JPH03127987A - クリングル１領域に変異を有する新規血栓溶解剤とその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規プラスミノーゲン活性化因子誘導体、該
誘導体を産する細胞、該誘導体をコードするり、　Ｎ　
Ａ配列及び該誘導体の製造法にかかわる。

本発明による新規プラスミノーゲン活性化因子誘導体は
、プラスミノーゲンをフィブリン溶解活性を有するプラ
スミンに変換する作用を有し、種々の血栓症の治療薬と
して用いることができる。

〔従来の技術］ ヒト組織プラス５ノーゲン活性化因子（以下、ＴＰＡと
略記する）は、ヒト・メラノーマ細胞（Ｂｏｗｅｓ　Ｍ
ｅｌａｎｏｍａ）の分泌するＴＰＡについてよく研究さ
れ、５２７のアミノ酸残基からなる糖蛋白質である　［
Ｐｅｎｎ１ｃａ、　Ｄ、　　ら（１９８３年）ネイチャ
ー　（Ｎａｔｕｒｅ）　　３０１巻、２１４頁ｌ。

ＴＰＡは、フィブリン溶解能を有しないプラスミノーゲ
ンを該活性を有するプラスミンに変換する酵素で血栓溶
解作用を有している。ＴＰＡは現在、血栓症の治療に用
いられている　［Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ。

Ｅ、Ｂ、　（１９８７年）ファーマシニーティカル。リ
サーチ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ）、　　４巻、３７５頁］。しかし、ＴＰＡの最大
の欠点はその血中からの急速なりリアランスにある。血
流中に投与されたＴ、ＰＡは、主に肝臓で代謝されると
推定され［Ｆｕｃｈｓ、　Ｈ，Ｅ、　ら（１９８５年）
ブラッド（Ｂｆｏｏｄ）　。

６５巻、５３９頁１、その血中半減期は僅かに２分であ
る　［Ｃｏ１１ｅｎ、　Ｄ、ら（１９８５年）サーキュ
レーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）、７２巻、３８
４頁１従って、血栓症の治療には大量のＴＰＡの投与が
必要である。ＴＰＡのような蛋白の大量投与による血栓
治療は、極めて高価な治療になるばかりでなく、抗原抗
体反応による副作用という懸念されるべき問題を含んで
いる。従って、ＴＰＡ分子の化学的修飾（ＷＯ８４１０
１７８６）　（特開昭６３−０６９８３）［Ｂｅｒｇｅ
ｒ、　Ｈ，ら（１９８３年）ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）７
１巻、１６４１頁］、酵素的修飾（特開昭６２−２８２
５８２）　（ＥＰｏ　２５３５８２　Ａｔ）　、あるい
は遺伝子工学的改変（特開昭６１−２４３０２４、特開
昭６２−１３０６９０．特開昭６２−２７２９７６、特
開昭６２−２６９６８８、特開昭６２−２８２５８２、
特開昭６４−６３３７９）等により血中半：＄ｉ期の長
いＴＰＡ誘導体の作成の試みが行なわれている。しかし
、現在までに開発された新規ＴＰＡでは、血中半減期の
延長は得られているものの、フィブリンに対する親和性
が低下してしまっており、その結果として、血栓に対す
る溶解特性に関して、従来のＴＰＡを凌ぐものになって
いない。

〔発明が解決しようとする課題〕

ＴＰＡはフィブリンに対する強い親和性とその活性のフ
ィブリン依存性のために血栓特異的に作用すると考えら
れている。しかしながらその血中半減期が著しく短いた
め血栓治療には大量投与が必要でありその結果出血傾向
等の副作用が問題になってきた。化学修飾、酵素修飾、
遺伝子工学的手法等によって、多くの血中持続性の向上
したＴＰＡ誘導体が発明されている。しかし血中持続性
が大幅に向上した反面、ＴＰＡの特徴的な性質であるフ
ィブリン親和性の極端な低下が認められ、優れた治療効
果を示すには至っていない。また改変によりＴＰＡとし
ての酵素活性が著しく低下している例もある。ＴＰＡの
特徴的な性質であるフィブリン親和性が向上し、かつＴ
ＰＡ本来の特性をできるだけ保持したＴｐＡｉ＝導体は
、より少量の投与での血栓治療が期待でき、その開発の
意義は極めて大きい。

本発明は、ＴＰＡの特徴的な性質であるフィブリン親和
性やフィブリンによる活性化能を強化することにより、
フィブリン溶解能の強力な、グリコジル化された新規Ｔ
ＰＡ誘導体の発見に基ずく。

本発明は、該新規ＴＰＡ誘導体、該ＴＰＡ誘導体を産生
ずる動物培養細胞の作製法及び該動物培養細胞を利用し
た該ＴＰＡ誘導体の製造方法を提供するものである。

〔課題を解決するための手段〕

ＴＰＡはＮ末端からフィンガー領域、成長因子領域、ク
リングル１．クリングル２及びセリンプロテアーゼ活性
を有する領域の５つの領域からなる　［Ｐｅｎｎ１ｃａ
、　Ｄら（１９８３年）ネイチャー　（Ｎａ　ｔｕｒｅ
）３０１巻、２１４頁］　、ＴＰＡのクリングル２領域
は、ＴＰＡのフィブリン親和性やフィブリンによる活性
化に関与していると言われているが、クリングル１領域
は、その欠失誘導体の研究からもその機能が不明であり
、その解析が待たれていた。

本発明者らは、クリングル１領域にクリングル２領域の
持つフィブリン親和性やフィブリンによる活性化などの
機能を付与することにより、ＴＰＡの特徴的な性質であ
るフィブリン親和性やフィブリンによる活性化能を更に
強化し、フィブリン溶解能の優れた新規ＴＰＡ誘導体を
作製した。

以下、本発明の詳細な説明する。本発明は、ＴＰＡ誘導
体の作製に関するものであり、遺伝子工学的手法をもっ
て達成されるものである。したがってＴＰＡ誘導体の作
成にはＴＰＡのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が
不可欠である。そのようなりＮＡ配列の取得は、ＴＰＡ
　ｃＤＮＡあるいは染色体ＤＮＡのクローニング、ある
いはＴＰＡ　　ｃＤＮＡ、染色体ＤＮＡやＴＰＡアミノ
酸配列配列とにＤＮＡを化学合成することによっても達
成できる。ＴＰＡ　ｃＤＮＡは、ペニカ等［Ｐｅｎｎ１
ｃａ、　Ｄ、ら（１９８３年）ネイチ−ｔ−−（Ｎａ　
ｔｕｒｅ）３０１巻、２１４頁１が単離している。ＴＰ
Ａのアミノ酸配列およびｃＤＮＡに対する番号付けは、
彼等が提案しているものに従った。ＴＰＡ染色体ＤＮＡ
はエイ等［ＩＪｙ、Ｔ、　ら（１９８４年）プロシーデ
ィング、オフ、ザ、ナショナル、アカデミ−オフ、サイ
エンス、ニーニスエイ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆｔ
ｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃ
ｉｅｎｃｅ　ＵＳＡ）　８１巻、５３５５頁１　とブラ
ウンら　［Ｂｒｏｗｎ、Ｍ、Ｊ、ら（１９８５年）ジー
ン（Ｇｅｎｅ）　３３巻、２７９頁］　とデーゲンら［
Ｄｅｇｅｎ、Ｓ、Ｊ、Ｆ、　ら（１９８６年）ザ、ジャ
ーナル、オフ、バイオロジカル、ケミストリー（Ｔｈｅ
　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）　２６１巻、６９７２頁１がそれぞれ単
離している。ＴＰＡ染色体遺伝子のエクソンに対する番
号付けは、エイらに従うことにする。本発明者らは、染
色体ＤＮＡ利用発現ベクターｐＳＶｅＰＡ−１（特開昭
６２−１４７８３）によって形質転換されたＣＨＯ−Ｋ
　１細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡの合成および
クローニングを行なった。

実施例にあるように新たに取得したＴＰＡｃＤＮＡおよ
びｐＳＶｅＰＡ−１に含まれる染色体ＤＮＡを利用して
ＴＰＡ誘導体作戒の基本となる発現ベクターｐＳＶｅＣ
ＰＡ−１が作成できた。発現ベクターｐＳＶｅＣＰＡ−
１は、ＴＰＡ遺伝子の上流にＳＶ４０ウィルスの初期プ
ロモーターがＴＰＡ遺伝子が発現可能な形で存在してお
り、動物細胞に導入された際、ＴＰＡあるいはＴＰＡ誘
導体が生産しうるように設計されている。もちろんプロ
モーターとしてはＳＶ４０以外にＴＰＡ遺伝子を発現可
能なものならなんでも利用可能であろう。発現ベクター
ｐＳＶｅＣＰＡ−１を利用した上記ＴＰＡ誘導体発現ベ
クターの作成方法については実施例２に詳細に記した。

（発現ベクターの動物培養細胞への導入とＴＰＡ誘導体
生産細胞の作成） 動物細胞へのＤＮＡの導入法として、トランスフェクシ
ョン効率に差はあるが、リン酸カルシウム法［Ｗｉｇｌ
ｅｒ、　Ｍ、　ら（１９７７年）セル（Ｃｅｌｌ）、　
１１巻、２３３頁］、マイクロインジェクション法［Ａ
ｎｄｅｒｓｏｎ　、　Ｗ、　Ｆ、ら　（１９８９年）プ
ロシーディング。

オフ、ザ、ナショナル、アカデミ−、オフ、サイエンス
、ニーニスニー（同上）、７７巻、５３９９頁］、リポ
ゾーム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法或いは細胞融合法
［５ｃｈｏｆｆｎｅｒ、Ｗ、ら（１９８０年）プロシー
ディング、オフ、ザ、ナショナル、アカデミ−、オフ、
サイエンス、ニーニスニー（同上）、７７巻、２１６３
頁１電気導入法［達家雅明ら、（１９８７年）細胞工学
、６巻、４９４頁１　などが利用できる。ＴＰＡ誘導体
発現ベクターを細胞に導入後、適当な選択マーカー遺伝
子によって獲得した形質により形質転換株を得ることが
できる。動物細胞での選択マーカー遺伝子としては、Ｅ
ｃｏｇｐｔ［門ｕｌｌｉｇａａｎ、Ｒ，Ｃ，ら（１９８
０年）サイエンス　（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　＋２０９巻、
１４２２頁］＋　ｎｅｏ　［５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｐ、
Ｊ、ら（１９８２年）ジャーナル、オプ、モレキュラー
、アンド、アプライド、ジェネティクス（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ
　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　１巻、３２７頁］、　ｄｈｆｒ
　［Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ、ら　（１９８０年）プロシーデ
ィング、オフ、ザ、ナショナル、アカデミ−、オフ。

サイエンス、ニーニスニー（同上）、７７ｔ−１３２７
頁ｊ等の遺伝子が用いられる。ＴＰＡ誘導体発現ベクタ
ーは、これら選択マーカー遺伝子を同一プラスミド内に
含んでいてもあるいは別のプラスミドであっても形質転
換株の取得は可能である。得られた形質転換株がＴ、Ｐ
Ａ誘導体を生産するか否かは、それぞれの形質転換細胞
の培養液に含まれるプラスミノーゲン活性化活性を測定
することによって決定できる。

（ＴＰＡ誘導体の精製） ＴＰＡ誘導体生産株の培養は、宿主となる動物細胞株に
応じた培養法にて行なうことができる。

培養上清からのＴＰＡ誘導体の回収精製は、ＣＰＧ、　
　キレ−ティング　セファロース、Ｃｏｎ−Ａセファロ
ース、イオン交換体、オクチル　セファロース、セファ
デックスゲルでのクロマトグラフィ、抗体カラムクロマ
トグラフィーや電気泳動等を用いて行なうことができる
。プラスミノーゲン活性化能は、プラスミノーゲン含有
フィブリン平板を用いる方法［Ｍａｃｋｉｅ、　Ｍ、ら
（１９８１年）ブリティッシュ、ジャーナル、オプ、ヘ
マトロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
）ｌｅｍａｔｏｒｏｇｙ）　４７巻、７７ページ１やプ
ラスミンの合成基質Ｓ−２２５１の分解を測定する方法
［Ａ１１ｅｎ、Ｒ，Ａ、とＰｅｐｐｅｒ、　Ｄ、Ｓ、　
（１９８１年）トロンボシス、アンド、ヘモスタシス（
Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ
ｉｓ）４５巻、４３頁］　、ＣＬＴ法［Ｇａｆｆｎｅｙ
、　Ｐ、Ｔ、　　とＣｕｒｔｉｓ、　Ａ、Ｄ、　（１９
８５年）トロンボシス、アンド、ヘモスタシス（同上）
５３巻、１３４頁］　、ＥＬＩＳＡ法［Ｈｏ１ｖｏｅｓ
ｔ＋Ｔ、　　ら（１９８５年）トロンボシス、アンド、
ヘモスタシス（同上）５４巻、６８４頁１等によって測
定できる。

（血栓溶解能の評価） 本発明が提示するＴＰＡ誘導体は、血栓の溶解にかかわ
る種々の性質すなわち、フィブリン親和性、酵素活性の
フィブリン依存性、血中持続性、プラスミノーゲン活性
化能、インビトロ血栓分解能等の性質のいくつかにおい
て改善された性質を持つ。フィブリン親和性は、フィブ
リンクロットへの取込みを指標とする方法に従って測定
することができる。［Ｃｏ１１ｅｎ、Ｄ、ら（１９８８
年）ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）　７１巻、２１６頁］　イ
ンビトロ血栓熔解能は、１２５１−フィブリンからの放
射能の遊離を指標する方法等によって測定することがで
きる。

［Ｌａｒｓｅｎ、Ｇ、Ｒ，ら（１９８８年）ザ、ジャー
ナル、オフ。

バイオロジカル、ケミストリー（同上）２６３巻、１０
２３頁１ 酵素活性のフィブリン依存性あるいはプラスミノーゲン
活性化活性は、プラスミンの合成基質Ｓ−２２５１を利
用するコレンら［Ｃｏｌ　ｆｅｎ、　Ｄ、ら（１９８２
年）ザ、ジャーナル、オフ、バイオロジカル、ケミスト
リー（同上）２５７巻、２９１２頁１の方法にて測定す
ることができる。血中持続性に関してはベーベら［Ｂｅ
ｅｂｅ、Ｄ、Ｐ、ら（１９８６年）トロンボシスリサー
チ（同上）４３巻、６６３頁１あるいはマットソンら　
［Ｍａｔｔｓｏｎ、Ｃｈ、　　ら（１９８３年）トロン
ボシス　リサーチ（同上）３０巻、９１頁ｊが報告して
おり、それらに記載の方法で血中半減期が測定できる。

〔発明の効果］ 生体内における血栓溶解能に影響する因子は、フィブリ
ン親和性、フィブリンによる活性化、プラスミノーゲン
活性化能、プロテアーゼ抵抗性、阻害剤感受性、血中持
続性など様々である。本発明が提供する新規ＴＰＡ誘導
体は、天然型ＴＰＡに比べて改善されたフィブリン親和
性、プラスミノーゲン活性化能を持ち、天然型ＴＰＡを
上回るインビトロ血栓溶解能を保持している点で、心筋
梗塞等の血栓症の治療に用いることができ、現在試みら
れている治療方法を改善することができる。

〔実施例〕

以下に実施例を示すが、本発明に係わる諸実験は、内閣
総理大臣の定める「組換えＤＮＡ実験指針」に従って行
なった。また実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ
、種々の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあ
げる雑誌、底置を参考とした。

１、蛋白質　核酸　酵素、２６巻、４号、（１９８１）
臨時増刊　遺伝子操作（英文出版）２、遺伝子操作実験
法、高木康敬　編著（１９８０年）講談社 ３、遺伝子操作マニュアル、高木康敬　編著（１９８２
年）講談社 ４、　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　１
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ。

Ｔ、ｍａｎｉａｔｉｓら！　（１９８２年）　Ｃｏ１ｄ
　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ５、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、６５巻、Ｌ、Ｇｒｏｓｓｍａｎら［（１９８０年）　
Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ６、　　、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８巻、Ｒ，Ｗｕｌ
ｉ（１９７９年）　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（実
施例１）ＴＰＡ発現ベクターｐＳＶｅＣＰＡ−１の作成
ＴＰＡ発現ベクターｐＳＶｅＣＰＡ−１は以下に記述す
るステップを経て作成した。

（１）ＴＰＡのｃＤＮＡりｏ　−ン１）ＣＨ７９の作成
まず、染色体ＤＮＡ利用ＴＰＡ発現ベクターｐＳＶｅＰ
Ａ−１（特開昭６２−１４７８３）を導入したＣＨＯ−
Ｋｌ細胞から、既知のグアニジン−ホットフェノール法
に準じ、トータルＲＮＡを抽出した。次に、オリゴｄＴ
セルロースクロマトグラフィーにより、ポリＡ″ｍＲＮ
Ａを調製し、ショ糖濃度勾配遠心法によって分子量分画
してＴＰＡのｍＲＮＡを含む両分を得た。市販のｃＤＮ
Ａ合或キ７ト　（アマジャム社製）にこの両分を供して
ｃＤＮＡを合成し、市販のλｇｔｌｏ利用ｃＤＮＡクロ
ーニングキット　（アマジャム社製）を用いて、ｃＤＮ
Ａライブラリーを作成した。このライブラリーに対して
、ｐＳＶｅＰＡｌを制限酵素Ｘｂａｌで切断、単離した
第１０．１１及び１２エクソンを含む約２．５Ｋｂの断
片をプローブとして用い、通常の方法でブラークハイブ
リダイゼイションを行なって陽性ファージを選択した。

得られた陽性ファージＤＮＡを調製し、制限酵素Ｈｉｎ
ｄｌ［Ｉ　（宝酒造■製）で消化後アガロースゲル電気
泳動を行なって、クローニングに用いたと同じχｂａＩ
の１２．５Ｋｂ断片をプローブとしてサザンハイブリダ
イゼイション法により解析した。その結果、ＣＨ７９と
名づけたクローンには、ＨｉｎｄＩ［Ｉで約２．２Ｋｂ
に切断されるプローブ陽性の断片が含まれていることが
分かった。この旧ｎｄＩ［ｒ約２．２断片をアガロース
ゲル電気泳動法にて単離後、同じく旧ｎｄ■で消化した
ｐＵｃ１９（宝酒造■製）と７４ＤＮＡＩＪガーゼを用
いて連結後、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨＩに導入してｐＣＨ７
９を作成した。このｐＣＨ７９のｃＤＮＡ部分の塩基配
列をＭ１３法を利用した市販のキット（宝酒造側製）に
て決定した。５“末端に存在する発現ベクター由来の旧
ｎｄｌ［Ｉ認識部位より約１５０ｂｐ下流にＢｇｌＩ［
認識部位が存在し、塩基配列はその下流約１５（１０　
ｂ　ｐの終止コドンＴＧＡまでｂｐ５８４のＣがＴ及び
ｂ　ｐ　１７２５のＡがＣであった以外は、ペニカら　
［Ｐｅｎｎ１ｃａ、Ｄ、ら（１９８３年）ネイチャー（
Ｎａｔｕｒｅ）　３０１巻、２１４頁１が報告した塩基
配列と一致しており、さらに、ＴＧＡコドンから約４１
０塩基下流には発現ベクターに由来する旧ｎｄ■部位が
存在していた。

（２）ＴＰＡ発現ベクターｐＳＶｅＣＰＡ−１の作成ｐ
ｓＶｅｃＰＡ−１は、第１図に示した手順により作成し
た。　ｐＳＶｅＳａ　１１　（特開昭６２−１４７８３
）を制限酵素Ｎｃｏｌ　（宝酒造■製）で切断後、大腸
菌内での複製起点およびアンピシリン耐性を付与する約
４．７にｂ断片を単離し、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ（
宝酒造■製）を用いて環状化後、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨＩ
に導入してｐｓＶｅｓａｌ　　Ｉ−Ｈｉｎｄｌ［Ｉを作
成した。従って、このベクターは旧ｎｄＩ［Ｉ認識部位
をはさんでＳＶ４０の複製起点を含む初期プロモーター
領域とＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含む配列が
それぞれ存在している。次に、ｐｓＶｅｓａｌ　　Ｉ−
ＨｉｎｄＩ［Ｉを旧ｎｄｌＩ［にて切断後、ｐＳＶｅＰ
Ａ−１を旧ｎｄｌ［及びＢｇｌＩＩ（宝酒造■製〉で切
断、単離して得たＴＰＡ染色体ＤＮＡの全第２エクソン
と第３エクソンの一部を含む約１．９Ｋｂ断片と、ｐｃ
Ｈ７９をＨｉｎｄｌ］ｌ及びＢｇｌＩＩで切断したＴＰ
Ａ　ｃＤＮＡを含む約２Ｋｂ断片とを７４ＤＮＡリガー
ゼニテ連結後、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨＩニ導入しテｐｓＶ
ｅｃＰＡ−１を作成した。このＴＰＡ発現ベクターｐＳ
ＶｅＣＰＡ−１は、第２エクソンから第３エクソンのＢ
ｇｌｌｌ認識部位までが染色体ＤＮＡ由来であり、それ
以降がｃＤＮＡより戒り、天然型のＴＰＡを発現する遺
伝子をコードしている。

（実施例２）ＴＰＡ誘導体発現ベクターｐＳＣＫ門−ｌ
の作製 （１）変異導入ベクターｐＢＮ９−１１の作製クリング
ル１領域にアミノ酸置換を導入するための第一ステップ
として、まず変異導入ベクターの作製を行なった。発現
ベクターｐＳＶｅＣＰＡ−１を制限酵素Ｂｇｌ　　Ｕと
Ｎａｒｌ　にューイングランド　バイオラボ社製）で切
断し、ポリアクリルア旦ド電気泳動によって、約０．３
Ｋｂの断片を分離した。また、ベクターｐＵｃ１１９　
（宝酒造■製）を制限酵素Ｓｍａ　１（宝酒造■製）で
切断し、その両端にＢｇｌＩ［’Ｊンカーｄ　（ＣＡＧ
ＡＴＣＴＧ）　（宝酒造■製）を接続した後、制限酵素
ＢｇｌＩ［とＮａｒｌで切断した。これらの約０．３Ｋ
ｂの断片とｐｔｌｃ１１９を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにて
連結後、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｄ旧に導入してｐＢＮ９−１１
を作製した。

この変異導入ベクターｐＢＮ９−１１は、ＴＰＡのＮ末
端からクリングル１領域にあるアミノ酸１１０番目のグ
リシンに相当するｃＤＮＡをコードしている。

（２）部位特異的アミノ酸置換反応 クリングル１領域にアミノ酸置換を導入するため、まず
変異導入ベクターｐＢＮ９−１１より一本鎖のＤＮＡを
ビエイラらの方法［Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、ａｎｄＭｅｓ
ｓｉｎｇ、　Ｊ　（１９８７）メソッズ　イン　エイザ
イモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ）、　　１５３巻、３頁１に従って調製した。そし
て次に、部位特異的アミノ酸置換反応に用いる合成りＮ
Ａプローブとして、 ５’　−ＧＣＴＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＧＴＡ
ＧＣＡＣＧＴＧＧＣＣ−３’の配列を持つものを作製し
た。この合成ＤＮＡプローブを用いることにより、アミ
ノ酸９４番目のグルタミン酸と９５番目のアスパラギン
酸を、それぞれバリンとグリシンに置換することができ
る。

この合成ＤＮＡプローブのＮ末端を、Ｔ４ポリヌクレオ
チド　キナーゼ（宝酒造■製）を用いてリン酸化した。

調製したｐＢＮ９−１１の１本鎖ＤＮＡと変異用合成Ｄ
ＮＡプローブより、市販のインビトロ変異システムキッ
ト（アマジャム社製）を用いて部位特異的変異反応を行
ない、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＴＧＩに導入してｐＢＮＫＭ−１
を作製した。このｐＢＮＫＭ−１より１木鎮Ｄ　Ｎ　Ａ
を前述の方法で調製し、Ｍ１３法を利用した市販のキッ
ト　（同上）を用いて変異の確認を行なったところ、ア
ミノ酸９４番目のグルタミン酸と９５番目のアスパラギ
ン酸に対応するＤＮＡ配列−ＧＡＧＧＡＣ−がそれぞれ
バリン及びグリシンに対応する一ＧＴＧＧＧＣ−に変異
していることが確認できた。

（３）ＴＰＡ誘導体発現ベクターｐＳＣＫＭ−１の作製
ＴＰＡ誘導体発現ベクターｐＳ（ＪＭ−１の作製は、以
下の手順に従って行なった。まず、ｐＢＮＫＭ−１を制
限酵素ＢｇｌｎとＮａｒｌで切断し、ボリアクリルアく
ド電気泳動によって、約０．３Ｋｂの断片を分離した。

次に、ｐＳＶｅＣＰＡ−１を制限酵素ＢｇｌｆｆとＮａ
ｒｌで切断し、アガロース電気泳動によって、約７．８
Ｋｂの断片を分離した。そして、これらの両断片をＴ４
ＤＮＡリガーゼによって連結後、Ｅ、ｃｏｌｉに導入し
てｐＳＣＫＭ−１を作製した。

（実施例３）　マーカーベクターｐＳＶ２ｎｅｏ−ｄｈ
ｆｒの作成 ｐＳＶ２ｎｅｏ−ｄｈｆｒは以下の手順で作成した。ｐ
ＳＶ２ｄｈｆｒ（アメリカン　タイプカルチャー　コレ
クションｒＤ　Ｎ　ＡＶｅｃｔｏｒｓ　３７１４６）を
制限酵素ＰｖｕＩ［（宝酒造■製）で切断し、そこにＢ
ａｍ）ｌ　１　　リンカ−ｄ　（ｐｃｃＧＡＴＣＣＧ）
　（宝酒造■製）をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結後、Ｅ、
ｃｏｌｉ　ＤＨＩに導入してｐＳＶ２Ｂｄｈｆｒを作成
した。

ｐｓＶ２ＢｄｈｆｒをＢａｍＨｌで消化して得られるｄ
ｈｆｒ遺伝子を含む約２Ｋｂの断片をアガロース電気泳
動法により調製し、ｐＳＶ２ｎｅｏ　（アメリカン　タ
イプカルチャー　コレクションｒ　Ｄ　Ｎ　ＡＶｅｃｔ
ｏｒｓ　３７１４９）をＢａｍ旧（宝酒造■製）で切断
したＤＮＡとをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて環状化後、
Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨＩに導入し、ｎｅｏ　ａｄｈｆｒ遺
伝子が同発現方向に挿入されたｐＳＶ２ｎｅｏ−ｄｈｆ
ｒを作成した。

（実施例４）ＴＰＡ誘導体発現ベクターの動物培養細胞
への導入とＴＰＡの生産 ＴＰＡ誘導体発現ベクターｐＳＣＫＭ−１をＣＨＯ−Ｋ
　１　（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−６１）を宿主として、チェ
７ら［Ｃｈｅｎ、　Ｃ，ａｎｄ　Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ，
ら（１９８７年）モレキュラー　アンド　セルラー　バ
イオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕ
ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　　７巻、２７４５頁１　の
方法に準じて形質転換を行なった。即ち、プラスごド［
Ｔ　Ｐ　Ａ誘導体発現ベクターｐＳＣＫＭ−１：　ｐＳ
Ｖ２ｎｅ。

−ｄｈｆｒ　＝１０　：　１　　（重量比）１−リン酸
カルシウム共沈澱物を予め５％牛脂児血清（ＦＣＳ）を
含むＭＤ培地（ＭＣＤＢ３０２：ダルベツコ変法ＭＥＭ
＝１：１　、シグマ）で生育させた細胞（２ＸＩＯ’細
胞／ｌＯｄ培地／直径１０ＣＩ培養皿）に加え、１５時
間後に培地を洗浄して更新した。さらに４８時間後、培
地を８（１０μｇ／ｄ　Ｇ４１８硫酸塩（ギブコ）、７
ｍＭε−アミノカプロン酸、５０μＭフォイパン（小野
薬品工業）を含むＭＤ培地に変え、さらに約２週間培養
を続けＧ４Ｌ８耐性株を分離した。０４１Ｂ耐性株を２
４穴マルチデイツシユ　（コーニング社製）の底面全体
に生育させ、上記培地で２４時間培養し、培地中に含ま
れるＫＭ−１の活性をプラスミノーゲン含有フィブリン
平板を用いて測定した。　［Ｍａｃｋｉｅ、　Ｍ。

ら（１９８１年）ブリティッシュ　ジャーナル　オフヘ
マトロジ−（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）。

４７巻、７７頁１゜ （実施例５）形質転換株のメソトレキセー）　（Ｍｔｘ
）による選択及び培養 実施例４で得たｐｓｃＫＭ−１の形質転換株をそれぞれ
直径１０ｃｍの培養皿にｌＸｌ０’からｌＸｌ０’個の
細胞を植え１１（１０ｎから１１（１００ｎのＭｔｘを
含むＭＤ培地で約２週間培養を続け、Ｍｔｘに対して耐
性を示す株を分離した。これらの耐性株が２４時間あた
り生産するＫＭ−１の量を実施例４に示した様にフィブ
リン平板法にて測定した。表−１には実施例４および５
で得られたＫＭ−１の生産株名及びその力価を示した。

Ｍｔｘで選択した細胞からは親株よりも高いＴＰＡ生産
性を示す株が得られた。また、これらの細胞はＭＤ無血
清培地（ＭＤ培地、７ｍＭε−アミノカプロン酸、５０
μＭフォイバン、■■／　ｍｌ牛血清アルブミン、５μ
ｇ／ｄインシュリン）においてもＴＰＡを生産した。

表−１ 〔μｇ／ｄ） ０．４４ ０．３４ ０．３７ ５４５ ０．３０ ０．２１ ０．８１ ０．３４ ０．２６ ０．３１ ０．４０ ０．２６ ０．３４ ０．０７ ０．６４ １．５　　　　　　５（１０ 株　名　ＴＰＡ力価 ＫＭ−１０２０ ＫＭ−１０２１ ＫＭ−１０２２ ＫＭ−１０５９ ＫＭ−１０６３ ＫＭ−１０６４ ＫＭ−１１０１ ＫＭ−１１１０ ６４Ｋ　１１７９ ＫＭ−１２３９ ＫＭ−１２４９ ＫＭ−１２５１ ＫＭ−１２５２ ＫＭ−１３１９ ＫＭ−１３３２ ＫＭ−１５１９ ＫＭ−１５３１２，２５（１０ ＫＭ−１５３２２，０５（１０ ＫＭ−１５４４１，９５（１０ ＫＭ−１５４５２，０５（１０ ＫＭ−１７０５１：４　　　　　　　　１（１００ＫＭ
１（１００Ｋ　　　　　　　　　　１．０　　　　　　
　　　１（１００（実施例６）　　ＫＭ−１の回収、精
製以下にＴＰＡ誘導体ＫＭ−１の回収、精製の工程を示
す。工程途中のＴＰＡ抗原の検出には、市販のＥＬＩＳ
Ａキット　（ＩＭｔｌＢＩＮＤ　Ｔ　Ｐ　ＡＥＬＩＳＡ
　ＫＩＴ、アメリカンダイアグツステイカ社製）を用い
た。ＫＭ−１１０１株を実施例５で示したＭＤ無血清培
地にて培養し、ＫＭ−１を含む培養液を、Ｉ　Ｍ　Ｎａ
Ｃ１，５０μＭフォイパンを含む２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，５）にて平衡化したＣＰＧ−１０（エレクト
ロヌクレオニクス社製）カラムにチャージし、平衡化に
用いたと同じ緩衝液にて洗浄した。ＣＰＧ−１０カラム
を通過した培養液および洗浄液中にＫＭ−１は、はとん
ど検出されなかった。ＣＰＧ−１０カラムよりＫＭ−１
をＩ　Ｍ　ＮａＣ！２．０．５Ｍ　ＫＳＣＮ、　Ｉ　Ｍ
　ｔ−アミノカプロン酸および５０μＭフォイパンを含
む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて溶出した。

？容出Ｙ夜をそのままＩ　Ｍ　ＮａＣ１，０，０１％Ｔ
ｈｅｅｎ８０および５０μＭフォイバンを含む２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて平衡化したＣｏｎＡ−
３ｅｐｈａｒｏｓｅ　（ファルマシア社製）カラムにチ
ャージした。平衡化に用いたと同じ緩衝液にて洗浄後、
２　Ｍ　ＫＳＣＮ、　０．４Ｍα−メチルマンノシド、
　０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０および５０μＭフォイパン
を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて溶出し
た。ＥＬＩＳＡを利用してＣｏｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ
の通過培養液、洗浄液および溶出液中に含まれるＴＰＡ
抗原を検出したところ、ＫＭ−１はほとんどＣｏｎＡ　
５ｅｐｈａｒｏｓｅに吸着し、溶出回収されていること
が分かった。

同溶出液に含まれるＴＰＡ蛋白量をＥＬＩＳＡ法にて測
定したところ、ＫＭ−１はＫＭ−１１０１株の培養成約
１．６　Ｌより１．８■が回収、精製されていることが
分かった。

（実施例７）インビトロでのフィブリン親和性ＫＭ−１
のインビトロでのフィブリン親和性を、コレンら（同上
）の方法によって測定した。５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ）ｉｃ
Ｊ２　（ｐＨ７，４）、０．０３８　Ｍ　ＮａＣｆｆ１
．０．１％Ｔｗｅｅｎ　８０　。

１　ｍｇ／　ｍｌ　ＢＳＡ、　０．１　ｕ　ｇ／ｍｆｌ
　Ｔ　Ｐ　Ａとし、ヒト−フィブリノーゲンを０．０１
■／　ｍ１〜２■／ｄとなる様に変化させ、ヒト−トロ
ンビンを２０　ＮＩ　　Ｈｕｎｉｔｓ／　ｍｌとなる様
に添加して室温で１０分間装いた。

そして、１５．ＯＯＯｒｐｍ、　１０分間遠心分離して
、上清を分離した。その活性をＳ−２２５１を用いた方
法で測定し、結果を第２図にまとめた。ＫＭ−１は天然
型ＴＰＡよりやや強いインビトロでのフィブリン親和性
をもっていることが分かった。

（実施例８）　インビトロでのプラスミノーゲン活性化
能測定 ＫＭ−１のインビトロでの酵素活性のフィブリン依存性
あるいはプラスミノーゲン活性化能は、プラスミンの合
成基１ｓ−２２５１を利用するコレンら（同上）の方法
にて測定した。　０．１　Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｆ　（ｐ
Ｈ７，５）、　０．１％Ｔｗｅｅｎ８０　＋　０．３　
ｍＭ　Ｓ−２２５１＋　０．１ｍｇヒト　フィプリノゲ
ン（ブロモシアンで分解したもの）、１ｎｇ／ｍ１又は
Ｌｏｎｇ／　ｔｒｄｌ　Ｔ　Ｐ　Ａとし、グルタミン酸
タイプ　プラスミノーゲンを０．１　μｇ／ｄ〜５０ｕ
ｇ／ｍｌとして、２５°Ｃ，３時間置いた後、４０５ｎ
ｍでの吸光度を測定した。その結果を第３図にまとめた
。ＫＭ−１は天然型ＴＰＡよりも強力なインビトロでの
プラスミノーゲン活性化能をもっていることが分かった
。

（実施例９）　インビトロでの血栓溶解能測定ＫＭ−１
のインビトロでの血栓溶解能をラーセンら（同上）の方
法を一部改変して測定した。

４．５５μｇ／ｍｌヒト　グルタミン酸タイプ　プラス
ミノーゲン、０．１　Ｍ　ＮａＣ１，、０，０１％Ｔｗ
ｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）
に５　ｍｇ　／　ｒｒｄｌとなるようにヒトフィブリノ
ーゲンを溶解後、ヒト　トロンビンを１．ＯＮＩＨｕｎ
ｉｔ／　ｒｔｄｌとなるように添加し、９６穴マルチデ
イツシユに１（１０μｌずつ分注して３７°Ｃ＋Ｉｈｒ
放置して凝固させた。作成したフィブリンクロットに１
（１０ｕｊ２の酵素液を重層し、３７°Ｃで４ｈｒ反応
させた０反応後、各ウェルの４０５帥での吸光度を測定
し、その結果を第４図にまとめた。ＫＭ−１は天然型Ｔ
ＰＡよりも強力なインビトロ血栓溶解能をもっているこ
とが分かった。

（実施例１０）ＫＭ−１の血中での半減期測定血中持続
性に関してはペーベら（同上）あるいはマットソンら（
同上）の方法で血中での半減期を測定した。精製したＫ
Ｍ−１３（１０ｕｇをウサギに耳介静脈より単回投与し
、その血中半減期を測定した。その結果、ウサギでの血
中半減期は、２．４分と測定された。（第５図）

【図面の簡単な説明】

第１図はＴＰＡ発現ベクターｐＳＶｅＣＰＡ−１の構築
をしめす図、 第２図は天然型ＴＰＡ及びＫＭ−１のフィブリン親和性
を示すグラフ、 第３図は天然型ＴＰＡ及びＫＭ−１のプラスミノーゲン
活性化能の比較をしめずグラフ、第４図は天然型ＴＰＡ
及びＫＭ−１のインビトロでのフィブリンクロット溶解
能を示すグラフ、第５図は天然型ＴＰＡ及びＫＭ−１の
ウサギでの血中持続性を示すグラフである。 第２図

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミノ酸９４番目のグルタミン酸と９５番目のア
   スパラギン酸が、それぞれバリンとグリシンに置換され
   た組織プラスミノーゲン活性化因子誘導体。
2. （２）形質転換された動物培養細胞で産生される請求項
   １記載のプラスミノーゲン活性化因子誘導体。
3. （３）動物培養細胞がＣＨＯ−Ｋ１である請求項２記載
   のプラスミノーゲン活性化因子誘導体。
4. （４）請求項１のプラスミノーゲン活性化因子誘導体を
   コードするＤＮＡ配列。
5. （５）ＤＮＡ配列がｃＤＮＡの一部分と染色体ＤＮＡの
   一部分からなる請求項４記載のＤＮＡ配列。
6. （６）第２エクソンから第３エクソンのＢｇｌII認識部
   位までが染色体ＤＮＡ、ＢｇｌII認識部位から下流がｃ
   ＤＮＡからなる請求項５記載のＤＮＡ配列。
7. （７）請求項４〜６記載のＤＮＡ配列のいずれかを含む
   発現ベクターによって形質転換された動物培養細胞。
8. （８）動物培養細胞が、ＣＨＯ−Ｋ１である請求項７記
   載の動物培養細胞。
9. （９）請求項４〜６記載のいずれかのＤＮＡ配列を含む
   発現ベクターによって形質転換された動物培養細胞を培
   養してプラスミノーゲン活性化因子誘導体を生成せしめ
   、これを採取するプラスミノーゲン活性化因子誘導体の
   製造方法。
10. （１０）動物培養細胞がＣＨＯ−Ｋ１である請求項９記
    載のプラスミノーゲン活性化因子誘導体の製造方法。