JPH0817696B2 - 浸透圧耐性に優れた育種株の取得方法 - Google Patents
浸透圧耐性に優れた育種株の取得方法Info
- Publication number
- JPH0817696B2 JPH0817696B2 JP1263316A JP26331689A JPH0817696B2 JP H0817696 B2 JPH0817696 B2 JP H0817696B2 JP 1263316 A JP1263316 A JP 1263316A JP 26331689 A JP26331689 A JP 26331689A JP H0817696 B2 JPH0817696 B2 JP H0817696B2
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、発酵工業その他で使用される微生物に関
し、さらに詳しくは、高糖濃度や高塩濃度の発酵原料を
用いる発酵プロセスで使用する微生物に浸透圧耐性を付
与する育種方法に関する。
し、さらに詳しくは、高糖濃度や高塩濃度の発酵原料を
用いる発酵プロセスで使用する微生物に浸透圧耐性を付
与する育種方法に関する。
［従来技術およびその問題点］ 現在、アルコール発酵やアミノ酸発酵などの産業分野
では、一般に、発酵原料として廃糖蜜が使用され、かつ
発酵用微生物として酵母やバクテリアが使用されてい
る。そして、これらの微生物、特にバクテリアの中に
は、アルコール耐性や耐塩性が低く、長期間の安定した
連続発酵運転が困難であるものがあり、実用上問題が生
じている。しかし、このような微生物に短期間に効率よ
くアルコール耐性や耐塩性を付与することができる育種
方法は、現在まだ確立されていない。
では、一般に、発酵原料として廃糖蜜が使用され、かつ
発酵用微生物として酵母やバクテリアが使用されてい
る。そして、これらの微生物、特にバクテリアの中に
は、アルコール耐性や耐塩性が低く、長期間の安定した
連続発酵運転が困難であるものがあり、実用上問題が生
じている。しかし、このような微生物に短期間に効率よ
くアルコール耐性や耐塩性を付与することができる育種
方法は、現在まだ確立されていない。
一般に、微生物の育種方法としては、突然変異処理、
馴養、遺伝子操作、細胞融合などの手法が採られている
が、アルコール耐性や耐塩性などの浸透圧耐性には多く
の遺伝子が関与していると考えられており、単一または
少数の遺伝子をターゲットとする突然変異処理や遺伝子
操作では所望の株を取得することは困難である。また、
馴養は育種に長時間を要するという欠点を有している。
さらに、細胞融合は、酵母、カビ、高等植物などの真核
生物においては、多くの研究例が示すように、多数の遺
伝子が関与している形質の改変・改良には有用な手段で
あるが、これをバクテリアのような原核生物に適用して
成功した事例は皆無である。
馴養、遺伝子操作、細胞融合などの手法が採られている
が、アルコール耐性や耐塩性などの浸透圧耐性には多く
の遺伝子が関与していると考えられており、単一または
少数の遺伝子をターゲットとする突然変異処理や遺伝子
操作では所望の株を取得することは困難である。また、
馴養は育種に長時間を要するという欠点を有している。
さらに、細胞融合は、酵母、カビ、高等植物などの真核
生物においては、多くの研究例が示すように、多数の遺
伝子が関与している形質の改変・改良には有用な手段で
あるが、これをバクテリアのような原核生物に適用して
成功した事例は皆無である。
本発明者らは、アルコール発酵性細菌であるザイモモ
ナス（Zymomonas）菌にアルコール耐性や耐塩性を付与
するために細胞融合を適用する過程で、ザイモモナス菌
に電気刺激を与えることにより、同菌のアルコール耐性
や耐塩性などの浸透圧耐性が増大するという現象を見い
出し、鋭意研究の結果、この発明を完成するに至った。
ナス（Zymomonas）菌にアルコール耐性や耐塩性を付与
するために細胞融合を適用する過程で、ザイモモナス菌
に電気刺激を与えることにより、同菌のアルコール耐性
や耐塩性などの浸透圧耐性が増大するという現象を見い
出し、鋭意研究の結果、この発明を完成するに至った。
［問題点の解決手段］ この発明は、上記の如き観点から、廃糖蜜などの高塩
濃度の原料を高濃度で仕込んで長期間安定した連続発酵
運転を行なうことができるような浸透圧耐性に優れた育
種株を取得する方法を提供することを目的とするもので
ある。
濃度の原料を高濃度で仕込んで長期間安定した連続発酵
運転を行なうことができるような浸透圧耐性に優れた育
種株を取得する方法を提供することを目的とするもので
ある。
すなわち、この発明は、アルコール発酵性細菌である
ザイモモナス属の細菌に電気刺激を与えることにより、
同細菌にアルコール耐性および耐塩性を付与することを
特徴とする、浸透圧耐性に優れた育種株の取得方法であ
る。
ザイモモナス属の細菌に電気刺激を与えることにより、
同細菌にアルコール耐性および耐塩性を付与することを
特徴とする、浸透圧耐性に優れた育種株の取得方法であ
る。
上記細菌に与えられる電気刺激の代表的な例は、高圧
直流パルスである。高圧直流パルスを用いる場合、その
処理条件は、例えば、パルス電圧:1−10kV/cm、処理時
間:10〜50μ秒．処理回数:1〜数回、である。ただし、
これらの値は例示であって、この発明を限定するもので
はない。
直流パルスである。高圧直流パルスを用いる場合、その
処理条件は、例えば、パルス電圧:1−10kV/cm、処理時
間:10〜50μ秒．処理回数:1〜数回、である。ただし、
これらの値は例示であって、この発明を限定するもので
はない。
この発明による育種方法は、これをさらに具体的に説
明すると、まずザイモモナス属の細菌をスフェロプラス
トすなわちプロトプラスト化し、好ましくは２種類（そ
のうち１種類はアルコール耐性や耐塩性を有する）のス
フェロプラストを混合し、得られた混合物に好ましくは
遠沈後に高圧直流パルスを印加し、その後スフェロプラ
ストをかん菌（細胞）に再生させることを特徴とする。
明すると、まずザイモモナス属の細菌をスフェロプラス
トすなわちプロトプラスト化し、好ましくは２種類（そ
のうち１種類はアルコール耐性や耐塩性を有する）のス
フェロプラストを混合し、得られた混合物に好ましくは
遠沈後に高圧直流パルスを印加し、その後スフェロプラ
ストをかん菌（細胞）に再生させることを特徴とする。
こうしてザイモモナス属の細菌に上記のような電気刺
激処理を施すことによって、無処理株に比べ高頻度で、
アルコール耐性や耐塩性などの浸透圧耐性が格段に向上
した育種株が得られる。
激処理を施すことによって、無処理株に比べ高頻度で、
アルコール耐性や耐塩性などの浸透圧耐性が格段に向上
した育種株が得られる。
［発明の効果］ この発明によれば、ザイモモナス属の細菌に電気刺激
を与えることにより、アルコール耐性や耐塩性などの浸
透圧耐性が格段に向上した育種株を、無処理株に比べ高
頻度で得ることができる。したがって、こうして得たア
ルコール耐性や耐塩性などの浸透圧耐性に優れた育種株
を発酵用微生物として用いることにより、廃糖蜜などの
高塩濃度の原料を高濃度で仕込んで長期間安定した連続
発酵運転を行なうことが可能となる。
を与えることにより、アルコール耐性や耐塩性などの浸
透圧耐性が格段に向上した育種株を、無処理株に比べ高
頻度で得ることができる。したがって、こうして得たア
ルコール耐性や耐塩性などの浸透圧耐性に優れた育種株
を発酵用微生物として用いることにより、廃糖蜜などの
高塩濃度の原料を高濃度で仕込んで長期間安定した連続
発酵運転を行なうことが可能となる。
［実施例］ 次に、この発明を図示の実施例に基づいて具体的に説
明する。
明する。
ａ） 育種株の取得 アルコール発酵性細菌［ザイモモナス・モビリス HS
ZM 1010（微工研菌寄第10821号）］および［ザイモモナ
ス・HSZM1087（微工研菌寄第10822号）］をそれぞれRM
培地（注１）を用いて30℃で24時間培養し、培養液をＴ
培地（注２）に接種後、30℃で15時間培養した。培養液
を再度Ｔ培地（注２）に接種し、30で７時間培養した。
集菌後、これを菌数が108個/mlになるようにＳ培地（注
３）に懸濁させ、ペニシリンＧカリウム水溶液（400U/m
l）を添加し、30℃で15時間培養後、集菌した。これをE
f溶液（注４）に懸濁させて、２種類のスフェロプラス
トを調製した。
ZM 1010（微工研菌寄第10821号）］および［ザイモモナ
ス・HSZM1087（微工研菌寄第10822号）］をそれぞれRM
培地（注１）を用いて30℃で24時間培養し、培養液をＴ
培地（注２）に接種後、30℃で15時間培養した。培養液
を再度Ｔ培地（注２）に接種し、30で７時間培養した。
集菌後、これを菌数が108個/mlになるようにＳ培地（注
３）に懸濁させ、ペニシリンＧカリウム水溶液（400U/m
l）を添加し、30℃で15時間培養後、集菌した。これをE
f溶液（注４）に懸濁させて、２種類のスフェロプラス
トを調製した。
こうして調製したHSZM1010のスフェロプラスト懸濁液
とHSZM1087のスフェロプラスト懸濁液とを同量（108個/
ml）混合した後、遠沈し、高圧直流パルス処理（パルス
電圧:3−7kV/cm、処理時間:30μ秒．処理回数:2回）を
行なった。
とHSZM1087のスフェロプラスト懸濁液とを同量（108個/
ml）混合した後、遠沈し、高圧直流パルス処理（パルス
電圧:3−7kV/cm、処理時間:30μ秒．処理回数:2回）を
行なった。
上記の各電気パルス処理液をそれぞれＳ培地（注３）
に接種し、30℃で４日間培養してスフェロプラストをか
ん菌（生菌）に再生させた。こうして、電気パルス処理
株［ザイモモナス・HSZM 1119（微工研菌寄第10823
号）］を得た。
に接種し、30℃で４日間培養してスフェロプラストをか
ん菌（生菌）に再生させた。こうして、電気パルス処理
株［ザイモモナス・HSZM 1119（微工研菌寄第10823
号）］を得た。
ｂ） 浸透圧耐性試験 ｉ エタノール耐性 上記操作によって再生させた電気パルス処理株を、所
定濃度のエタノールを添加したシュークロース寒天培地
（注５）に塗抹し、30℃で６日間培養した。寒天培地上
に生じたコロニーを単離し、RM培地（注１）にそれぞれ
接種して30℃で24時間培養した。各培養液を5V/V％のエ
タノールを含むRM培地（注１）に接種し、30℃で28時間
培養した。この培養液の吸光度（OD660）を測定するこ
とにより、この育種株の生育度を調べ、同株のアルコー
ル耐性を評価した。
定濃度のエタノールを添加したシュークロース寒天培地
（注５）に塗抹し、30℃で６日間培養した。寒天培地上
に生じたコロニーを単離し、RM培地（注１）にそれぞれ
接種して30℃で24時間培養した。各培養液を5V/V％のエ
タノールを含むRM培地（注１）に接種し、30℃で28時間
培養した。この培養液の吸光度（OD660）を測定するこ
とにより、この育種株の生育度を調べ、同株のアルコー
ル耐性を評価した。
また電気パルス処理を行なわない点を除いて上記と同
じ操作で得た菌株についても、同じく培養液の吸光度の
測定によりアルコール耐性を評価した。
じ操作で得た菌株についても、同じく培養液の吸光度の
測定によりアルコール耐性を評価した。
これら菌株の評価試験結果の一例を第１表および第１
図に示す。この結果から明らかなように、電気パルス処
理株は培養時間８時間位から著しい吸光度の上昇、すな
わち生育度の向上を示した。これに対し、無処理株の吸
光度は経時液にわずかしか上昇しなかった。このことか
ら、上記の電気パルス処理株は、培養液がエタノールを
含んでいても、支障なく生育でき、優れたアルコール耐
性を有するものであることがわかる。
図に示す。この結果から明らかなように、電気パルス処
理株は培養時間８時間位から著しい吸光度の上昇、すな
わち生育度の向上を示した。これに対し、無処理株の吸
光度は経時液にわずかしか上昇しなかった。このことか
ら、上記の電気パルス処理株は、培養液がエタノールを
含んでいても、支障なく生育でき、優れたアルコール耐
性を有するものであることがわかる。
ii 耐塩性 また、単離した電気パルス処理株をそれぞれRM培地
（注１）に接種し、30℃で24時間培養した。各培養液を
0.8％の塩化ナトリウムを含むRM培地（注１）に接種
し、30℃で32時間培養した。この培養液の吸光度（OD
660）を測定することにより、この育種株の生育度を調
べ、同株の耐塩性を評価した。
（注１）に接種し、30℃で24時間培養した。各培養液を
0.8％の塩化ナトリウムを含むRM培地（注１）に接種
し、30℃で32時間培養した。この培養液の吸光度（OD
660）を測定することにより、この育種株の生育度を調
べ、同株の耐塩性を評価した。
また電気パルス処理を行なわない点を除いて上記と同
じ操作で得た菌株についても、同じく培養液の吸光度の
測定により耐塩性を評価した。
じ操作で得た菌株についても、同じく培養液の吸光度の
測定により耐塩性を評価した。
これら菌株の評価試験結果の一例を第２表および第２
図に示す。この結果から明らかなように、電気パルス処
理株は培養時間12時間位から著しい吸光度の上昇、すな
わち生育度の向上を示した。これに対し、無処理株の吸
光度は経時的にそれほど上昇しなかった。このことか
ら、上記の電気パルス処理株は、培養液が塩化ナトリウ
ムを含んでいても、支障なく生育でき、優れた耐塩性を
有するものであることがわかる。
図に示す。この結果から明らかなように、電気パルス処
理株は培養時間12時間位から著しい吸光度の上昇、すな
わち生育度の向上を示した。これに対し、無処理株の吸
光度は経時的にそれほど上昇しなかった。このことか
ら、上記の電気パルス処理株は、培養液が塩化ナトリウ
ムを含んでいても、支障なく生育でき、優れた耐塩性を
有するものであることがわかる。
（注１） RM培地 グルコース 20g/l 酵母エキス 10g/l リン酸１カリウム 2g/l （注２） Ｔ培地 グルコース 100g/l 酵母エキス 10g/l リン酸１カリウム 10g/l 硫酸アンモニウム 1g/l 硫酸マグネシウム・７水塩 0.5g/l （注３） Ｓ培地 グルコース 20g/l 酵母エキス 10g/l リン酸１カリウム 2g/l 硫酸マグネシウム・７水塩 2g/l シュークロース 200g/l （注４） Ef培地 塩化ナトリウム 4g/l 塩化マグネシウム 1g/l 塩化カルシウム 0.8g/l ソルビトール 160g/l 10mM トリス・塩酸緩衝液（pH7.2） （注５） シュークロース寒天培地 シュークロース 20g/l 酵母エキス 10g/l リン酸１カリウム 2g/l 寒天 15g/l
第１図は、本発明の実施例で示した方法により育種した
電気パルス処理株と電気パルス無処理株のアルコール耐
性を比較するために、5V/V％エタノールの存在下での両
菌株の経時的な生育度を吸光度（OD660）で示したグラ
フである。また、第２図は、本発明の実施例で示した方
法により育種した電気パルス処理株と電気パルス無処理
株の耐塩性を比較するために、0.8％塩化ナトリウムの
存在下での両菌株の経時的な生育度を吸光度（OD660）
で示したグラフである。
電気パルス処理株と電気パルス無処理株のアルコール耐
性を比較するために、5V/V％エタノールの存在下での両
菌株の経時的な生育度を吸光度（OD660）で示したグラ
フである。また、第２図は、本発明の実施例で示した方
法により育種した電気パルス処理株と電気パルス無処理
株の耐塩性を比較するために、0.8％塩化ナトリウムの
存在下での両菌株の経時的な生育度を吸光度（OD660）
で示したグラフである。
Claims (1)
- 【請求項１】アルコール発酵性細菌であるザイモモナス
属の細菌に電気刺激を与えることにより、同細菌にアル
コール耐性および耐塩性を付与することを特徴とする、
浸透圧耐性に優れた育種株の取得方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1263316A JPH0817696B2 (ja) | 1989-10-09 | 1989-10-09 | 浸透圧耐性に優れた育種株の取得方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1263316A JPH0817696B2 (ja) | 1989-10-09 | 1989-10-09 | 浸透圧耐性に優れた育種株の取得方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03123482A JPH03123482A (ja) | 1991-05-27 |
| JPH0817696B2 true JPH0817696B2 (ja) | 1996-02-28 |
Family
ID=17387789
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1263316A Expired - Fee Related JPH0817696B2 (ja) | 1989-10-09 | 1989-10-09 | 浸透圧耐性に優れた育種株の取得方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0817696B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6892842B2 (en) * | 2000-08-31 | 2005-05-17 | Bombardier Recreational Products Inc. | Air intake for a straddle-type all terrain vehicle |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR830006419A (ko) * | 1980-05-30 | 1983-09-24 | 로오스 엠 페코라 | 고주파 전기 신호에 의한 발효법 |
| JPS60105495A (ja) * | 1983-11-11 | 1985-06-10 | Shinryo Air Conditioning Co Ltd | 微生物の生反応促進方法 |
-
1989
- 1989-10-09 JP JP1263316A patent/JPH0817696B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03123482A (ja) | 1991-05-27 |
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