JPH03112483A - バチルス・リケニホルミス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

本発明は大豆蛋白凝固酵素を生産するバチルス・リケニ
ホルミスに関する。

【技術的背景】

牛乳からチーズを作るように、動物性蛋白質を凝固酵素
によって凝固させて食品を作ることは。 従来からよく知られている。一方、近年、健康上及び経
済的な理由から、大豆蛋白を凝固させることにより、安
価かつ豊富にある大豆を利用して大豆加工食品を製造す
ることが希望されていた。

【従来技術】

このような背景に鑑み、本発明者は、自然界に生存する
細菌の中から、大豆蛋白凝固酵素を菌体外に生産するバ
チルス・リケニホルミスを発見するとともに、これを単
離することに成功し、該菌株をｒＢ−６−４ＪＪと命名
して工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８
６２６号（ＦＥＲＭＰ−８６２６）として寄託するとと
もに、蒜菌株を利用して生産される大豆蛋白凝固酵素及
びその製造方法について特許出願している（特開昭６２
−１７９３８６号公報参照）。なお、得られた大豆蛋白
凝固酵素は苦みがなくて食料素材に適している。

【発明が解決しようとする課題】

しかるに、上記バチルス・リケニホルミスＢ−６−４Ｊ
　（微工研菌寄第８６２６号）にあっては、大豆蛋白凝
固酵素を生産するものの、その量はあまり多くなく、大
豆蛋白を凝固させることにより大豆加工食品を工業的に
大量に生産するためには、充分な量の大豆蛋白凝固酵素
を得ることが難しかった。また、このバチルス・リケニ
ホルミスＢ−６−４Ｊは胞子形成頻度が高く、生産され
た大豆蛋白凝固酵素を菌体と分離して抽出する際に胞子
が混入し易く、該胞子から生育した前記Ｂ−６−４５が
前記酵素とともに大豆蛋白に作用して、でき上がった大
豆蛋白食品に意図しない味が付与されるという問題があ
る。 本発明は上記問題に対処するためになされたもので、そ
の目的は、大量の大豆蛋白凝固酵素を生産するとともに
、該酵素のみを菌体から容易に分離して抽出することが
可能な新規なバチルス・リケニホルミスを提供すること
にある。

【課題を解決するための手段】

本発明はバチルス・リケニホルミスに関し、その第１の
発明は胞子形成能が低くかつ大豆蛋白凝固酵素の生産能
が高いバチルス・リケニホルミスにある。 また、本発明の第２の発明は大豆蛋白凝固酵素の生産能
が高いバチルス・リケニホルミス微工研条寄第１７７８
号にある。 しかして、本発明に係るバチルス・リケニホルミスはバ
チルス・リケニホルミスＢ−６−４Ｊを親株とする変異
株であり、本発明において胞子形成能が低いとは、後述
する規定された条件下で測定した胞子形成頻度が親株の
バチルス・リケニホルミスに比較して１１５００倍また
はそれ以下であることを意味し、かつ大豆蛋白凝固酵素
の生産能が高いとは同様に大豆蛋白凝固活性が親株のバ
チルス・リケニホルミスに比較して５倍またはそれ以上
であることを意味する。

【発明の作用・効果】

本発明に係るバチルス・リケニホルミスにおいては、胞
子形成能がきわめて低くかつ大豆蛋白凝固酵素の生産能
が高いことから、大豆蛋白凝固酵素の生成系から該酵素
を菌体と分離して胞子を混入させることなく大量に抽出
することができ、かつ得られた酵素は苦みのない滑らか
な口当りの大豆蛋白凝固物を形成する。従って、本発明
に係るバチルス・リケニホルミスによれば、大豆蛋白加
工食品の製造に適した大豆蛋白凝固酵素を大量に得るこ
とができる。

【実施例】

本発明に係るバチルス・リケニホルミスは上記したバチ
リス・リケニホルミスＢ−６−４Ｊ　（野生株）の中間
変異株を経て取得した変異株であり、これらの菌株につ
いて分離、ｍ製、培養、突然変異の発生、有用性等の実
験を行うとともに、それらの特性を測定した。 ａ、大豆蛋白凝固酵素生産菌のスクリーニング（ａｌ）
分離源 静岡県三島市にある国立遺伝学研究所内及び箱根の山の
ふもとの植物、土壌及び豚、牛等家畜の排せつ物から試
料を広く採取した。 （ａｌ）分離方法（大豆蛋白凝固酵素）採取した各資料
（植物、土壌、排せつ物等をそれぞれ粉砕した耳かき一
杯程度の資料）を、滅菌した豆乳が各３ｍ７ずつ分注さ
れている試験管にそれぞれ入れて、１２〜１６時間、３
７℃にて振とう培養する（１次スクリーニング）、これ
らの中でカードを形成している（凝固した物を含む）試
験管内の豆乳のｐ　ＩＩを測定し、Ｐ　Ｈが５．５以上
の試験管内の資料について、前記と同様のスクリーニン
グを繰り返し行なった。なお、凝固した試料の中からｐ
Ｈ５，５未満のものを除く理由は、酸によりカード形成
された資料を除外するためである。 目的とする微生物の純化のために豆乳によるスクリーニ
ングを５次まで行った。かかる５次までのスクリーニン
グにより、豆乳凝固能を有する微生物を、カード形成し
た豆乳から滅菌した豆乳へ植え継ぎできることが確認さ
れた。その結果、■前記スクリーニングした資料中に、
大豆蛋白凝固能を有する微生物が存在すること、■この
微生物が豆乳の中で繁殖していることが確認できた。 その後、５次スクリーニングにより得た微生物を、下記
表１に示す組成でｐＨ６，０に調製された増殖培地で、
　１２〜１６時間、３７℃にて振どう培養することによ
り、植え継いだ。 １ 硫酸アンモニウム　　　　　　　０．１％リン酸塩　　
　　　　　　　　　　１．０％硫酸マグネシウム　　　
　　　　０．０１％クエン酸ナトリウム　　　　　　０
．０５％カザミノ酸　　　　　　　　　　０．０２％酵
母エキス　　　　　　　　　　０．１％グルコース　　
　　　　　　　　　０．５％ｂ、大豆蛋白凝固酵素生産
菌の純化 ５次スクリーニングを行ったサンプルから平板希釈法に
より、大豆蛋白凝固能が最も高い菌株を単一菌株として
得た。この菌株をｒＢ−６−４ＪＪと命名し、同菌株を
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。寄託番号
は徹工研菌寄８６２６号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８６２６）
である。この菌株は竹の葉および竹の根に集中して分布
していた。 次に、得られた菌株（Ｂ−６−４Ｊ）において、大豆蛋
白凝固能を有する物質が菌体内あるいは菌体外に存在す
るのかを確認した。まず、この菌株を上記表２に示す組
成でｐＨ６，０に調製された生産培地で、　２４時間、
　３７℃にて振とう培養した。 硫酸アンモニウム リン酸二水素カリウム 硫酸マグネシウム クエン酸ナトリウム カザミノ酸 酵母エキス グルコース １１．１％の塩化カルシウム溶液 地 ０．１％ １．０％ ０．０１％ ０．０５％ ０．０２％ ０．１％ ０．５％ ０．０１％ 豆乳（大豆蛋白濃度１０％）　　５％ このようにして培養したものを、０℃、６０００　ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離を行い、上澄液と菌体とに分離し
てそれぞれの活性を調べた。上澄液に関しては、該上澄
液を平均細孔径０．２２μｍのフィルタを通すことによ
って除菌し、同波に含まれるものの豆乳凝固活性を調べ
た。また、菌体に関しては、該菌体を乳ばちにおいて石
英砂と共によく磨砕し、そこにｐＨ７，０のリン酸緩衝
液を加えて、上記と同様に０．２２μｍのフィルタを通
して得た菌体抽出液に含まれるものの豆乳凝固活性を調
べた。 なお、かかる場合に、　リン酸緩衝液を入れるのは、菌
体の粉砕によって変化したｐＨを元に戻して酸による豆
乳凝固の影響をなくすためであり、また。 フィルタを通すのは、不要な成分を除去するためである
。 その結果、上澄液には豆乳を凝固させる活性能が存在し
、菌体抽出液には豆乳を凝固させる活性は全く存在して
いないことが確認できた。 さらに、前記上澄液を８０℃で３０分間加熱して、該加
熱した上澄液に豆乳凝固活性能が存在するかを調べた結
果、前記活性能がなくなることから、加熱によって豆乳
凝固活性能が消失することが確認された。 これらの実験により、豆乳凝固活性能を有する物質は無
機物ではなく、前記微生物が生産する菌体外酵素である
ことを確認できた。 Ｃ０酵素生産性を増加させる培養条件の検討（ｃｌ）こ
の菌株（Ｂ−６−４Ｊ）を各種条件で培養を行うことに
より、大豆蛋白凝固酵素生産能を増加させる培養条件の
検討を行なった。かかる場合、基本的培地として、上記
表２の組成のものを用いた。なお、この培地組成は、資
化しうる（菌株が栄養素として培地に接種できるととも
に、その培地で増殖できる）炭素源、窒素源、栄養源等
を含有するものであり、かつ大豆蛋白凝固酵素を分泌す
るものであれば、いかなる培地でもかまわない。 前記実験の結果、大豆蛋白凝固酵素の生産を増加させる
菌株の培養条件に関し、次のことを知得した。なお、説
明の便宜上、上記表２の組成を有する培地を例に取り説
明する。 ■無機塩（（Ｎｌ１４ｈｓＯａ、　　ＫＩ１２ＰＯ４，
Ｍｇ５Ｏａ・７＋１２０）、クエン酸ナトリウム、グル
コース、酵母エキス及びカザミノ酸は、菌体を増殖させ
るものであって、大豆蛋白凝固酵素の生産性を高める上
ではあまり関係ない。換言すれば、これらの化合物は大
豆蛋白凝固活性能を引き出す上ではあまり関係ない。 ■豆乳（蛋白質濃度＝１０％）を添加するかしないかは
、大豆蛋白凝固酵素生産能を引き出すことに大きく影響
する。第１図は表２に示す生産培地への豆乳添加量と大
豆蛋白凝固活性との関係を示すもので、温度４５℃で２
４時間振とう培養シた場合の結果であり、凝固活性は後
述する定義に基づいて算出した。第１図によれば、豆乳
（大豆蛋白１０％）を培地に２．５〜７．５％程度添加
すると、菌体の大豆蛋白凝固活性能を有効に引き出せる
こと、及び豆乳を培地に５％程度添加すると、菌体の大
豆蛋白凝固活性能を最も有効に引き出せることが解る。 　また、この場合、豆乳がこの菌株に対して大豆蛋白凝
固酵素の生産能を高めるインデューサとして働いている
ものと考えられる。 ■第２図は４５℃、ｐＩ（６，０で振とう培養した場合
の培養時間に対する菌数（ｃｏｌｏｎｙ　ｆｏｒｍｉＢ
ｕｎｉｔ／＋ｊ）及び大豆蛋白凝固活性の関係を示して
いる。この結果によれば、培養時間は２０時間以上必要
であり、５０時間までは前記凝固活性が残っていること
が解る。また、上記培養条件において最適時間で温度を
変化させ、かつ最適時間および最適温度でｐ　Ｈを変化
させて振とう培養を行った結果、培養温度は４５℃前後
が適当であり、かつ培養地のｐ　Ｈは６〜７で安定であ
った。 （Ｃ２）大豆蛋白凝固活性ＳＣＡの定義豆乳（蛋白質濃
度：１０％）に培養液を加え６５℃でカードを形成する
基準時間を１時間とし、下記式にて算出する。 Ｓ　ＣＡ　＝　Ｓｏｙｍｉｌｋ　　Ｃｌｏｔｔｉｎｇ　
　Ａｃｔｉｖｉｔｙ（ｕｎｉｔ）＝　（Ｓ／Ｅ）ｘ　（
３６００／ｌ） Ｓ：基質（豆乳）のｆｆｉ（ｍ）） Ｅ：培養液を遠心し菌体を取り除いた上澄液の量（ｍ）
） を二　カードの生じる時間（秒） ｄ１分泌酵素量を増大させるための菌体の改良（突然変
異株の取得） 前記菌株（Ｂ−６−４Ｊ）の菌体外酵素の分泌量を増大
させるために、以下の方法で突然変異株を取得した。な
お、この菌株を、表３に示す市販の栄養増殖培地により
４５℃、ｐＨ６，０で振とう培養した後、菌体だけを遠
心分離により採取し、採取した菌体を長く生存させるた
め壜こ、同菌体にリン酸緩衝液を入れることにより懸濁
して以下の実験に供した。 ３゜ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ 肉エキス 酵母エキス ペプトン デキストローゼ 塩化ナトリウム リン酸水素二カリウム リン酸二水素カリウム 地　　　　　１ ２（デイフコ社製商品名） ０６１５％ ０．１５％ ０．５％ ０．１％ ０．３５％ ０．３８８％ ０．１３２％ Ｍｅｄｉｕ園 （ｄｌ）紫外線（ＵＶ）処理 上記の処理で得られた懸濁状態にある菌体を１００倍に
希釈して、表３の組成を培地とする栄養増殖平板プレー
トに塗抹し、紫外線を種々条件を変えて照射した。かか
る照射後、前記プレート上で３７℃、１昼夜培養した。 該培養後、胞子形成能が低い変異株を取り出したところ
、９株の変異株が得られた。この得られた変異株の大豆
蛋白凝固活性能を調べたが、この中には大豆蛋白凝固活
性能を持つ菌株は見い出されなかった。 （ｄ２）γ線照射処理 上記１００倍に希釈したものと同じ菌株にγ線を２０に
レントゲン照射後、菌体を表３の組成を培地とする栄養
増殖平板プレートにまき、４５℃で３日間培養した。プ
レート上に増殖した菌株より、胞子形成能が低い株を捜
したが、一つも見い出されなかった。また、大豆蛋白凝
固活性能を有する菌株も見い出されなかった。 （ｄ３）ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理ＮＴＧ５ｍ
ｚをリン酸ＩＩ！ＩＷＪ液４．５ｄに溶解し、この溶液
の中に前記１００倍に希釈した菌体液を０．５ｍｔ添加
して、　３７℃で６０分捏上うさせた。次に、この菌体
をリン酸緩衝液で３回洗浄を行なった後上記した栄養増
殖平板プレートにまき、４５℃で１昼夜培養した。その
結果、胞子形成能が低いと思われる菌株は２２株得られ
た。 この２２株のうち、大豆蛋白凝固活性能を有する菌株が
３株見い出された。この中で、最も凝固活性が高いもの
を中間変異株２６Ｄとし、以後の実験に供した。 この中間変異株２６Ｄの野生株Ｂ−６−４Ｊに対する性
質を以下に記す。 ■胞子形成頻度 野性株Ｂ−６−４Ｊの１／１０００ 〜１／１００００倍 ■大豆蛋白凝固活性の比較 野性株の約２倍 これらの性質は、野性株Ｂ−４−６Ｊを培養するときよ
り、エアレーション（通気量）が低い培養条件時に観察
される。なお、他の培養条件は上記（ｃｌ）で述べた菌
株Ｂ−６，−４Ｊの場合と同様である。また、胞子形成
頻度は下記の方法により菌株を処理し、測定して算出し
た。 ａ：菌株のコロニーを１つ１つプレートに移す。 この同じプレートを２枚作る。 ｂ：底部にクロロホルムを１満々下したシャーレの　　
蓋に上記プレートの１枚を被せるとともに、他のプレー
トをクロロホルムの滴下してないシャーレの蓋に被せ（
コントロール）、これらのプレート上の菌株を４５℃、
１６時間培養する。胞子形成能が弱い菌株、胞子形成の
少ない菌株はクロロホルムの影響で生えない。 Ｃ：生えていない菌株（クロロホルム側）に対応するコ
ントロール側の菌株の凝固活性を調べ凝固活性を持つ菌
株を表３に示す栄養増殖培地で増殖する。 ｄ：菌体を８０℃で１５分間熱処理し、熱処理前後の菌
数を測定して下記式により胞子形成頻度を算出する。 胞子形成頻度＝（熱処理後の菌数）／ （熱処理前の菌数） 増殖した菌体が１００％胞子を形成している場合胞子形
成頻度は１となる。 （ｄ４）中間変異株２６ＤのＮＴＧ処理中間変異株２６
Ｄから、さらに変異株を取得するために次のような処理
を行なった。 ■中間変異株２６Ｄを表３に示す栄養増殖培地３ｍ［中
で、４５℃にて１晩培養する。 ■前記■の培養液０．１ｍＪ２を上記栄養増殖培地３ｍ
ｇ中に添加し、４５℃で対数増殖期（ログフェーズ）ま
で振とう培養する。なお、対数増殖期まで培養する理由
は、該増殖期における菌株が最も突然変異する傾向が強
いためである。 ■前記■の培養液を０．５ｎ＋／ずつ５つの試験管に分
注し、それぞれにｌｌ１ｇ／ａｆのＮＴＧを０．０．　
２．５．　５．０゜１０．０．　２５．０μｌずつ入れ
る。これにより、各試験管内のＮＴＧｍ度は、それぞれ
０．　５．　１０．　２０．５０μｇ／ｍノとなる。 ■前記■の各試験管を４５℃で３０分分間上うする。 ■前記■の処理後、各試験管内の菌体を１＋ｎｅの上記
栄養増殖培地で３回ずつ洗浄する。 ■前記■の処理後、菌体にそれぞれ０．５ｍｌの上記栄
養増殖培地を添加してＪｌ！ＴＩ濁する。 ■前記■の懸濁液の、各３０μノを３Ｉｌｌｌの上記栄
養増殖培地に加えて、４５℃で１晩振とう培養する。 前記■の処理後、各培養液を一８０℃に保存して以後の
実験に供する。 次に、細菌は通常カナマイシン（抗生物′Ｉｉ”）に対
して感受性であるが（今回得た中間突然変異株２６Ｄも
カナマイシンに対して感受性である）、突然変異によっ
て得られた細菌はカナマイシンに対して耐性となる場合
があることに鑑み、前記保存しである菌株を０．２μｇ
ノＩＩＩ／！のカナマイシンを含む栄養増殖平板プレー
トにまき、ミューチージョン頻度の高いＮＴＧ１度群を
選別した。その結果、ＮＴＧ２１度が２０Ｐｇ／ｍノで
ある場合に、　ミューテーシ目ン頻度が最も高く、その
頻度は３．５２ｘ　１０−３であった。ＮＴＧ濃度２０
μｇ／ｍｌの群を、上記表１の培地にプロテアーゼ活性
測定試薬（シグマ製のハイドパウダー　商品名）０．５
％と、寒天とを加えて平板培地としたものにまき、ハロ
ーを形成した菌株を採取する。菌数は１．３ｘｌＯ５と
なり、その中から１株の目的とする菌株（蛋白凝固活性
能が最も高い菌株）が得られた。この菌株を変異株２６
Ｄ＝７と命名し、工業技術院微生物工業技術研究所に国
際寄託した。寄託番号は微工研条寄第１７７８号（ＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ−１７７８）である。 野性株（Ｂ−６−４Ｊ）、　　中間変異株（２６Ｄ）お
よび変異株２６Ｄ−７の胞子形成頻度及び大豆蛋白凝固
活性の比較を下記表４に示す。 （以下余白） 表４゜ び大豆 ｅ、　　Ｂ−６−４Ｊ、　　２６Ｄ−７の菌学的性質上
記表５に示したＢ−２培地を用いて、両菌株Ｂ−６−４
Ｊ、　　２６Ｄ−７を培養し、　　ｒＴｈｅ　Ｇｅｎｕ
ｓＢａｃｉｌｌｕｓＪ及びｒＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎ
ｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ。 ｉｖｅ　Ｂａｃｔ、ｅｒｉｏｌｏｇｙＪ　　に基づいて
、それらの菌学的性質を調べた。 （以下余白） 表５゜ 旦二二又」Ｌ墳」「威 なお、上記組成の培地をプレートにする場合は１．５％
の寒天粉末を加える。 下記表５に、Ｂ−６−４Ｊ、２６Ｄ−７の菌学的性質を
示した。 （以下余白） 表６゜ 苗ご１葡１質 表６に示す菌学的性質から野生株Ｂ−６−４Ｊ及び変異
株２６Ｄ−７は共にバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属で
あると考えられ、さらにバチルス属の中では、寒天に固
く張り付いたコロニーを作ること、成育温度が高いこと
、嫌気下での成育が見られることなどから、前記両画は
バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃ
ｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）種であると同定した。 また、こ九らの野生株Ｂ　＝　６−４　Ｊ、中間変異株
２６Ｄ及び変異株２６Ｄ−７の大豆蛋白凝固酵素生産能
及び胞子形成頻度に関しては表４に示したとおりである
。さらに、前記ＮＴＧ処理の過程にて、野生株Ｂ−６−
４Ｊ及び中間変異株２６Ｄは抗生物質としてのカナマシ
ンに感受性であるが、変異株２６Ｄ−７は前記カナマイ
シンに耐性であることも確認された。 ｆ、大豆蛋白凝固酵素の単離及び精製 ２を容量のジャーファーメンタ−に１．５１の培地（上
記式２の培地）を入れて殺菌を行った後、変異株２６Ｄ
−７を植えて、４５℃で４８時間通気攪伴培養を行った
。培養液は、珪藻±（ＳＳＣ）で濾過して菌体を除去し
た後、５５％の飽和硫酸アンモニウムを用いて硫安分画
を行い、ゲル濾適用充填剤（ファーマシア社製５ｅｐｈ
ａｄｅｘＧ　−１００、商品名）を用いて脱塩した。 １’ｌ　Ｉｉ；Ｘ後の培養液をカルボキシメチルセルロ
ースカラム（ＣＭ−５２カラム）に透し、塩化ナトリウ
ム直線濃度勾配法で経時的にフラクションを採取した。 この場合の培養液の溶出パターン（分光光度針による波
長２８０Ｉの吸光度）を第３図に破線で示すとともに、
大豆蛋白凝固酵素の凝固活性を実線で示した。 これらの各フラクションのうち、第３図に実線で示すビ
ーク■に対応する酵素とビークＨに対応する酵素とに大
豆蛋白凝固活性が見られた。更に、酵素の溶出量が多か
ったビーク■を前記ゲル濾適用充填剤のカラムを用いて
、ビーク■を単一な物質に精製した。第４図にはかかる
精製物の上記した塩化ナトリウム直線濃度勾配法での溶
出パターンを示しであるが、かかる場合も、破線のよう
な溶出パターンのうちで、実線で示す部分の酵素に大豆
蛋白凝固活性能が認めら九た。 これにより、所望とする大豆蛋白凝固酵素が単離及び精
製される。 ｇ、大豆蛋白１１１固酵素の性質 前記ビークＩ、　　ＩＩに対応する酵素（以下、単に酵
素ピークＩ、　　ＩＩという）の理化学的性質は、各種
実験の結果、次のとおりであることを確認した。 ■酵素ビークＩ、　　ＩＩは共に、豆乳に作用させると
大豆蛋白を凝固させる。 ■酵素ピークＩ、■は共に、苦みがなく、毒性もなく食
品加工用に適する。 ■酵素ビーク■は５ＤＳｔ気泳動的に単一なバンドとな
り、分子量は３０，０００前後である。酵素ビーク■は
その生産量が少ないために、前記測定が不能である。 ■第５図のグラフは下記条件（１）により測定された酵
素の大豆蛋白凝固活性と温度との関係、第６図のグラ°
フは下記条件（ＩＩ）により測定した酵素の熱安定性、
第７図のグラフは下記条件（ＩＩＩ）により測定した酵
素の同凝固活性とｐＨとの関係、第８図のグラフは下記
条件（ｒＶ）により測定した酵素のｐＨ安定性をそれぞ
れ示している。これらのグラフの結果から、凝固活性を
示す最適温度は酵素ピーク！では約８０℃、酵素ピーク
■では約６５℃であり、かつこれら両酵素共３０〜４０
℃の下では１時間安定である。また、これら両酵素は共
に酸性側で高い凝固活性を示し、ｐ　Ｈ＞　７では凝固
活性をほとんど消失するが、４°Ｃの下では両酵素共に
ｐＨ４〜９ではほぼ安定であり、少なくとも７０％の活
性が残存する。 条件（■）：酵素ピーク■、■の各２００μノを１８０
０μｌの豆乳にそれぞれ添加するとと もにｐ　Ｈを６．５に調整し、各温度での凝固活性を測
定。 条件（■）：酵素ピークｒ、　　ｒｒを１時間各温度に
保持した後、酵素ピーク■は８０℃ にて酵素ピーク■は６５℃にて、か つ他の条件は条件（１）と同様にし て凝固活性を測定。 条件（■）：豆乳を各ｐ　Ｈに調整するとともにこれら
の凝固活性測定温度を８０°Ｃ１ ６５℃とした点を除き条件（１）と 同様にして凝固活性を測定。 条件（■）：酵素ピーク！、■を各ｐ　Ｈに調整すると
ともに４℃で１６１Ｉ４Ｊ間冷蔵し、凝固活性測定温度
を８０℃、６５℃ とした点を除き条件（１）と同様に して凝固活性を測定。 ■表７は下記条件により測定した酵素の大豆蛋白凝固活
性に対する各化合物の影響を示しており、同表に示すよ
うに、酵素ピーク！、　■は、共に金属イオンによる影
響が認められない。酵素ピーク■は、ＰＭＳＦ（フェニ
ルメチルスルフォニルフルオライド）及びＴＳＦ　（）
ルエンスルフオニルフルオライド）によって１００％阻
害され、酵素ピーク■はＥＤＴＡ　（エチレンジアミン
四＃酸）によって１００％阻害された。これらにより、
酵素ピーク■はセリンプロテアーゼの一種と考えられ、
酵素ピーク■は金属酵素の一種であると考えられる。 表７゜ 大豆蛋白凝固酵素に対する各化合物の影響り、酵素の有
用性 上記ピークＩに対応する酵素を用いて豆乳を凝固させて
、大豆加工食品を￥Ａ造できる。例えば、豆乳、乳糖、
油脂及び乳化剤の混合物に、乳酸菌及び前記酵素を添加
して発酵させ、該発酵物からホエー（乳しよう）を排除
してプレスすることにより離水すると、固形物が得られ
る。かかる場合、乳酸菌を添加するのは、大豆特有の臭
味を消すためである。この固形物に、水、安定剤、チー
ズ用の呈味、チーズ用フレーバ等を加えて殺菌を行うと
、乳製品としてのチーズに近いものが製造される。なお
、この場合、水及び安定剤の添加量を種々変えることに
より、ハードタイプ、クリームタイプ等のチーズが製造
される。また、前記チーズ用の呈味及びチーズ用フレー
バに変えて、他の食品に適した呈味及びフレーバを添加
すれば、チーズとは異なる大豆加工食品も製造できる。 このようにして製造された食品はコレステロールが少な
く、健康食品として優れている。また、原料としての大
豆は豊富にあり、安価に乳製品と類似した大豆加工食品
を提供できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はバチルス・ケニホルミスの野生株が生産する酵
素の大豆蛋白凝固活性と豆乳添加量の関係を示すグラフ
、第２図は培養時間と菌数及び同凝固活性の関係を示す
グラフ、第３図は本発明に係るバチルス・リケニホルミ
スが生産する酵素の溶出パターン図、第４図は第３図の
ピークＩに対応する酵素の再溶出パターン図、第５図は
第３図のピークＩ、　　ＩＩに対応する酵素の大豆蛋白
凝固活性と温度の関係を示すグラフ、第６図は同酵素の
温度に対する安定性を示すグラフ、第７図は同酵素の同
凝固活性とＰＨの関係を示すグラフ、第８図は同酵素の
ｐ　Ｈに対する安定性を示すグラフである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）胞子形成能が低くかつ大豆蛋白凝固酵素の生産能
   が高いバチルス・リケニホルミス。
2. （２）大豆蛋白凝固酵素の生産能が高いバチルス・リケ
   ニホルミス微工研条寄第１７７８号。