JPH03108484A - 成熟遺伝子のｍＲＮＡのためのエンドリボヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡ、その製造および植物におけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ ある条件下で、ＲＮＡ分子は、タンパク質の関与なしで
他のＲＮＡ分子上の反応を触媒することまたは自触媒作
用的にそれら自身の分子からフラグメントを除去するこ
とができる。したがって、４１３個のヌクレオチドを含
むイントロンのテトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒ
ａｈｙｍｅｎａｔｈｅｒｍｏｐｈｉ　ｌａ）の２３ｓの
ｒＲＮＡの３′末端からの自触媒作用的欠失、および現
型への変換がある。

これは、グアノシン補因子が関与する一連のフォスフオ
ニステル転移反応によって起きる（　（ｅｃｈ、Ｔ、Ｒ
，：　Ｎａｔａｕｒｅ　ｌ、５７８−５８３、＋９８３
）。ＲＮＡ基質または選択される反応条件によって、イ
ントロンは特異的リボヌクレアーゼ、末端トランスフェ
ラーゼ、フォスフオドランスフェラーゼまたは酸フォス
ファターゼとして機能することができる。ざらに、一つ
のＲＮＡ分子はそれ自身を変化させることなく多くの変
換を行うことができ、この点で、酵素のように挙動する
。これが、これらの性質を有するＲＮＡ分子にリボザイ
ム（口ｂｏｚｙｍｅ　）という用語が付された理由であ
る。

タンパク質の関与しない同様の反応は、いくつかのウィ
ロイドＲＮＡおよびサテライトＲＮＡでも示された。し
、たがって、自己プロセシング（ｓｅｌｆ−ｐｒｏｃｅ
ｓｓｉｎｇ）は、アボカド日シミ（ｓｕｎｂｌｏｔｃｈ
）ウィロイド（ＡＳ　Ｂ　Ｖ）　　（Ｈｕｔｃｈｉｎｓ
、　Ｃ。

ｊ、ら：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　Ｌ
！ｉ、３６２７−３６４０．１９８６）、タバコ環斑（
ｒｉｎｇｓｐｏｔ）ウィルスのサテライトＲＮＡ　（ｓ
　Ｔ　ｏ　ｂ　ＲＶ）　　（Ｐｒｏｄｙ、　Ｇ、Ａ、ら
：５ｃｉｅｎｃｅ　２，３１．１５７７−１５８０．１
９８６）およびルサーン−時線条ウィルス（１ｕｃｅｒ
ｎｅ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　５ｔｒｅａｋｖｉｒｕｓ、
　　ｓ　Ｌ　Ｔ　Ｓ　Ｖ　）　　（Ｆｏｒｓｔｅｒ、Ａ
、Ｃ，ら：Ｃｅ竹、２１１−２２０．１９８７）の複製
のための必須の反応のようである。現型はこれらＲＮＡ
の複製中に産生されて、延長部分を有するＲＮＡの合成
をテンプレートとして導く、と考えられる。これら転写
物は、自己触媒のエンドヌクレアーゼ的（ｅｎｄｏ−ｎ
ｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）反応によって正しいゲノムの長
さに切断される。

後者を反応に取り入れると思われるＲＮＡの構造物はハ
ンマー頭（ｈａｍｍｅｒ−ｈｅａｄ）　Ｊ　　（Ｆｏｒ
ｓｔｅｒ。

Ａ、Ｃ，ら：　Ｃｅ１ｌ　１５４．２１＋−２２０，１
９８７、Ｈａｓｅｌｏｆｆ、　Ｊ　。

ら：　Ｎａｔｕｒｅ　３３Ａ、　５８５−５９１．１９
８８）と記述された。

これらＲＮＡ酵素の切断部位は特異的で、プロセシング
を行い得るための特殊な構造的必要条件を示さなければ
ならない。

リボザイムが成熟酵素をコードする植物ＲＮＡを攻撃す
ることができ、したがって、植物における成熟過程に影
響させることに使用できることが、いま見出された。

成熟酵素であるポリガラクツロナーゼをコードするＤＮ
ＡのアンチセンスＲＮＡによる発現の調節は、　Ｓｍ１
ｔｈ　Ｃ，Ｊ−５，ら（Ｎａｔｕｒｅ　出、７２４．１
９８８）によって記述されている。ポリガラクッロナー
ゼ。ＤＮＡのフラグメントは、発現ベクターにおいて反
対の位置方向に位置されている。このベクタープラスミ
ドは、大腸菌およびアグロバクテリウム−’／メファシ
エンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓ）を介して、トマトの茎部分を形質転換させるた
めに用いられる。次いで、アンチセンスＲＮＡの発現を
トマト植物体の葉部で検出することができる。アンチセ
ンスＲＮＡがそれ自体を実際のポリガラクッロナーゼＲ
ＮＡに付着させて、後者の不活化を起こし、さらにその
結果としてポリガラクツロナーゼ合成の部分的阻害があ
ること、が考えられる。

成熟酵素ＲＮＡに結合してそれを配列中の特定の切断部
位で切断することができるリボザイムが、植物における
成熟過程に対して特異的に影響を及ぼすようにするため
にいま開発された。本発明によるリボザイムを用いるこ
とによって、特定の成熟酵素の合成を部分的に阻害する
だけではなく実質的に完全に、すなわち約８０−１００
％、阻害することが可能である。

従って、本発明は次のことに関する。

１、　　リボザイムをコードする遺伝子または遺伝子フ
ラグメント、ならびに対応するりボブイムＲＮＡ配列物
およびそれらの製造法 ２、　１で特定したＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む、植
物体、植物細胞および植物の部分または種子 ３、　植物における成熟酵素の合成の阻害のための、リ
ボザイムの使用 ［発明の詳細な説明］ 本発明は、特にその好ましい態様において、以下に詳細
に記述される。本発明はまた特許請求の範囲に定義され
る通りである。

リボザイムは、阻害されるべき成熟遺伝子のＤＮＡ配列
に基づいて合成することができる。これに関連して、原
則として、植物成熟酵素をコーＦ　ｔ　ルイかなるＤＮ
Ａ配列からでも出発することカ可能である。そのような
植物成熟酵素の例としては、ポリガラクッロナーゼ、ペ
クチンエステラーゼおよびいわゆる成熟聞達タンパク質
がある。

合成の「スターター」としては、少なくとも１０個の連
続したヌクレオチドを、特に１４〜２０個のヌクレオチ
ドを、有利には構造遺伝子のｃＤＮＡ配列の中間部から
、選択することが好ましい。それぞれの場合、ポリガラ
クツロナーゼ（Ｇｒｉｅｒｓｏｎ、　Ｄ、ら：　ＮＡＲ
ｌ、８５９５．１９８６）　、ペクチンエステラーゼ（
Ｒａｙ、　Ｊ、ら：　Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ＩＪｊ４．１１９．１９８８）およ
び成熟関連タンハク質（Ｒａｙ、　Ｊ　、ら：　ＮＡＲ
ＬＭ、＋０５８７．１９８７）のｃＤＮＡ配列から出発
することが特に有利である。

ｃＤＮＡ配列に基づくオリゴヌクレオチドの化学合成は
、オリゴヌクレオチドの最初のおよび最終の配列が各々
、ともに、阻害されるべき成熟酵素のＤＮＡ各々、とも
に、阻害されるべき成熟酵素のヌクレオチドからなるよ
うに、がっ、一部はオリゴヌクレオチドの最初のおよび
最終の配列がリボザイムの機能性を予め決定した特異的
ヌクレオチドから、また一部は可変的ヌクレオチドから
なる挿入されたＲＮＡ配列によって分かれているように
して、行う。基質ＲＮＡとパイプリダイズしたりボザイ
ムの状態は、次のように概略的に表わすことができる。

基質ＲＮＡ ここで、 Ｎは、基質ＲＮＡのヌクレオチド、Ａ、Ｃ，ＧまたはＴ
であり、 Ｋは、リボザイム中のＮに相補的なヌクレオチドであり
、 ■は、リボザイム中の可変的なヌクレオチドてあり、 ■、は、リボザイムのループ中の可変的なヌクレオチド
である・ ループ中のＶ、ヌクレオチドの数は、０〜５５０でよい
。ＡＧＵ認識配列は、好ましくは、基質ＲＮＡ中の切断
部位として選択される。

上記オリゴヌクレオチドは、適当なリンカ−とともに提
供される。このタイプのリンカ−は、例えば、Ｅｃ　ｏ
ＲＩＳ　Ｓａ　ｌ　Ｌ　　ＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｄｍ、Ｅ
ｃｏＲＶ、ＳｍａＩ、Ｘｈｏ（、ＫｐｎＩ、好ましくは
ＸｂａＩおよびＰｓｔＩ、の切断部位を有する。

合成されたオリゴヌクレオチドを、ベクターｐ　ＵＣ１
８、ｐＵｃｌＢまたはｐ　ＢＩＩＪｅＳＣｒｉｐｔ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ％Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、　Ｐｒｏ
ｄｕｃｔＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を用いてクローニン
グしてから、配列決定をする。確認されたオリゴヌクレ
オチドを、植物プロモーターを有する介在ベクターにク
ローニングする。このタイプのベクターの例としては、
ｐ　Ｐ　ＣＶ　７０１　（ＶｅｌｔｅｎＳＪ−ら：　Ｅ
Ｍｇｏ　Ｊ、　！、２７２３−２７３０．１９８４）、
ｐ　Ｎ　ＣＮ　（Ｆｒｏｍｍ、門、ら：ＰＮＡＳ　ａ２
．５８２４−５８２６．１９８５）またはｐＮＯ５（Ａ
ｎＧ、ら：　ＥＭＢＯＪ、　ｌ、２７？−２７６，１９
８５）などのプラスミドがあげられる。３５Ｓプロモー
ターを有するベクターｐ　Ｄ　Ｈ５１（Ｐｉｅｔｒｚａ
ｋＳＭ、ら：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５−　
ＬＬ、５８５７、！９８６）が好ましく用いられる。

続イテノ、例エバ大１ｉ１ｉ！Ｍｃ　１０６１、ＤＴ（
１、Ｄ　Ｋ　１．０Ｍ４８またはＸＬ−１などの、大腸
菌の形質転換の後、陽性のクローンを、プラスミドミニ
調製および適当な制限酵素による切断などの既知の方法
（Ｍａｎｉａｔｉｓら：　Ｌａｂ、　Ｍａｎｕａｌ）に
よって同定する。

これら陽性クローンを、次いで、バイナリ−植物ベクタ
ーにサブクローニングする。用い得る植物ベクターは、
ｐ　Ｇ　Ｖ　３８５０　（Ｚａｍｂｒｙｓｋ、　Ｐ。

ら：　ＥＭＢＯＪ、　２．２１４３−２１５０．１９８
３）またはｐ　ＱＣＡ　１８　（Ｃｌｌｓｚｅｗｓｋｉ
、Ｎ、：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　Ｌｆ
ｉ、＋０７６５−１０７８２．１９８８）である。ｐＯ
ｃＡ１８が好ましく用いられる・ Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａ中のりボザイム産生のための付加した
ＤＮＡフラグメントを有している植物プロモーターを含
む得られたバイナリ−植物ベクターを、植物の形質転換
に用いるウニレフトロボレーションまたはマイクロイン
ジェクションの技術をこれに用いることができる。

好ましくは、プロトプラストの共培養 （ｃｏｌｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）またはアゲロバクチ
’Ｊ７を用いての葉部細片の形質転換を用いる。このた
めに、植物ベクター構築物を、精製ＤＮＡによるまたは
大腸菌５Ｍｌ０など（Ｓｉｍｏｎ　Ｒ，ら：　Ｂｉｏ−
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｌ、７８４−７９１．１９８３
）のヘルパー株を介しての形質転換によって、Ｔｉプラ
スミドを有するＡ２８２のようなアグロバクテリウム・
ツメファシェンス中にトリバレンタル交配（ｔｒｉｐａ
ｒｅｎ−ｔａｌ　ｍａｔｉｎｇ）を介して転移させる。

直接的形質転換およびトリバレンタル交配を、ｒＰｌａ
ｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｎｕａ
ｌＪ　　（Ｋｌｕｗｅｒ　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉ
ｓｈｅｒｓ、　Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、１９８８）に記載
のようにして行った。

原則として、リボザイムＤＮＡを有するバイナリ−植物
ベクターによって全ての植物を形質転換させることが可
能である。双子葉植物、特に作物植物、例えば果実形成
性植物、が好ましい。トマト、イチゴ、アボカド、およ
び、パパイヤ、マンゴ−などの熱帯産果実、さらにナシ
、リンゴ、ネクタリン、アンズまたはモモのような、果
実形成性植物などを例にあげることができよう。記述さ
れた工程は、トマトで特に好まし〈実施される。

形質転換された細胞を、選択培地を用いて選択して、カ
ルスにまで培養して、適当な培地（Ｓｈａｉｎら：　Ｔ
ｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　Ｌ！、７７０
−７７０．１９８７、Ｍａｓｓｏｎ、　Ｊ、ら：　Ｐｌ
ａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ　５２．１６７−１７６．１９
８７、Ｚｈａｎら：　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ
、　ｋｌ、５５１−５５９．１９８８、ＭｃＧｒａｎａ
ｈａｍら：　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８．８０
０８０４、１９８８、　Ｎｏｖｒａｔ　　ら：　　Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１．　　ヱ、　１５４−１５９．１９
８９）上で植物体に再生する。

得られる植物体を、リボザイムが細胞中で発現されるよ
うな形質転換によって変える。これは、リボザイムＲＮ
Ａが適当な成熟遺伝子と相補的なＲＮＡに結合して多か
れ少なかれ広範囲の成熟酵素合成の阻害をもたらすのみ
ならず、適当な成熟遺伝子い相補的なＲＮＡをＧＵＣ配
列において詩興的に切断するという効果をもたらし、こ
れによって、関連成熟酵素の合成のほぼ完全な阻害が起
きる。

インビボのトランスジェニック（ｔｒａｎｓ３ｅｎｉｃ
）植物体において合成されたりボザイムＲＮＡのリボザ
イム特異性二次構造的特徴の形成は、全く予期されなか
った。したがって、観察された成熟酵素の合成阻害は、
全く予想外であった。

以下の諸例によって、本発明はさらに説明される。

例 特に記載がなければ、百分率は重量パーセントである。

１、　　オリゴヌクレオチドのクローニングリボザイム
発現のためのオリゴヌクレオチドの合成を、以下のｃＤ
ＮＡ配列に基づいて行った。

ａ）　　５’ＴＧＡＴＧＧＡＧＴＣＣＡＴＧＴＡＴＣＡ
　　３’Ｇｒｉｅｒｓｏｎら　（Ｇｒｉｅｒｓｏｎ、　
　Ｄ、ら：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　１
１．８５９５−８６０３）によるポリガラクツロナーゼ
ｃＤＮＡ配列の部分 ｂ）　　５’ＴＡＧＣＡＡＧＴＣＣＴＧＡＣＣＴＡＡ　
３’Ｒａｙ　（Ｒａｙ、　Ｊ、：　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　ｕＡ、１１９−１２４、＋９８８）に
よるペクチンエステラーゼのｃＤＮＡ配列の部分 Ｃ）　　５’ＴＧＣＴＴＴＧＴＣＣＧＡＴＡＣＡＧＴ　
３’Ｒａｙ　（Ｒａｙ、　Ｊ、：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５．１０５８７．１９８７）に
よる成熟関連タンパク質のｃＤＮＡ配列の部分 ホスフォルアミダイト法（Ｅｎｇｅｌｓ　Ｊ、ら：Ａｄ
ｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｒ＋
２；ｉｎｅｅｒｉｎｇＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖ
ｏｌｕｍｅ　３７　ｅｄ、：　Ａ、　Ｆｉｅｃｈｔｅｒ
、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ／Ｈ
ｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、　１９８８）を用いて、次のオリ
ゴヌクレオチドを合成機で合成した。

ａ）に対応 Ｉ Ｉ ｂ）に対応 Ｃ）に対応 ベクターｐ　Ｄ　Ｈ５１（Ｐｉｅｔｚａｋ、　Ｍ、ら：
　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　ＩＡ、５８５
７．１９８６）を制限エンドヌクレアーゼＸｂａ　Ｉお
よびＰｓｔＩで切断して、仔ウシ腸管ホスファターゼ（
ＣＩ　Ｐ）とともにインキュベートして、フェノール処
理してから、沈澱させた（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｌａｂ
、　Ｍａｎｕａｌ）。このように処理したベクターを、
二倍過剰の燐酸化オリゴヌクレオチドと連結して、大腸
菌ＭＣ１０６１を形質転換させた。陽性クローンを、プ
ラスミドミニ調製およびＸｂａ　ＩおよびＰｓｔｌによ
る続いての消化によって同定した。

ざらに、アンピシリン耐性の形質転換大腸菌細胞（ＬＢ
培地１ｍｌ当り１００μｇのアンピシリン）３’ＴＡＣ
ＴＡＴにＴＡＣＧＡ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　５ｒを、ニトロセルロース膜（Ｇｅｎｅ
　５ｃｒｅｅｎ　ＰｌｕｓＲ。

ＮＥＮＲ，Ｂｏｓｔｏｎ）に移して、アンピシリンを含
むＬＢ培地上で３７℃でさらに１４時間インキュベート
した。次いでコロニーを０　、５　Ｍ　Ｎ　ａ　ＯＨ中
で破壊して、固定した。乾燥後、フィルターを放射性標
識したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせること
が可能であった。陽性クローンはフィルム上に黒変を生
じた。

２、　　　ｐｏｃＡｌｓにおける３５Ｓプロモーター遺
伝子フラグメントのサブクローニング１のようにして得
た各々のクローンから０．７５ｋｂのＥｃｏＲＩフラグ
メントを単離した。

このフラグメントを、ＥｃｏＲＩで切断しておいたｐＯ
ｃＡ１８ベクターに挿入して、大腸菌ＭＣ１０６１を形
質変換させた。陽性のクローンを、プラスミドミニ調製
によって、続いてＥｃｏＲＩで加水分解した後に０．７
５ｋｂバンドの出現によって、同定した。

３、　　アグロバクテリウム・ツメファシェンスの形質
転換 植物体の形質転換を可能にするために、２のようにして
得られた構築物をアゲロバクチリア中に転移させねばな
らない。これは、トリバレンタル交配によっであるいは
直接的に行われる。トリバレンタル交配の場合には、大
腸菌５Ｍｌ０の一晩培養液からの細菌の試料１００μｍ
、構築物を有する大腸菌ＭＣ１０６１およびアグロバク
テリウム・ツメファシェンスを、遠心して沈澱させて、
３０μｍのＬＢ培地に入れた。室温で３０分間の後、こ
の細菌懸濁液を抗生物質を含まないＬＢプレート上のフ
ィルター上に置いた。フィルターを３７℃で１２時間イ
ンキュベートして、次いで２．５ｍｌの１０ｍＭ　Ｍｇ
ＣＩ２中で洗浄した。リファンピシン、テトラサイクリ
ンおよびカナマイシンを含むＬＢプレート上で分液を選
択した。陽性のコロニーを、発現されるべき遺伝子の３
２　ｐ標識したＤＮＡとのハイブリダイゼーションによ
って同定した。

アゲロバクチリアの直接的形質転換の場合は、細胞を、
２５μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１００μｇ／ｍｌ
のりファンビシンを含むＹＥＢ培地（１％酵母エキス、
１％ペプトン、０．５％ＮａＣ１）中で２８℃で一晩培
養した。１６時間後、細菌懸濁液を０Ｄ５５ｏＯ０１ま
でに希釈して、さらに○Ｄ　５５８が０．５になるまで
２８℃でざらにインキュベートした。この培養物の１ｍ
ｌを、遠沈して、１ｍｌの１５０ｍＭＮａＣ１で洗浄し
た。洗浄後、沈澱物を６００μＩ（１）氷冷１ｏｍＭｃ
ａｃ１２溶液中ニ再懸濁させた。

クローニングした０、７５ｋｂフラグメントを有するｐ
ＯＣＡ１８ベクターを、細胞を０．２ＮＮａＯＨ／１％
ＳＤＳで破壊した後に２のようにして得た大腸菌クロー
ンから単離して、ＣｓＣ１密度勾配遠心分離によって精
製した。１８ｇのプラスミドＤＮＡをコンピテントのア
ゲロバクチリアに加えて、エツペンドルフ管を氷上に１
時１％’ｆｔ！いた。１時間後、プラスミド溶液を３７
℃で５分間インキュベートして、２ｍｌのＹＥＢ培地を
加えた。

細胞を次いで２８℃で振盪インキュベーター中で一晩イ
ンキユベートした。その後、１００μｍの試料を、１０
０μｍ７ｍ１のりファンピシン、２５μｇ／ｍｌのカナ
マイシンおよび２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを
含むＹＥＢプレート上に置いた。コロニーを、２８℃で
２日後にプレート上に見出した。陽性クローンを、適当
な３２　ｐ標識オリゴヌクレオチドａ）、ｂ）またはＣ
）とのハイブリダイゼーションによって検出した。

このために、形質転換させたアゲロバクチリアを、Ｇｅ
ｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ膜に塗布して、１００μ
ｇ（７）リファンピシン、２５μｇ／ｍｌのカナマイシ
ンおよび２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＹ
ＥＢプレート上で２８℃で１４時間インキュベートした
。膜を、次いで０．５ＭＮａＯＨ上に２分間、続いて０
．５Ｍ）リス（ｐＨ７−５）上に２分装置いた。乾燥の
後、プレハイブリダイゼーションを１０％の硫酸デキス
トラン／ＩＭ　ＮａＣｌ／１％ＳＤＳ中で５５℃で２時
閉行って、次いで、放射性標識したオリゴヌクレオチド
ａ）、ｈ）またはＣ）を加えた。フィルターを、放射性
標識したオリゴヌクレオチドとともに５５℃で−晩イン
キュベートした。各々Ｉ　Ｘ５ＳＣ（０，１５ＭＮａＣ
ｌ、Ｃ１０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）お
よび２Ｘ０．２ＸＳＳＣで５５℃で３０分間洗浄した後
、陽性クローンを最上部に置いたフィルムの黒変によっ
て同定した。

４、トマトの形質転換 ａ）プロトプラスト形質転換ニ トマトプロトブラスト（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐ
ｏｒｔｓ６．１７２−１７５．１９８７）をＷ５溶Ｍ（
１５４ｍＭＮａＣｌ、１２．５ｍＭＣａＣ１２・２２Ｈ
ｚｏ、５ｍＭＫＣｌ、５ｍＭグルコース）で１回および
Ｍ　ａ　Ｍ　ｇ溶液（０，４５Ｍマンニトール、２５ｍ
ＭＭｇＣ１２，０，１％２−（Ｎ−モルフォリノ）エタ
ンスルフォン酸（ＭＥＳ、ｐＨ５，８）、Ｓｉｇｍａ　
Ｃｈｅｍｉｅ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、　ＦＲＧｅｒ
ｍａｎｙ）て１回洗浄する。

６００　ｒｐｍで３分間の注意深い遠心分離の後、０．
５ｍｌとは別に、上清を吸引除去する。これに、５０μ
ｇの仔ウシ胸腺ＤＮＡ、１０μｇの上記のプラスミドお
よび１０滴の４５％ポリエチレングリコール（ＰＥＣ；
８０００）をピペットで加える。

１０分後、プロトプラストをＷ５溶液で２回洗浄して、
ＬＣＭ培地（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　
（Ａ、１７２−１７５．１９８７）中でインキュベート
する。

ｈ）アゲロバクチリアによる、葉部細片の形質変１９１
＝ トマト葉部を細断して、２％ショ糖および１　ｐｐｍ植
物成長ホルモンゼアチン（ｚｅａｔｉｎ、　Ｓｅｒｖａ
Ｆｅｉｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　ＧｍｂＨ＆　Ｃｏ、、
ｌｌｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、　ＦＲＧｅｒｍａｎｙ）を含
むＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ、　Ｔ、ら：Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ　１５．４７３−４９７．１９６
２）上に置いて、２５℃で１日１６時間光を当ててイン
キュベートする。アグロバクテリウムによる感染を１日
後に行う。すなわち、葉部の細片を形質転換したアグロ
バクテリウム株の希釈細菌懸濁液（ＯＤｏ、１５）中に
短時間浸漬させて、同じプレートに再び置いて、同じ条
件でさらにインキュベートする。第３日に、葉部の細片
の全てを２５０　ｍｇ／Ｉのカルベニシリン（ｃａｒｂ
ｅｎｉｃｉ　ｌ　ｌ　ｉｎ）溶液で洗浄して、１ρρｍ
のゼアチン、２００ｍｇ／ｌのセフォタキシム（ｃｅｆ
ｏｔａｘｉｍｅＳＨｏｅｃｈｓｔ　ＡＧ％Ｆｒａｎｋｆ
ｕｒｔ）、２００ｍｇ／Ｉカルベニシリンおよび１００
ｍｇ／Ｉのカナマイシンを含む２ＭＳ培地上に置く。再
生体（ｒｅｇｅｎｅｒａｎｔｓ）をざらに約２０日後に
１　ｐｐｍゼアチン、２００ｍｇ／ｌのセフォタキシム
、２００ｍｇ／Ｉのカルへニジリンおよび１００ｍｇ／
ｌのカナマイシンを含む２ＭＳ培地に移した。

成熟関連タンパク質ＲＮＡに対して向けられたトランス
ジェニックトマト植物体のりボザイムＲＮＡの検出 全細胞性ＲＮＡを、成熟関連タンパク質ＲＮＡに対する
リボザイムをコードする遺伝子で形質転換させておいた
トランスゲニックトマト植物体からの葉の細片から単離
した。このために、葉材料を乳鉢と乳棒を用いて液体窒
素下ですりつぶした。

粉状になった葉材料を、２倍量の抽出緩衝液（０，２Ｍ
酢酸ナトリウム、１％ＳＤＳ、１０ｍＭＥＤＴＡ）、２
倍量のフェノール（抽出緩衝液で平衡にしたもの）およ
び半容量のクロロホルム／イソアミルアルコール２４：
１　（ｖ／ｖ）と混合した。充分に混合した後、遠心分
離によって相を分離させて、上層の水相のフェノール抽
出を繰り返した。この水相を、混合および遠心分離によ
る分離の後、再び新たなエッペンドルフ管に移し入れて
、クロロホルム／イソアミルアルコール２４：１（Ｖ／
Ｖ）で抽出した。次いで、１／３容堡の８ＭＬｉｃｔを
水相に加えて、混合物を４℃で一晩保持した・遠心分離
後に沈澱が生じた。これを水ζ２溶かして、０．３Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ５，５）（最終濃度）の添加の後、
２１／２容量のエタノールで洗浄した。７０％のエタノ
ールで洗浄して乾燥させた後、沈澱物を５０μｍの水に
溶解させた。

リボザイムをコードする遺伝子の特異的な発現を検出す
るために、非形質転換野生型トマト植物体からおよびト
ランスジェニックトマト植物体からの試料約４μ８の全
ＲＮＡを、６％ホルムアルデヒドを含む１％アガアロー
スゲルに塗布した。この塗布のために、ＲＮＡを乾燥さ
せて、５０％ホルムアミド７６％ホルムアルデヒドに溶
かして、６０℃で１５分間加熱した。泳動後にアガロー
スゲルを水で簡単に洗浄して、ｌ０ＸＳＳＣを用いてＧ
ｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ膜に移した。２４時時
閉、膜を２ＸＳＣＣで洗浄して、８０’Ｃで２時間イン
キュベートしてから、乾燥させた。

ハイブリダイゼーションを、１％ＳＤＳ、ＩＭＮａＣｌ
および１０％硫酸デキストランを用いた２時間のプレハ
イブリダイゼーションの後に５５℃で成熟関連タンパク
質ＤＮＡの放射性標識したオリゴヌクレオチドＣ）を用
いて行った。

成熟関連タンパク質ＲＮＡに対するリボザイムをコード
する遺伝子の検出 トランスジェニックトマト植物体からまたは非形質転換
野生型トマトからの葉の二つの細片を、液体窒素下で乳
鉢および乳棒を用いて粉末にした。

粉末を、エツペンドルフ管に入れて、予め６５℃に加熱
しておいた５００μｍの２ＸＣＴＡＢ緩衝液（２ＸＣＴ
ＡＢ：２％セチルトリメチル−臭化アンモニウム、１０
０ｍＭ）リス（ｐＨ８，０）、２゜ｍＭ　ＥＤＴＡ、１
．４Ｍ　ＮａＣｌ、１％ポリビニルピロリドン分子量＝
４０，０００）と混合した。次いで、５００μｍのクロ
ロホルム／イソアミルアルコール２４：１　（ｖ／ｖ）
を加えて、水相を抽出した。二つの相を、遠心分離によ
って次いて分離した。水相を、ピペットで新たなエツペ
ンドルフ管に入れて、６５℃に加熱しておいた１　００
　）１１の５ＸＣＴＡＢを加えた。クロロホルム／イソ
アミルアルコールを用いる他の抽出を、５００μｍのＣ
ＴＡＢ沈澱緩衝液（１ＸＣＴＡＢ、５０ｍＭ）リス（ｐ
Ｈ８，０）、１０ｍＭＥＤＴＡ）を水相に加える前に、
行った。遠心分離後、沈澱物を高塩ＴＥ（１０ｍＭ）リ
ス（ｐＨ８，０）、１ｍＭＥＤＴＡ、ＩＭＮａＣｌ）中
に溶解して、２１／２容量のエタノールによって沈澱さ
せた。遠心分離、洗浄および乾燥の後、沈澱物を水に溶
かして、２５ｔｔｇｌ巾１のＲＮａｓｅＡ（最終濃度）
で処理した。次いでフェノール処理によってＲＮａｓｅ
　　を除去した。

再度の乾燥の後、ＤＮＡを５０μｍの水に溶解させた。

次いで、４μｇのＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＥ
ｃｏＲＩを用いて３７℃で１時間で加水分解した。加水
分解物を、１％アガロースゲルで分画した。ゲルを０．
４Ｎ　　ＮａＯＨ１０，６ＭＮａＣ１とともに３０分間
、次いで、０．５Ｍ）リス（ｐＨ７，５）／１．５Ｍ　
ＮａＣｌを用いて３０分間、振盪した。用いたサイズ標
準物は、λ−ファージＤＮＡのＰｓｔＩ加水分解物であ
った。

次いで、ＤＮＡを網線プロットを介してｌ０ＸＳＳＣを
用いてＧｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ膜に移した・
フィルターを次いで乾燥させて、１％ＳＤＳ／ＩＭＮａ
Ｃ１／１０％硫酸デキストランでプレハイブリダイズさ
せた。ハイブリダイゼーションのために、プレハイブリ
ダイゼーション混合物を、予め１０分間煮沸しておいた
オリゴヌクレオチドＣ）の放射性標識した試料と混合し
た。

リボザイムをコードする遺伝子を、最上部に置いたＸ線
フィルム上の約０．８ｋｈに現れた黒変によって検出し
た。

リボザイムのインビトロ活性の検出 成熟関連タンパク質ＲＮＡに対するリボザイムをコード
したオリゴヌクレオチドを、制限エンドヌクレアーゼＸ
ｂａＩおよびＰｓｔＩによる加水分解後に開いておいた
ＢＩｕｅＳＣｒｉｐｔベクター中にクローニングした。

これと平行して、成熟関連タンパク質（Ｒａｙ、Ｊ、ら
：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５、＋
０５８７．１９８７に示されているＤＮＡ配列のヌクレ
オチド番号７９２〜８１５）のＤＮＡフラグメントを、
同じベクターの５ａｃｌ／ＫｐｎＩ切断部位にクローニ
ングした。両ベクターを、ＲＮＡ合成のためのＤＮＡテ
ンプレートとしてインビトロのＲＮＡポリメラーゼ反応
において用いた。

このために、平行して、リボザイム遺伝子を有するベク
ターおよび成熟関連タンパク質遺伝子のＤＮＡフラグメ
ントを有するベクターを、制限エンドヌクレアーゼＳａ
ｃ　Ｉで切断した。開環ベクターの１Ｍｇの試料を、次
いで、５０ｍＭＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，５）に溶かした
１０μ１Ｔｌｏ１の各ヌクレオチドＡＴＰ、ＧＴＰ、Ｃ
ＴＰ、ＵＴＰおよび（ａ−３２Ｐ）ＵＴＰ　（５，、、
）　およびＩＯＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼとともに３
７℃で３０分間インキュベートした。ＲＮＡを、ＤＮａ
ｓｅ処理後、エタノール中で沈澱させた。

リボザイム遺伝子を有するベクターの合成ＲＮＡおよび
成熟関連タンパク質遺伝子フラグメントを有するベクタ
ーのＲＮＡを、−緒に５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，８
）および１０ｍＭＭｇＣ１２とともに２５℃で２時間イ
ンキュベートした。次いで、反応産生物を５％変性ポリ
アクリルアミドゲル（８Ｍ尿素）上で分離して、Ｘ線フ
ィルム上のオートラジオグラフィーによって同定した。

オートラジオグラムは、リボザイムＲＮＡの存在下では
、成熟関連タンパク質遺伝子フラグメントのＲＮＡ転写
物が切断されたことを示す。

トランスジェニックトマトの遅延成熟の検出非形質転換
野生型トマト植物体と成熟関連タンパク質ＲＮＡに対し
て向けられたりボザイムをコードする遺伝子を有してい
るトランスジェニックトマト植物体との比較によって、
トランジェニック植物体からのトマトは数日遅れて成熟
することが明らかになった。リボザイム活性およびこれ
と関連した成熟の遅延は、このように、トマト果実にお
いても検出され、これは作用の実際の部位を表す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下のＤＮＡ配列を有する、リボザイ ムをコードする遺伝子または遺伝子フラグメント。 ａ）【遺伝子配列があります】 ｂ）【遺伝子配列があります】 ｃ）【遺伝子配列があります】 ２、以下の配列の、リボザイム活性を有す るＲＮＡ。 【遺伝子配列があります】 ここで、 Ｋは、植物成熟酵素ＲＮＡに相補的なヌクレオチドＡ、
   Ｃ、ＧまたはＵであり、 Ｖは、可変的なヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり
   、 Ｖ＿Ｌは、ループ中の可変的ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇま
   たはＵであって、ループ中のＶ＿Ｌヌクレオチドの数は
   ０〜５５０である。 ３、以下の配列を有する、リボザイム活性 を有するＲＮＡ。 ａ）【遺伝子配列があります】 ｂ）【遺伝子配列があります】 ｃ）【遺伝子配列があります】 ４、以下のＤＮＡ配列を有するリボザイム をコードする遺伝子または遺伝子フラグメントの、オリ
   ゴヌクレオチドの合成による製造法であつて、オリゴヌ
   クレオチドの最初のおよび最終の配列が各々、ともに、
   阻害されるべき成熟酵素のＤＮＡ配列と相補的な５、好
   ましくは７〜１０個、のヌクレオチドからなり、かつ、
   一部はリボザイムの機能性を予め決定した特異的ヌクレ
   オチドからまた一部は可変的ヌクレオチドから成る挿入
   されたＤＮＡ配列によつて分かれているオリゴヌクレオ
   チドの合成からなる、製造法。 ａ）【遺伝子配列があります】 ｂ）【遺伝子配列があります】 ｃ）【遺伝子配列があります】 ５、以下の配列のリボザイム活性を有する ＲＮＡの製造法であって、 【遺伝子配列があります】 以下の配列のオリゴヌクレオチドを合成することからな
   り、 【遺伝子配列があります】 ここで、 Ｋは、植物成熟酵素ＲＮＡに相補的なヌクレオチドＡ、
   Ｃ、ＧまたはＴであり、 Ｖは、可変的なヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴであり
   、 Ｖ＿Ｌは、可変的ヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴであ
   って、Ｖ＿Ｌヌクレオチドの数は０から５５０であり、 Ｋ′、Ｖ′、Ｖ＿Ｌ′は、各々の場合にＫ、Ｖ、Ｖ＿Ｌ
   に相補的なＡ、Ｃ、ＧまたはＴであり、 これを植物プロモーターを有する仲介ベクターにクロー
   ニングして、次いで、植物プロモーターとともにバイナ
   リー植物ベクターにクローニングして、このようにして
   得たプラスミドＤＮＡで植物を形質転換させることを特
   徴とする製造法。 ６、リボザイム活性を有する合成ＲＮＡが 下記の配列のＲＮＡである、請求項５に記載の製造法。 ａ） 【遺伝子配列があります】 ｂ） 【遺伝子配列があります】 または ｃ） 【遺伝子配列があります】 ７、請求項１に記載のＤＮＡ配列の一つま たはそれ以上を含む、植物細胞、植物体、種子およびそ
   れらの部分。 ８、請求項２または３に記載のＲＮＡ配列 の一つまたはそれ以上を含む、植物細胞、植物体、種子
   およびそれらの部分。 ９、請求項１に記載のＤＮＡ配列の一つま たはそれ以上を含む、トマト、その部分、その植物細胞
   または種子。 １０、請求項２または３に記載のＲＮＡ配列の一つまた
   はそれ以上を含む、トマト、その部分、その植物細胞ま
   たは種子。 １１、植物体において成熟酵素の合成を阻害するための
   、リボザイムの使用。 １２、植物体が果実形成性植物である、請求項１１に記
   載の使用。 １３、果実形成性植物がトマトである、請求項１２に記
   載の使用。 １４、請求項２または３のいずれかに記載のＲＮＡ配列
   をリボザイムとして用いる、請求項１１〜１３のいずれ
   か１項に記載の使用。