一種又は二種以上の真核生物の翻訳開始因子とを含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成用の組成物が提供される。

本発明の方法によれば、哺乳動物培養細胞から調製された抽出液に上記特定の真核生物の翻訳開始因子及び／又は翻訳制御因子を添加することによって高いタンパク質合成活性を有する無細胞タンパク質合成系を構築することができる。しかも、ｍＲＮＡの５’末端へのキャップ付加を行わなくても高い翻訳活性を得ることができるから、鋳型ｍＲＮＡを安価に製造することができる。

[定義]
本発明の方法において、「無細胞タンパク質合成系」とは、タンパク質の翻訳に必要なタンパク質因子を細胞抽出液として取り出し、試験管内でこの反応を再構成することで目的とするタンパク質を合成させる系である。さまざまな生物種に由来する抽出液を利用して無細胞系を構成することができ、例えば、大腸菌や好熱性細菌等の細菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞及び出芽酵母等の、高いタンパク質合成活性の状態の真核細胞、及び原核細胞の抽出液を用いることができる(Clemens, M.J., Transcription and Translation - A Practical Approach, (1984), pp. 231-270, Henes, B.D. et al. eds., IRL Press, Oxford)。

用語「真核生物の翻訳開始因子（ｅＩＦ）」とは、真核生物のタンパク質合成の開始に必要なタンパク質因子であって、１０種類以上が知られている。真核生物の翻訳開始段階は、原核生物に比べてはるかに複雑な反応を含み、原核生物の開始因子が３つであるのと対照的である。これらの開始因子は、リボソームサブユニットへ結合するｅＩＦ３、ｅＩＦ４Ｃ及びｅＩＦ６、ｍＲＮＡへの結合に関与するｅＩＦ４Ｂ、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ａ及びｅＩＦ４Ｇ、開始ｔＲＮＡの運搬に関与するｅＩＦ２及びｅＩＦ２Ｂ、他の因子を解離させるｅＩＦ５等が含まれる。一方、真核細胞での翻訳開始に不可欠な因子ではないが、何らかの機構、例えば翻訳開始因子と相互作用することにより、翻訳を制御する因子の存在することが知られている。例えば、ｐ９７はｅＩＦ４ＡやｅＩＦ３と結合することにより、翻訳活性を抑制又は促進すると考えられる。本明細書においては、これらを「真核生物の翻訳制御因子」と称する。

用語「鋳型ｍＲＮＡ」とは、発現させたい所望のタンパク質をコードするｍＲＮＡである。また、「ピコルナウイルス」とは、一本鎖の正のＲＮＡを持つ（ピコルナとは小さいＲＮＡという意味である。）正二十面体対称の粒子ウイルスである。ピコルナウイルス科は、エンテロウイルス（enterovirus）とライノウイルス（rhinovirus）、動物の疾患に関係あるアフトウイルス（aphthovirus）、カルジオウイルス（cardiovirus）の４属に分けられる。

[真核生物の翻訳開始因子及び翻訳制御因子]
本発明の無細胞タンパク質合成系は、真核生物細胞である哺乳動物培養細胞の抽出液と、鋳型ｍＲＮＡとを含み、さらに真核生物の翻訳開始因子及び／又は翻訳制御因子（以下「翻訳開始因子等（ｅＩＦ等）」という。）が添加される。１つの実施形態において、上記無細胞タンパク質合成系に添加される翻訳開始因子等は、翻訳開始因子ｅＩＦ２、ｅＩＦ２Ｂ、及びｅＩＦ４Ｅ、並びに翻訳制御因子ｐ９７からなる群より選択される少なくとも１種である。ｅＩＦ２は、開始ｔＲＮＡを４０Ｓリボソームサブユニットへ運搬するヘテロ三量体のＧＴＰ結合タンパク質である。ヒトｅＩＦ２の３つのサブユニットα：３６ｋＤａ、β：３８ｋＤａ、及びγ：５２ｋＤａをコードするｍＲＮＡの塩基配列はGenBankのデータベースにそれぞれAccession No. NM_004094, NM_003908, 及びNM_001415として登録されている。

ｅＩＦ２Ｂは、ｅＩＦ２に結合しているＧＤＰをＧＴＰに置換する反応を触媒し、５つの異なるサブユニットにより構成されている。夫々のサブユニットにＦＬＡＧ−タグを付けたタンパク質をバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞で発現させて精製し、グアニンヌクレオチド置換活性を有するｅＩＦ２Ｂとして再構成できることが報告されている(Fabian, J.R. et al., J. Biol. Chem. Vol.272, No.19, pp.12359-12365, 1997参照)。ヒトｅＩＦ２Ｂの各サブユニットをコードするｍＲＮＡの塩基配列はGenBankのデータベースにそれぞれAccession number: NM_001414 (eIF2B1)、NM_014239 (eIF2B2)、NM_020365 (eIF2B3)、Q9UI10 (eIF2B4)、XM_291076 (eIF2B5)として登録されている。

ｅＩＦ４Ｅはキャップ結合複合体であるｅＩＦ４Ｆの構成成分であり、キャップ構造に直接結合する因子である。ｅＩＦ４Ｅはキャップ依存的な翻訳開始に不可欠であり、ＮＩＨ３Ｔ３細胞で過剰発現させると細胞が癌化することが知られている（Lazaris-Karatzas,A et.al. Nature (1990)345:544-547参照）。マウスｅＩＦ４ＥをコードするｍＲＮＡの塩基配列はGenBankのデータベースにAccession number:NM_007917として登録されている。ｅＩＦ４Ｇは、ｅＩＦ４ＥとｅＩＦ４Ａの足場として働き、ｅＩＦ４Ｆが形成される。ｅＩＦ４Ａは、ＲＮＡ依存的なＡＴＰ分解酵素であり、かつＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼでもある。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域の２次構造をまき戻し、リボソームが結合しやすくなるようにしていると考えられている。

ｐ９７は、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇと相同性を有する翻訳制御因子である。ヒトｐ９７タンパク質は、ｅＩＦ４ＧのＣ末端側の３分の２と約２８％の相同性を示す９０７個のアミノ酸残基からなる(前掲の非特許文献３参照)。その完全なｍＲＮＡのコード領域は、DDBJ/EMBL/GenBankのデータベースにAccession No.U73824として登録されている。当初は、生細胞中でキャップ付加ｍＲＮＡの翻訳を抑制すると考えられたが、本発明において初めて非キャップ付加ｍＲＮＡの翻訳を無細胞系で増強することが見出された。

これらの翻訳開始因子等のうちｅＩＦ２以外は、組換えＤＮＡ技術により容易に入手することができる。例えば、これらをコードする遺伝子をクローン化し、適当なベクターに連結(挿入)することにより発現ベクターを作製する。次いで、この発現ベクターを適当な宿主細胞に形質転換し、得られた形質転換細胞を培養することによってそれぞれの翻訳開始因子等を製造することができる。ここで、本発明の方法に用いる上記翻訳開始因子等は、哺乳動物由来のものであれば特に制限されないが、好ましくはヒト由来の翻訳開始因子等が用いられる。なお、上記の方法により得られた翻訳開始因子等のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ夫々の翻訳開始因子等としての活性を有するタンパク質もまた本発明の方法に用いられることは当然である。さらに、これらの翻訳開始因子等には精製しやすいようにヒスチジンタグやＦＬＡＧタグなどが付加されていてもよい。

宿主としては、上記発現ベクターを複製及び維持できるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）等の細菌や、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等の酵母、さらにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、或いはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を用いることができる。

大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、翻訳開始因子等の遺伝子を導入した組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、翻訳開始因子の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。

大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)Ｋ１２、ＤＨ１などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｐ_Ｌプロモーター、Ｐ_Ｒプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法(Cohen, S.N. et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 2110-2114)、エレクトロポレーション法等が挙げられる。

酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法(Becker, D.M. et al. (1990) Methods. Enzymol., 194,182-187)、スフェロプラスト法(Hinnen, A. et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 75, 1929-1933)、酢酸リチウム法(Itoh, H. (1983) J. Bacteriol. 153,163-168)等が挙げられる。

動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。

昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。

動物細胞を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地が用いられる。培養は、通常５％ＣＯ_２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。また、血清の共存が望ましくない場合には目的に応じた無血清培地を使用してもよい。

培養後、所望の翻訳開始因子等が細胞内に生産される場合には細胞を破砕することにより当該翻訳開始因子等を抽出する。また、所望の翻訳開始因子等が細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により細胞を除去する。その後、当該翻訳開始因子等の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で、又は適宜組み合わせて用いることにより、上記培養物中から当該翻訳開始因子等を単離精製することができる。

［鋳型ｍＲＮＡ］
本発明の方法に用いる鋳型ｍＲＮＡは、発現したい所望のタンパク質をコードするものであれば特に限定されないが、細胞から直接ｍＲＮＡを単離するか、前記タンパク質をコードするＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼプロモータを有するベクターにクローン化してインビトロ転写反応を行うことにより合成することができる。ファージポリメラーゼプロモータの後ろにクローン化されたＤＮＡのインビトロ転写方法が知られている(Krieq, P. and Melton, D., Nucl. Acids Res., Vol.12, p.7057, 1984)。この方法は、発現したい遺伝子を、ＳＰ６、Ｔ７、及びＴ３ＲＮＡポリメラーゼのいずれか１つのプロモーターを有するベクターにクローン化する。次いで、このベクターのクローン化された遺伝子の３’末端で制限酵素を使用して線状化され、インビトロ転写反応によってｍＲＮＡへの転写を行う。ＳＰ６、Ｔ７及びＴ３ＲＮＡポリメラーゼプロモータを有する多数のベクターは市販されており、容易に入手可能である。このようにして合成した鋳型ｍＲＮＡは、５’末端にキャップ構造を有するか、又は有しないもののいずれでもよい。５’末端にキャップを付加する場合は、キャップアナログと呼ばれるキャップ類似体を基質にして、ＲＮＡポリメラーゼの酵素反応でキャップを持ったｍＲＮＡを合成することができる。

本発明の１つの実施形態において、鋳型ｍＲＮＡの５’末端にピコルナウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が付加される。ピコルナウイルスのｍＲＮＡは内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を使用して翻訳反応を開始することが知られている。ピコルナウイルスのＩＲＥＳの構造は大きく２つに分けられ、１つは、エンテロウイルス（例えば、ポリオウイルス）やライノウイルスであり、他の１つは、カルジオウイルス（例えば、Encephalomyocarditis virus（ＥＭＣＶ））やアフトウイルス（例えば、口蹄疫ウイルス）である。

好ましくは、鋳型ｍＲＮＡの５’末端にＥＭＣＶの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が付加される。ＥＭＣＶのゲノムは約７９００塩基長の正のＲＮＡ鎖である。ＥＭＣＶゲノムの完全な塩基配列は、例えばGenBank Accession No.NC_001497及びX87335等に登録されている。細胞内においてＥＭＣＶのＲＮＡは自らのタンパク質を翻訳するための鋳型として働き、続いて負のＲＮＡ鎖の合成に使用される。ＥＭＣＶのＲＮＡは、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇの結合部位として作用する内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の助けをかりてリボソームと結合する。このＩＲＥＳは、ＥＭＣＶのＲＮＡゲノムの５’非翻訳領域に存在し、例えば、ＥＭＣＶゲノムの２８１〜８４８番目の塩基配列をＰＣＲにより増幅してクローン化することができる。

［無細胞タンパク質合成用組成物の調製］
本発明の方法に用いる哺乳動物の抽出液は、哺乳動物細胞を培養し、これを回収して破砕することにより抽出液を調製する。哺乳動物細胞としては特に制限されないが、タンパク質合成活性の高い細胞が好ましく、例えば、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞などを用いることができる。ＨｅＬａＳ３細胞はＨｅＬａ細胞から派生した浮遊細胞であり、細胞培養が容易であり増殖しやすいため特に好ましい。また、培養した細胞は、例えばホモジナイザー等の公知の方法を用いて機械的に破砕することができる。抽出液はミクロコッカスヌクレアーゼ及びＣａＣｌ_２処理して内因性ｍＲＮＡを破壊し、その結果バックグラウンド翻訳を減少させて最小にする。次いで、ＥＧＴＡを加えてＣａＣｌ_２をキレートさせ、それによってヌクレアーゼを不活化する。

本発明の１つの実施形態において、上記哺乳動物の培養細胞を圧縮した不活性ガス（例えば、窒素ガス）に接触させて圧力をかけ、続いて減圧（除圧）することによって破砕する。このための装置として、例えば、Ｍｉｎｉ−Ｂｏｍｂ細胞破砕チャンバがＫＯＮＴＥＳ社から販売されている。この方法は、機械的な方法や超音波処理の場合などに見られる温度の上昇を伴わず、細胞は膨張するガスによって冷却される。圧力や平衡時間を変えることによって細胞の破砕の程度を調節できる。例えば、中程度の圧力で短時間処理することによって細胞内の小器官を壊すことなく外部の細胞膜のみを破砕することもできる。この装置を用いて昆虫細胞の抽出液を調製することによって、高い糖タンパク質合成活性が得られることが報告されている(Tarui, H. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. Vol.55, pp.446-453, 2001参照)。

この抽出液はタンパク質合成に必要な成分を含有しており、例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アミノ酸並びに開始因子、延長及び終結因子が含まれる。さらに、ホスホクレアチンキナーゼ及びホスホクレアチンからなるエネルギー再生系を添加することによってｍＲＮＡ翻訳が最適化される。さらにアミノ酸混合物を添加してもよい。酢酸カリウム及び酢酸マグネシウムは翻訳反応に適した濃度となるように調整して添加される。本発明の方法によれば、これらの抽出液へ上記真核生物の翻訳開始因子を添加することによってｍＲＮＡの翻訳活性をさらに増強することができる。添加する各翻訳開始因子の濃度は適宜最適化することができるが、例えば、０．０１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭである。

これらの無細胞タンパク質合成用反応混合物又はアミノ酸混合物は、それぞれ別に、若しくはあらかじめ混合した状態で、使用しやすいように一定量ごと分注して製品として配送することができる。これらの製品は凍結又は乾燥状態で保存することができ、保存及び輸送に適した容器に収容してキットとして販売される。キットには取扱説明書や陽性コントロールＤＮＡ、ベクターＤＮＡ等を添付することができる。

本発明は、以下の実施例によりさらに詳細に説明されるが、これらの実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。
［細胞培養］
シャーレを用いたＨｅＬａＳ３細胞の培養は、炭酸ガスインキュベーター（ＣＯ_２濃度５％、３７℃）内にて行った。培地は、イーグルＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）に、加熱処理を施した１０％子ウシ血清（ICN Biomedicals、Inc）、２ｍＭのＬ−グルタミン溶液、１ユニット／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したものを用いた。

１Ｌスケールでの攪拌培養は、細胞培養コントローラーシステム（セルマスターモデル１７００和研薬）を取り付けたスピンナーフラスコを用いて行った。温度、ｐＨ、溶存酸素濃度、及び攪拌スピードは、それぞれ３７℃、ｐＨ７．２、６．７ｐｐｍ、及び５０ｒｐｍに設定した。

［細胞抽出液の調製］
細胞濃度が１．０〜１．５×１０^６個／ｍｌに達した時点で、培養液中のＨｅＬａＳ３細胞を３６０×ｇ、４℃、１０分間の遠心によって回収した。培地は、アスピレーターを用いて除き、培養液１Ｌ分から得られた細胞に対して８０ｍｌの緩衝液（３５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（２５℃でのｐＨ７．５）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１１ｍＭグルコース）で軽く懸濁した後、２本の５０ｍｌチューブに移し替え、３６０×ｇ、４℃、５分間の遠心を行った。この操作を３回繰り返した後、細胞容積の１．５倍量の抽出ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（２５℃でのｐＨ７．５）、１３５ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭのＫＣｌ、１．６５ｍＭ酢酸マグネシウム）を加え、細胞濃度が約２．５×１０^８個／ｍｌになるように懸濁したものをMini-Bomb cell disruption chamber (KONTES)に封入した。細胞の破砕は、窒素ガス圧１．０Ｍｐａ、氷中にて静置した状態で行った。３０分後、アウトレットポートをゆっくりと開口し、流速約３〜１０滴／秒にて細胞破砕液を回収した。得られた細胞破砕液は、１０，０００×ｇ、４℃、５分間の遠心を２回繰り返し、沈澱画分を除いたもの（２〜２．５ｍｌ）を、予め２５ｍｌの抽出ｂｕｆｆｅｒにて平衡化しておいたＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）へ添加した。自然落下にてサンプルをカラム内に入り込ませた後、さらに抽出ｂｕｆｆｅｒを添加し、カラム下から落下している溶液が透明から乳白色に変わった時点で、約１．７〜２．０ｍｌまで採取したものを細胞抽出液とした。得られた抽出液は均等に小分けし、液体窒素で瞬間凍結後、マイナス８０℃にて保存した。

［プラスミドとｍＲＮＡの調製］
ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ、ｃａｐ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａ及びＬｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａを合成するために、まず、ルシフェラーゼｃＤＮＡをプラスミドｐＳＰ７２（プロメガ社）のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータの下流に挿入したプラスミドｐＳＰ７２−Ｌｕｃを作製し、続いて、ルシフェラーゼ遺伝子の下流にポリＡストレッチ（８５個のデオキシアデニン）を挿入してプラスミドｐＳＰ７２−ＬＵＣ−Ａを作製した（前掲の非特許文献４参照）。また、ＥＭＣＶのＩＲＥＳを有するｍＲＮＡ、ＥＭＣＶ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａを合成するためには、プラスミドｐＳＰ７２−ＥＭＣＶ−Ｌｕｃ−Ａ（前掲の非特許文献５参照）を用いた。このプラスミドは、ｐＧｅｍＣＡＴ−ＥＭＣＶ−ＬＵＣ(Pause et al., Nature 371, 762-767参照)を鋳型とし、ＰＣＲにより増幅したＥＭＣＶゲノムの２８１〜８４８番目のヌクレオチドからなるＤＮＡ断片を、プラスミドｐＳＰ７２−ＬＵＣ−ＡのＴ７プロモータとルシフェラーゼ遺伝子の間にクローン化することにより作製した。各プラスミドの構造を概略的に図１に表わした。

Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａ、及びＥＭＣＶ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−ＡのｍＲＮＡの合成は、上記各プラスミド内のポリＡ配列の３’側を制限酵素ＢａｍＨＩで切断したものを鋳型とし、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたRiboMAX Large Scale RNA Production Systems (Promega)の方法に従って行った。ｃａｐ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−ＡｍＲＮＡの合成では、上記合成法で使用するＧＴＰ濃度を５．０ｍＭから０．８ｍＭに変更し、さらにキャップ構造アナログであるｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ（NEW ENGLAND BioLabs）を４ｍＭ加えた条件で行った。合成した各ｍＲＮＡは、波長２６０ｎｍの吸光度から濃度を定量した後、マイナス８０℃にて保存した。

［無細胞タンパク質合成］
ルシフェラーゼをコードする各ｍＲＮＡの翻訳反応を行う前に、抽出液に含まれている内因性のＲＮＡの分解と除去を行った。方法については以下の通りである。抽出液１００μｌ（タンパク質濃度１４〜１８ｍｇ／ｍｌ）に対し、１μｌの７５００ユニット／ｍｌヌクレアーゼＳ７、１００ｍＭのＣａＣｌ_２を添加し、５分間、２０℃の処理を施した後、８μｌの３０ｍＭのＥＧＴＡを加え反応を停止した。次にその抽出液１１０μｌへ、エネルギーミックス溶液（１８４ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１３．２ｍＭのＡＴＰ、１．３２ｍＭのＧＴＰ、１９８ｍＭクレアチンリン酸、３．３ｍＭスペルミジン、１３．２ｍＭ酢酸マグネシウム）を１６．４μｌ、３．３ｍＭアミノ酸溶液（２０種）を１．６４μｌ、３．３ｍｇ／ｍｌ牛肝臓由来ｔ−ＲＮＡを４．９２μｌ、６．０ｍｇ／ｍｌのクレアチンリン酸キナーゼを１．８μｌを加え混合液を調製した。さらに混合液を透析チャンバー（ＭＷＣＯ５０ｋＤａ、再生セルロース製）へ充填し、４．９ｍｌの外部液（エネルギーミックス溶液６００μｌ、３．３ｍＭアミノ酸溶液（２０種）６０μｌ、抽出ｂｕｆｆｅｒ３．５ｍｌ、１００ｍＭ酢酸マグネシウム２１μｌ、４００ｍＭのＥＧＴＡ２７μｌを含む）に対し１．５〜６時間の透析を３２℃にて行った。なお、外部液の酢酸カリウム濃度は、目的に応じて変更した。

翻訳反応はまず、透析中の混合液を必要量採取し、アイスボックス中に静置した。次に氷冷したその混合液４．５μｌをエッペンドルフチューブに移し、そこへ酢酸カリウム溶液、ｍＲＮＡ溶液を順に添加した後（最終容量６μｌ）、反応を開始した。また、翻訳開始因子（ｅＩＦ）の効果を調べる場合には、必要量のｅＩＦ、ｍＲＮＡ溶液を順に混合液へ添加してから反応を開始した。反応液に含まれる各組成の最終濃度は、９〜１２ｍｇ／ｍｌの抽出液由来タンパク質、２７ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、３０μＭアミノ酸（２０種）、１．２ｍＭのＡＴＰ、１２０μＭのＧＴＰ、１８ｍＭクレアチンリン酸、０．３ｍＭスペルミジン、１．２ｍＭ酢酸マグネシウム、１６ｍＭのＫＣｌ、１．６５ｍＭのＥＧＴＡ、９０μｇ／ｍｌ牛肝臓由来ｔ−ＲＮＡ、６０μｇ／ｍｌクレアチンリン酸キナーゼである。酢酸カリウムおよび各ｍＲＮＡ濃度は、条件に応じてそれぞれ４４〜２２４ｍＭ、０〜０．７２μｇ／６μｌの範囲で変更した。１時間、３２℃のインキュベーションの後、反応液を直ちに氷冷し、一部をルシフェラーゼ活性測定に用いた。活性測定にはLuciferase Assay System（プロメガ社製）を使用した。

その結果を図２〜７に示した。図２はｃａｐ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａ及びＬｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａを用いた無細胞系翻訳反応の特性を示す。（Ａ）は、ＨｅＬａＳ３細胞抽出液のヌクレアーゼ処理を行い、カリウム濃度を８０ｍＭに調整した外部液に対し透析を行った後、グラフに示されたカリウム濃度の条件下で、各ｍＲＮＡ（濃度０．２４μｇ／６μｌ）の翻訳を行った。３２℃で１時間インキュベーションした後、反応液の一部を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。（Ｂ）は、ｃａｐ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａ及びＬｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａについて最適のカリウム濃度であるそれぞれ１２０ｍＭ、及び９０ｍＭの条件の下、グラフに示されたｍＲＮＡ濃度（０〜０．７２μｇ／６μｌ）にて翻訳反応を行い、上記と同様にルシフェラーゼ活性を測定した。（●）：ｃａｐ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙＡ、（○）：Ｌｕｃ−ｐｏｌｙＡを示す。図２（Ａ）及び（Ｂ）に示したように、５’末端にキャップ構造を有するｃａｐ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａはカリウム濃度が１２０ｍＭ、及びｍＲＮＡ濃度が０．２４μｇ／６μｌのときに最も高いルシフェラーゼ活性を示した。また、キャップ構造をもたないＬｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａはカリウム濃度が９０ｍＭ、及びｍＲＮＡ濃度が０．４８μｇ／６μｌのときに最大の活性を示した。

次に、図３はＥＭＣＶ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａを用いた無細胞系翻訳反応の特性を示す。（Ａ）は、ヌクレアーゼ処理を行ったＨｅＬａＳ３細胞抽出液をカリウム濃度を１２０ｍＭに調整した外部液に対し透析を行った後、グラフに示されたカリウム濃度の条件下で、ｍＲＮＡ（０．２μｇ／６μｌ）の翻訳を行った。３２℃で１時間インキュベーションした後、反応液の一部を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。（Ｂ）は、（Ａ）の結果から得られたＥＭＣＶ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａの翻訳における最適なカリウム濃度（１８０ｍＭ）の条件の下、グラフに示されたｍＲＮＡ濃度（０〜０．６μｇ／６μｌ）にて翻訳反応を行い、上記と同様にルシフェラーゼ活性を測定した。図３（Ａ）及び（Ｂ）に示したように、ＥＭＣＶのＩＲＥＳを有するＬｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａは、カリウム濃度が１８０ｍＭのときに最大活性を示し、ｍＲＮＡの濃度依存的に活性値が上昇した。

図４は、ｃａｐ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａを用いた無細胞系翻訳反応における各因子（ｅＩＦ）の効果を示す。ヌクレアーゼ処理を行ったＨｅＬａＳ３細胞抽出液を、カリウム濃度を１６０ｍＭに調整した外部液に対し透析を行った後、グラフに示された各因子を添加し、最適な条件の下（カリウム、ｍＲＮＡ濃度をそれぞれ１２０ｍＭ、０．２４μｇ／６μｌ）、翻訳を行った。３２℃で１時間インキュベーションした後、反応液の一部を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。各反応は２回繰り返し、ｅＩＦ無添加でのルシフェラーゼ活性値を１．０としたときの各反応の活性値を比率で算出し、その平均値を表した。バーの種類：白、ライトグレー、ダークグレーは、それぞれ０．５、１．０、２．０ｐｍｏｌのｅＩＦが反応液に含まれていることを示す。黒は、ｅＩＦ２、ｅＩＦ２Ｂが各１．０ｐｍｏｌ、ｅＩＦ４Ｅが２．０ｐｍｏｌ含まれている。図４より明らかなように、５’末端にキャップ構造を有するｍＲＮＡ、ｃａｐ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａの翻訳は、ｅＩＦ２、ｅＩＦ２Ｂ、及びｅＩＦ４Ｅのいずれか、又は夫々を共に添加したときに有意に高いルシフェラーゼ活性を示した。これら３種類の翻訳開始因子を共に添加した場合には、無添加の場合と比べて約３倍のタンパク質合成活性が得られることが分かる。

図５は、Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａを用いた無細胞系翻訳反応における各因子（ｅＩＦ等）の効果を示す。ヌクレアーゼ処理を行ったＨｅＬａＳ３細胞抽出液を、カリウム濃度を１２０ｍＭに調整した外部液に対し透析を行った後、グラフに示された各因子を添加し、最適な条件の下（カリウム、ｍＲＮＡ濃度をそれぞれ９０ｍＭ、０．４８μｇ／６μｌ）、翻訳を行った。３２℃で１時間インキュベーションした後、反応液の一部を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。各反応は２回繰り返し、ｅＩＦ等無添加でのルシフェラーゼ活性値を１．０としたときの各反応の活性値を比率で算出し、その平均値を表した。バーの種類：白、ライトグレー、ダークグレーは、それぞれ０．５、１．０、２．０ｐｍｏｌのｅＩＦが反応液に含まれていることを示す。黒は、ｅＩＦ２、ｅＩＦ２Ｂが各１．０ｐｍｏｌ、ｐ９７が２．０ｐｍｏｌ含まれている。図５より、５’末端にキャップが付加されていないｍＲＮＡ、Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａの翻訳は、ｅＩＦ２、ｅＩＦ２Ｂ、及びｐ９７のいずれか、又は夫々を共に添加したときに有意に高いルシフェラーゼ活性を示した。これら３種類の翻訳開始因子等を共に添加した場合には、無添加の場合と比べて５倍以上のタンパク質合成活性が得られることが分かる。

図６は、ＥＭＣＶ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａを用いた無細胞系翻訳反応における各因子（ｅＩＦ）の効果を示す。ヌクレアーゼ処理を行ったＨｅＬａＳ３細胞抽出液を、カリウム濃度を２４０ｍＭに調整した外部液に対し透析を行った後、グラフに示された各因子を添加し、最適な条件の下（カリウム、ｍＲＮＡ濃度をそれぞれ１８０ｍＭ、０．６μｇ／６μｌ）、翻訳を行った。３２℃で１時間インキュベーションした後、反応液の一部を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。各反応は２回繰り返し、ｅＩＦ無添加でのルシフェラーゼ活性値を１．０としたときの各反応の活性値を比率で算出し、その平均値を表した。バーの種類：白、ドット、ライトグレー、ダークグレーは、それぞれ０．３、０．６、１．０、２．０ｐｍｏｌのｅＩＦが反応液に含まれていることを示す。黒は、ｅＩＦ２、ｅＩＦ２Ｂが各１．５ｐｍｏｌ、含まれている。図６より、５’末端にＥＭＣＶのＩＲＥＳが付加されたｍＲＮＡ、ＥＭＣＶ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａの翻訳は、ｅＩＦ２、及びｅＩＦ２Ｂのいずれか、又は両方を添加したときに有意に高いルシフェラーゼ活性を示し、これら２種類の翻訳開始因子を共に添加した場合には、無添加の場合と比べて１．５倍以上のタンパク質合成活性が得られることが分かる。

図７は、ＨｅＬａＳ３、ウサギ網状赤血球抽出液を用いた無細胞系翻訳反応における各ｍＲＮＡの翻訳活性を示す。図４〜６の結果から得られた、ＨｅＬａＳ３を用いた各ｍＲＮＡ翻訳の最適条件（ｅＩＦ等無添加：ライトグレー）、およびｅＩＦ等の添加によって一番効果が見られた条件（ｅＩＦ等添加：黒）で翻訳反応を行ったときのルシフェラーゼ活性値を比較した。すなわち、ＥＭＣＶ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａを鋳型としたときはｅＩＦ２、及びｅＩＦ２Ｂを各１．５ｐｍｏｌ添加し、ｃａｐ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａを用いたときはｅＩＦ２、ｅＩＦ２Ｂを各１．０ｐｍｏｌと、ｅＩＦ４Ｅ２．０ｐｍｏｌとを添加し、並びにＬｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａを用いたときはｅＩＦ２、ｅＩＦ２Ｂを各１．０ｐｍｏｌと、ｐ９７を２．０ｐｍｏｌ添加した。また、ウサギ網状赤血球の抽出液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたときの各ｍＲＮＡ翻訳反応の結果も合わせて比較した。ウサギ網状赤血球の抽出液を用いた反応では、ＥＭＣＶ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａ、ｃａｐ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａ、Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａの翻訳に酢酸カリウムをそれぞれ１００、１５０、５０ｍＭ補った上、添付されていた説明書に基づいて３０℃で１時間のインキュベーションを行った。ｍＲＮＡ濃度は全て０．１μｇ／６μｌに設定した。図７より、ｅＩＦ等無添加の条件ではＨｅＬａＳ３細胞よりもウサギ網状赤血球の抽出液の方がキャップ付加及び非キャップ付加のいずれの条件でも高いルシフェラーゼ活性を示したが、それぞれ所定の翻訳開始因子等を添加することによってＨｅＬａＳ３細胞抽出液のタンパク質合成活性は著しく増強され、いずれの条件下でもウサギ網状赤血球の抽出液中での合成量を上回ることが分かった。

［参考例］ｅＩＦ等の調製
上記実施例において翻訳増強効果のあったｅＩＦ等の調製は以下のとおりである。各々の最終標本のタンパク質濃度はBradford法によりＢＳＡを標準物質に用いて定量した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、クーマシーブルー染色によって他のタンパク質が混入していない事を確認した。

［ｅＩＦ２の調製］
ＨｅＬａ細胞（ヒト）またはＫｒｅｂｓ細胞（マウス）より内因性ｅＩＦ２を精製して用いた(Trachsel et.al. (1979) Biochim. Bicphys. Acta 561:484-490参照)。

［ｅＩＦ２Ｂの調製］
（１）ｅＩＦ２ＢのｃＤＮＡ、発現プラスミド、及び形質転換バキュロウイルスの作製：
各々のｃＤＮＡは逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により得た。ＲＴ−ＰＣＲ用のＲＮＡはＨｅＬａ細胞より得た。ｅＩＦ２Ｂ１(GenBank accession number: NM＿001414)、ｅＩＦ２Ｂ２(同NM＿014239)、ｅＩＦ２Ｂ３(同NM＿020365)、ｅＩＦ２Ｂ４(同Q9UI10)、ｅＩＦ２Ｂ５(同XM＿291076)に対応するプライマーＤＮＡは各々GeneBankに登録されたシークエンスを参考にした。得られたすべてのｃＤＮＡは塩基配列の決定を行い、登録されている配列と一致していることを確認した。精製を容易にするためｅＩＦ２Ｂ３のＣ−末端にＦＬＡＧ配列を、ｅＩＦ２Ｂ４のＮ−末端に６×Ｈｉｓ配列を付加した。これらのｃＤＮＡをバキュロウイルス作製用のプラスミドｐＡｃＤＢ３（PharMingen）に挿入し、ｐＡｃＤＢ３−２Ｂ１−２Ｂ２−Ｈｉｓ２Ｂ４、及びｐＡｃＤＢ３−２Ｂ３−ＦＬＡＧ−２Ｂ５を作製した。これらの作製したプラスミドとバキュロウイルスＤＮＡＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ(PharMingen)を昆虫細胞Ｓｆ９に同時導入させた。正しく組み換えを起こしたウイルスを選び出し、Ｂａｃｕｌｏ−２Ｂ１−２Ｂ２−ｈｉｓ−２Ｂ４ウイルスとＢａｃｕｌｏ−２Ｂ３−ＦＬＡＧ−２Ｂ５ウイルスを増幅した。前者のウイルスはｅＩＦ２Ｂ１、ｅＩＦ２Ｂ２そしてＨｉｓ−ｅＩＦ２Ｂ４を同時に発現するウイルスであり、後者はｅＩＦ２Ｂ３−ＦＬＡＧと、ｅＩＦ２Ｂ５を同時に発現するウイルスである。

（２）ｅＩＦ２Ｂの発現と精製：昆虫細胞ＨｉｇｈＦｉｖｅ（インビトロジェン社）を細胞培養コントローラーシステム(セルマスターモデル１７００、和研薬)を取り付けたスピンナーフラスコを用いて、１Ｌの培養液ＥｘｐｒｅｓｓＦｉｖｅＳＦＭ（インビトロジェン社）にて培養した。温度、溶存酸素濃度、攪拌スピードは、それぞれ２７℃、７．８ｐｐｍ、５０ｒｐｍに設定した。細胞濃度０．５〜０．８ｘ１０^６細胞／ｍｌに達した時Ｂａｃｕｌｏ−２Ｂ１−２Ｂ２−ｈｉｓ−２Ｂ４と、Ｂａｃｕｌｏ−２Ｂ３−ＦＬＡＧ−２Ｂ５を同時感染させた。５０時間後、細胞を回収し−２０℃にて凍結保存した。ｅＩＦ２Ｂの精製は以下のように行った。この凍結保存してあった細胞を１００ｍｌのバッファー（０．５ＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、プロテナーゼ阻害剤「-EDTA Complete, Roche」）に懸濁し、２０分間氷中に置き、１０，０００Ｘｇにて２０分遠心後、上澄み液を得た。それにイミダゾールを最終濃度２０ｍＭになるように加え、２ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ−アガロース樹脂（キアゲン社）と４℃にて混和した。一時間後、空のカラムに通して結合していないタンパク質を除いた。さらに、上のバッファー５０ｍｌで洗った後、高濃度のイミダゾールを含むバッファー（１０ｍｌ）（０．２５Ｍイミダゾール、０．１５ＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を用いて結合したタンパク質を溶出した。ＥＤＴＡを１ｍＭになるように加え、Amicon Ultra 30,000MWCO (MILLIPORE)によって２ｍｌまで濃縮し、ゲル濾過カラムSuperdex 200 HiLoad 16/60 (Amersham)に添加した。バッファー（０．５ＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、１ｍＭのＥＤＴＡ）にて分画（０．３ｍｌ／分、１ｍｌ／画分）し、クーマシーブルー染色とウエスタンブロッテイングにより各々のサブユニットが存在している画分を確認した。すべてのサブユニットが確認された画分を集め、バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、１ｍＭのＥＤＴＡ）にて三倍に希釈した後、anti-FLAG-Agarose（シグマ社）カラム（０．２ｍｌ）に添加した。バッファー（５ｍｌ）（０．１ＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、１ｍＭのＥＤＴＡ）にて洗浄した後、そのバッファー（０．７ｍｌ）にＦＬＡＧ−ｐｅｐｔｉｄｅ（シグマ社）（５０μｇ／ｍｌ）を加えた溶出液を添加することによりｅＩＦ２Ｂを溶出した。溶出されたｅＩＦ２ＢはSlide-A-Lyzer Mini Dialysis unit (10,000 MWCO)（ピアス社）を用いて（０．１ＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）に対して透析し、Slide-A-Lyzer Concentrating solution（ピアス社）を用い濃縮した。

［ｅＩＦ４Ｅの調製］
マウスｅＩＦ４ＥｃＤＮＡ(Jaramillo et.al. (1991) J.Biol.Chem. 266:10446-10451)をｐＧＥＸ−６Ｐ（アマーシャム社）に挿入し、ｐＧＥＸ−６Ｐ−ｅＩＦ４Ｅを作製した。ｐＧＥＸ−６Ｐ−ｅＩＦ４Ｅを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ−３）（ｐＬｙｓ）に導入し、６００ｎｍにおける吸光度が０．５から０．９に至るまで２ＬのLuria broth（ＬＢ）にて培養した。ＩＰＴＧを（最終濃度０．１ｍＭ）加え、３０℃にて１２から１６時間培養を行うことによりＧＳＴ−ｅＩＦ４Ｅの発現誘導を行った。このバクテリアを遠心によって回収し、一度、バッファー（０．１５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ）（５０ｍｌ）にて洗浄した後、バッファー（０．１ＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、１ｍＭのＤＴＴ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、プロテナーゼ阻害剤「Complete, Roche」）（５０ｍｌ）に懸濁した。超音波処理によって細胞を破壊した後、超遠心３０，０００ｒｐｍ（Beckman 70Ti roter）（１時間）にて不溶性画分を除いた。上澄み液をGlutathione Sepharose 4B レジン（アマーシャム社）（０．５ｍｌ）と混合し、４℃にて一時間混和した。この混合液を空のカラムに流し込み、更にバッファー（０．１ＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、１ｍＭのＤＴＴ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ）（３０ｍｌ）にて洗うことにより非結合タンパク質を除いた。この段階では、ＧＳＴ−ｅＩＦ４Ｅがレジンに結合した状態であると考えられる。上のバッファー（０．５ｍｌ）にPreScission Protease (12 unit) (アマーシャム社)加え、レジンと混合し、４℃にて一晩混和することによりＧＳＴ−ｅＩＦ４ＥのＧＳＴとｅＩＦ４Ｅの間を切断した。レジンから離れたｅＩＦ４Ｅを回収し、再度Glutathione Sepharose 4B レジン（０．３ｍｌ）に通すことにより、完全にＧＳＴ−ｅＩＦ４ＥとＧＳＴを除いた。得られたｅＩＦ４Ｅ標本をさらに精製するため、バッファーのｐＨを７．０にした後SP-Sepharose（０．３ｍｌ）（ファルマシア）に結合させた。バッファー（０．１ＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１０％グリセロール、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）（１０ｍｌ）にて洗った後、０．３ＭのＫＣｌの同バッファーにてｅＩＦ４Ｅを溶出した。

［Ｐ９７（Ｃ−末端にＦＬＡＧを付加させてある）の調製］
ｐ９７のｃＤＮＡ（Imataka et.al. (1997) EMBO J 17:6940-6947)のＣ−末端にＦＬＡＧ配列を付加し、ｐＧＥＸ−６Ｐに挿入し、ｐＧＥＸ−６Ｐ−ｐ９７−ＦＬＡＧを作製した。ＧＳＴ−ｐ９７−ＦＬＡＧをＧＳＴ−ｅＩＦ４Ｅと同様に発現させた。超遠心の後の上澄み液をHeparin Sepharose CL-6B （０．５ｍｌ）（アマーシャム社）と混合し、４℃にて一時間混和した。非結合タンパク質をＧＳＴ−ｅＩＦ４Ｅ／Glutathione Sepharose 4Bの場合と同様に洗い流し、結合したタンパク質をバッファー（０．５ＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、１ｍＭのＤＴＴ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ）（３ｍｌ）にて溶出した。溶出液をGlutathione Sepharose4Bレジン（０．５ｍｌ）と混合し、ｅＩＦ４Ｅの場合と同様の処置をすることにより、ｐ９７−ＦＬＡＧを得た。さらに、ｅＩＦ２Ｂの場合と同様にanti-FLAG-resinを用いて精製を完全にした。

実施例で用いた各種ルシフェラーゼｍＲＮＡを調製するためのプラスミドの構造を概略的に示す。ｃａｐ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａ及びＬｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａを用いた無細胞系翻訳反応の特性（カリウム濃度及びｍＲＮＡ濃度依存性）を示す。ＥＭＣＶ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａを用いた無細胞系翻訳反応の特性（カリウム濃度及びｍＲＮＡ濃度依存性）を示す。ｃａｐ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａを用いた無細胞系翻訳反応における各因子（ｅＩＦ）の効果を示す。Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａを用いた無細胞系翻訳反応における各因子（ｅＩＦ等）の効果を示す。ＥＭＣＶ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａを用いた無細胞系翻訳反応における各因子（ｅＩＦ）の効果を示す。ＨｅＬａＳ３、ウサギ網状赤血球抽出液を用いた無細胞系翻訳反応における各ｍＲＮＡの翻訳活性を示す。

Claims

哺乳動物の培養細胞から調製された抽出液に、非キャップ付加ｍＲＮＡと、翻訳開始因子２（ｅＩＦ２）、及び翻訳開始因子２Ｂ（ｅＩＦ２Ｂ）からなる群より選択される少なくとも１つ以上の真核生物の翻訳開始因子とを添加することを特徴とする無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法。
前記非キャップ付加ｍＲＮＡにウイルス核酸由来のリボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
１２０ｍＭから２４０ｍＭのカリウムイオンを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
哺乳動物の培養細胞から調製された抽出液に、非キャップ付加ｍＲＮＡと、真核生物の翻訳開始因子２（ｅＩＦ２）、及び２Ｂ（ｅＩＦ２Ｂ）、並びに真核生物の翻訳制御因子ｐ９７を添加することを特徴とする無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法。
前記哺乳動物の培養細胞が、ヒト培養細胞である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記ヒト培養細胞が、ＨｅＬａＳ３培養細胞である請求項５に記載の方法。
哺乳動物培養細胞の抽出液と、
非キャップ付加ｍＲＮＡと、
真核生物の翻訳開始因子２（ｅＩＦ２）及び翻訳開始因子２Ｂ（ｅＩＦ２Ｂ）を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成のための組成物。
さらに真核生物の翻訳制御因子ｐ９７を含むことを特徴とする請求項７に記載の組成物。
前記哺乳動物培養細胞が、ヒト培養細胞である請求項７又は８に記載の組成物。
前記ヒト培養細胞が、ＨｅＬａＳ３培養細胞である請求項９に記載の組成物。
前記非キャップ付加ｍＲＮＡがウィルス核酸由来のリボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含み、さらに１２０ｍＭから２４０ｍＭのカリウムイオンを含むことを特徴とする請求項７に記載の組成物。