JPH03108491A - ガラクトシル化糖タンパク質単位の酵素的合成方法 - Google Patents
ガラクトシル化糖タンパク質単位の酵素的合成方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
糖タンパク質は、腫瘍発生、細菌およびウィルス感染、
細胞／細胞認識、細胞増殖および細胞分化など生物学的
認識過程において中心的役割を果している。それらは血
液型分類の基礎をなし、また様々な高分子物質および医
薬の内部化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を担っ
ている。すナワチ、糖タンパク質の重要な使用分野の一
つは、例えば、標的臓器への医薬の選択的配向およびタ
ンパク質加水分解からの医薬の保護である［Ｎ。
細胞／細胞認識、細胞増殖および細胞分化など生物学的
認識過程において中心的役割を果している。それらは血
液型分類の基礎をなし、また様々な高分子物質および医
薬の内部化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を担っ
ている。すナワチ、糖タンパク質の重要な使用分野の一
つは、例えば、標的臓器への医薬の選択的配向およびタ
ンパク質加水分解からの医薬の保護である［Ｎ。
５ｈａｒｏｎ、 Ｈ，Ｌｉｓ、 Ｃｈｅｍ、 Ｅｎｇ、
Ｎｅｗｓ ５９（１３）（１９８１） ２１ ；Ｈ，
５ｃｈａｃｈｔｅｒ、 Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓＬｒｙ １７． （１９８４） ３］。
Ｎｅｗｓ ５９（１３）（１９８１） ２１ ；Ｈ，
５ｃｈａｃｈｔｅｒ、 Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓＬｒｙ １７． （１９８４） ３］。
糖タンパク質は、ペプチド部分と炭水化物部分の間の結
合の種類に応じてＯ−グリコシドおよびＮ−グリコシド
糖タンパク質に分類される。
合の種類に応じてＯ−グリコシドおよびＮ−グリコシド
糖タンパク質に分類される。
Ｎ−グリコシド糖タンパク質はほぼ専らに、中心結合単
位としてのアスパラギンに結合したＮ−アセチルグルコ
サミンを含有する。糖タンパク質の前記諸機能に関して
は、グリコジル化アスパルチル−Ｎ−アセチルグルコサ
ミンの合成が特に注目に値する。
位としてのアスパラギンに結合したＮ−アセチルグルコ
サミンを含有する。糖タンパク質の前記諸機能に関して
は、グリコジル化アスパルチル−Ｎ−アセチルグルコサ
ミンの合成が特に注目に値する。
これら物質の試験管内生合成経路に従う酵素を用いての
かかる糖タンパク質の合成は、立体選択性および領域選
択性（ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔ １ｖｉｔｙ）が高く、
また保護基を伴う煩瑣な化学を回避できる長所を有して
おり、そのため多工程化学合成に比べ大抵の場合に好収
率が保証される。
かかる糖タンパク質の合成は、立体選択性および領域選
択性（ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔ １ｖｉｔｙ）が高く、
また保護基を伴う煩瑣な化学を回避できる長所を有して
おり、そのため多工程化学合成に比べ大抵の場合に好収
率が保証される。
ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２，４，１，２
２）は領域特異的および立体特異的に、β（ｌ→４）結
合形成を伴ってガラクトースをＮ−アセチルグルコサミ
ンを転移する。ガラクトシルトランスフェラーゼの天然
基質はグルコス（しかしこれはσ−ラクトアルブミンの
存在下でのみこの酵素により受容される）および末端に
Ｎ−アセチルグルコサミンを有するＮ−糖タンパク質で
ある。この酵素と非天然基質の反応は以下の刊行物に記
載されている。
２）は領域特異的および立体特異的に、β（ｌ→４）結
合形成を伴ってガラクトースをＮ−アセチルグルコサミ
ンを転移する。ガラクトシルトランスフェラーゼの天然
基質はグルコス（しかしこれはσ−ラクトアルブミンの
存在下でのみこの酵素により受容される）および末端に
Ｎ−アセチルグルコサミンを有するＮ−糖タンパク質で
ある。この酵素と非天然基質の反応は以下の刊行物に記
載されている。
１、 Ｈ，Ａ、 Ｎｕｎｅｚ、 Ｒ，Ｂａｒｋｅｒ；
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９゜４８９（１９８０
） ２、 Ｊ、 Ｔｈｉｅｍ、 Ｗ、 Ｔｒｅｄａｒ、
Ｔ、 Ｗｉｅｍａｎｎ；Ｄｅ−ｃｈｅｍａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓ、 Ｖｏｌ
、 ２゜１８９ （１９８８）、 ｅｄ、 ：Ｄ、 Ｂ
ｅｈｒｅｎｓ、 ＶＣＨ−Ｖｅｒ−１ａｇｓｇｅｓｅｌ
ｌｓｃｈａｆｔ、 Ｗｅｉｎｈｅｉｍ３、 Ｃ，Ａｕ
ｇ６． Ｓ、 Ｄａｖｉｄ、 Ｃ，Ｍａｔｈｉｅｕ
、Ｃ。
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９゜４８９（１９８０
） ２、 Ｊ、 Ｔｈｉｅｍ、 Ｗ、 Ｔｒｅｄａｒ、
Ｔ、 Ｗｉｅｍａｎｎ；Ｄｅ−ｃｈｅｍａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓ、 Ｖｏｌ
、 ２゜１８９ （１９８８）、 ｅｄ、 ：Ｄ、 Ｂ
ｅｈｒｅｎｓ、 ＶＣＨ−Ｖｅｒ−１ａｇｓｇｅｓｅｌ
ｌｓｃｈａｆｔ、 Ｗｅｉｎｈｅｉｍ３、 Ｃ，Ａｕ
ｇ６． Ｓ、 Ｄａｖｉｄ、 Ｃ，Ｍａｔｈｉｅｕ
、Ｃ。
Ｇａｕｔｈｅｒｏｎ； ＴｅＬｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅ
ｔｔ、 ２５．１４６７（１９８４） ４、 Ｕ、 Ｚｅｈａｖｉ、 Ｍ、 Ｈｅｒｃｈｍａ
ｎ；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、 Ｒｅｓ。
ｔｔ、 ２５．１４６７（１９８４） ４、 Ｕ、 Ｚｅｈａｖｉ、 Ｍ、 Ｈｅｒｃｈｍａ
ｎ；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、 Ｒｅｓ。
■盈、 １６（１（１９８４）
５、 口、 Ｚｅｈａｖｉ、Ｓ、 ５ａｄｅｈ、
Ｍ、 Ｈｅｒｃｈｍａｎ；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、
Ｒｅｓ、 １２４．２３ （１９８３）６、 Ｕ、
Ｚｅｈａｖｉ、 Ｍ、 Ｈｅｒｃｈｍａｎ； Ｃａｒ
ｂｏｈｙｄｒ、 Ｒｅｓ。
Ｍ、 Ｈｅｒｃｈｍａｎ；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、
Ｒｅｓ、 １２４．２３ （１９８３）６、 Ｕ、
Ｚｅｈａｖｉ、 Ｍ、 Ｈｅｒｃｈｍａｎ； Ｃａｒ
ｂｏｈｙｄｒ、 Ｒｅｓ。
す３．３３９ （１９８４）
７、 Ｃ，Ａｕｇ６． Ｃ，Ｍａｔｈｉｅｕ、 Ｃ，
Ｍｅｒｉｅｎｎｅ；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、 Ｒｅｓ、
１５１． １４７ （１９８６）３、 Ｍ、Ｍ、
Ｐａ１ｃｉｃ、Ｏ，Ｐ、５ｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｏ。
Ｍｅｒｉｅｎｎｅ；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、 Ｒｅｓ、
１５１． １４７ （１９８６）３、 Ｍ、Ｍ、
Ｐａ１ｃｉｃ、Ｏ，Ｐ、５ｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｏ。
Ｈｉｎｄｓｇａｕｌ；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、Ｒｅｓ、
１５９，３１５（１９８７）。
１５９，３１５（１９８７）。
この場合に、末端にグルコースまたはＮ−アセチルグル
コサミンを有する糖類または低級オリゴ糖類はこの酵素
により転化される。グリココンジュゲートアミノ酸およ
び炭水化物、特に相当するアスパラギン誘導体は従来よ
り基質として用いられていない。
コサミンを有する糖類または低級オリゴ糖類はこの酵素
により転化される。グリココンジュゲートアミノ酸およ
び炭水化物、特に相当するアスパラギン誘導体は従来よ
り基質として用いられていない。
今般、ガラクトシルトランスフェラーゼは式Ｉおよび■
のグリコアスパラギン類の合成モ可能にし、既知の方法
の組合せにより非ガラクトンド部分を前もって化合的に
合成できることが見出された。
のグリコアスパラギン類の合成モ可能にし、既知の方法
の組合せにより非ガラクトンド部分を前もって化合的に
合成できることが見出された。
Ｇａ１−β（１＝４）−ＧｌｃＮＡｃ−β（１−４Ｎ）
−Ａｓｎ（Ｉ ）はアスパルチルグルコサミン尿症患者
の尿中に完全にすなわちアミノ酸部分を含めて、ブロッ
クされていない形で存在するＥＲ，Ｊ、 Ｐｏ１ｌｉＬ
ｔ。
−Ａｓｎ（Ｉ ）はアスパルチルグルコサミン尿症患者
の尿中に完全にすなわちアミノ酸部分を含めて、ブロッ
クされていない形で存在するＥＲ，Ｊ、 Ｐｏ１ｌｉＬ
ｔ。
Ｋ、Ｍ、 Ｐｒｅｔｔｙ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、
１４１ （１９７４） １４１］。
１４１ （１９７４） １４１］。
Ｇａ１−β（１→４）−ＧＩｃＮＡｃ−β（１→４）−
ＧｌｃＮＡｃ−β（１−Ｎ）−Ｌ−Ａｓｎ（ｎ）は、赤
血球膜＋： 存在する。それはＲｏｂｉｎｉａレクチン
の受容体部位ではないかと考えられている［Ａ、Ｍ、
Ｌｅｓｅｎｅｙ、 Ｒ。
ＧｌｃＮＡｃ−β（１−Ｎ）−Ｌ−Ａｓｎ（ｎ）は、赤
血球膜＋： 存在する。それはＲｏｂｉｎｉａレクチン
の受容体部位ではないかと考えられている［Ａ、Ｍ、
Ｌｅｓｅｎｅｙ、 Ｒ。
Ｂｏｕｒｒｉｌｌｏｎ、 Ｓ、 Ｋｏｒｎｆｅｌｄ、
Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 １５３ （１９７２） ８３１］。
すなわち、・本発明は、弐■または■
で示される化合物をガラクトシル供与体の存在下にガラ
クトシルトランスフェラーゼと共にインキュベートする
ことより成る前記式１または前記式■の化合物の酵素的
製造方法に関するものである。
クトシルトランスフェラーゼと共にインキュベートする
ことより成る前記式１または前記式■の化合物の酵素的
製造方法に関するものである。
以下、本発明を詳述するが、本発明は特許請求の範囲に
定義されている。
定義されている。
ガラクトシルトランスフェラーゼ、例えばＥＣ２，４，
１，２２は弐■および■のグリフアスパラギン類を基質
として受容し、そしてそれらは、本方法においては末端
Ｎ−アセチルグルコサミン単位においてβ（ｌ→４）位
にガラクトシル化される。この酵素はガラクトース供与
体としてウリジン−５′−ジホスフェート−ガラクトー
ス（ＵＤＰ−Ｇａｌ）を必要とする。しかしながら、こ
のヌクレオチド類は極めて高価であり、従って、酵素ウ
リジン−５′−ジホスフェート−ガラクトース４−エピ
メラーゼ（ＥＣ５，１，３，２） ｌこより触媒される
反応でウリジン−５′−ジホスフェート−グルコース（
ＵＤＰ −Ｇａ１）からそれを系内で製造した方がより
有利である。
１，２２は弐■および■のグリフアスパラギン類を基質
として受容し、そしてそれらは、本方法においては末端
Ｎ−アセチルグルコサミン単位においてβ（ｌ→４）位
にガラクトシル化される。この酵素はガラクトース供与
体としてウリジン−５′−ジホスフェート−ガラクトー
ス（ＵＤＰ−Ｇａｌ）を必要とする。しかしながら、こ
のヌクレオチド類は極めて高価であり、従って、酵素ウ
リジン−５′−ジホスフェート−ガラクトース４−エピ
メラーゼ（ＥＣ５，１，３，２） ｌこより触媒される
反応でウリジン−５′−ジホスフェート−グルコース（
ＵＤＰ −Ｇａ１）からそれを系内で製造した方がより
有利である。
化合物Ｉまたは■の製造にあたっては、前述のそれぞれ
の出発基質■または■をガラクトシル供与体、例えばＵ
ＤＰ−Ｇａｌと共に水性溶液中でガラクトシルトランス
フェラーゼで処理する。
の出発基質■または■をガラクトシル供与体、例えばＵ
ＤＰ−Ｇａｌと共に水性溶液中でガラクトシルトランス
フェラーゼで処理する。
それら出発基質およびガラクトース供与体はそれぞれ等
モル濃度、好ましくは１０〜１５ｍＭ量で用いられる。
モル濃度、好ましくは１０〜１５ｍＭ量で用いられる。
商業的に入手し得るガラクトシルトランスフェラーゼは
可溶形態または固定形態で用いることができる。固定を
行う場合には、特に経済的理由からシリカゲルが担体と
して好ましい。反応は有利には緩衝溶液中で行われる。
可溶形態または固定形態で用いることができる。固定を
行う場合には、特に経済的理由からシリカゲルが担体と
して好ましい。反応は有利には緩衝溶液中で行われる。
緩衝剤として特にカコジル酸ナトリウムが用いられる。
培養温度は酵素の温度／活性範囲に応じて広い範囲にわ
たって変えることができる。
たって変えることができる。
反応は好ましくは３２〜３７°Ｃで行われる。
本発明による反応は、前述の如く、いわゆる″ワンポッ
ト法（ｏｎ−ｐｏｔ ｐｒｏｃｅｓｓ）”により、ウリ
ジン−５′−ジホスフェート−ガラクトース４−エピメ
ラーゼを用いてＵＤＰ −Ｇａ１ｆ！：ＵＤＰ −Ｇｌ
ｃから製造することから始まる。ワンポット法とは、す
べての関与基質およびすべての関与酵素を一つの反応混
合物に合体することを意味する。前述の諸反応、ＵＤＰ
−ＧｌｃからのＵＤＰ−Ｇａｌの製造および化合物Ｉま
たはＨの製造を逐次的に行うこともできることはもちろ
んである。しかしながら、前記反応パラメータを混合物
全体についで維持する場合にはワンポット法の方がより
経済的である。
ト法（ｏｎ−ｐｏｔ ｐｒｏｃｅｓｓ）”により、ウリ
ジン−５′−ジホスフェート−ガラクトース４−エピメ
ラーゼを用いてＵＤＰ −Ｇａ１ｆ！：ＵＤＰ −Ｇｌ
ｃから製造することから始まる。ワンポット法とは、す
べての関与基質およびすべての関与酵素を一つの反応混
合物に合体することを意味する。前述の諸反応、ＵＤＰ
−ＧｌｃからのＵＤＰ−Ｇａｌの製造および化合物Ｉま
たはＨの製造を逐次的に行うこともできることはもちろ
んである。しかしながら、前記反応パラメータを混合物
全体についで維持する場合にはワンポット法の方がより
経済的である。
反応進行の検出は薄層クロマトグラフィによって行われ
る。ヌクレオチドホスフェートをイオン交換クロマトグ
ラフィ、例えばＤｏｗｅｘ １−Ｘ８（対イオン： Ｃ
Ｑ−）および例えばＢｌｏ−Ｃａ１ Ｐ２を用いたゲル
クロマトグラフィにより除いた後で最終生成物を分離す
るがそれらは２５〜３５％の収率で得られる。
る。ヌクレオチドホスフェートをイオン交換クロマトグ
ラフィ、例えばＤｏｗｅｘ １−Ｘ８（対イオン： Ｃ
Ｑ−）および例えばＢｌｏ−Ｃａ１ Ｐ２を用いたゲル
クロマトグラフィにより除いた後で最終生成物を分離す
るがそれらは２５〜３５％の収率で得られる。
ガラクトシル受容体■および■は様々な著者に係る論文
に由来する方法により化学合成できる［Ｄ、Ｅ、 Ｃｏ
ｗｌｅｙ、 Ｌ、 Ｈｏｕｇｈ、 Ｃ，Ｍ、 Ｐｅａｃ
ｈ。
に由来する方法により化学合成できる［Ｄ、Ｅ、 Ｃｏ
ｗｌｅｙ、 Ｌ、 Ｈｏｕｇｈ、 Ｃ，Ｍ、 Ｐｅａｃ
ｈ。
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、 Ｒｅｓ、 １９ （１９７１）
２３１ ； Ｍ、 ５ｐｉｎｏｌａ。
２３１ ； Ｍ、 ５ｐｉｎｏｌａ。
Ｒ，Ｗ、 Ｊｅａｎｌｏｚ、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈ
ｅｍ、 ２４５ （１９７０）４１５８；Ｈ，Ｋｕｎｚ
、 Ｈ，Ｗａｌｄｍａｎｎ、 Ａｎｇｅｗ、 Ｃｂｅｍ
。
ｅｍ、 ２４５ （１９７０）４１５８；Ｈ，Ｋｕｎｚ
、 Ｈ，Ｗａｌｄｍａｎｎ、 Ａｎｇｅｗ、 Ｃｂｅｍ
。
９７ （１９８５）８８５］
アスパルチル−Ｎ−アセチルグルコサミ７Ｉ［１の場合
には、Ｎ−アセチルグルコサミンをアセチルクロライド
でベルアセチル化ａ−クロライドに変えた後それを水／
クロロホルム中で相間移動触媒によりβ−アジドに変え
る。パラジウム上で水素によりβ−アミンまで還元後、
エチル２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン−１−
カルボキシレート（ＥＥＤＱ）介助縮合によりα−メチ
ルＮ−アセチルアスパルテートに結合することができる
。ナトリウムメタル−トで脱０−アセチル化後、式■の
ガラクトシル受容体が得られるが、これは酵素ガラクト
シル化に先立ちゲルクロマトグラフィにより精製する必
要がある。
には、Ｎ−アセチルグルコサミンをアセチルクロライド
でベルアセチル化ａ−クロライドに変えた後それを水／
クロロホルム中で相間移動触媒によりβ−アジドに変え
る。パラジウム上で水素によりβ−アミンまで還元後、
エチル２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン−１−
カルボキシレート（ＥＥＤＱ）介助縮合によりα−メチ
ルＮ−アセチルアスパルテートに結合することができる
。ナトリウムメタル−トで脱０−アセチル化後、式■の
ガラクトシル受容体が得られるが、これは酵素ガラクト
シル化に先立ちゲルクロマトグラフィにより精製する必
要がある。
アスパルチルキトビオジルアミン■を合成するには、ま
ずキチンをアセトリシスによりオリゴマー混合物に分解
しそこからキトビオースオクタアセテートをフラッシュ
クロマトグラフィにより単離することができる。これを
アセチルクロライド中に懸濁させ、そして気体状塩化水
素を通じることによってベルアセチル化α−キトビオジ
ルクロライドに変える。弐■の化合物の合成と同様にし
て、そのσ−クロライドをナトリウムアジドを用いてβ
−アジドに変え、β−アミンに還元し、α−メチルＮ−
アセチルアスパルテートに結合し、そして最後に脱Ｏ−
アセチル化する。このようにして得られた式■のアスパ
ルチルキトビオジルアミン マトグラフィによる精製後前述の酵素ガラクトシル化に
用いることができる。
ずキチンをアセトリシスによりオリゴマー混合物に分解
しそこからキトビオースオクタアセテートをフラッシュ
クロマトグラフィにより単離することができる。これを
アセチルクロライド中に懸濁させ、そして気体状塩化水
素を通じることによってベルアセチル化α−キトビオジ
ルクロライドに変える。弐■の化合物の合成と同様にし
て、そのσ−クロライドをナトリウムアジドを用いてβ
−アジドに変え、β−アミンに還元し、α−メチルＮ−
アセチルアスパルテートに結合し、そして最後に脱Ｏ−
アセチル化する。このようにして得られた式■のアスパ
ルチルキトビオジルアミン マトグラフィによる精製後前述の酵素ガラクトシル化に
用いることができる。
以下、本発明を実施例により例示する。
実施例
１、グリコジルアスパラギン■および■のガラクトシル
化手順 ａ．反応を塩化マンガン（ ５ ｍＭ）の存在下にカコ
ジル酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ， ｐＨ７．７）中
で行う。ＵＤＰ−ガラクトース（１３ｍＭ） 、グリコ
ジルアスパラギン（■またはＩＶ，１３ｍＭ）および牛
血清アルブミン（ ｌ ｍｙ／ ｒａｎを添加し、そし
て窒素で脱酸素を行った後、ガラクトシルトランスフェ
ラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２２． ｌＯＵ ）を添加
する。３７°Ｃで２日後、その混合物を陰イオン交換体
（ Ｄｏｗｅｘ ｌ −Ｘ８ 、クロライド型）を用い
て後処理し、対でＢｉｏ−Ｇａｌ Ｐ２でのゲルクロ
マトグラフィにより精製する。
化手順 ａ．反応を塩化マンガン（ ５ ｍＭ）の存在下にカコ
ジル酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ， ｐＨ７．７）中
で行う。ＵＤＰ−ガラクトース（１３ｍＭ） 、グリコ
ジルアスパラギン（■またはＩＶ，１３ｍＭ）および牛
血清アルブミン（ ｌ ｍｙ／ ｒａｎを添加し、そし
て窒素で脱酸素を行った後、ガラクトシルトランスフェ
ラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２２． ｌＯＵ ）を添加
する。３７°Ｃで２日後、その混合物を陰イオン交換体
（ Ｄｏｗｅｘ ｌ −Ｘ８ 、クロライド型）を用い
て後処理し、対でＢｉｏ−Ｇａｌ Ｐ２でのゲルクロ
マトグラフィにより精製する。
ｂ．反応を塩化マンガン（ ５ ｍＭ）の存在下にカコ
ジル酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ， ｐＨ７．７）中
で行う。ＵＤＰ−グルコース（１３ｍＭ） 、グリコジ
ルアスパラギン（■またはＩＶ 、 １３ｍＭ）および
牛血清アルブミン（ ｌ ｒｎｇ／ ｍＱ）を添加し、
そして窒素で脱酸素を行った後、ガラクトシルトランス
フェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２２， ＩＴＪ）およ
びＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（ＥＣ ５。
ジル酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ， ｐＨ７．７）中
で行う。ＵＤＰ−グルコース（１３ｍＭ） 、グリコジ
ルアスパラギン（■またはＩＶ 、 １３ｍＭ）および
牛血清アルブミン（ ｌ ｒｎｇ／ ｍＱ）を添加し、
そして窒素で脱酸素を行った後、ガラクトシルトランス
フェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２２， ＩＴＪ）およ
びＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（ＥＣ ５。
１、２．２， ＩＯＵ）を添加する。３７°Ｃで２日後
、その混合物を陰イオン交換体（ Ｄｏｗｅｘ ｌ −
Ｘ３ 、りロライド型）を用いて後処理し、次いでＢｉ
ｏ −Ｇｅｌ Ｒ２でのゲルクロマトグラフィにより精
製する。
、その混合物を陰イオン交換体（ Ｄｏｗｅｘ ｌ −
Ｘ３ 、りロライド型）を用いて後処理し、次いでＢｉ
ｏ −Ｇｅｌ Ｒ２でのゲルクロマトグラフィにより精
製する。
１．１） ２−アセトアミド−４−０−（β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル）−１−Ｎ−（Ｎ−アセチル−１−メ
チル−４−Ｌ−アスパルチル）−２−デオキシ−β−Ｄ
−グルコピラノシルアミン（Ｉ） 混合物： ６４．５ｍｇ（１００μｍｏｆ２）のＵＤＰ
−Ｇａ １３９ ｍｇ（１００／ｌ＋ｏ１２）の化合
物■ＴＬＣチエツク：移動相ｎ−グロバノール／酢酸／
水（８５： １２： ３ ） Ｒ４値： ＧＩｃＮＡｃ−Ａｓｎ（ＩＩＩ ）
０．２２Ｇａｌ −ＧｌｃＮＡｃ −Ａｓｎ（１）
０．０８収率： ２０ｍｇ（３５％） 選択された’Ｈ−ＮＭＲデータ（３００ＭＨｚ、 Ｄ、
Ｏ） ：δ−ｓ、ｏ６（ｄ、ＩＨ，＋（−１）、 ４．
４０（ｃ＋、ｔＨ，ｕ−１）、 ２．９ｓ（ｄｄ、ＩＨ
。
ラクトピラノシル）−１−Ｎ−（Ｎ−アセチル−１−メ
チル−４−Ｌ−アスパルチル）−２−デオキシ−β−Ｄ
−グルコピラノシルアミン（Ｉ） 混合物： ６４．５ｍｇ（１００μｍｏｆ２）のＵＤＰ
−Ｇａ １３９ ｍｇ（１００／ｌ＋ｏ１２）の化合
物■ＴＬＣチエツク：移動相ｎ−グロバノール／酢酸／
水（８５： １２： ３ ） Ｒ４値： ＧＩｃＮＡｃ−Ａｓｎ（ＩＩＩ ）
０．２２Ｇａｌ −ＧｌｃＮＡｃ −Ａｓｎ（１）
０．０８収率： ２０ｍｇ（３５％） 選択された’Ｈ−ＮＭＲデータ（３００ＭＨｚ、 Ｄ、
Ｏ） ：δ−ｓ、ｏ６（ｄ、ＩＨ，＋（−１）、 ４．
４０（ｃ＋、ｔＨ，ｕ−１）、 ２．９ｓ（ｄｄ、ＩＨ
。
β−Ａｓｎ）、 ２．８２（ｄｄ、Ｉｔ（、β””ｓｎ
） ； Ｌ ２＝９．４Ｊ、 、２’＝７．６．
Ｊ−、ｊ−５，５５，Ｊ、、１ ＝１７．ｌ、Ｊ、＝
＝７．６３Ｈｚ０ １２） ２−アセトアミド−４−〔２−アセトアミド−
２−デオキシ−４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−
β−Ｄ−グルコピラノシル）−１−Ｎ−（Ｎ−アセチル
−ｌメチル−４−Ｌ−アスパルチル）−２ −デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシルアミン（ＩＩ） 混合物： ３２．０ｍｇ（５０μｍｏＱ）のＵＤＰ−Ｇ
ａ １２９．０ｍｇ（５０μｍｏｆ２）の化合物■ＴＬ
Ｃチエツク：移動相ｎ−ブタノール／酢酸／水２：４：
Ｉ Ｒｒ値： ＧｌｃＮＡｃ −ＧＩｃＮＡｃ −Ａｓｎ（
ＩＶ ） ０．３１Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇ
ｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ（ＩＩ） ０．１９収率： ｌｏ
ｍｇ（２５％） 選択された’Ｈ−ＮＭＲデータ（３３０ＭＨｚ、 Ｄ
２０）δ＝５．０９（ｄ、ＩＩ（、Ｈ−１）、 ４．６
２（ｄ、ＩＨ，Ｈ−１’）、 ４．４７Ｃｄ、ＩＨ。
） ； Ｌ ２＝９．４Ｊ、 、２’＝７．６．
Ｊ−、ｊ−５，５５，Ｊ、、１ ＝１７．ｌ、Ｊ、＝
＝７．６３Ｈｚ０ １２） ２−アセトアミド−４−〔２−アセトアミド−
２−デオキシ−４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−
β−Ｄ−グルコピラノシル）−１−Ｎ−（Ｎ−アセチル
−ｌメチル−４−Ｌ−アスパルチル）−２ −デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシルアミン（ＩＩ） 混合物： ３２．０ｍｇ（５０μｍｏＱ）のＵＤＰ−Ｇ
ａ １２９．０ｍｇ（５０μｍｏｆ２）の化合物■ＴＬ
Ｃチエツク：移動相ｎ−ブタノール／酢酸／水２：４：
Ｉ Ｒｒ値： ＧｌｃＮＡｃ −ＧＩｃＮＡｃ −Ａｓｎ（
ＩＶ ） ０．３１Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇ
ｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ（ＩＩ） ０．１９収率： ｌｏ
ｍｇ（２５％） 選択された’Ｈ−ＮＭＲデータ（３３０ＭＨｚ、 Ｄ
２０）δ＝５．０９（ｄ、ＩＩ（、Ｈ−１）、 ４．６
２（ｄ、ＩＨ，Ｈ−１’）、 ４．４７Ｃｄ、ＩＨ。
Ｈ刊″）、 ２．０６．２．０２．２．０１（各々Ｓ、
各々３Ｈ，各々ＮＡＣ）： Ｊ＋、２＝９−６ Ｈｚ
、Ｊ＋２’＝８．１ Ｈｚ、Ｊ１７２ ＝ ７．７Ｈｚ。
各々３Ｈ，各々ＮＡＣ）： Ｊ＋、２＝９−６ Ｈｚ
、Ｊ＋２’＝８．１ Ｈｚ、Ｊ１７２ ＝ ７．７Ｈｚ。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）式IIIまたはIV ▲数式、化学式、表等があります▼III ▲数式、化学式、表等があります▼IV で示される化合物をガラクトシル供与体の存在下にガラ
クトシルトランスフェラーゼと共にインキュベートする
ことより成る式 I またはII ▲数式、化学式、表等があります▼ I ▲数式、化学式、表等があります▼II で示される化合物の酵素的製造方法。 ２）ＵＤＰ−Ｇａｌがガラクトシル供与体として用いら
れる請求項１記載の方法。 ３）ＵＤＰ−ＧａｌがＵＤＰ−ガラクトース４−エピメ
ラーゼによる触媒作用によりＵＤＰ−Ｇｌｃから合成さ
れる請求項１または２記載の方法。 ４）反応が緩衝溶液中で行われる請求項１〜３のいずれ
かに記載の方法。 ５）反応が３２〜３７℃で行われる請求項１〜４のいず
れかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19893927801 DE3927801A1 (de) | 1989-08-23 | 1989-08-23 | Verfahren zur enzymatischen synthese galactosylierter glycoprotein-bausteine |
| DE3927801.8 | 1989-08-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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