JPH03130076A - クリングル１領域に変異を有する新規血栓溶解剤とその製造方法 - Google Patents
クリングル１領域に変異を有する新規血栓溶解剤とその製造方法Info
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- JPH03130076A JPH03130076A JP1269406A JP26940689A JPH03130076A JP H03130076 A JPH03130076 A JP H03130076A JP 1269406 A JP1269406 A JP 1269406A JP 26940689 A JP26940689 A JP 26940689A JP H03130076 A JPH03130076 A JP H03130076A
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- JP
- Japan
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- tpa
- derivative
- plasminogen activator
- plasminogen
- dna
- Prior art date
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、新規プラスミノーゲン活性化因子、該因子を
産する細胞、該因子をコードするＤＮＡ配列及び該因子
の製造法にかかわる。本発明による新規プラスミノーゲ
ン活性化因子は、プラスミノーゲンをフィブリン溶解活
性を有するプラスミンに変換する作用を有し、種々の血
栓症の治療薬として用いることができる。
産する細胞、該因子をコードするＤＮＡ配列及び該因子
の製造法にかかわる。本発明による新規プラスミノーゲ
ン活性化因子は、プラスミノーゲンをフィブリン溶解活
性を有するプラスミンに変換する作用を有し、種々の血
栓症の治療薬として用いることができる。
ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（以下、ＴＰＡと
略記する）は、ヒト・メラノーマ細胞（Ｂｏｗｅｓ Ｍ
ｅｌａｎｏｍａ） の分泌するＴＰＡについてよく研
究され、５２７のアミノ酸残基からなる糖蛋白質である
（Ｐｅｎｎｌｃａ、Ｄ、ら（１９８３年）ネイチ＋ −
（Ｎａｔｕｒｅ） ３０１巻、２１４頁〕。
略記する）は、ヒト・メラノーマ細胞（Ｂｏｗｅｓ Ｍ
ｅｌａｎｏｍａ） の分泌するＴＰＡについてよく研
究され、５２７のアミノ酸残基からなる糖蛋白質である
（Ｐｅｎｎｌｃａ、Ｄ、ら（１９８３年）ネイチ＋ −
（Ｎａｔｕｒｅ） ３０１巻、２１４頁〕。
ＴＰＡは、フィブリン溶解能を有しないプラスミノーゲ
ンを該活性を有するプラスミンに変換する酵素で血栓溶
解作用を有している。ＴＰＡは現在、血栓症の治療に用
いられている［Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ 。
ンを該活性を有するプラスミンに変換する酵素で血栓溶
解作用を有している。ＴＰＡは現在、血栓症の治療に用
いられている［Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ 。
Ｅ、Ｂ、 （１９８７年）ファーマシューティカル・リ
サーチ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｌｌｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ） 、 ４巻、３７５頁〕。しかし、ＴＰＡの最大
の欠点はその血中からの急速なりリアランスにある。血
流中に投与されたＴＰＡは、主に肝臓で代謝されると推
定され（Ｆｕｃｈｓ、ｔ（、Ｅ、ら（１９８５年）ブラ
ッド（Ｂｆｏｏｄ） 、 ６５巻、５３９頁〕 その
血中半減期は僅かに２分である（Ｃｏｌｌｅｎ、Ｄ、ら
（１９８５年）サーキュレーション（Ｃ１ｒｃｕｌａｔ
ｉｏｎ） ７２巻、３８４頁〕。従って、血栓症の治療
には大量のＴＰＡの投与が必要である。ＴＰＡのような
蛋白の大量投与による血栓症治療は、極めて高価な治療
になるばかりでなく、抗原抗体反応による副作用という
懸念されるべき問題を含んでいる。従って、ＴＰＡ分子
の化学的修飾（ＷＯ８４１０１７８Ｂ） （特開昭６３
−０６９８３ ） （Ｂｅｒｇｅｒ、Ｈ，ら（１９８
３年）ブラッド（Ｂｌｏｏｄ） ７１巻、１６４１頁〕
、酵素的修飾（特開昭６２−２８２５８２）（ＥＰ
０２５３５８２ ＡＬ） 、あるいは遺伝子工学的改変
（特開昭６１−２４３０２４、特開昭６２−１３０６９
０、特開昭６２−２７２９７６、特開昭６２−２６９６
８８、特開昭６２−２８２５８２、特開昭６４−６３３
７９）等により血中持続性の改良された、すなわち血中
半減期の長いＴＰＡ誘導体の作成の試みが行なわれてい
る。しかし、現在までに開発された新規ＴＰＡでは、血
中半減期の延長は得られているものの、フィブリンに対
する親和性が低下してしまっており、その結果として、
血栓に対する溶解特性に関して、従来のＴＰＡを凌ぐも
のにはなっていない。
サーチ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｌｌｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ） 、 ４巻、３７５頁〕。しかし、ＴＰＡの最大
の欠点はその血中からの急速なりリアランスにある。血
流中に投与されたＴＰＡは、主に肝臓で代謝されると推
定され（Ｆｕｃｈｓ、ｔ（、Ｅ、ら（１９８５年）ブラ
ッド（Ｂｆｏｏｄ） 、 ６５巻、５３９頁〕 その
血中半減期は僅かに２分である（Ｃｏｌｌｅｎ、Ｄ、ら
（１９８５年）サーキュレーション（Ｃ１ｒｃｕｌａｔ
ｉｏｎ） ７２巻、３８４頁〕。従って、血栓症の治療
には大量のＴＰＡの投与が必要である。ＴＰＡのような
蛋白の大量投与による血栓症治療は、極めて高価な治療
になるばかりでなく、抗原抗体反応による副作用という
懸念されるべき問題を含んでいる。従って、ＴＰＡ分子
の化学的修飾（ＷＯ８４１０１７８Ｂ） （特開昭６３
−０６９８３ ） （Ｂｅｒｇｅｒ、Ｈ，ら（１９８
３年）ブラッド（Ｂｌｏｏｄ） ７１巻、１６４１頁〕
、酵素的修飾（特開昭６２−２８２５８２）（ＥＰ
０２５３５８２ ＡＬ） 、あるいは遺伝子工学的改変
（特開昭６１−２４３０２４、特開昭６２−１３０６９
０、特開昭６２−２７２９７６、特開昭６２−２６９６
８８、特開昭６２−２８２５８２、特開昭６４−６３３
７９）等により血中持続性の改良された、すなわち血中
半減期の長いＴＰＡ誘導体の作成の試みが行なわれてい
る。しかし、現在までに開発された新規ＴＰＡでは、血
中半減期の延長は得られているものの、フィブリンに対
する親和性が低下してしまっており、その結果として、
血栓に対する溶解特性に関して、従来のＴＰＡを凌ぐも
のにはなっていない。
ＴＰＡはフィブリンに対する強い親和性とその活性のフ
ィブリン依存性のために血栓特異的に作用すると考えら
れている。しかしながらその血中半減期が著しく短いた
め血栓治療には大量投与が必要でありその結果出血傾向
等の副作用が問題になってきた。化学修飾、酵素修飾、
遺伝子工学的手法等によって、多くの血中持続性の向上
したＴＰＡ誘導体が発明されている。しかし血中持続性
が大幅に向上した反面、ＴＰＡの特徴的な性質であるフ
ィブリン親和性の極端な低下が認められ、優れた治療効
果を示すには至っていない。また改変によりＴＰＡとし
ての酵素活性が著しく低下している例もある。ＴＰＡの
特徴的な性質であるフィブリン親和性や、フィブリンに
よる活性化能が向上し、かつＴＰＡ本来の特性をできる
だけ保持したＴＰＡ誘導体は、より少量の投与での血栓
治療が期待でき、その開発の意義は極めて大きい。
ィブリン依存性のために血栓特異的に作用すると考えら
れている。しかしながらその血中半減期が著しく短いた
め血栓治療には大量投与が必要でありその結果出血傾向
等の副作用が問題になってきた。化学修飾、酵素修飾、
遺伝子工学的手法等によって、多くの血中持続性の向上
したＴＰＡ誘導体が発明されている。しかし血中持続性
が大幅に向上した反面、ＴＰＡの特徴的な性質であるフ
ィブリン親和性の極端な低下が認められ、優れた治療効
果を示すには至っていない。また改変によりＴＰＡとし
ての酵素活性が著しく低下している例もある。ＴＰＡの
特徴的な性質であるフィブリン親和性や、フィブリンに
よる活性化能が向上し、かつＴＰＡ本来の特性をできる
だけ保持したＴＰＡ誘導体は、より少量の投与での血栓
治療が期待でき、その開発の意義は極めて大きい。
本発明は、ＴＰＡの特徴的な性質であるフィブリン親和
性やフィブリンによる活性化能を強化することにより、
フィブリン溶解能の強力な、グリコジル化された新規Ｔ
ＰＡ誘導体の発見に基ずく。
性やフィブリンによる活性化能を強化することにより、
フィブリン溶解能の強力な、グリコジル化された新規Ｔ
ＰＡ誘導体の発見に基ずく。
本発明は、該ＴＰＡ誘導体、該ＴＰＡ誘導体を産生ずる
動物培養細胞の作製性及び該動物培養細胞を利用した該
ＴＰＡ誘導体の製造方法を提供するものである。
動物培養細胞の作製性及び該動物培養細胞を利用した該
ＴＰＡ誘導体の製造方法を提供するものである。
ＴＰＡはＮ末端からフィンガー領域、成長因子領域、ク
リングル１．クリングル２及びセリンプロテアーゼ活性
を有する領域の５つの領域からなる（ Ｐｅｎｎ ｌｅ
ａ 、 Ｄら（１９８３年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ
） ３０１巻、２１４頁）。ＴＰＡのクリングル２領域
は、ＴＰＡのフィブリン親和性やフィブリンによる活性
化に関与していると言われているが、クリングル１領域
は、その欠失誘導体の研究からもその機能が不明であり
、その解析が待たれていた。本発明者らは、クリングル
１領域にクリングル２領域の持つフィブリン親和性やフ
ィブリンによる活性化などの機能を付与することにより
、ＴＰＡの特徴的な性質であるフィブリン親和性やフィ
ブリンによる活性化能を更に強化し、フィブリン溶解能
の優れた新規ＴＰＡ誘導体を作製した。
リングル１．クリングル２及びセリンプロテアーゼ活性
を有する領域の５つの領域からなる（ Ｐｅｎｎ ｌｅ
ａ 、 Ｄら（１９８３年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ
） ３０１巻、２１４頁）。ＴＰＡのクリングル２領域
は、ＴＰＡのフィブリン親和性やフィブリンによる活性
化に関与していると言われているが、クリングル１領域
は、その欠失誘導体の研究からもその機能が不明であり
、その解析が待たれていた。本発明者らは、クリングル
１領域にクリングル２領域の持つフィブリン親和性やフ
ィブリンによる活性化などの機能を付与することにより
、ＴＰＡの特徴的な性質であるフィブリン親和性やフィ
ブリンによる活性化能を更に強化し、フィブリン溶解能
の優れた新規ＴＰＡ誘導体を作製した。
以下、本発明の詳細な説明する。本発明は、ＴＰＡ誘導
体の作製に関するものであり、遺伝子工学的手法を持つ
て達成されるものである。したがって改良型ＴＰＡの作
成にはＴＰＡのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が
不可欠である。そのようなりＮＡ配列の取得は、ＴＰＡ
ｃＤＮＡあるいは染色体ＤＮＡのクローニング、あるい
はＴＰＡｃＤＮＡ、染色体ＤＮＡやＴＰＡアミノ酸配列
配列とにＤＮＡを化学合成することによって達成できる
。ＴＰＡｃＤＮＡは、ベニ力等（Ｐｅｎｎ ｔｅａ 、
Ｄ 、ら（１９８３年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
３０１巻、２１４頁〕が単離している。
体の作製に関するものであり、遺伝子工学的手法を持つ
て達成されるものである。したがって改良型ＴＰＡの作
成にはＴＰＡのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が
不可欠である。そのようなりＮＡ配列の取得は、ＴＰＡ
ｃＤＮＡあるいは染色体ＤＮＡのクローニング、あるい
はＴＰＡｃＤＮＡ、染色体ＤＮＡやＴＰＡアミノ酸配列
配列とにＤＮＡを化学合成することによって達成できる
。ＴＰＡｃＤＮＡは、ベニ力等（Ｐｅｎｎ ｔｅａ 、
Ｄ 、ら（１９８３年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
３０１巻、２１４頁〕が単離している。
ＴＰＡのアミノ酸配列およびｃＤＮＡに対する番号付け
は、彼等が提案しているものに従った。ＴＰＡ染色体Ｄ
ＮＡはエイ等（Ｎｙ、 Ｔ、 ら（１９８４年）プロ
シーディング オブ ザ ナショナル アカデミ−オブ
サイエンス ニーニスエイ（Ｐｒｏｃｅｅｄｌｎｇ
ｏｆ’ ｔｈｅ Ｎａｔｈｌｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｒＳｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ） ８１巻、５３５５頁〕
とブラウンら（Ｂｒｏｖｎ、Ｍ、Ｊ 、ら（１９８５年
）ジーン（Ｇｅｎｅ） ３３巻、２７９頁Ｊとデーゲン
ら（Ｄｅｇ、ｅｎ、ｓ、Ｊ、Ｆ、ら（１９８６年）ザ
ジャーナル オブバイオロジカル ケミストリー（Ｔｈ
ｅ ＪｏｕｒｎａｌｏｒＢｉｏｌｏｄｌｅａｌ Ｃｈｃ
ｖｉｓｔｒｙ） ２６１巻、６９７２頁〕がそれぞれ
単離している。ＴＰＡ染色体遺伝子のエクソンに対する
番号付けは、エイらに従うことにする。本発明者らは、
染色体ＤＮＡ利用発現ベクターｐｓＶｅＰＡ−１，（特
開昭６２−１４７８３）によって形質転換されたＣｌｌ
０−Ｋｌ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡの合成お
よびクローニングを行なった。実施例１にあるように新
たに取得したＴＰＡｃＤＮＡおよびｐｓＶｅＰＡ−１に
含まれる染色体ＤＮＡを利用してＴＰＡ誘導体作成の基
本となる発現ベクターｐｓＶｅｃＰ＾−１が作成できた
。発現ベクターｐＳＶｅＣＰ＾−Ｌは、ＴＰＡ遺伝子の
上流にＳＶ４０ウィルスの初期プロモーターがＴＰＡ遺
伝子が発現可能な形で存在しており、動物細胞に導入さ
れた際、ＴＰＡあるいはＴＰＡ誘導体が生産しつるよう
に設計されている。もちろんプロモーターとしてはＳＶ
４０以外にＴＰＡ遺伝子を発現可能なものならなんでも
利用可能であろう。発現ベクターＰＳＶｅＣＰＡ−１を
利用した上記ＴＰＡ誘導体発現ベクターの作成方法につ
いては実施例２に詳細に記した。
は、彼等が提案しているものに従った。ＴＰＡ染色体Ｄ
ＮＡはエイ等（Ｎｙ、 Ｔ、 ら（１９８４年）プロ
シーディング オブ ザ ナショナル アカデミ−オブ
サイエンス ニーニスエイ（Ｐｒｏｃｅｅｄｌｎｇ
ｏｆ’ ｔｈｅ Ｎａｔｈｌｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｒＳｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ） ８１巻、５３５５頁〕
とブラウンら（Ｂｒｏｖｎ、Ｍ、Ｊ 、ら（１９８５年
）ジーン（Ｇｅｎｅ） ３３巻、２７９頁Ｊとデーゲン
ら（Ｄｅｇ、ｅｎ、ｓ、Ｊ、Ｆ、ら（１９８６年）ザ
ジャーナル オブバイオロジカル ケミストリー（Ｔｈ
ｅ ＪｏｕｒｎａｌｏｒＢｉｏｌｏｄｌｅａｌ Ｃｈｃ
ｖｉｓｔｒｙ） ２６１巻、６９７２頁〕がそれぞれ
単離している。ＴＰＡ染色体遺伝子のエクソンに対する
番号付けは、エイらに従うことにする。本発明者らは、
染色体ＤＮＡ利用発現ベクターｐｓＶｅＰＡ−１，（特
開昭６２−１４７８３）によって形質転換されたＣｌｌ
０−Ｋｌ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡの合成お
よびクローニングを行なった。実施例１にあるように新
たに取得したＴＰＡｃＤＮＡおよびｐｓＶｅＰＡ−１に
含まれる染色体ＤＮＡを利用してＴＰＡ誘導体作成の基
本となる発現ベクターｐｓＶｅｃＰ＾−１が作成できた
。発現ベクターｐＳＶｅＣＰ＾−Ｌは、ＴＰＡ遺伝子の
上流にＳＶ４０ウィルスの初期プロモーターがＴＰＡ遺
伝子が発現可能な形で存在しており、動物細胞に導入さ
れた際、ＴＰＡあるいはＴＰＡ誘導体が生産しつるよう
に設計されている。もちろんプロモーターとしてはＳＶ
４０以外にＴＰＡ遺伝子を発現可能なものならなんでも
利用可能であろう。発現ベクターＰＳＶｅＣＰＡ−１を
利用した上記ＴＰＡ誘導体発現ベクターの作成方法につ
いては実施例２に詳細に記した。
（発現ベクターの動物培養細胞への導入とＴＰＡ誘導体
生産細胞の作成） 動物細胞へのＤＮＡの導入法として、トランスフェクシ
ョン効率に差はあるが、リン酸カルシウム法「Ｗｌｇｌ
ｅｒ、Ｍ、ら（１９７７年） セル（Ｃｅｌｌ）１１巻
、２３３頁Ｊ、マイクロインジェクション法（Ａｎｄｅ
ｒｓｏｎ、 ｌ／、Ｆ、ら（１９８９年）プロシーディ
ング オブ ザ ナショナル アカデミーオブ サイエ
ンス ニーニスニー（１’４上）７７巻、５３９９頁〕
リボゾーム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法或いは細胞
融合法（５ｃｈｏｒｒｎｅｒ、Ｗ、ら（１９８０年）プ
ロシーディング オブ ザ ナショナル アカデミ−オ
ブ サイエンス ニーニスニー（同上）７７巻、２１６
３頁〕、電気導入法〔達家雅明ら、（１９８７年）細胞
工学、６巻、４９４頁〕などが利用できる。ＴＰＡ誘導
体発現ベクターを細胞に導入後、適当な選択マーカー遺
伝子によって獲得した形質により形質転換株を得ること
ができる。動物細胞での選択マーカ遺伝子としては、Ｅ
ｃｏｇｐｔ （Ｍｕｌｌｌｇａａｎ、Ｒ，Ｃ，ら（１９
８０年）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） 、 ２０９巻
、１４２２頁） 、 ｎｅｏ （Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、
Ｐ、Ｊ、ら（１９８２年）ジャーナル オブ モレキュ
ラーアンド アプライド ジエネティクス（Ｊｏｕｒｎ
ａｌｏｒ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ＡｐｐＨｅｄ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ） １巻、３２７頁］ 、 ｄｈｆ
’ｒ （Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ、ら（１９８０年）プロシー
ディング オブ ザ ナショナル アカデミ−オブ サ
イエンス ニーニスニー（同上）７７巻、３２７頁〕等
の遺伝子が用いられる。ＴＰＡ誘導体発現ベクターは、
ごれら選択マーカー遺伝子を同一プラスミド内に含んで
いてもあるいは別のプラスミドであっても形質転換株の
取得は可能である。得られた形質転換株がＴＰＡ誘導体
を生産するか否かは、それぞれの形質転換細胞の培養液
に含まれるプラスミノーゲン活性化活性を測定すること
によって決定できる。
生産細胞の作成） 動物細胞へのＤＮＡの導入法として、トランスフェクシ
ョン効率に差はあるが、リン酸カルシウム法「Ｗｌｇｌ
ｅｒ、Ｍ、ら（１９７７年） セル（Ｃｅｌｌ）１１巻
、２３３頁Ｊ、マイクロインジェクション法（Ａｎｄｅ
ｒｓｏｎ、 ｌ／、Ｆ、ら（１９８９年）プロシーディ
ング オブ ザ ナショナル アカデミーオブ サイエ
ンス ニーニスニー（１’４上）７７巻、５３９９頁〕
リボゾーム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法或いは細胞
融合法（５ｃｈｏｒｒｎｅｒ、Ｗ、ら（１９８０年）プ
ロシーディング オブ ザ ナショナル アカデミ−オ
ブ サイエンス ニーニスニー（同上）７７巻、２１６
３頁〕、電気導入法〔達家雅明ら、（１９８７年）細胞
工学、６巻、４９４頁〕などが利用できる。ＴＰＡ誘導
体発現ベクターを細胞に導入後、適当な選択マーカー遺
伝子によって獲得した形質により形質転換株を得ること
ができる。動物細胞での選択マーカ遺伝子としては、Ｅ
ｃｏｇｐｔ （Ｍｕｌｌｌｇａａｎ、Ｒ，Ｃ，ら（１９
８０年）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） 、 ２０９巻
、１４２２頁） 、 ｎｅｏ （Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、
Ｐ、Ｊ、ら（１９８２年）ジャーナル オブ モレキュ
ラーアンド アプライド ジエネティクス（Ｊｏｕｒｎ
ａｌｏｒ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ＡｐｐＨｅｄ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ） １巻、３２７頁］ 、 ｄｈｆ
’ｒ （Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ、ら（１９８０年）プロシー
ディング オブ ザ ナショナル アカデミ−オブ サ
イエンス ニーニスニー（同上）７７巻、３２７頁〕等
の遺伝子が用いられる。ＴＰＡ誘導体発現ベクターは、
ごれら選択マーカー遺伝子を同一プラスミド内に含んで
いてもあるいは別のプラスミドであっても形質転換株の
取得は可能である。得られた形質転換株がＴＰＡ誘導体
を生産するか否かは、それぞれの形質転換細胞の培養液
に含まれるプラスミノーゲン活性化活性を測定すること
によって決定できる。
（ＴＰＡ誘導体の精製）
ＴＰＡ誘導体生産株の培養は、宿主となる動物細胞株に
応じた培養法にて行なうことができる。
応じた培養法にて行なうことができる。
培養上清からのＴＰＡ誘導体の回収精製は、ＣＰＧ１キ
レ−ティング セファロース、Ｃｏｎ−Ａセファロース
、イオン交換体、オクチル セファロース、セファデッ
クスゲルでのクルマドグラフィ、抗体カラムクロマトグ
ラフィーや電気泳動等を用いて行なうことができる。プ
ラスミノーゲン活性化能は、プラスミノーゲン含有フィ
ブリン平板を用いる方法（Ｈａｃｋｌｅ、Ｍ、ら（１９
８１年）ブリティッシュ ジャーナル オプ ヘマトロ
ジ−（Ｂｒｌｔｌｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｒＨｅｍａ
ｔｏｒｏｇｙ） ４７巻、７７頁）やプラスミンの合成
基質Ｓ−２２５１の分解を測定する方法（Ａｌｌｅｎ、
Ｒ，Ａ、とＰｅｐｐｅｒ 、 Ｄ、Ｓ 。
レ−ティング セファロース、Ｃｏｎ−Ａセファロース
、イオン交換体、オクチル セファロース、セファデッ
クスゲルでのクルマドグラフィ、抗体カラムクロマトグ
ラフィーや電気泳動等を用いて行なうことができる。プ
ラスミノーゲン活性化能は、プラスミノーゲン含有フィ
ブリン平板を用いる方法（Ｈａｃｋｌｅ、Ｍ、ら（１９
８１年）ブリティッシュ ジャーナル オプ ヘマトロ
ジ−（Ｂｒｌｔｌｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｒＨｅｍａ
ｔｏｒｏｇｙ） ４７巻、７７頁）やプラスミンの合成
基質Ｓ−２２５１の分解を測定する方法（Ａｌｌｅｎ、
Ｒ，Ａ、とＰｅｐｐｅｒ 、 Ｄ、Ｓ 。
（１９８１年）トロンボシス アンド へモスタシス（
Ｔｈｒｏａ＋ｂｏｓ１ｓ ａｎｄ ｌ１ａｅＩＩｌｏｓ
ｔａｓｌｓ）４５巻、４３頁）ＣＬＴ法（Ｇａｆｆ’ｎ
ｅｙ、Ｐ、Ｔ、とＣｕｒｔＩｓ、Ａ、Ｄ。
Ｔｈｒｏａ＋ｂｏｓ１ｓ ａｎｄ ｌ１ａｅＩＩｌｏｓ
ｔａｓｌｓ）４５巻、４３頁）ＣＬＴ法（Ｇａｆｆ’ｎ
ｅｙ、Ｐ、Ｔ、とＣｕｒｔＩｓ、Ａ、Ｄ。
（１９８５年）トロンボシス アンド へモスタシス（
同上）５３巻、１３４頁）ＥＬＩＳＡ法（ｔｌｏｌｖｏ
ｅｓｔ、Ｔ、ら（１９８５年）トロンボシスアンド へ
モスタシス（同上）５４巻、６８４頁〕によって測定で
きる。
同上）５３巻、１３４頁）ＥＬＩＳＡ法（ｔｌｏｌｖｏ
ｅｓｔ、Ｔ、ら（１９８５年）トロンボシスアンド へ
モスタシス（同上）５４巻、６８４頁〕によって測定で
きる。
（血栓溶解能の評価）
本発明が提示するＴＰＡ誘導体は、血栓の溶解にかかわ
る性質、すなわちフィブリン親和性、酵素活性のフィブ
リン依存性、血中持続性、プラスミノーゲン活性化能、
インビトロ血栓分解能の性質の幾つかにおいて改善され
た性質を持つ。フィブリン親和性は、フィブリンクロッ
トへの取込みを指標とする方法に従って測定することが
できる。
る性質、すなわちフィブリン親和性、酵素活性のフィブ
リン依存性、血中持続性、プラスミノーゲン活性化能、
インビトロ血栓分解能の性質の幾つかにおいて改善され
た性質を持つ。フィブリン親和性は、フィブリンクロッ
トへの取込みを指標とする方法に従って測定することが
できる。
（Ｃｏｌｌｅｎ、Ｄ、 ら（１９８８年）ブラッド（
Ｂｆｏｏｄ）７１巻、２１６頁〕。インビトロ血栓溶解
能は、１２５Ｉ−ブイプリンからの放射“能の遊離を指
標する方法等によって測定することができる。〔Ｌａｒ
−ｓｅｎ＋Ｇ、Ｒ，ら（１９８８年）ザ ジャーナル
オブバイオロジカル ケミストリー（同上）２６３巻、
１０２３頁〕。酵素活性のフィブリン依存性あるいはプ
ラスミノーゲン活性化活性は、プラスミンの合成基質Ｓ
−２２５１を利用するコレンら（Ｃｏｌｌｅｎ、Ｄ、ら
（１９８２年）ザ ジャーナルオブ バイオロジカル
ケミストリー（同上）２５７巻、２９１２頁〕の方法に
て測定することができる。血中持続性に関しては、ベー
ベら［Ｂｅｅｂｅ、Ｄ、Ｐ、ら（１９８６年）トロンボ
シス リサーチ（同上）４３巻、６６３頁〕あるいはマ
ットソンら［Ｍａｔｔｓｏｎ、Ｃｈ、ら（１９８３年）
トロンボシス リサーチ（同上）３０巻、９１頁〕が報
告しており、それらに記載の方法で血中半減期が測定で
きる。
Ｂｆｏｏｄ）７１巻、２１６頁〕。インビトロ血栓溶解
能は、１２５Ｉ−ブイプリンからの放射“能の遊離を指
標する方法等によって測定することができる。〔Ｌａｒ
−ｓｅｎ＋Ｇ、Ｒ，ら（１９８８年）ザ ジャーナル
オブバイオロジカル ケミストリー（同上）２６３巻、
１０２３頁〕。酵素活性のフィブリン依存性あるいはプ
ラスミノーゲン活性化活性は、プラスミンの合成基質Ｓ
−２２５１を利用するコレンら（Ｃｏｌｌｅｎ、Ｄ、ら
（１９８２年）ザ ジャーナルオブ バイオロジカル
ケミストリー（同上）２５７巻、２９１２頁〕の方法に
て測定することができる。血中持続性に関しては、ベー
ベら［Ｂｅｅｂｅ、Ｄ、Ｐ、ら（１９８６年）トロンボ
シス リサーチ（同上）４３巻、６６３頁〕あるいはマ
ットソンら［Ｍａｔｔｓｏｎ、Ｃｈ、ら（１９８３年）
トロンボシス リサーチ（同上）３０巻、９１頁〕が報
告しており、それらに記載の方法で血中半減期が測定で
きる。
生体内における血栓溶解能に影響する因子は、ブイプリ
ン親和性、フィブリンによる活性化、プラスミノーゲン
活性化能、プロテアーゼ抵抗性、阻害剤感受性、血中持
続性など様々である。本発明が提供する新規ＴＰＡ誘導
体は、天然型ＴＰＡに比べて改善されたフィブリン親和
性、プラスミノーゲン活性化能を持ち、天然型ＴＰＡを
上回るインビトロ血栓溶解能を保持している点で、心筋
梗塞等の血栓症の治療に用いることができ、現在試みら
れている治療方法を改善することができる。
ン親和性、フィブリンによる活性化、プラスミノーゲン
活性化能、プロテアーゼ抵抗性、阻害剤感受性、血中持
続性など様々である。本発明が提供する新規ＴＰＡ誘導
体は、天然型ＴＰＡに比べて改善されたフィブリン親和
性、プラスミノーゲン活性化能を持ち、天然型ＴＰＡを
上回るインビトロ血栓溶解能を保持している点で、心筋
梗塞等の血栓症の治療に用いることができ、現在試みら
れている治療方法を改善することができる。
以下に実施例を示すが、本発明に係わる諸実験は、内閣
総理大臣の定める１組換えＤＮＡ実験指針」に従って行
なった。また実施例中のファージプラスミド、ＤＮＡ、
種々の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあげ
る雑誌、底置を参考とした。
総理大臣の定める１組換えＤＮＡ実験指針」に従って行
なった。また実施例中のファージプラスミド、ＤＮＡ、
種々の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあげ
る雑誌、底置を参考とした。
１、蛋白質 核酸 酵素、２６巻、４号、（１９８１年
）臨時増刊 遺伝子操作（載支出版２、遺伝子操作実験
法、高木康敬 編著（１９８０年）講談社 ３、遺伝子操作マニュアル、゛高木康敬 編著（１９８
２年）講談社 ４、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｌｎｇ ａ １
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｔ、ｍａｎｌａｔ
ｌｓ ら編（１９８２年） Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇｌ
ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ５、 Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ １ｎ Ｅｎｚｙｏ＋ｏｌｏｇｙ、６５巻、Ｌ、Ｇ
ｒｏｓｓｍａａ＋ら編（１９８０年） ＡｃａｄｅｌＩ
ｌｉｃ Ｐｒｅｓｓ６、 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８巻、Ｒ，Ｗｕ編（１９７９年）
＾ｃａｄｅａ＋Ｉｃ Ｐｒｅｓｓ実施例１ ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅｃＰＡ−Ｌの作成ＴＰＡ発
現ベクターｐｓＶｅｃＰＡ−１は以下に記述するステッ
プを経て作成した。
）臨時増刊 遺伝子操作（載支出版２、遺伝子操作実験
法、高木康敬 編著（１９８０年）講談社 ３、遺伝子操作マニュアル、゛高木康敬 編著（１９８
２年）講談社 ４、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｌｎｇ ａ １
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｔ、ｍａｎｌａｔ
ｌｓ ら編（１９８２年） Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇｌ
ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ５、 Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ １ｎ Ｅｎｚｙｏ＋ｏｌｏｇｙ、６５巻、Ｌ、Ｇ
ｒｏｓｓｍａａ＋ら編（１９８０年） ＡｃａｄｅｌＩ
ｌｉｃ Ｐｒｅｓｓ６、 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８巻、Ｒ，Ｗｕ編（１９７９年）
＾ｃａｄｅａ＋Ｉｃ Ｐｒｅｓｓ実施例１ ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅｃＰＡ−Ｌの作成ＴＰＡ発
現ベクターｐｓＶｅｃＰＡ−１は以下に記述するステッ
プを経て作成した。
（１）ＴＰＡのｃＤＮＡクローンｐＣＨ７９の作成
まず、染色体ＤＮＡ利用ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅｃ
ＰＡ−１（特開昭６２−１４７８３）を導入したＣｌｌ
０−Ｋｌ細胞から、既知のグアニジン−ホットフェノー
ル法に準じ、トータルＲＮＡを抽出した。
ＰＡ−１（特開昭６２−１４７８３）を導入したＣｌｌ
０−Ｋｌ細胞から、既知のグアニジン−ホットフェノー
ル法に準じ、トータルＲＮＡを抽出した。
次に、オリゴｄＴセルロースクロマトグラフィーにより
、ポリＡ ｍＲＮＡを調製し、ショ糖濃度勾配遠心法
によって分子量分画してＴＰＡのｍＲＮＡを含む画分を
得た。市販のｃＤＮＡ合或キブト（アマジャム社製）に
この画分を供してｃＤＮＡを合成し、市販のλｇｔｌＯ
利用ｃＤＮＡクロニングキット（アマシャク社製）を用
いて、ＣＤＮＡライブラリーを作成した。このライブラ
リーに対して、ｐＳＶｅＣＰ＾−１を制限酵素Ｘｂａｌ
で切断、単離した第１０．１１及び１２エクソンを含む
約２．５ｋｂの断片をプローブとして用い、通常の方法
でプラークハイプリダイゼイションを行なって陽性ファ
ージを選択した。得られた陽性ファージＤＮＡを調製し
、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造（株）製）で消化後
アガロースゲル電気泳動を行なって、クローニングに用
いたと同じＸｂａｌｌ、 ２ 、５ ｋ ｂ断片をプロ
ーブとしてサザンハイプリダイゼイション法により解析
した。その結果、Ｃｌ７つと名ずけたクローンには、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩで約２．２ｋｂに切断されるプローブ陽性
の断片が含まれていることが分かった。このＨｉｎｄｌ
ｌＩ約２．２ｋｂ断片をアガロースゲル電気泳動法にて
単離後、同じ＜Ｈｉｎｄｍで消化したｐＵｃ１９ （宝
酒造（株）製〕とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結後、
Ｅ、ｃｏｌｌ ＤＩｒＬに導入してｐＣＨ７９を作成し
た。このｐＣＨ７９のｃＤＮＡ部分の塩基配列をＭ１３
法を利用した市販のキット〔宝酒造（株）製〕にて決定
した。５′末端に存在する発現ベクター由来のＨｉｎｄ
ｍ認識部位より約１５０ｂｐ下流にＢｇｌ■の認識部位
が存在し、塩基配列はその下流的１５００ｂｐの終止コ
ドンＴＧＡまでｂｐ５８４のＣがＴ及びｂｐｌ ７２５
のＡがＣであった以外は、ペニカら（Ｐｅｎｎ１ｃａ、
Ｄら（１９８３年）ネイチャー （Ｎａｔｕｒｅ）
３０１巻、２１４頁〕が報告した塩基配列と一致してお
り、さらに、ＴＧＡコドンから約４１０塩基下流には発
現ベクターに由来するＨｉｎｄｍ部位が存在していた。
、ポリＡ ｍＲＮＡを調製し、ショ糖濃度勾配遠心法
によって分子量分画してＴＰＡのｍＲＮＡを含む画分を
得た。市販のｃＤＮＡ合或キブト（アマジャム社製）に
この画分を供してｃＤＮＡを合成し、市販のλｇｔｌＯ
利用ｃＤＮＡクロニングキット（アマシャク社製）を用
いて、ＣＤＮＡライブラリーを作成した。このライブラ
リーに対して、ｐＳＶｅＣＰ＾−１を制限酵素Ｘｂａｌ
で切断、単離した第１０．１１及び１２エクソンを含む
約２．５ｋｂの断片をプローブとして用い、通常の方法
でプラークハイプリダイゼイションを行なって陽性ファ
ージを選択した。得られた陽性ファージＤＮＡを調製し
、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造（株）製）で消化後
アガロースゲル電気泳動を行なって、クローニングに用
いたと同じＸｂａｌｌ、 ２ 、５ ｋ ｂ断片をプロ
ーブとしてサザンハイプリダイゼイション法により解析
した。その結果、Ｃｌ７つと名ずけたクローンには、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩで約２．２ｋｂに切断されるプローブ陽性
の断片が含まれていることが分かった。このＨｉｎｄｌ
ｌＩ約２．２ｋｂ断片をアガロースゲル電気泳動法にて
単離後、同じ＜Ｈｉｎｄｍで消化したｐＵｃ１９ （宝
酒造（株）製〕とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結後、
Ｅ、ｃｏｌｌ ＤＩｒＬに導入してｐＣＨ７９を作成し
た。このｐＣＨ７９のｃＤＮＡ部分の塩基配列をＭ１３
法を利用した市販のキット〔宝酒造（株）製〕にて決定
した。５′末端に存在する発現ベクター由来のＨｉｎｄ
ｍ認識部位より約１５０ｂｐ下流にＢｇｌ■の認識部位
が存在し、塩基配列はその下流的１５００ｂｐの終止コ
ドンＴＧＡまでｂｐ５８４のＣがＴ及びｂｐｌ ７２５
のＡがＣであった以外は、ペニカら（Ｐｅｎｎ１ｃａ、
Ｄら（１９８３年）ネイチャー （Ｎａｔｕｒｅ）
３０１巻、２１４頁〕が報告した塩基配列と一致してお
り、さらに、ＴＧＡコドンから約４１０塩基下流には発
現ベクターに由来するＨｉｎｄｍ部位が存在していた。
（２）ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅｃＰＡ−１の作成ｐ
ｓＶｅｃＰ＾−１は、第１図に示した手順により作成し
た。 ｐｓＶｅｓａｌｌ （特開昭６２−１．４７８３
＞を制限酵素Ｎｃｏｌ（宝酒造（株）製）で切断後、
大腸菌内での複製起点およびアンピシリン耐性を付与す
る約４．７ｋｂ断片を単離し、さらにＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造（株）製）を用いて環状化後、Ｅ、ｃｏｌｆ
Ｄ旧に導入してＰＳＶｅＳａｌｌ −Ｈｉ ｎ ｄ
ｍを作成した。従って、このベクターはＨｉｎｄｍ認識
部位をはさんでＳＶ４０の複製起点を含む初期プロモー
ター領域とＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含む配
列がそれぞれ存在している。次に、ｐＳＶｅＳａｌｌ
−Ｈｉ ｎ ｄ Ｉ［ＩをＨｉｎｄｍにて切断後、ｐｓ
ＶｅｃＰＡ−１をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩ（宝酒
造（株）製）で切断、単離して得たＴＰＡ染色体ＤＮＡ
の全第２エクソンと第３エクソンの一部を含む約１．９
ｋｂ断片と、ｐＣＨ７９を）ｉｉｎｄｍ及びＢｇｌＩＩ
で切断したＴＰＡｃＤＮＡを含む約２ｋｂ断片とをＴ４
ＤＮＡリガーゼにて連結後、 Ｅ、ｃｏｌｉＤ旧に導入
してｐｓＶｅｃＰＡ−１を作成した。このＴＰＡ発現ベ
クターｐｓＶｅｃＰ＾−ｔは、第２エクソンから第３エ
クソンのＢｇｌＩ［認識部位までが染色体ＤＮＡ由来で
あり、それ以降がｃＤＮＡより成り、天然型のＴＰＡを
発現する遺伝子をコードしている。
ｓＶｅｃＰ＾−１は、第１図に示した手順により作成し
た。 ｐｓＶｅｓａｌｌ （特開昭６２−１．４７８３
＞を制限酵素Ｎｃｏｌ（宝酒造（株）製）で切断後、
大腸菌内での複製起点およびアンピシリン耐性を付与す
る約４．７ｋｂ断片を単離し、さらにＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造（株）製）を用いて環状化後、Ｅ、ｃｏｌｆ
Ｄ旧に導入してＰＳＶｅＳａｌｌ −Ｈｉ ｎ ｄ
ｍを作成した。従って、このベクターはＨｉｎｄｍ認識
部位をはさんでＳＶ４０の複製起点を含む初期プロモー
ター領域とＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含む配
列がそれぞれ存在している。次に、ｐＳＶｅＳａｌｌ
−Ｈｉ ｎ ｄ Ｉ［ＩをＨｉｎｄｍにて切断後、ｐｓ
ＶｅｃＰＡ−１をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩ（宝酒
造（株）製）で切断、単離して得たＴＰＡ染色体ＤＮＡ
の全第２エクソンと第３エクソンの一部を含む約１．９
ｋｂ断片と、ｐＣＨ７９を）ｉｉｎｄｍ及びＢｇｌＩＩ
で切断したＴＰＡｃＤＮＡを含む約２ｋｂ断片とをＴ４
ＤＮＡリガーゼにて連結後、 Ｅ、ｃｏｌｉＤ旧に導入
してｐｓＶｅｃＰＡ−１を作成した。このＴＰＡ発現ベ
クターｐｓＶｅｃＰ＾−ｔは、第２エクソンから第３エ
クソンのＢｇｌＩ［認識部位までが染色体ＤＮＡ由来で
あり、それ以降がｃＤＮＡより成り、天然型のＴＰＡを
発現する遺伝子をコードしている。
実施例２
ＴＰＡ誘導体発現ベクターｐｓｃＫＭ−２及びｐＳＣＫ
Ｍ−４の作製 （１）変異導入ベクターＭ１３−ＮＳの作製クリングル
１領域にアミノ酸置換を導入するための第一ステップと
して、まず変異導入ベクターの作製を行なった。発現ベ
クターｐＳＶｅＣＰＡ−１を制限酵素Ｎａｒｌにューイ
ングランド バイオラボ社製造）とＳｍａｌ（宝酒造（
株）製）で切断し、アガロース電気泳動によって、約ｔ
、ｔｋｂの断片を分離した。また、Ｍ１３ｍｐＨ（宝酒
造（株））を制限酵素ＮａｒｌとＳｍａ １で切断した
。これらの約１．１ｋｂの断片とＭ１３ｍｐＨを、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼにて連結後、Ｅ、ｃｏｌ １ＤＨ１に導
入してＭｌ３−ＮＳを作製した。この変異導入ベクター
Ｍ１３−ＮＳは、ＴＰＡのクリングル１領域にあるアミ
ノ酸１１０番目のグリシンから、プロテアーゼ領域にあ
るアミノ酸５０８番目のプロリンに相当するｃＤＮＡを
コードしている。
Ｍ−４の作製 （１）変異導入ベクターＭ１３−ＮＳの作製クリングル
１領域にアミノ酸置換を導入するための第一ステップと
して、まず変異導入ベクターの作製を行なった。発現ベ
クターｐＳＶｅＣＰＡ−１を制限酵素Ｎａｒｌにューイ
ングランド バイオラボ社製造）とＳｍａｌ（宝酒造（
株）製）で切断し、アガロース電気泳動によって、約ｔ
、ｔｋｂの断片を分離した。また、Ｍ１３ｍｐＨ（宝酒
造（株））を制限酵素ＮａｒｌとＳｍａ １で切断した
。これらの約１．１ｋｂの断片とＭ１３ｍｐＨを、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼにて連結後、Ｅ、ｃｏｌ １ＤＨ１に導
入してＭｌ３−ＮＳを作製した。この変異導入ベクター
Ｍ１３−ＮＳは、ＴＰＡのクリングル１領域にあるアミ
ノ酸１１０番目のグリシンから、プロテアーゼ領域にあ
るアミノ酸５０８番目のプロリンに相当するｃＤＮＡを
コードしている。
（２）部位特異的アミノ酸置換反応
クリングル１領域にアミノ酸置換を導入するため、まず
変異導入ベクターＭ１Ｂ−ＮＳより一本鎖のＤＮＡを調
製した。そして次に、部位特異的アミノ酸置換反応に用
いる合成ＤＮＡプローブとして、 （ａ ） ５’ −ＴＴＣＴＧＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣ
ＡＴＧＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＴＣＧＧ
Ｃ−３’ 及び （、ｂ ） ５’ −ＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＣＴＣＣ
ＣＡＧＣＴＧＴＡＣＣＴＣＣＴＣＧＣＣＴＴ＾ＡＡＧＡ
ＣＧ−３’ の配列を持つものを作製した、この合成ＤＮＡプローブ
を用いることにより、（ａ）アミノ酸１１５番目のアス
パラギンと１１９番目のセリンを、それぞれプロリンと
メチオニンに、及び（ｂ）アミノ酸１６１番目のグリシ
ン、１６２番目のリジン、及び１６５番目のセリンを、
それぞれアルギニン、アルギニン、及びトリプトファン
に置換することができる。この合成りＮＡプローブのＮ
末端を、Ｔ４ポリヌクレオチド キナーゼ（宝酒造（株
）製）を用いてリン酸化した。
変異導入ベクターＭ１Ｂ−ＮＳより一本鎖のＤＮＡを調
製した。そして次に、部位特異的アミノ酸置換反応に用
いる合成ＤＮＡプローブとして、 （ａ ） ５’ −ＴＴＣＴＧＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣ
ＡＴＧＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＴＣＧＧ
Ｃ−３’ 及び （、ｂ ） ５’ −ＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＣＴＣＣ
ＣＡＧＣＴＧＴＡＣＣＴＣＣＴＣＧＣＣＴＴ＾ＡＡＧＡ
ＣＧ−３’ の配列を持つものを作製した、この合成ＤＮＡプローブ
を用いることにより、（ａ）アミノ酸１１５番目のアス
パラギンと１１９番目のセリンを、それぞれプロリンと
メチオニンに、及び（ｂ）アミノ酸１６１番目のグリシ
ン、１６２番目のリジン、及び１６５番目のセリンを、
それぞれアルギニン、アルギニン、及びトリプトファン
に置換することができる。この合成りＮＡプローブのＮ
末端を、Ｔ４ポリヌクレオチド キナーゼ（宝酒造（株
）製）を用いてリン酸化した。
調製したＭｌ ３−ＮＳの１本鎖ＤＮＡと変異用合成り
ＮＡプローブより、市販のインビトロ変異システム キ
ット（アマジャム社製）を用いて部位特異的変異反応を
行ない、Ｅ、ｃｏｌｉ ＴＧＩに導入してＭｌ ３−Ｎ
５Ｍ２、及びＭｌ３−Ｎ３Ｍ４を作製した。このＭｌ３
−Ｎ８Ｍ２、及びＭｌ ３−Ｎ５Ｍ４より１本鎖ＤＮＡ
を調製し、ＭｌＢを利用した市販のキット（同上）を用
いて変異の確認を行なったところ、（ａ）アミノ酸１１
５番目のアスパラギンと１１９番目のセリンに対応する
ＤＮＡ配列−ＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣ−が、そ
れぞれプロリン及びメチオニンに対応する一ＣＣＣＴＧ
ＧＡＡＣＡＧＣＡＴＧ−に、そして（ｂ）アミノ酸１６
１番目のグリシン、１６２番目のリジン、及び１６５番
目のセリンに対応するＤＮＡ配列−ＧＧＧ＾＾ＧＴＡＣ
ＡＧＣＴＣＡ−が、それぞれアルギニン、アルギニン、
及びトリプトファンに対応するーＡＧＧＡＧＧＴＡＣＡ
ＧＣＴＧＧ−に変異していることが確認できた。
ＮＡプローブより、市販のインビトロ変異システム キ
ット（アマジャム社製）を用いて部位特異的変異反応を
行ない、Ｅ、ｃｏｌｉ ＴＧＩに導入してＭｌ ３−Ｎ
５Ｍ２、及びＭｌ３−Ｎ３Ｍ４を作製した。このＭｌ３
−Ｎ８Ｍ２、及びＭｌ ３−Ｎ５Ｍ４より１本鎖ＤＮＡ
を調製し、ＭｌＢを利用した市販のキット（同上）を用
いて変異の確認を行なったところ、（ａ）アミノ酸１１
５番目のアスパラギンと１１９番目のセリンに対応する
ＤＮＡ配列−ＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣ−が、そ
れぞれプロリン及びメチオニンに対応する一ＣＣＣＴＧ
ＧＡＡＣＡＧＣＡＴＧ−に、そして（ｂ）アミノ酸１６
１番目のグリシン、１６２番目のリジン、及び１６５番
目のセリンに対応するＤＮＡ配列−ＧＧＧ＾＾ＧＴＡＣ
ＡＧＣＴＣＡ−が、それぞれアルギニン、アルギニン、
及びトリプトファンに対応するーＡＧＧＡＧＧＴＡＣＡ
ＧＣＴＧＧ−に変異していることが確認できた。
（３）ＴＰＡ誘導体発現ベクターｐＳＣＫＭ−２、及び
ｐｓｃＫＭ−４の作製 ＴＰＡ誘導体発現ベクターｐｓｃＫＭ−２、及びｐＳＣ
ＫＭ−４の作製は、以下の手順に従って行なった。まず
、Ｍｌ Ｂ−Ｎ８Ｍ２及びＭｌ３−Ｎ３Ｍ４を制限酵素
ＮａｒｌとＳｍａ １で切断し、アガロース電気泳動に
よって、約１．ｌｋｂの断片を分離した。
ｐｓｃＫＭ−４の作製 ＴＰＡ誘導体発現ベクターｐｓｃＫＭ−２、及びｐＳＣ
ＫＭ−４の作製は、以下の手順に従って行なった。まず
、Ｍｌ Ｂ−Ｎ８Ｍ２及びＭｌ３−Ｎ３Ｍ４を制限酵素
ＮａｒｌとＳｍａ １で切断し、アガロース電気泳動に
よって、約１．ｌｋｂの断片を分離した。
次に、ｐｓＶｅｃＰＡ−１を制限酵素ＮａｒｌとＳｍａ
１で切断し、アガロース電気泳動によって、約７ｋｂ
の断片を分離した。そして、これらの両断片をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼによって連結後１、Ｅ、ｃｏｌｌに導人して
ｐｓｃＫＭ−２、及びｐｓｃＫＭ−４を作製した。
１で切断し、アガロース電気泳動によって、約７ｋｂ
の断片を分離した。そして、これらの両断片をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼによって連結後１、Ｅ、ｃｏｌｌに導人して
ｐｓｃＫＭ−２、及びｐｓｃＫＭ−４を作製した。
実施例３
マーカーベクターｐｓＶ２ｎｅｏ−ｄｈｆｒの作成ｐｓ
Ｖ２ｎｅｏ−ｄｈｆ’ｒは以下の手順で作成した。ｐｓ
Ｖ２ｄｈｒｒ（アメリカン タイプカルチャーコレクシ
ョン ｒＤＮＡＶｅｃｔｏｒｓ ８７１４Ｂ）を制限酵
素ＰｖｕＩＩ（宝酒造（株）製）で切断し、そこにＢａ
ｍｔｌｌ リンカ−ｄ （ｐＣＧＧＡＴＣＣＧ） （
宝酒造（株）製）をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結後Ｅ、ｃ
ｏｌｌＤｌ（ｌに導入してｐｓＶ２−ｄｈｒｒを作成し
た。ｐｓＶ２Ｂｄｈｌ’ｒをＢａｍＨｌで消化して得ら
れるｄｈｆｒ遺伝子を含む約２ｋｂの断片をアガロース
電気泳動法により調製し、ｐｓＶ２ｎｅｏ（アメリカン
タイプカルチャー コレクション ｒＤＮＡ Ｖｅｃ
ｔｏｒｓ ３７１４９）をＢａｍＨｌ （宝酒造（株）
製）で切断したｃＤＮＡとをＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て環状化後、Ｅ、ｃｏｌｉＤｔｌｌに導入し、ｎｅｏと
ｄｈｆｒ遺伝子が同発現方向に挿入されたｐｓＶ２ｎｅ
ｏ−ｄｈｆ’ｒを作成した。
Ｖ２ｎｅｏ−ｄｈｆ’ｒは以下の手順で作成した。ｐｓ
Ｖ２ｄｈｒｒ（アメリカン タイプカルチャーコレクシ
ョン ｒＤＮＡＶｅｃｔｏｒｓ ８７１４Ｂ）を制限酵
素ＰｖｕＩＩ（宝酒造（株）製）で切断し、そこにＢａ
ｍｔｌｌ リンカ−ｄ （ｐＣＧＧＡＴＣＣＧ） （
宝酒造（株）製）をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結後Ｅ、ｃ
ｏｌｌＤｌ（ｌに導入してｐｓＶ２−ｄｈｒｒを作成し
た。ｐｓＶ２Ｂｄｈｌ’ｒをＢａｍＨｌで消化して得ら
れるｄｈｆｒ遺伝子を含む約２ｋｂの断片をアガロース
電気泳動法により調製し、ｐｓＶ２ｎｅｏ（アメリカン
タイプカルチャー コレクション ｒＤＮＡ Ｖｅｃ
ｔｏｒｓ ３７１４９）をＢａｍＨｌ （宝酒造（株）
製）で切断したｃＤＮＡとをＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て環状化後、Ｅ、ｃｏｌｉＤｔｌｌに導入し、ｎｅｏと
ｄｈｆｒ遺伝子が同発現方向に挿入されたｐｓＶ２ｎｅ
ｏ−ｄｈｆ’ｒを作成した。
実施例４
ＴＰＡ発現ベクターの動物培養細胞への導入とＴＰＡの
生産 ＴＰＡ発現ベクターｐｓｃＫＭ−２及びｐＳＣＫＭ−４
をＣＨＯ−Ｋｌ （ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−６１＞を宿主と
して、チェノら（Ｃｈｅｎ、Ｃ，ａｎｄ Ｏｋａｙａｍ
ａ、Ｈ，ら（１９８７年）モレキュラー アンド セル
ラー バイオロジー（Ｈｏｔｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃ
ｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）７巻、２７４５頁〕
の方法に準じて形質転換を行なった。即ち、プラスミド
〔ＴＰＡ発現ベクター ｐｓｃＫＭ−２又ハｐＳＣＫＭ
−４：ｐＳＶ２ｎｅｏ−ｄｈｆｒ−１０：１ （重量
比）〕−リン酸カルシウム共沈澱物を予め５％牛脂児血
清（Ｆ ＣＳ’）含むＭＤ培地（ＭＣＤＢ３（１２：ダ
ルベツコ変法ＭＥＭ−１：１、シグマ）で生育させた細
胞（２Ｘ１０５細胞／１０ｍ１培地／直径１０（２）培
養皿）に加え、１５時間後に培地を洗浄して更新した。
生産 ＴＰＡ発現ベクターｐｓｃＫＭ−２及びｐＳＣＫＭ−４
をＣＨＯ−Ｋｌ （ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−６１＞を宿主と
して、チェノら（Ｃｈｅｎ、Ｃ，ａｎｄ Ｏｋａｙａｍ
ａ、Ｈ，ら（１９８７年）モレキュラー アンド セル
ラー バイオロジー（Ｈｏｔｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃ
ｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）７巻、２７４５頁〕
の方法に準じて形質転換を行なった。即ち、プラスミド
〔ＴＰＡ発現ベクター ｐｓｃＫＭ−２又ハｐＳＣＫＭ
−４：ｐＳＶ２ｎｅｏ−ｄｈｆｒ−１０：１ （重量
比）〕−リン酸カルシウム共沈澱物を予め５％牛脂児血
清（Ｆ ＣＳ’）含むＭＤ培地（ＭＣＤＢ３（１２：ダ
ルベツコ変法ＭＥＭ−１：１、シグマ）で生育させた細
胞（２Ｘ１０５細胞／１０ｍ１培地／直径１０（２）培
養皿）に加え、１５時間後に培地を洗浄して更新した。
さらに４８時間、培地を８００μｇ／ｍ１０４１８硫酸
塩（ギブコ）、７ｆｆ１Ｍ ε−アミノカプロン酸、５
０μＭフォイバン（小野薬品工業）を含むＭＤ培地に変
え、さらに約２週間培養を続けＧ４１８耐性株を分離し
た。６４１８耐性株を２４穴マルチデイツシユ（コーニ
ング社製）の底面全体に生育させ、上記培地で２４時間
培養し、これらの発現ベクターによって生産される変異
型ＴＰＡ、それぞれＫＭ−２，ＫＭ−４の活性をプラス
ミノーゲン含有フィブリン平板を用いて測定した（ Ｈ
ａｃｋｌｅ、Ｍら（１９８１年）ブリティッシュ ジャ
ーナルオブ ヘマトロジ−（Ｂｒｆｔｌｓｈ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ ｌ１ｅｔｔｒａｔｏ＋ｏｇｙ） ４７巻
、７７頁〕。
塩（ギブコ）、７ｆｆ１Ｍ ε−アミノカプロン酸、５
０μＭフォイバン（小野薬品工業）を含むＭＤ培地に変
え、さらに約２週間培養を続けＧ４１８耐性株を分離し
た。６４１８耐性株を２４穴マルチデイツシユ（コーニ
ング社製）の底面全体に生育させ、上記培地で２４時間
培養し、これらの発現ベクターによって生産される変異
型ＴＰＡ、それぞれＫＭ−２，ＫＭ−４の活性をプラス
ミノーゲン含有フィブリン平板を用いて測定した（ Ｈ
ａｃｋｌｅ、Ｍら（１９８１年）ブリティッシュ ジャ
ーナルオブ ヘマトロジ−（Ｂｒｆｔｌｓｈ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ ｌ１ｅｔｔｒａｔｏ＋ｏｇｙ） ４７巻
、７７頁〕。
実施例５
形質転換株のメソトレキセート（Ｍｔｘ）による選択及
び培養 実施例４で得たｐｓｃＫＭ−２又はｐｓｃＫＭ−４の形
質転換株を直径１０ｃｌＩ＋の培養皿に１×１０３から
１×１０５ｍ（７）細胞を植え１１００ｎから１ｏｏｏ
ｎＭのＭ ｔ ｘを含むＭＤ培地で約２週間培養を続け
、Ｍｔｘに対して耐性を示す株を分離した。これらの耐
性株が２４時間あたり生産するＫＭ−２の量を実施例４
に示した様にブイプリン平板法にて測定した。表−１に
は実施例４および５で得られたＫＭ−２又はＫＭ−４の
生産株芯及びその力価を示した。Ｍ ｔ ｘで選択した
細胞からは親株よりも高いＴＰＡ生産性を示す株が得ら
れた。また、これらの細胞はＭＤ無血清培地（ＭＤ培地
、７ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５０μＭフォイバ
ン １ｍｇ／ｉｆ牛血清アルブミン ５μｇ／ｍｌイン
シュリン）においてもＴＰＡを生産した。
び培養 実施例４で得たｐｓｃＫＭ−２又はｐｓｃＫＭ−４の形
質転換株を直径１０ｃｌＩ＋の培養皿に１×１０３から
１×１０５ｍ（７）細胞を植え１１００ｎから１ｏｏｏ
ｎＭのＭ ｔ ｘを含むＭＤ培地で約２週間培養を続け
、Ｍｔｘに対して耐性を示す株を分離した。これらの耐
性株が２４時間あたり生産するＫＭ−２の量を実施例４
に示した様にブイプリン平板法にて測定した。表−１に
は実施例４および５で得られたＫＭ−２又はＫＭ−４の
生産株芯及びその力価を示した。Ｍ ｔ ｘで選択した
細胞からは親株よりも高いＴＰＡ生産性を示す株が得ら
れた。また、これらの細胞はＭＤ無血清培地（ＭＤ培地
、７ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５０μＭフォイバ
ン １ｍｇ／ｉｆ牛血清アルブミン ５μｇ／ｍｌイン
シュリン）においてもＴＰＡを生産した。
表１
ＫＭ
２及びＫＭ
４生産株
株
名
ＴＰＡ力価
〔μｇ／ｍｌ〕
Ｍ ｔ ｘ濃度
（ｎＭ）
（ＫＭ−２生産株）
ＫＭ−２００４
ＫＭ−２００５
ＫＭ−２００６
ＫＭ−２００９
ＫＭ−２０１０
ＫＭ−２０１２
ＫＭ−２０１３
ＫＭ−２０１４
ＫＭ−２０１５
ＫＭ−２１００
ＫＭ−２１０１
ＫＭ−２１０２
ＫＭ−２８００
ＫＭ−２６０１
ＫＭ −２ｆｆ０３
０．２２
０．１８
０．１６
０．１６
０．２４
０．１８
０．１０
０、（６
０、（９
１，００
０，４０
０，４４
（，６０
０，９５
０，３８
００
００
００
００
００
００
（ＫＭ−４生産株）
ＫＭ−４００３
ＫＭ−４００４
ＫＭ−４００５
ＫＭ−４００６
ＫＭ−４００７
ＫＭ−４０１２
ＫＭ−４０１３
ＫＭ−４０１４
ＫＭ−４０１５
ＫＭ−４１０１
ＫＭ−４１０２
ＫＭ−４ｔｏ ３
ＫＭ−４１０４
ＫＭ−４１０５
ＫＭ−４１０６
ＫＭ−４１０９
ＫＭ−４８０１
ＫＭ−４８０５
ＫＭ−４８０８
０，５５
０，３０
０，８０
０，２２
０，１７
０、Ｉ４
０．１８
０．２５
０．１８
０．３２
０．２５
０．２９
０．８５
１．２０
１．３０
０．５３
０．８０
０゜９０
０．９０
００
ｔｏ ０
００
００
００
００
００
００
００
００
実施例６
ＫＭ−２およびＫＭ−４の回収、精製
以下にＴＰＡ誘導体ＫＭ−２及びＫＭ−４の回収、精製
の工程を示す。工程途中のＴＰＡ抗原の検出には、市販
のＥＬＩＳＡキット（ＩＭＵＢＩＮＤＴＰＡ ＥＬＩＳ
Ａ ＫＩＴ、アメリカンダイグツステイカ社製）を用い
た。ＫＭ−２６０１株またはＫＭ−４８０１を実施例５
で示したＭＤ無血清培地にて培養し、ＫＭ−２またはＫ
Ｍ−４を含む培養液を、ＩＮＮａｃｔ、５０μＭフォイ
パンを含む２０＋Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて平
衡化したＣＰＧ−１０（エレクトロヌクレオニクス社製
）カラムにチャージし、平衡化に用いたと同じ緩衝液に
て洗浄した。
の工程を示す。工程途中のＴＰＡ抗原の検出には、市販
のＥＬＩＳＡキット（ＩＭＵＢＩＮＤＴＰＡ ＥＬＩＳ
Ａ ＫＩＴ、アメリカンダイグツステイカ社製）を用い
た。ＫＭ−２６０１株またはＫＭ−４８０１を実施例５
で示したＭＤ無血清培地にて培養し、ＫＭ−２またはＫ
Ｍ−４を含む培養液を、ＩＮＮａｃｔ、５０μＭフォイ
パンを含む２０＋Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて平
衡化したＣＰＧ−１０（エレクトロヌクレオニクス社製
）カラムにチャージし、平衡化に用いたと同じ緩衝液に
て洗浄した。
ＣＰＧ−１０カラムを通過した培養液および洗浄液中に
ＫＭ−２又はＫＭ−４はほとんど検出されなかった。Ｃ
ＰＧ−１０カラムよりＫＭ−２及びＫＭ−４をＬＭ Ｎ
ａＣＩ、 ０．５Ｍ ＫＳＣＮ、 Ｉ Ｍε−アミ
ノカプロン酸および５０μＭフォイパンを含む２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて溶出した。
ＫＭ−２又はＫＭ−４はほとんど検出されなかった。Ｃ
ＰＧ−１０カラムよりＫＭ−２及びＫＭ−４をＬＭ Ｎ
ａＣＩ、 ０．５Ｍ ＫＳＣＮ、 Ｉ Ｍε−アミ
ノカプロン酸および５０μＭフォイパンを含む２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて溶出した。
溶出液をそのままＩＭＮａＣｌ、 ０．０１％Ｔｖｅ
ｅｎ８０および５０ｕＭフォイバンを含む２０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて平衡化したＣｏｎＡ−８ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）カラムにチャージ
した。平衡化に用いたと同じ緩衝液にて洗浄後、２ＭＫ
ＳＣＮ 、 ０．４Ｍα−メチルマンノシド、 ０
．０１％Ｔｖｅｅｎ８０および５０μＭフォイパンを含
む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて溶出した。
ｅｎ８０および５０ｕＭフォイバンを含む２０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて平衡化したＣｏｎＡ−８ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）カラムにチャージ
した。平衡化に用いたと同じ緩衝液にて洗浄後、２ＭＫ
ＳＣＮ 、 ０．４Ｍα−メチルマンノシド、 ０
．０１％Ｔｖｅｅｎ８０および５０μＭフォイパンを含
む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて溶出した。
ＥＬＩＳＡを利用してＣｏｎＡ ５ｅｐｈａｒｏｓｅの
通過培養液、洗浄液および溶出液中に含まれるＴＰＡ抗
原を検出したところ、ＫＭ−２及びＫＭ−４はほとんど
ＣｏｎＡ ５６ｐｌＨｒｏｓｅに吸着し、溶出回収され
ていることが分かった。
通過培養液、洗浄液および溶出液中に含まれるＴＰＡ抗
原を検出したところ、ＫＭ−２及びＫＭ−４はほとんど
ＣｏｎＡ ５６ｐｌＨｒｏｓｅに吸着し、溶出回収され
ていることが分かった。
同溶出液に含まれるＴＰＡ蛋白質をＥＬ Ｉ ＳＡ法に
て測定したところ、ＫＭ−２及びＫＭ−４はＫＭ−２６
０１株、ＫＭ−４８０１株の培養成約５、ＯＬ 、約６
．ＯＬより、それぞれ１２．３Ｂ及び４．ｌｆｆ１ｇが
回収、精製されていることが分かった。
て測定したところ、ＫＭ−２及びＫＭ−４はＫＭ−２６
０１株、ＫＭ−４８０１株の培養成約５、ＯＬ 、約６
．ＯＬより、それぞれ１２．３Ｂ及び４．ｌｆｆ１ｇが
回収、精製されていることが分かった。
実施例フ
インビトロでのフィブリン親和性
ＫＭ−２及びＫＭ−４のインビトロでのフィブリン親和
性を、コレンら（同上）の方法によって測定した。５０
ｏ＋Ｍ Ｔｒｌｓ ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、０．０３
８Ｍ Ｎ ａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０． １ｏ
＋ｇ／ｍｌ ＢＳＡ、 ０．１μｇ／ｍｌＴ Ｐ Ａ
とし、ヒト フィブリノーゲンを０、ＯＬｍｇ／ａｔ
〜４ ｌａｇ／ｉｆとなる様に変化させ、ヒト−トロン
ビンを２０ ＮＩＨｕｎｌｔｓ／ｉｆとなる様に添加し
て室温で１０分間装いた。そして、１５．ｏｏＯｒｐａ
＋３分間遠心分離して、上清を分離した。その活性をＳ
−２２５１を用いた方法で測定し、結果を第２図にまと
めた。ＫＭ−４は天然型ＴＰＡと同程度のフィブリン親
和性を示したが、ＫＭ−２は天然型ＴＰＡよりも遥かに
強力゛なインビトロでのフィブリン親和性をもっている
ことが分かった。
性を、コレンら（同上）の方法によって測定した。５０
ｏ＋Ｍ Ｔｒｌｓ ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、０．０３
８Ｍ Ｎ ａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０． １ｏ
＋ｇ／ｍｌ ＢＳＡ、 ０．１μｇ／ｍｌＴ Ｐ Ａ
とし、ヒト フィブリノーゲンを０、ＯＬｍｇ／ａｔ
〜４ ｌａｇ／ｉｆとなる様に変化させ、ヒト−トロン
ビンを２０ ＮＩＨｕｎｌｔｓ／ｉｆとなる様に添加し
て室温で１０分間装いた。そして、１５．ｏｏＯｒｐａ
＋３分間遠心分離して、上清を分離した。その活性をＳ
−２２５１を用いた方法で測定し、結果を第２図にまと
めた。ＫＭ−４は天然型ＴＰＡと同程度のフィブリン親
和性を示したが、ＫＭ−２は天然型ＴＰＡよりも遥かに
強力゛なインビトロでのフィブリン親和性をもっている
ことが分かった。
実施例８
インビトロでのプラスミノーゲン活性化能測定ＫＭ−２
及びＫＭ−４のインビトロでのプラスミノーゲン活性化
能は、プラスミンの合成基質Ｓ−２２５１を利用するコ
レンら（同上）の方法にて測定した。 ０．１Ｍ Ｔｒ
ｌｓ ＨＣＩ（ｐＨ７，５） 、 ０．１％Ｔｖｅｅ
ｎ８０． ０．３ｉＭ Ｓ−２２５１，Ｏ，１ｍｇヒ
トフィブリノゲン（ブロモシアンで分解したもの）。
及びＫＭ−４のインビトロでのプラスミノーゲン活性化
能は、プラスミンの合成基質Ｓ−２２５１を利用するコ
レンら（同上）の方法にて測定した。 ０．１Ｍ Ｔｒ
ｌｓ ＨＣＩ（ｐＨ７，５） 、 ０．１％Ｔｖｅｅ
ｎ８０． ０．３ｉＭ Ｓ−２２５１，Ｏ，１ｍｇヒ
トフィブリノゲン（ブロモシアンで分解したもの）。
１ ｎｇ／ＩＩＩＩ Ｔ Ｐ Ａとし、グルタミン酸タ
イプのプラスミノーゲンを０．０４ ｕ ｇ／ＩＩ＋Ｉ
〜２５ ｕ ｇ／ｒＡＩとなるようにして、２５℃、
３時装置いた後、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。そ
の結果を第３図にまとめた。ＫＭ−２及びＫＭ−４は天
然型ＴＰＡよりも強力なインビトロでのプラスミノーゲ
ン活性化能をもっていることが分かった。
イプのプラスミノーゲンを０．０４ ｕ ｇ／ＩＩ＋Ｉ
〜２５ ｕ ｇ／ｒＡＩとなるようにして、２５℃、
３時装置いた後、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。そ
の結果を第３図にまとめた。ＫＭ−２及びＫＭ−４は天
然型ＴＰＡよりも強力なインビトロでのプラスミノーゲ
ン活性化能をもっていることが分かった。
実施例９
インビトロでの血栓溶解能測定
ＫＭ−２及びＫＭ−４のインビトロでの血栓溶解能をラ
ーセンら（同上）の方法を一部改変して測定した。５０
μｇ／ｍｌヒト グルタミン酸タイププラスミノーゲン
、０．ＩＭＮａＣｌ、 ０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０を
含む１０ＩＩＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ１７，２）に５
Ｂ／ｍｌ となるようにヒトフィブリノーゲンを溶解後
、ヒト トロンビンをり、０ＮＬＨｕｎｉｔ／ｍｌとな
るように添加し、９６穴マルチデイツシユに１００μｌ
ずつ分注して３７℃、１ｈ「放置して凝固させた。作成
したフィブリンクロットに１００μｍの酵素液を重層し
、３７℃で３ｈｒ反応させた。
ーセンら（同上）の方法を一部改変して測定した。５０
μｇ／ｍｌヒト グルタミン酸タイププラスミノーゲン
、０．ＩＭＮａＣｌ、 ０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０を
含む１０ＩＩＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ１７，２）に５
Ｂ／ｍｌ となるようにヒトフィブリノーゲンを溶解後
、ヒト トロンビンをり、０ＮＬＨｕｎｉｔ／ｍｌとな
るように添加し、９６穴マルチデイツシユに１００μｌ
ずつ分注して３７℃、１ｈ「放置して凝固させた。作成
したフィブリンクロットに１００μｍの酵素液を重層し
、３７℃で３ｈｒ反応させた。
反応後、各ウェルの４０５ｎａ＋での吸光度を測定し、
その結果を第４図にまとめた。ＫＭ−２及びＫＭ−４は
天然型ＴＰＡよりも強力なインビトロ血栓溶解能をもっ
ていることが分った。
その結果を第４図にまとめた。ＫＭ−２及びＫＭ−４は
天然型ＴＰＡよりも強力なインビトロ血栓溶解能をもっ
ていることが分った。
実施例１０
ＫＭ−２およびＫＭ−４の血中での半減期測定血中持続
性に関してはベーベら（同上）あるいはマットソンら（
同上）の方法で血中での半減期を測定した。精製したＫ
Ｍ−２又はＫＭ−４３００μｇをウサギに耳介静脈より
単独回投与し、経時的に採血してその血中ＴＰＡ濃度を
ＥＬＩＳＡ法にて測定した。その結果、ウサギでの血中
半減期は、ＫＭ−２が約４分、ＫＭ−４が約２．５分と
測定された。（第５図）
性に関してはベーベら（同上）あるいはマットソンら（
同上）の方法で血中での半減期を測定した。精製したＫ
Ｍ−２又はＫＭ−４３００μｇをウサギに耳介静脈より
単独回投与し、経時的に採血してその血中ＴＰＡ濃度を
ＥＬＩＳＡ法にて測定した。その結果、ウサギでの血中
半減期は、ＫＭ−２が約４分、ＫＭ−４が約２．５分と
測定された。（第５図）
第１図はＴＰＡ発現ベクターｐＳＶｅＣＰＡ−１の構築
を示す図、 第２図は、天然型ＴＰＡ及びＫＭ−２およびＫＭ−４の
フィブリン親和性を示すグラフ、第３図は、天然型ＴＰ
Ａ及びＫＭ−２およびＫＭ−４のプラスミノーゲン活性
化能の比較を示すグラフ、 第４図は、天然型ＴＰＡ及びＫＭ−２およびＫＭ−４の
Ｉｎ ｖｌｔｒｏでのフィブリンクロット溶解能を示す
グラフ、 第５図は、天然型ＴＰＡ及びＫＭ−２およびＫＭ−４の
ウサギでの血中持続性を示すグラフである。
を示す図、 第２図は、天然型ＴＰＡ及びＫＭ−２およびＫＭ−４の
フィブリン親和性を示すグラフ、第３図は、天然型ＴＰ
Ａ及びＫＭ−２およびＫＭ−４のプラスミノーゲン活性
化能の比較を示すグラフ、 第４図は、天然型ＴＰＡ及びＫＭ−２およびＫＭ−４の
Ｉｎ ｖｌｔｒｏでのフィブリンクロット溶解能を示す
グラフ、 第５図は、天然型ＴＰＡ及びＫＭ−２およびＫＭ−４の
ウサギでの血中持続性を示すグラフである。
Claims (11)
- （１）アミノ酸１１５番目のアスパラギンと１１９番目
のセリンが、それぞれプロリンとメチオニンに置換され
た組織プラスミノーゲン活性化因子誘導体。 - （２）アミノ酸１６１番目のグリシン、１６２番目のリ
ジン、および１６５番目のセリンが、それぞれアルギニ
ン、アルギニン、及びトリプトファンに置換された組織
プラスミノーゲン活性化因子誘導体。 - （３）形質転換された動物培養細胞で産生される請求項
１または２に記載のプラスミノーゲン活性化因子誘導体
。 - （４）動物培養細胞がＣＨＯ−Ｋ１である請求項３記載
のプラスミノーゲン活性化因子誘導体。 - （５）請求項１または２で示されるプラスミノーゲン活
性化因子誘導体をコードするＤＮＡ配列。 - （６）ＤＮＡ配列が、ｃＤＮＡの一部分と染色体ＤＮＡ
の一部分からなる請求項５記載のＤＮＡ配列。 - （７）第２エクソンから第３エクソンのＢｇｌII認識部
位までが染色体ＤＮＡ、該ＢｇｌII認識部位から下流が
ｃＤＮＡからなる請求項６記載のＤＮＡ配列。 - （８）請求項１または２のプラスミノーゲン活性化因子
誘導体をコードする請求項５〜７のいずれかに記載のＤ
ＮＡ配列を含む発現ベクターによって形質転換された動
物培養細胞。 - （９）動物培養細胞がＣＨＯ−Ｋ１である請求項８記載
の動物培養細胞。 - （１０）請求項５〜７のいずれかに記載のＤＮＡ配列を
含む発現ベクターによって形質転換された動物培養細胞
を培養してプラスミノーゲン活性化因子誘導体を生成せ
しめ、これを採取するプラスミノーゲン活性化因子誘導
体の製造方法。 - （１１）動物培養細胞がＣＨＯ−Ｋ１である請求項１０
記載のプラスミノーゲン活性化因子誘導体の製造方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1269406A JP2787483B2 (ja) | 1989-10-17 | 1989-10-17 | クリングル１領域に変異を有する新規血栓溶解剤とその製造方法 |
| CA002025743A CA2025743A1 (en) | 1989-09-20 | 1990-09-19 | Plasminogen activator derivative and a method for its manufacture |
| EP19900310305 EP0420502B1 (en) | 1989-09-20 | 1990-09-20 | A new plasminogen activator derivative and a method for its manufacture |
| DE1990609135 DE69009135T2 (de) | 1989-09-20 | 1990-09-20 | Plasminogenaktivatorderivat und Methode zu seiner Herstellung. |
| US07/869,380 US5407819A (en) | 1989-09-20 | 1992-04-16 | Human plasminogen activator variants having amino acids 37-42 substituted and a method for their manufacture |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1269406A JP2787483B2 (ja) | 1989-10-17 | 1989-10-17 | クリングル１領域に変異を有する新規血栓溶解剤とその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03130076A true JPH03130076A (ja) | 1991-06-03 |
| JP2787483B2 JP2787483B2 (ja) | 1998-08-20 |
Family
ID=17471971
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1269406A Expired - Fee Related JP2787483B2 (ja) | 1989-09-20 | 1989-10-17 | クリングル１領域に変異を有する新規血栓溶解剤とその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2787483B2 (ja) |
-
1989
- 1989-10-17 JP JP1269406A patent/JP2787483B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2787483B2 (ja) | 1998-08-20 |
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |