JPH03123482A - 浸透圧耐性に優れた育種株の取得方法 - Google Patents
浸透圧耐性に優れた育種株の取得方法Info
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- JPH03123482A JPH03123482A JP26331689A JP26331689A JPH03123482A JP H03123482 A JPH03123482 A JP H03123482A JP 26331689 A JP26331689 A JP 26331689A JP 26331689 A JP26331689 A JP 26331689A JP H03123482 A JPH03123482 A JP H03123482A
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Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
この発明は、発酵工業その他で使用される微生物に関し
、さらに詳しくは、高糖濃度や高塩濃度の発酵原料を用
いる発酵プロセスで使用する微生物に浸透圧耐性を付与
する育種方法に関する。
、さらに詳しくは、高糖濃度や高塩濃度の発酵原料を用
いる発酵プロセスで使用する微生物に浸透圧耐性を付与
する育種方法に関する。
［従来技術およびその問題点］
現在、アルコール発酵やアミノ酸発酵などの産業分野で
は、一般に、発酵原料として廃糖蜜が使用され、かつ発
酵用微生物として酵母やノくクチリアが使用されている
。そして、これらの微生物、特にバクテリアの中には、
アルコール耐性や耐塩性が低く、長期間の安定した連続
発酵運転が困難であるものがあり、実用上問題が生じて
いる。しかし、このような微生物に短期間に効率よくア
ルコール耐性や耐塩性を付与することができる育種方法
は、現在まだ確立されていない。
は、一般に、発酵原料として廃糖蜜が使用され、かつ発
酵用微生物として酵母やノくクチリアが使用されている
。そして、これらの微生物、特にバクテリアの中には、
アルコール耐性や耐塩性が低く、長期間の安定した連続
発酵運転が困難であるものがあり、実用上問題が生じて
いる。しかし、このような微生物に短期間に効率よくア
ルコール耐性や耐塩性を付与することができる育種方法
は、現在まだ確立されていない。
一般に、微生物の育種方法としては、突然変異処理、馴
養、遺伝子操作、細胞融合などの手法が採られているが
、アルコール耐性や耐塩性などの浸透圧耐性には多くの
遺伝子が関与していると考えられており、単一または少
数の遺伝子をターゲットとする突然変異処理や遺伝子操
作では所望の株を取得することは困難である。
養、遺伝子操作、細胞融合などの手法が採られているが
、アルコール耐性や耐塩性などの浸透圧耐性には多くの
遺伝子が関与していると考えられており、単一または少
数の遺伝子をターゲットとする突然変異処理や遺伝子操
作では所望の株を取得することは困難である。
また、馴養は育種に長時間を要するという欠点を有して
いる。さらに、細胞融合は、酵母、カビ、高等植物など
の真核生物においては、多くの研究例が示すように、多
数の遺伝子が関与している形質の改変・改良には有用な
手段であるが、これをバクテリアのような原核生物に適
用して成功した事例は皆無である。
いる。さらに、細胞融合は、酵母、カビ、高等植物など
の真核生物においては、多くの研究例が示すように、多
数の遺伝子が関与している形質の改変・改良には有用な
手段であるが、これをバクテリアのような原核生物に適
用して成功した事例は皆無である。
本発明者らは、アルコール発酵性細菌であるザイモモナ
ス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）菌にアルコール耐性や耐塩性
を付与するために細胞融合を適用する過程で、ザイモモ
ナス菌に電気刺激を与えることにより、同量のアルコー
ル耐性や耐塩性などの浸透圧耐性が増大するという現象
を見い出し、鋭意研究の結果、この発明を完成するに至
った。
ス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）菌にアルコール耐性や耐塩性
を付与するために細胞融合を適用する過程で、ザイモモ
ナス菌に電気刺激を与えることにより、同量のアルコー
ル耐性や耐塩性などの浸透圧耐性が増大するという現象
を見い出し、鋭意研究の結果、この発明を完成するに至
った。
［問題点を解決手段〕
この発明は、上記の如き観点から、廃糖蜜などの高塩濃
度の原料を高濃度で仕込んで長期間安定した連続発酵運
転を行なうことができるような浸透圧耐性に優れた育種
株を取得する方法を提供することを目的とするものであ
って、微生物に電気刺激を与えることにより、同微生物
にアルコール耐性や耐塩性などの浸透圧耐性を付与する
ことを特徴とする。
度の原料を高濃度で仕込んで長期間安定した連続発酵運
転を行なうことができるような浸透圧耐性に優れた育種
株を取得する方法を提供することを目的とするものであ
って、微生物に電気刺激を与えることにより、同微生物
にアルコール耐性や耐塩性などの浸透圧耐性を付与する
ことを特徴とする。
ここで、この発明による方法が適用できる微生物の例と
しては、細菌、糸状菌、酵母などが挙げられる。微生物
に与えられる電気刺激の代表的な例は、高圧直流パルス
である。高圧直流パルスを用いる場合、その処理条件は
、例えば、パルス電圧： １−１０ ｋＶ／ｃｍ、処理
時間：１０〜５０μ秒、処理回数：１〜数回、である。
しては、細菌、糸状菌、酵母などが挙げられる。微生物
に与えられる電気刺激の代表的な例は、高圧直流パルス
である。高圧直流パルスを用いる場合、その処理条件は
、例えば、パルス電圧： １−１０ ｋＶ／ｃｍ、処理
時間：１０〜５０μ秒、処理回数：１〜数回、である。
ただし、これらの値は例示であって、この発明を限定す
るものではない。
るものではない。
この発明による育種方法は、これをさらに具体的に説明
すると、まず微生物をスフェロプラストすなわちプロト
プラスト化し、好ましくは２種類（そのうち１種類はア
ルコール耐性や耐塩性を有する）のスフェロプラストを
混合し、得られた混合物に好ましくは遠沈後に高圧直流
パルスを印加し、その後スフェロプラストをかん菌（細
胞）に再生させることを特徴とする。
すると、まず微生物をスフェロプラストすなわちプロト
プラスト化し、好ましくは２種類（そのうち１種類はア
ルコール耐性や耐塩性を有する）のスフェロプラストを
混合し、得られた混合物に好ましくは遠沈後に高圧直流
パルスを印加し、その後スフェロプラストをかん菌（細
胞）に再生させることを特徴とする。
こうして微生物に上記のような電気刺激処理を施すこと
によって、無処理株に比べ高頻度で、アルコール耐性や
耐塩性などの浸透圧耐性が格段に向上した育種株が得ら
れる。
によって、無処理株に比べ高頻度で、アルコール耐性や
耐塩性などの浸透圧耐性が格段に向上した育種株が得ら
れる。
［発明の効果］
この発明によれば、微生物に電気刺激を与えることによ
り、アルコール耐性や耐塩性などの浸透圧耐性が格段に
向上した育種株を、無処理株に比べ高頻度で得ることが
できる。したがって、こうして得たアルコール耐性や耐
塩性などの浸透圧耐性に優れた育種株を発酵用微生物と
して用いることにより、廃糖蜜などの高塩濃度の原料を
高濃度で仕込んで長期間安定した連続発酵運転を行なう
ことが可能となる。
り、アルコール耐性や耐塩性などの浸透圧耐性が格段に
向上した育種株を、無処理株に比べ高頻度で得ることが
できる。したがって、こうして得たアルコール耐性や耐
塩性などの浸透圧耐性に優れた育種株を発酵用微生物と
して用いることにより、廃糖蜜などの高塩濃度の原料を
高濃度で仕込んで長期間安定した連続発酵運転を行なう
ことが可能となる。
［実施例］
次に、この発明を図示の実施例に基づいて具体的に説明
する。
する。
ａ）育種株の取得
アルコール発酵性細菌［ザイモモナス・モビリス Ｈ５
ＺＭ １０１０ （微工研菌寄第１０８２１号）］お
よび［ザイモモナス・ＨＳＺＭ１０８７（微工研菌寄第
１０８２２号）］をそれぞれＲＭ培地（注１）を用いて
３０℃で２４時間培養し、培養液をＴ培地（注２）に接
種後、３０℃で１５時間培養した。培養液を再度Ｔ培地
（注２）に接種し、３０℃で７時間培養した。
ＺＭ １０１０ （微工研菌寄第１０８２１号）］お
よび［ザイモモナス・ＨＳＺＭ１０８７（微工研菌寄第
１０８２２号）］をそれぞれＲＭ培地（注１）を用いて
３０℃で２４時間培養し、培養液をＴ培地（注２）に接
種後、３０℃で１５時間培養した。培養液を再度Ｔ培地
（注２）に接種し、３０℃で７時間培養した。
集菌後、これを菌数が１０８個／ ｍ ／になるように
Ｓ培地（注３）に懸濁させ、ペニシリンＧカリウム水溶
液（４００Ｕ／ｍ１）を添加し、３０℃で１５時間培養
後、集菌した。これをＥｆ温溶液注４）に懸濁させて、
２種類のスフェロプラストを調製した。
Ｓ培地（注３）に懸濁させ、ペニシリンＧカリウム水溶
液（４００Ｕ／ｍ１）を添加し、３０℃で１５時間培養
後、集菌した。これをＥｆ温溶液注４）に懸濁させて、
２種類のスフェロプラストを調製した。
こうして調製したＨＳ ＺＭＩ ０１０のスフェロプラ
スト懸濁液とＨ８２Ｍ１０８７のスフェロプラスト懸濁
液とを同量（１０８個／ｍ／）混合した後、遠沈し、高
圧直流パルス処理（パルス電圧：３−７ｋＶ／ｃｍ、処
理時間二３０μ秒６処理回数：２回）を行なった。
スト懸濁液とＨ８２Ｍ１０８７のスフェロプラスト懸濁
液とを同量（１０８個／ｍ／）混合した後、遠沈し、高
圧直流パルス処理（パルス電圧：３−７ｋＶ／ｃｍ、処
理時間二３０μ秒６処理回数：２回）を行なった。
上記の各電気パルス処理液をそれぞれＳ培地（注３）に
接種し、３０℃で４日間培養してスフェロプラストをか
ん菌（生菌）に再生させた。
接種し、３０℃で４日間培養してスフェロプラストをか
ん菌（生菌）に再生させた。
こうして、電気パルス処理株［ザイモモナスｅＨ３ＺＭ
１１１９（微工研菌寄第１０８２３号）コを得た。
１１１９（微工研菌寄第１０８２３号）コを得た。
ｂ）浸透圧耐性試験
ｌ エタノール耐性
上記操作によって再生させた電気パルス処理法を、所定
濃度のエタノールを添加したシュークロース寒天培地（
注５）に塗抹し、３０℃で６日間培養した。寒天培地上
に生じたコロニを単離し、ＲＭ培地（注１）にそれぞれ
接種して３０℃で２４時間培養した。各培養液を５■／
Ｖ％のエタノールを含むＲＭ培地（注１）に接種し、３
０℃で２８時間培養した。この培養液の吸光度（ＯＤ６
６０）を測定することにより、この育種株の生育度を調
べ、同株のアルコール耐性を評価した。
濃度のエタノールを添加したシュークロース寒天培地（
注５）に塗抹し、３０℃で６日間培養した。寒天培地上
に生じたコロニを単離し、ＲＭ培地（注１）にそれぞれ
接種して３０℃で２４時間培養した。各培養液を５■／
Ｖ％のエタノールを含むＲＭ培地（注１）に接種し、３
０℃で２８時間培養した。この培養液の吸光度（ＯＤ６
６０）を測定することにより、この育種株の生育度を調
べ、同株のアルコール耐性を評価した。
また電気パルス処理を行なわない点を除いて上記と同じ
操作で得た菌株についても、同じく培養液の吸光度の測
定によりアルコール耐性を評価した。
操作で得た菌株についても、同じく培養液の吸光度の測
定によりアルコール耐性を評価した。
これら菌株の評価試験結果の一例を第１表および第１図
に示す。この結果から明らかなように、電気パルス処理
法は培養時間８時間位から著しい吸光度の上昇、すなわ
ち生育度の向上を示した。これに対し、無処理株の吸光
度は経時的にわずかしか上昇しなかった。このことから
、上記の電気パルス処理法は、培養液がエタノールを含
んでいても、支障なく生育でき、優れたアルコール耐性
を有するものであることがわかる。
に示す。この結果から明らかなように、電気パルス処理
法は培養時間８時間位から著しい吸光度の上昇、すなわ
ち生育度の向上を示した。これに対し、無処理株の吸光
度は経時的にわずかしか上昇しなかった。このことから
、上記の電気パルス処理法は、培養液がエタノールを含
んでいても、支障なく生育でき、優れたアルコール耐性
を有するものであることがわかる。
１１ 耐塩性
また、単離した電気パルス処理法をそれぞれＲＭ培地（
注１）に接種し、３０℃で２４時間培養した。各培養液
を０．８％の塩化ナトリウムを含むＲＭ培地（注１）に
接種し、３０℃で３２時間培養した。この培養液の吸光
度（ＯＤ６６ｏ）を７ｆｇｌ定することにより、この育
種株の生育度を調べ、同株の耐塩性を評価した。
注１）に接種し、３０℃で２４時間培養した。各培養液
を０．８％の塩化ナトリウムを含むＲＭ培地（注１）に
接種し、３０℃で３２時間培養した。この培養液の吸光
度（ＯＤ６６ｏ）を７ｆｇｌ定することにより、この育
種株の生育度を調べ、同株の耐塩性を評価した。
また電気パルス処理を行なわない点を除いて上記と同じ
操作で得た菌株についても、同じく培養液の吸光度の測
定により耐塩性を評価した。
操作で得た菌株についても、同じく培養液の吸光度の測
定により耐塩性を評価した。
これら菌株の評価試験結果の一例を第２表および第２図
に示す。この結果から明らかなように、電気パルス処理
法は培養時間１２時間位から著しい吸光度の上昇、すな
わち生育度の向上を示した。これに対し、無処理株の吸
光度は経時的にそれほど上昇しなかった。このことから
、上記の電気パルス処理法は、培養液が塩化ナトリウム
を含んでいても、支障なく生育でき、優れた耐塩性を有
するものであることがわかる。
に示す。この結果から明らかなように、電気パルス処理
法は培養時間１２時間位から著しい吸光度の上昇、すな
わち生育度の向上を示した。これに対し、無処理株の吸
光度は経時的にそれほど上昇しなかった。このことから
、上記の電気パルス処理法は、培養液が塩化ナトリウム
を含んでいても、支障なく生育でき、優れた耐塩性を有
するものであることがわかる。
第１表
酵母エキス
リン酸１カリウム
（注２）Ｔ培地
グルコース
酵母エキス
リン酸１カリウム
硫酸アンモニウム
硫酸マグネシウム・
１０ｇ／／
２ ｇ／／
７水塩
ｔｏｏ ｇ ／ ／
１０ｇ／１
１０ｇ／ １
１ｇ／ １
０．５ ｇ／ ／
第２表
（注３）Ｓ培地
グルコース
酵母エキス
リン酸１カリウム
硫酸マグネシウム・
シュークロース
７水塩
２０ｇ／／
ｌｏｇ／／
２ ｇ ／／
２ ｇ ／／
２００ ｇ／ ／
（注１）ＲＭ培地
グルコース
２０ｇ／ｌ
（注４）Ｅｆ培地
塩化ナトリウム
塩酸マグネシウム
４ ｇ ／１
１ ｇ／／
塩化カルシウム ０．８ｇ／／ソルビトール
１６０ｇ／１１０ＩＵＭ ）リス・塩
酸緩衝液（ｐ）１７．２）経時的な生育度を吸光度（Ｏ
Ｄ６６０）で示したグラフである。
１６０ｇ／１１０ＩＵＭ ）リス・塩
酸緩衝液（ｐ）１７．２）経時的な生育度を吸光度（Ｏ
Ｄ６６０）で示したグラフである。
以上
（注５）シュークロース寒天培地
Claims (1)
- 微生物に電気刺激を与えることにより、浸透圧耐性を
付与することを特徴とする、浸透圧耐性に優れた育種株
の取得方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1263316A JPH0817696B2 (ja) | 1989-10-09 | 1989-10-09 | 浸透圧耐性に優れた育種株の取得方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1263316A JPH0817696B2 (ja) | 1989-10-09 | 1989-10-09 | 浸透圧耐性に優れた育種株の取得方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03123482A true JPH03123482A (ja) | 1991-05-27 |
| JPH0817696B2 JPH0817696B2 (ja) | 1996-02-28 |
Family
ID=17387789
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1263316A Expired - Fee Related JPH0817696B2 (ja) | 1989-10-09 | 1989-10-09 | 浸透圧耐性に優れた育種株の取得方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0817696B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6892842B2 (en) * | 2000-08-31 | 2005-05-17 | Bombardier Recreational Products Inc. | Air intake for a straddle-type all terrain vehicle |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5739772A (en) * | 1980-05-30 | 1982-03-05 | Ppg Industries Inc | Electric stimulation of microorganism reaction |
| JPS60105495A (ja) * | 1983-11-11 | 1985-06-10 | Shinryo Air Conditioning Co Ltd | 微生物の生反応促進方法 |
-
1989
- 1989-10-09 JP JP1263316A patent/JPH0817696B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5739772A (en) * | 1980-05-30 | 1982-03-05 | Ppg Industries Inc | Electric stimulation of microorganism reaction |
| JPS60105495A (ja) * | 1983-11-11 | 1985-06-10 | Shinryo Air Conditioning Co Ltd | 微生物の生反応促進方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6892842B2 (en) * | 2000-08-31 | 2005-05-17 | Bombardier Recreational Products Inc. | Air intake for a straddle-type all terrain vehicle |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0817696B2 (ja) | 1996-02-28 |
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